一種電轉染裝置及使用該裝置的雞胚視頂蓋電轉染方法
2023-05-17 18:24:51
一種電轉染裝置及使用該裝置的雞胚視頂蓋電轉染方法
【專利摘要】本發明公開了一種電轉染裝置及使用該裝置的雞胚視頂蓋電轉染方法，該電轉染裝置包括用於與電源供應器測試端連接的第一電極和第二電極，所述第一電極為板形電極，第二電極為針形電極，所述針形電極呈弧形。本發明採用2個分別獨立的電極，放置位置和角度可以靈活調整；本發明的第二電極為針形電極，直徑較細，在放入雞胚視頂蓋底部時，不會對組織或卵黃膜造成損傷，避免由此引起的胚胎死亡，且能夠起到良好的導電作用，同時該針形電極呈弧形，弧形設計能夠在不損傷雞胚的情況下起到固定雞胚視頂蓋的作用。
【專利說明】一種電轉染裝置及使用該裝置的雞胚視頂蓋電轉染方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種電轉染裝置，同時還涉及使用該電轉染裝置的雞胚視頂蓋電轉染方法。
【背景技術】
[0002]神經元的遷移對於神經系統的形成以及發揮正常功能起著重要的作用，許多疾病就與神經元的遷移障礙有關。由於禽類視頂蓋的分層結構比哺乳類動物大腦皮質層的結構更複雜，因此研究其細胞的遷移機制相對更為困難。目前，神經元的遷移機制以及大腦皮層發生機制尚不明確，與神經發生相關的分子功能以及信號調節通路還有待進一步研究。
[0003]對神經元遷移發生紊亂相關分子機制的研究，必須藉助活體動物模型，而神經系統是形成較早的一個龐大系統，研究早期影響中樞神經系統發育相關分子需要在胚胎發育過程中進行幹預，由此進一步分析其作用。基因打靶技術是目前活體內基因沉默和超表達成熟的技術，而在發育生物學研究領域廣泛使用的模式動物雞胚中無法進行基因打靶，近年來建立的活體電轉基因技術實現了雞胚發育過程基因的抑制表達和超表達。
[0004]從最早1998年Ochiai H等首次在雞胚中實現轉基因成功的報導以來，建立在雞胚活體電轉模型上開展了一系列研究。從目前研究進展來看，實現早期脊髓內轉染成功率和胚胎的成活都是比較高的，而且開展的研究也是較多，是因為雞胚脊髓中的轉染最佳時間在E2.5-E3，此時胚胎較小，採用開窗培養的方法能夠方便的進行轉染，由於脊髓轉染電極大多採用針狀電極，體積較小，只需要蛋殼側面打開較小的窗口就可以進行電擊。但是目前，針對雞胚神經元遷移研究最佳部位視頂蓋的研究並不多，主要原因在於在胚胎發育6天(E6)以後，胚胎將會下沉到蛋清中，此時無法進行轉染，從發育的時間上看最佳視頂蓋轉染的時間是在E5。但是由於在E5時胚胎較大，視頂蓋轉染無法採用針狀電極，多採用板狀電極，而板狀電極較大，蛋殼 開窗由於窗口的限制，很難準確放置，轉染成功率低，而且直接利用現有電極不能夠實現轉染到視頂蓋正確的部位。
【發明內容】
[0005]本發明的目的是提供一種電轉染裝置。
[0006]本發明的目的還在於提供一種使用電轉染裝置的雞胚視頂蓋電轉染方法。
[0007]為了實現以上目的，本發明所採用的技術方案是提供一種電轉染裝置，包括用於與電源供應器測試端連接的第一電極和第二電極，所述第一電極為板形電極，第二電極為針形電極，所述針形電極呈弧形。
[0008]該裝置還包括電源供應器，所述電源供應器的測試端經兩個獨立的導線分別與第一電極和第二電極連接。
[0009]各導線與對應電極的連接部位設有手柄。
[0010]所述的第一電極為橢圓形的板形結構。
[0011]所述的第二電極由鉬金或黃金材料製成。[0012]所述第二電極截面為直徑0.3-0.5mm的圓形。
[0013]本發明採用2個分別獨立的電極，放置位置和角度可以靈活調整；本發明的第二電極為針形電極，直徑較細，在放入雞胚視頂蓋底部時，不會對組織或卵黃膜造成損傷，避免由此引起的胚胎死亡，且能夠起到良好的導電作用，同時該針形電極呈弧形，弧形設計能夠在不損傷雞胚的情況下起到固定雞胚視頂蓋的作用；本發明的第一電極為板形電極，由於板形結構的面積較大，放置在視頂蓋上方(注入質粒一側)時，能夠增加質粒的轉染面積，提高轉染效率和成活率。
[0014]本發明各導線與對應電極的連接部位設有手柄，便於操作時手握。
[0015]本發明的第二電極由鉬金或黃金材料製成，具有良好的導電性能。
[0016]本發明所採用的技術方案還在於提供一種使用電轉染裝置的雞胚視頂蓋電轉染方法，包括以下步驟:
[0017]1)雞胚培養
[0018]a)將新鮮受精雞蛋清洗、擦乾，孵育，孵育第3天取出雞蛋，在雞蛋鈍端側面間隔Icm處分別打孔，從鈍端側面開孔處吸取蛋清；
[0019]b)然後密封開孔，繼續孵育至第5天，從雞蛋正上方開孔處開口，暴露胚胎，進行轉染；
[0020]2)雞胚轉染
[0021]在孵育第5天時，將質粒液注射到視頂蓋內，將第二電極插入視頂蓋底部，將第一電極放置在被轉染視頂蓋上方，在電壓18V，電脈衝長度60ms，間隔100ms，電脈衝6次條件下轉染即可；其中第一電極為板形電極，第二電極為針形電極，針形電極呈弧形。
[0022]所述孵育溫度為37.5-37.8°C，溼度為60%_65%。
[0023]所述取出蛋清的量為3_4ml。
[0024]所述注射質粒液的量為1-2 μ l ;所述質粒液中質粒的濃度為2-4 μ g/ μ l。
[0025]步驟2)轉染過程中，第一電極放置於被轉染視頂蓋的正上方，即注射質粒位置的上方，無需插入卵黃膜內，只是接近視頂蓋浸入蛋清即可，而且不需要接觸視頂蓋。
[0026]本發明無需將雞胚轉移到培養皿中去殼培養後電轉染，而是可以直接在蛋殼內進行操作。由於本發明所採用的電轉染裝置設計了 2個單獨的電極，能夠分開來進行放置，只需要將雞胚側面打開窗口即可。本發明在雞胚孵育第3天(Ε3)時從雞胚的鈍端用注射器取出部分蛋清，主要目的是在Ε5時開口的時候防止損傷胚胎，但與以往操作不同的是，本發明取出蛋清後無需開口，而是將雞胚鈍端側面的2個孔密封，待培養至Ε5時再開口轉染，這樣能大大降低雞胚汙染的機會，提高雞胚的存活率。本發明在雞胚孵育第5天(Ε5)時進行轉染，此時雞胚是懸浮在整個蛋清的最上面，只需要將視頂部位的一層薄膜用尖頭鑷子撕破暴露視頂就可以進行轉染，整個轉染過程是在體視顯微鏡下進行，能夠準確看到質粒注射的部位和電擊的部位，操作簡單，在電壓18V，電脈衝長度60ms，間隔100ms，電脈衝6次條件下轉染，雞胚成活率高，轉染後雞胚發育時間更長，可以實現整個雞胚在蛋殼內發育過程基因功能的研究。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0027]圖1為本發明用於雞胚視頂蓋轉基因的電轉染裝置的結構示意圖。【具體實施方式】
[0028]實施例1
[0029]實施例1是本發明提供的用於雞胚視頂蓋轉基因的電轉染裝置的具體實施例，如圖1所示，一種電轉染裝置，包括電源供應器I和經兩個獨立的導線2分別與電源供應器I測試端連接的第一電極3和第二電極4，所述第一電極3為橢圓形的板形電極，第二電極4為針形電極，所述針形電極呈弧形，由鉬金材料製成；所述第二電極4截面為直徑0.3mm的圓形；各導線2的與對應電極的連接部位設有手柄5。
[0030]實施例2
[0031]實施例2是本發明提供的雞胚視頂蓋的電轉染方法的具體實施例，包括以下步驟:
[0032]I)雞胚培養
[0033]a)將新鮮受精雞蛋用溫水洗淨、擦乾，水平放入恆溫恆溼培養箱孵育，孵育溫度為37.8°C，溼度為60%，孵育至第3天取出雞蛋，不轉動方向水平放置，在雞蛋鈍端側面間隔Icm處用IOml注射器針頭分別打一個孔，用帶有針頭的注射器將針頭刺入鈍端側面開孔處吸取4ml蛋清；
[0034]b)然後密封兩個開孔，繼續孵育至第5天，從雞蛋正上方開口，暴露胚胎，進行轉染；
[0035]2)雞胚轉染
[0036]在孵育第5天時，將I μ 1、質粒濃度為4 μ g/ μ I的質粒液注射到一側視頂蓋內，將第二電極插入視頂蓋底部，將第一電極放置在被轉染視頂蓋上方，在電壓18V，電脈衝長度60ms,間隔100ms，電脈衝6次條件下轉染即可；其中第一電極為板形電極，第二電極為針形電極，針形電極呈弧形。
[0037]實施例3
[0038]實施例3是本發明提供的雞胚視頂蓋的電轉染方法的具體實施例，包括以下步驟:
[0039]I)雞胚培養
[0040]a)將新鮮受精雞蛋用溫水洗淨、擦乾，水平放入恆溫恆溼培養箱孵育，孵育溫度為37.8°C，溼度為60%，孵育至第3天取出雞蛋，不轉動方向水平放置，在雞蛋鈍端側面間隔Icm處用IOml注射器針頭分別打一個孔，用帶有針頭的注射器將針頭刺入鈍端側面開孔處吸取3ml蛋清；
[0041 ] b)然後密封兩個開孔，繼續孵育至第5天，從雞蛋正上方開口，暴露胚胎，進行轉染；
[0042]2)雞胚轉染
`[0043]在孵育第5天時，將2 μ 1、質粒濃度為2 μ g/ μ I的質粒液注射到一側視頂蓋內，將第二電極插入視頂蓋底部，將第一電極放置在被轉染視頂蓋上方，在電壓18V，電脈衝長度60ms,間隔100ms，電脈衝6次條件下轉染即可；其中第一電極為板形電極，第二電極為針形電極，針形電極呈弧形。
[0044]本發明的各實施例中，第二電極的截面也可以為其他直徑的圓形，如0.5mm。[0045] 本發明的各實施例中 ，第二電極也可以由其他導線材料製成，如黃金。
【權利要求】
1.一種電轉染裝置，包括用於與電源供應器測試端連接的第一電極和第二電極，其特徵在於，所述第一電極為板形電極，第二電極為針形電極，所述針形電極呈弧形。
2.根據權利要求1所述的電轉染裝置，其特徵在於，該裝置還包括電源供應器，所述電源供應器的測試端經兩個獨立的導線分別與第一電極和第二電極連接。
3.根據權利要求1或2所述的電轉染裝置，其特徵在於，各導線與對應電極的連接部位設有手柄。
4.根據權利要求1或2所述的電轉染裝置，其特徵在於，所述的第一電極為橢圓形的板形結構。
5.根據權利要求1或2所述的電轉染裝置，其特徵在於，所述的第二電極由鉬金或黃金材料製成。
6.根據權利要求1或2所述的電轉染裝置，其特徵在於，所述第二電極截面為直徑0.3-0.5mm的圓形,頭部為光滑的圓頭。
7.一種使用權利要求1所述電轉染裝置的雞胚視頂蓋電轉染方法，其特徵在於，包括以下步驟: 1)雞胚培養 a)將新鮮受精雞蛋清洗、擦乾，孵育，孵育第3天取出雞蛋，在雞蛋鈍端側面間隔Icm處分別打孔，從鈍端側面開孔處吸取蛋清； b)然後密封開孔，繼續孵育至第5天，從雞蛋正上方開孔處開口，暴露胚胎，進行轉染； 2)雞胚轉染 在孵育第5天時，將質粒液注射到視頂蓋內，將第二電極插入視頂蓋底部，將第一電極放置在被轉染視頂蓋上方，在電壓18V，電脈衝長度60ms，間隔100ms，電脈衝6次條件下轉染即可；其中第一電極為板形電極，第二電極為針形電極，針形電極呈弧形。
8.根據權利要求7所述的雞胚視頂蓋電轉染方法，其特徵在於，所述孵育溫度為37.5-37.8°C，溼度為 60%-65%。
9.根據權利要求7所述的雞胚視頂蓋電轉染方法，其特徵在於，所述取出蛋清的量為3_4mlο
10.根據權利要求7所述的雞胚視頂蓋電轉染方法，其特徵在於，所述注射質粒液的量為1-2 μ I ;所述質粒液中質粒的濃度為2-4 μ g/μ I。
【文檔編號】C12M1/42GK103695311SQ201310680758
【公開日】2014年4月2日 申請日期:2013年12月12日 優先權日:2013年12月12日
【發明者】楊慈清, 王聰睿, 李小英, 林俊堂, 範文豔, 李瓊, 劉彥禮, 付蘇雷, 賈陽陽, 李晗 申請人:新鄉醫學院