糖peg化的促紅細胞生成素的製作方法

2023-05-17 11:03:21

>X＝O，NH，S，CH2，N-(R1-5)2.Y＝X；Z＝X；A＝X；B＝X.Q＝H2，O，S，NH，N-R.R，R1-4＝H，連接物-M，M.M＝PEG，例如，m-PEG在另一個示例性的實施方案中，使UDP-半乳糖-PEG與牛乳β1，4-半乳糖基轉移酶反應，從而將修飾的半乳糖轉移至合適的末端N-乙醯基葡糖胺結構。在表達過程中，可以生產糖肽上的末端GlcNAc殘基，如哺乳動物、昆蟲、植物或真菌等表達系統中會出現的，但是也可以根據需要，通過用唾液酸酶和/或糖苷酶和/或糖基轉移酶處理糖肽來生產。在另一個示例性的實施方案中，使用GlcNAc轉移酶，例如GNT1-5，來將PEG化的GlcN轉移到糖肽上的末端甘露糖殘基。在另一個示例性的實施方案中，從糖肽酶促地去除N-和/或O-連接的聚糖結構，以暴露胺基酸或末端糖基殘基，其隨後用修飾的糖綴合。例如，使用內切聚糖酶來去除糖肽的N-連接的結構，以暴露作為糖肽上的GlcNAc-連接-Asn的末端GlcNAc。使用UDP-Gal-PEG和合適的半乳糖基轉移酶來將PEG-半乳糖官能團導入到暴露的GlcNAc上。在一個可替代的實施方案中，使用已知能將糖殘基轉移到肽主鏈上的糖基轉移酶，將修飾的糖直接添加到肽主鏈上。該示例性的實施方案如方案4所述。用於實現本發明的示例性的糖基轉移酶包括但不限於，GalNAc轉移酶(GalNAcT1-14)，GlcNAc轉移酶，巖藻糖基轉移酶，葡糖基轉移酶，木糖基轉移酶，甘露糖基轉移酶等。使用該方法，可以將修飾的糖直接添加到缺少任何碳水化合物的肽上，或者，已有的糖肽上。在兩種情況下，修飾的糖的添加發生在肽主鏈的特異性的位置上，這糖基轉移酶的底物特異性所定義，而不是以使用化學方法修飾蛋白的肽主鏈的過程中發生的隨機方式。通過將合適的胺基酸序列構建進多肽鏈，可以將許多試劑導入缺少糖基轉移酶底物肽序列的蛋白或糖肽。方案4在每一個上述的示例性的實施方案中，在將修飾的糖綴合到肽上後，可以使用一個或多個其它的化學的或酶促的修飾步驟。在示例性的實施方案中，使用酶(例如，巖藻糖基轉移酶)將糖基單元(例如，巖藻糖)添加到結合到肽上的末端的修飾的糖上。在另一個實施例中，使用酶促反應對修飾的糖不能綴合的位點「加帽」。或者，使用化學反應來改變綴合的修飾的糖的結構。例如，使綴合的修飾的糖與能穩定或去穩定與肽組分的連接的試劑反應，所述的肽組分結合了修飾的糖。在另一個實施例中，在綴合到肽上後，修飾的糖的組分被去保護。技術人員能認識到，存在許多酶促的和化學的方法，其在本發明的方法中可以用在將修飾的糖綴合到肽上之後的階段。修飾的糖-肽綴合物的進一步修飾，在本發明的範圍內。i.酶糖轉移除了上面在形成醯基-連接的綴合物的上下文中討論的酶以外，通過使用其它酶的方法，可以細化、修整或修飾綴合物和起始底物(例如，肽，脂類)的糖基化模式。在2003年4月17日公開的DeFrees的WO03/031464A2中，非常詳細地討論了使用能將糖供體轉移到受體上的酶重構肽和脂類的方法。下面簡單總結了在本方法中使用的選擇的酶。糖基轉移酶糖基轉移酶能催化活化的糖(供體NDP-糖)以逐步的方式添加到蛋白、糖肽、脂類或糖脂上，或生長的寡糖的非-還原末端。通過轉移酶和脂類-連接的寡糖供體Dol-PP-NAG2Glc3Man9以模塊轉移的方式(enblocktransfer)可以合成N-連接的糖肽，隨後修整核心。在該情況下，″核心″糖的性質稍微與隨後的結合不同。非常大量的糖基轉移酶是本領域已知的。在本發明中使用的糖基轉移酶可以是任意的，只要它可以利用修飾的糖作為糖供體。這樣的酶的實例包括Leloir途徑糖基轉移酶，例如半乳糖基轉移酶，N-乙醯基氨基葡糖基轉移酶，N-乙醯基氨基半乳糖基轉移酶，巖藻糖基轉移酶，唾液酸轉移酶，甘露糖基轉移酶，木糖基轉移酶，葡糖醛酸基轉移酶等。對於涉及糖基轉移酶反應的酶促的糖合成，可以克隆糖基轉移酶，或從任意的來源分離。許多克隆的糖基轉移酶是已知的，它們的多核苷酸序列也是如此。見，例如，「TheWWWGuideToClonedGlycosyltransferases，」(http//www.vei.co.uk/TGN/gt_guide.htm)。糖基轉移酶胺基酸序列和可以從其推斷胺基酸序列的能編碼糖基轉移酶的核苷酸序列也記載在許多可公開得到的資料庫中，包括GenBank，Swiss-Prot，EMBL，和其它。可以用在本發明的方法中的糖基轉移酶包括但不限於，半乳糖基轉移酶，巖藻糖基轉移酶，葡糖基轉移酶，N-乙醯基氨基半乳糖基轉移酶，N-乙醯氨基葡萄糖轉移酶，葡糖醛酸基轉移酶，唾液酸轉移酶，甘露糖基轉移酶，葡糖醛酸轉移酶，半乳糖醛酸轉移酶，和寡糖基轉移酶。合適的糖基轉移酶包括從真核生物和原核生物得到的那些。通過化學合成，通過從合適的細胞或細胞系培養物篩選mRNA的逆轉錄物，通過從合適的細胞篩選基因組文庫，或通過這些方法的組合，可以得到能編碼糖基轉移酶的DNA。用從糖基轉移酶基因序列產生的寡核苷酸探針，可以篩選mRNA或基因組DNA。根據已知的並用在常規的雜交試驗中的方法，可以用可檢測的基團例如螢光基團，放射性的原子或化學發光的基團標記探針。在替代方案中，通過使用聚合酶鏈式反應(PCR)方法，利用從糖基轉移酶基因序列生成的PCR寡核苷酸引物，可以得到糖基轉移酶基因序列。見，Mullis等的美國專利號4,683,195和Mullis的美國專利號4,683,202。在用含有能編碼糖基轉移酶的DNA的載體轉化的宿主細胞中，可以合成糖基轉移酶。使用載體來擴增能編碼糖基轉移酶的DNA，和/或表達能編碼糖基轉移酶的DNA。表達載體是可複製的DNA構建體，其中能編碼糖基轉移酶的DNA序列可操作地連接到合適的控制序列上，後者能實現糖基轉移酶在合適的宿主中的表達。對這樣的控制序列的需要，隨選擇的宿主和選擇的轉化方法而異。通常，控制序列包括轉錄啟動子，任選的控制轉錄的操縱基因序列，能編碼合適的mRNA核糖體結合位點的序列，和能控制轉錄和翻譯終止的序列。擴增載體不需要表達控制域。只需要在宿主中複製的能力(這通常由複製起點賦予)和選擇基因(以促進轉化體的識別)。在示例性的實施方案中，本發明使用原核生物酶。這樣的糖基轉移酶包括參與合成脂寡糖(LOS)的酶，其由許多革蘭氏陰性細菌生成(Preston等，CriticalReviewsinMicrobiology23(3)139-180(1996))。這樣的酶包括但不限於，大腸桿菌和鼠傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphimurium)的rfa操縱子的蛋白，其包括β1，6半乳糖基轉移酶和β1，3半乳糖基轉移酶(見，例如，EMBL登記號M80599和M86935(大腸桿菌)；EMBL登記號S56361(鼠傷寒沙門氏菌)，葡糖基轉移酶(Swiss-Prot登記號P25740(大腸桿菌)，β1，2-葡糖基轉移酶(rfaJ)(Swiss-Prot登記號P27129(大腸桿菌)和Swiss-Prot登記號P19817(鼠傷寒沙門氏菌)，和β1，2-N-乙醯基氨基葡糖基轉移酶(rfaK)(EMBL登記號U00039(大腸桿菌)。已知其胺基酸序列的其它的糖基轉移酶包括由操縱子例如rfaB編碼的那些，其已經在生物中表徵，例如肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)，大腸桿菌，鼠傷寒沙門氏菌，腸沙門氏菌(Salmonellaenterica)，小腸結腸炎耶爾森氏菌(Yersiniaenterocolitica)，Mycobacteriumleprosum，也包括綠膿假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)的rh1操縱子。也適用於本發明中的是，參與生成含有乳糖-N-新四糖，D-半乳糖基-β-1，4-N-乙醯基-D-氨基葡糖基-β-1，3-D-半乳糖基-β-1，4-D-葡萄糖，和Pk血型三糖序列D-半乳糖基-α-1，4-D-半乳糖基-β-1，4-D-葡萄糖(其已經在黏膜病原體淋病奈瑟氏球菌(Neisseriagonnorhoeae)和腦膜炎奈瑟氏球菌(N.meningitidis)的LOS中鑑別出)(Scholten等，J.Med.Microbiol.41236-243(1994))的結構的糖基轉移酶。從腦膜炎奈瑟氏球菌免疫型L3和L1(Jennings等，Mol.Microbiol.18729-740(1995))和淋病奈瑟氏球菌突變體F62(Gotshlich，J.Exp.Med.1802181-2190(1994))中，已經鑑別出了能編碼參與這些結構的生物合成的糖基轉移酶的腦膜炎奈瑟氏球菌和淋病奈瑟氏球菌的基因。在腦膜炎奈瑟氏球菌中，由3個基因lgtA，lgtB和lgE組成的基因座能編碼添加乳糖-N-新四糖鏈中的最後3個糖所需的糖基轉移酶(Wakarchuk等，J.Biol.Chem.27119166-73(1996))。近來，證實了lgtB和lgtA基因產物的酶活性，為它們的推測的糖基轉移酶功能提供了第一手的直接證據(Wakarchuk等，J.Biol.Chem.271(45)28271-276(1996))。在淋病奈瑟氏球菌中，存在2個其它的基因lgtD，其能將β-D-GalNAc添加到乳糖-N-新四糖結構的末端半乳糖的3位置，和lgtC，其能將末端α-D-Gal添加到截短的LOS的乳糖元件，從而建立Pk血型抗原結構(Gotshlich(1994)，同上)。在腦膜炎奈瑟氏球菌中，單獨的免疫型L1也能表達Pk血型抗原，且已經被證實攜帶lgtC基因(Jennings等，(1995)，同上)。奈瑟氏球菌糖基轉移酶和有關的基因也記載在USPN5,545,553(Gotschlich)中。還已經表徵了來自幽門螺桿菌(Helicobacterpylori)的α1，2-巖藻糖基轉移酶和α1，3-巖藻糖基轉移酶的基因(Martin等，J.Biol.Chem.27221349-21356(1997))。在本發明中也可以使用空腸彎曲桿菌空腸亞種(Campylobacterjejuni)的糖基轉移酶(見，例如，http//afmb.cnrs-mrs.fr/～pedro/CAZY/gtf_42.html)。巖藻糖基轉移酶在一些實施方案中，在本發明的方法中使用的糖基轉移酶是巖藻糖基轉移酶。巖藻糖基轉移酶是本領域的技術人員已知的。示例性的巖藻糖基轉移酶包括能將L-巖藻糖從GDP-巖藻糖轉移到受體糖的羥基位置的酶。能將非-核苷酸糖轉移到受體上的巖藻糖基轉移酶，也可以用在本發明中。在一些實施方案中，受體糖是，例如，寡糖糖苷中的Galβ(1→3，4)GlcNAcβ-基團中的GlcNAc。用於該反應的合適的巖藻糖基轉移酶包括Galβ(1→3，4)GlcNAcβ1-α(1→3，4)巖藻糖基轉移酶(FTIIIE.C.No.2.4.1.65)，其首次從人乳中表徵(見，Palcic，等，CarbohydrateRes.1901-11(1989)；Prieels，等，J.Biol.Chem.25610456-10463(1981)；和Nunez，等，Can.J.Chem.592086-2095(1981))和Galβ(1→4)GlcNAcβ-α巖藻糖基轉移酶(FTIV，FTV，FTVI)，其在人血清中發現。還已經表徵了FTVII(E.C.No.2.4.1.65)，即唾液酸基α(2→3)Galβ((1→3)GlcNAcβ巖藻糖基轉移酶。還已經表徵了重組形式的Galβ(1→3，4)GlcNAcβ-α(1→3，4)巖藻糖基轉移酶(見，Dumas，等，Bioorg.Med.Letters1425-428(1991)和Kukowska-Latallo，等，GenesandDevelopment41288-1303(1990))。其它的示例性的巖藻糖基轉移酶包括，例如，α1，2巖藻糖基轉移酶(E.C.No.2.4.1.69)。通過Mollicone，等，Eur.J.Biochem.191169-176(1990)或美國專利號5,374,655中所述的方法，可以進行酶促的巖藻糖基化。用於生產巖藻糖基轉移酶的細胞，也包括用於合成GDP-巖藻糖的酶促系統。半乳糖基轉移酶在另一組實施方案中，糖基轉移酶是半乳糖基轉移酶。示例性的半乳糖基轉移酶包括α(1，3)半乳糖基轉移酶(E.C.No.2.4.1.151，見，例如，Dabkowski等，TransplantProc.252921(1993)和Yamamoto等Nature345229-233(1990)，牛(GenBankj04989，Joziasse等，J.Biol.Chem.26414290-14297(1989))，鼠(GenBankm26925；Larsen等，Proc.Nat』l.Acad.Sci.USA868227-8231(1989))，豬(GenBankL36152；Strahan等，Immunogenetics41101-105(1995))。另一種合適的α1，3半乳糖基轉移酶是參與合成血型B抗原的(EC2.4.1.37，Yamamoto等，J.Biol.Chem.2651146-1151(1990)(人類))。另一種示例性的半乳糖基轉移酶是核心Gal-T1。在本發明的方法中也適合使用β(1，4)半乳糖基轉移酶，其包括，例如，EC2.4.1.90(LacNAc合成酶)和EC2.4.1.22(乳糖合成酶)(牛(D′Agostaro等，Eur.J.Biochem.183211-217(1989))，人(Masri等，Biochem.Biophys.Res.Commun.157657-663(1988))，鼠(Nakazawa等，J.Biochem.104165-168(1988))，以及E.C.2.4.1.38和神經醯胺半乳糖基轉移酶(EC2.4.1.45，Stahl等，J.Neurosci.Res.38234-242(1994))。其它合適的半乳糖基轉移酶包括，例如，α1，2半乳糖基轉移酶(來自例如，粟酒裂殖糖酵母(Schizosaccharomycespombe)，Chapell等，Mol.Biol.Cell5519-528(1994))。唾液酸轉移酶唾液酸轉移酶是另一種類型的糖基轉移酶，其可以用於重組的細胞和本發明的反應混合物中。能生產重組的唾液酸轉移酶的細胞也能生產CMP-唾液酸，後者是唾液酸轉移酶的唾液酸供體。適用於本發明的唾液酸轉移酶的實例包括ST3GalIII(例如，大鼠或人ST3GalIII)，ST3GalIV，ST3GalI，ST6GalI，ST3GalV，ST6GalII，ST6GalNAcI，ST6GalNAcII，和ST6GalNAcIII(在本文中使用的唾液酸轉移酶命名法如Tsuji等，Glycobiology6v-xiv(1996)所述)。稱作α(2，3)唾液酸轉移酶(EC2.4.99.6)的示例性的α(2，3)唾液酸轉移酶能將唾液酸轉移到Galβ1→3Glc二糖或糖苷的非還原末端Gal。見，VandenEijnden等，J.Biol.Chem.2563159(1981)，Weinstein等，J.Biol.Chem.25713845(1982)和Wen等，J.Biol.Chem.26721011(1992)。另一種示例性的α2，3-唾液酸轉移酶(EC2.4.99.4)能將唾液酸轉移到二糖或糖苷的非還原末端Gal。見，Rearick等，J.Biol.Chem.2544444(1979)和Gillespie等，J.Biol.Chem.26721004(1992)。其它的示例性的酶包括Gal-β-1，4-GlcNAcα-2，6唾液酸轉移酶(見，Kurosawa等Eur.J.Biochem.219375-381(1994))。優選地，為了糖肽的碳水化合物的糖基化，唾液酸轉移酶能將唾液酸轉移到序列Galβ1，4GlcNAc-(其是完全唾液酸化的碳水化合物結構上的末端唾液酸下面的最常見的倒數第二個序列)(見，表2)。表2使用Galβ1，4GlcNAc序列作為受體底物的唾液酸轉移酶1)Goochee等，Bio/Technology91347-1355(1991)2)Yamamoto等，J.Biochem.120104-110(1996)3)Gilbert等，J.Biol.Chem.27128271-28276(1996)在所述的方法中使用的唾液酸轉移酶的實例是ST3GalIII，它也稱作α(2，3)唾液酸轉移酶(EC2.4.99.6)。該酶能催化唾液酸向Galβ1，3GlcNAc或Galβ1，4GlcNAc糖苷的Gal的轉移(見，例如，Wen等，J.Biol.Chem.26721011(1992)；VandenEijnden等，J.Biol.Chem.2563159(1991))，且負責糖肽中的天冬醯胺-連接的寡糖的唾液酸化。唾液酸連接到Gal，形成2個糖之間的α-連接。糖之間的鍵合(連接)是在NeuAc的2-位置和Gal的3-位置之間。從以下可以分離該特定的酶大鼠肝臟(Weinstein等，J.Biol.Chem.25713845(1982))；人cDNA(Sasaki等(1993)J.Biol.Chem.26822782-22787；KitagawaPaulson(1994)J.Biol.Chem.2691394-1401)和基因組(Kitagawa等(1996)J.Biol.Chem.271931-938)DNA序列是已知的，有利於通過重組表達生產該酶。在一個優選的實施方案中，所述的唾液酸化方法使用大鼠ST3GalIII。在本發明中使用的其它示例性的唾液酸轉移酶包括從空腸彎曲桿菌空腸亞種分離的那些，包括α(2，3)。見，例如，WO99/49051。除了表2列出的那些以外的唾液酸轉移酶也可以用於商業上重要的糖肽的唾液酸化的經濟的且有效的大規模方法。作為發現這些其它的酶的效用的簡單實驗，使不同量的每種酶(1-100mU/mg蛋白)與脫唾液酸-α1AGP(1-10mg/ml)反應，以對比目標唾液酸轉移酶與牛ST6GalI，ST3GalIII或兩種唾液酸轉移酶相比唾液酸化糖肽的能力。或者，其它的糖肽，或從肽主鏈酶促地釋放的N-連接的寡糖，可以用於替代用於該評價的脫唾液酸-α1AGP。能比ST6GalI更有效地唾液酸化糖肽的N-連接的寡糖的唾液酸轉移酶，可以用於實現肽唾液酸化的大規模方法。GalNAc轉移酶N-乙醯基氨基半乳糖基轉移酶可以用於實現本發明，特別是用於將GalNAc基團結合到肽的O-連接的糖基化位點的胺基酸上。合適的N-乙醯基氨基半乳糖基轉移酶包括但不限於，α(1，3)N-乙醯基氨基半乳糖基轉移酶，β(1，4)N-乙醯基氨基半乳糖基轉移酶(Nagata等，J.Biol.Chem.26712082-12089(1992)和Smith等，J.BiolChem.26915162(1994))和多肽N-乙醯基氨基半乳糖基轉移酶(Homa等，J.Biol.Chem.26812609(1993))。眾所周知通過基因工程從克隆的基因生產蛋白例如酶GalNAcT1-XX。見，例如，美國專利號4,761,371。一種方法包含收集足夠的樣品，然後通過N-末端測序確定酶的胺基酸序列。然後，使用該信息來分離能編碼全長(膜結合的)轉移酶的cDNA克隆，該cDNA克隆在昆蟲細胞系Sf9中表達，導致完全活性的酶的合成。然後，使用在16種不同蛋白中的已知糖基化位點周圍的胺基酸的半定量分析，隨後體外地研究合成的肽的糖基化，確定酶的受體特異性。該工作已經證實，某些胺基酸殘基在糖基化的肽片段中過量存在，在糖基化的絲氨酸和蘇氨酸殘基周圍的特定位置中的殘基，可能具有比其它胺基酸基團對受體效率更顯著的影響。細胞-結合的糖基轉移酶在另一個實施方案中，在本發明的方法中使用的酶是細胞-結合的糖基轉移酶。儘管已知許多可溶的糖基轉移酶(見，例如，美國專利號5,032,519)，當伴隨細胞時，糖基轉移酶通常是膜-結合的形式。認為迄今研究的許多膜-結合的酶是膜內蛋白；換而言之，通過超聲處理不能使它們從膜釋放出來，且需要去汙劑進行增溶。在脊椎動物和無脊椎動物細胞的表面，已經鑑別出了表面糖基轉移酶，還已經認識到，這些表面轉移酶能在生理條件下維持催化活性。但是，細胞表面糖基轉移酶的更公認的功能是細胞間的識別(Roth，MOLECULARAPPROACHEStoSUPRACELLULARPHENOMENA，1990)。已經開發了改變細胞表達的糖基轉移酶的方法。例如，Larsen等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA868227-8231(1989)，報導了一種遺傳方法，以分離克隆的cDNA序列，後者能決定細胞表面寡糖結構的表達和它們的相關糖基轉移酶。將由從已知能表達UDP-半乳糖.β.-D-半乳糖基-1，4-N-乙醯基-D-氨基葡糖苷α-1，3-半乳糖基轉移酶的鼠細胞系分離的mRNA產生的cDNA文庫轉染進COS-1細胞。然後，培養轉染的細胞，並測定α1-3半乳糖基轉移酶活性。Francisco等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA892713-2717(1992)，公開了一種將β-內醯胺酶錨定到大腸桿菌的外表面的方法。生產了由(i)外膜蛋白的信號序列，(ii)外膜蛋白的跨膜部分，和(iii)完全的成熟β-內醯胺酶序列組成的三重融合體，產生了有活性的表面結合的β-內醯胺酶分子。但是，Francisco方法僅僅限於原核細胞系統，且如作者認識到的，合適的功能需要完整的三重融合體。磺基轉移酶本發明還提供了生產肽的方法，所述肽包括硫酸化的分子，包括，例如硫酸化的多糖例如肝素，類肝素，角叉菜膠，和有關的化合物。合適的磺基轉移酶包括，例如，軟骨素-6-磺基轉移酶(Fukuta等，J.Biol.Chem.27018575-18580(1995)所述的雞cDNA；GenBank登記號D49915，糖胺聚糖N-乙醯基葡糖胺N-脫乙醯基酶/N-磺基轉移酶1(Dixon等，Genomics26239-241(1995)；UL18918)，和糖胺聚糖N-乙醯基葡糖胺N-脫乙醯基酶/N-磺基轉移酶2(Orellana等，J.Biol.Chem.2692270-2276(1994)和Eriksson等，J.Biol.Chem.26910438-10443(1994)所述的鼠cDNA；GenBank登記號U2304所述的人cDNA)。糖苷酶本發明還包括使用野生型和突變型糖苷酶。已經證實，突變型β-半乳糖苷酶能通過將α-糖基氟化物偶聯到半乳糖基受體分子上，催化二糖的形成(Withers，美國專利號6,284,494；2001年9月4日授權)。在本發明中使用的其它糖苷酶包括，例如，β-葡糖苷酶，β-半乳糖苷酶，β-甘露糖苷酶，β-乙醯基氨基葡糖苷酶，β-N-乙醯基氨基半乳糖苷酶，β-木糖苷酶，β-巖藻糖苷酶，纖維素酶，木聚糖酶，半乳聚糖酶，甘露聚糖酶，半纖維素酶，澱粉酶，葡糖澱粉酶，α-葡糖苷酶，α-半乳糖苷酶，α-甘露糖苷酶，α-N-乙醯基氨基葡糖苷酶，α-N-乙醯基氨基半乳糖苷酶，α-木糖苷酶，α-巖藻糖苷酶，和神經氨酸酶/唾液酸酶。固定化的酶本發明還提供了固定化到固體和/或可溶的載體上的酶的應用。在示例性的實施方案中，提供了糖基轉移酶，其根據本發明的方法，通過完整的糖基連接物，綴合到PEG上。PEG-連接物-酶綴合物任選地結合到固體載體上。固體支持的酶在本發明的方法中的應用，能簡化反應混合物的建立和反應產物的純化，也能容易地回收酶。糖基轉移酶綴合物可以用在本發明的方法中。本領域的技術人員能明白酶和支持體的其它組合。融合蛋白在其它的示例性的實施方案中，本發明的方法使用具有超過一種參與合成需要的糖肽綴合物的酶活性的融合蛋白。融合多肽可以由例如糖基轉移酶的催化活性域和與其連接的輔助酶的催化活性域組成。輔助酶催化域可以，例如，催化形成核苷酸糖(其是糖基轉移酶的供體)的步驟，或催化涉及糖基轉移酶循環的反應。例如，可以將能編碼糖基轉移酶的多核苷酸按讀碼框連接到多核苷酸上，後者能編碼參與核苷酸糖合成的酶。然後，得到的融合蛋白不但可以催化核苷酸糖的合成，而且可以催化糖基團向受體分子的轉移。融合蛋白可以是兩個或多個循環酶，其連接成一個可表達的核苷酸序列。在其它的實施方案中，融合蛋白包括兩個或多個糖基轉移酶的催化活性域。見，例如，5,641,668。可以容易地使用各種合適的融合蛋白設計和生產本發明的修飾的糖肽(見，例如，PCT專利申請PCT/CA98/01180，其在1999年6月24日公開為WO99/31224)。促紅細胞生成素綴合物的純化可以不經純化地使用通過上述方法生產的產物。但是，通常優選地回收產物。可以使用標準的眾所周知的回收糖基化的糖的技術，例如薄層或厚層色譜，柱色譜，離子交換色譜或膜過濾。優選地使用膜過濾，更優選地使用反滲透膜，或一種或多種用於回收的柱色譜技術，如下文和本文引用的文獻中討論的。例如，可以使用膜過濾來去除蛋白例如糖基轉移酶，其中膜具有約3000至約10,000的分子量截止值。然後，可以使用納米過濾或反滲透來去除鹽和/或純化產物糖(見，例如，WO98/15581)。納米濾膜是一類反滲透膜，其能通過單價鹽，但是能保留多價鹽和大於約100至約2,000道爾頓的無電荷的溶質，取決於使用的膜。因而，在典型的應用中，通過本發明的方法製備的糖會被保留在膜中，且汙染的鹽會通過。如果修飾的糖蛋白是細胞內生產的，作為第一步，去除顆粒碎片，無論是宿主細胞還是裂解的片段，例如，通過離心或超濾；任選地，可以用市場上可買到的蛋白濃縮過濾器濃縮蛋白，然後通過選自下述的一個或多個步驟，從其它的雜質中分離多肽變體免疫親合色譜，離子交換柱分離(例如，在二乙基氨基乙基(DEAE)或含有羧甲基或硫代丙基的基質中)，在Blue-Sepharose、CMBlue-Sepharose、MONO-Q、MONO-S、扁豆凝集素-Sepharose、WGA-Sepharose、ConA-Sepharose，EtherToyopearl、ButylToyopearl、PhenylToyopearl或蛋白ASepharose上的色譜，SDS-PAGE色譜，二氧化矽色譜，色譜聚焦，反相HPLC(例如，具有附加的脂肪族基團的矽凝膠)，使用例如Sephadex分子篩或大小排阻色譜的凝膠過濾，在能選擇性地結合多肽的柱上的色譜，和乙醇或硫酸銨沉澱。通常，通過初步提取細胞、酶等，然後通過一個或多個濃縮、鹽析、含水的離子交換或大小排阻色譜步驟，分離在培養物中生產的修飾的糖肽。另外，通過親合色譜，可以純化修飾的糖蛋白。最後，可以使用HPLC進行最後的純化步驟。可以將蛋白酶抑制劑例如甲磺醯氟(PMSF)包含在任一個前述的步驟中，以抑制蛋白水解，且可以包含抗生素，以預防外來汙染物的生長。在另一個實施方案中，使用市場上可買到的蛋白濃縮過濾器，例如，Amicon或MilliporePellicon超濾單元，首先濃縮來自生產本發明的修飾的糖肽的系統的上清液。在濃縮步驟後，可以將濃縮物應用到合適的純化基質上。例如，合適的親合基質可以包含結合到合適的載體上的肽的配體，凝集素或抗體分子。或者，可以使用陰離子交換樹脂，例如，具有側掛的DEAE基團的基質或底物。合適的基質包括丙烯醯胺，瓊脂糖，葡聚糖，纖維素，或在蛋白純化中普遍使用的其它類型。或者，可以使用陽離子交換步驟。合適的陽離子交換劑包括各種不溶的基質，包含硫代丙基或羧甲基。硫代丙基是特別優選的。最後，可以使用一個或多個RP-HPLC步驟(採用疏水的RP-HPLC介質，例如，具有側掛的甲基或其它脂肪族基團的矽凝膠)，以進一步純化多肽變體組合物。也可以以不同的組合，使用一些或所有的前述的純化步驟，提供均一的修飾的糖蛋白。通過類似於Urdal等，J.Chromatog.296171(1984)公開的方法，可以純化由大規模發酵得到的本發明的修飾的糖肽。該文獻描述了2個連續的用於在製備級HPLC柱上純化重組人IL-2的RP-HPLC步驟。或者，可以使用親合色譜等技術，純化修飾的糖蛋白。藥物組合物在另一個方面，本發明提供了藥物組合物。該藥物組合物包含藥學上可接受的稀釋劑和非天然地產生的PEG基團、治療基團或生物分子和糖基化的或非-糖基化的肽之間的共價綴合物。聚合物、治療基團或生物分子通過置於肽和聚合物、治療基團或生物分子之間且共價地連接於其上的完整的糖基連接基團，綴合到肽上。本發明的藥物組合物適用於許多藥物輸送系統。在本發明中使用的合適的製劑，參見Remington′sPharmaceuticalSciences，MacePublishingCompany，Philadelphia，PA，17thed.(1985)。關於藥物輸送方法的簡單評論，見，Langer，Science2491527-1533(1990)。可以將藥物組合物配製成用於任何合適的給藥方式，包括例如，局部的，經口的，鼻的，靜脈內的，顱內的，腹膜內的，皮下的或肌肉內的給藥。對於腸胃外給藥，例如皮下注射，載體優選地包含水，鹽水，醇，脂肪，蠟或緩衝劑。對於經口給藥，可以使用任一種上述的載體或固體載體，例如甘露醇，乳糖，澱粉，硬脂酸鎂，糖精鈉，滑石，纖維素，葡萄糖，蔗糖，和碳酸鎂。也可以將可生物降解的微球(例如，聚乳酸酯聚乙醇酸酯)用作本發明的藥物組合物的載體。合適的可生物降解的微球記載在，例如，美國專利號4,897,268和5,075,109。通常，腸胃外地施用藥物組合物，例如，靜脈內地。因而，本發明提供了用於腸胃外施用的組合物，其包含溶解或懸浮在合適的載體中的化合物，優選水性載體，例如，水，緩衝的水，鹽水，PBS等。為了接近生理條件，組合物可以含有藥學上可接受的輔助物質，例如pH調節劑和緩衝劑，張力調節劑，潤溼劑，去汙劑等。通過常規的滅菌技術，可以將這些組合物滅菌，或可以過濾除菌。可以將得到的水溶液原樣包裝備用，或凍幹，在施用之前，將凍幹的製品與無菌的水性載體相混合。製品的pH典型地是3-11，更優選5-9，最優選7-8。在一些實施方案中，可以將本發明的糖肽整合進由標準的能形成泡囊的脂類形成的脂質體中。可以得到許多製備脂質體的方法，例如，Szoka等，Ann.Rev.Biophys.Bioeng.9467(1980)，美國專利號4,235,871，4,501,728和4,837,028所述。使用許多靶向劑(例如，本發明的唾液酸基半乳糖苷)導向脂質體，是本領域眾所周知的(見，例如，美國專利號4,957,773和4,603,044)。可以使用將靶向劑偶聯至脂質體的標準方法。這些方法通常包含將脂類組分(例如磷脂醯乙醇胺)整合進脂質體中，其可以被活化，用於結合靶向劑或衍生的親脂的化合物，例如本發明的脂類-衍生的糖肽。靶向機理通常要求，靶向劑以靶基團可以與靶標(例如，細胞表面受體)相互作用的方式位於脂質體的表面。使用本領域的技術人員已知的方法(例如，分別用長鏈烷基滷化物或脂肪酸烷化或醯化碳水化合物上的羥基)，可以在形成脂質體之前，將本發明的碳水化合物結合到脂類分子上。或者，可以以下述方式構造脂質體，使連接部分在形成膜時首先整合進膜中。連接部分必須具有親脂部分，其牢固地植入和錨在膜中。它還必須具有反應部分，其可以在脂質體的水性表面上而參與化學反應。選擇反應部分，使其化學地適用於與以後添加的靶向劑或碳水化合物形成穩定的化學鍵。在一些情況下，可以將靶試劑直接結合到連接分子上，但是在大多數情況下，更合適地是使用第三種分子作為化學橋，從而將膜中的連接分子和靶向劑或碳水化合物相連接，後者三維地延伸出泡囊表面。通過本發明的方法製備的化合物也可以用作診斷試劑。例如，標記的化合物可以用於定位懷疑患有炎症的患者中的炎症的區域或腫瘤轉移。對於該用途，可以用125I，14C，或氚標記化合物。在本發明的藥物組合物中使用的活性成分是糖PEG化的促紅細胞生成素和其具有使骨髓細胞增加生產網狀細胞和紅細胞的生物學性質的衍生物。本發明的脂質體分散系可以用作治療血液障礙的腸胃外製劑，所述血液障礙的特徵在於低或有缺陷的紅細胞生產，例如各種形式的貧血，包括與慢性腎衰竭有關的貧血，zidovidine治療的HIV感染的患者，和化療的癌症患者。它也可以用於治療多種疾病狀態、障礙和血液學失常的狀態，例如鐮狀細胞病，β-地中海貧血，囊性纖維化，懷孕和月經失調，早熟性早期貧血，脊髓損傷，空間飛行，急性失血，老化等。優選地，腸胃外地(例如IV，IM，SC或IP)施用本發明的EPO組合物。有效劑量會根據治療的病症和給藥途徑而很大地變化，但是範圍應當是約0.1(約7U)至100(約7000U)μg/kg體重的活性物質。用於治療貧血病症的優選的劑量是約50至約300單位/kg，每周3次。因為本發明提供了具有增強的體內停留時間的促紅細胞生成素，當施用本發明的組合物時，可以任選地降低所述的劑量。提供了下面的實施例來解釋本發明的綴合物和方法，但是不會限制要求保護的發明。實施例實施例1UDP-GalNAc-6』-CHO的製備將UDP-GalNAc(200mg，0.30mmol)溶於1mMCuSO4溶液(20mL)和25mMNaH2PO4溶液(pH6.0；20mL)中。然後，加入半乳糖氧化酶(240U；240μL)和過氧化氫酶(13000U；130μL)，反應系統裝配了裝滿氧的氣球，並在室溫攪拌7天。然後，過濾反應混合物(離心筒；MWCO5K)，將濾液(約40mL)保藏在4℃，直到需要。TLC(二氧化矽；EtOH/水(7/2)；Rf＝0.77；用茴香醛染料可視化)。實施例2UDP-GalNAc-6』-NH2的製備在0℃，將醋酸銨(15mg，0.194mmol)和NaBH3CN(1MTHF溶液；0.17mL，0.17mmol)加入從上面得到的UDP-GalNAc-6』-CHO溶液(2mL或約20mg)，加熱至室溫過夜。經G-10柱過濾反應物，收集水和產物。冷凍乾燥相應的級分，並冷凍保藏。TLC(二氧化矽；乙醇/水(7/2)；Rf＝0.72；用茚三酮試劑可視化)。實施例3UDP-GalNAc-6-NHCO(CH2)2-O-PEG-OMe(1KDa)的製備將氨基半乳糖基-1-磷酸-2-NHCO(CH2)2-O-PEG-OMe(1KDa)(58mg，0.045mmol)溶於DMF(6mL)和吡啶(1.2mL)中。然後加入UMP-morpholidate(60mg，0.15mmol)，在70℃攪拌得到的混合物48h。通過用氮在反應混合物中鼓泡，去除溶劑，通過反相色譜(C-18二氧化矽，10-80％的階梯梯度，甲醇/水)純化殘餘物。收集需要的級分，並在減壓下乾燥，產生50mg(70％)白色固體。TLC(二氧化矽，丙醇/H2O/NH4OH，(30/20/2)，Rf＝0.54)。MS(MALDI)觀察值，1485，1529，1618，1706.實施例4半胱氨酸-PEG2(2)的製備4.1化合物1的合成在氬下，將氫氧化鉀(84.2mg，1.5mmol，作為粉末)加入L-半胱氨酸(93.7mg，0.75mmol)在無水甲醇(20L)中的溶液。在室溫攪拌混合物30分鐘，然後，經2小時，分幾部分加入分子量20千道爾頓的mPEG-O-甲苯磺酸(Ts；1.0g，0.05mmol)。將混合物在室溫攪拌5天，通過旋轉蒸發進行濃縮。用水(30mL)稀釋殘餘物，並在室溫攪拌2小時，破壞所有多餘的20千道爾頓mPEG-O-甲苯磺酸。然後，用醋酸中和溶液，將pH調節至pH5.0，並裝載到反相色譜(C-18二氧化矽)柱上。用甲醇/水的梯度洗脫柱(在約70％甲醇洗脫產物)，通過蒸氣光散射監視產物洗脫，並收集相應的級分，用水(500mL)稀釋。對該溶液進行色譜(離子交換，XK50Q，BIG珠子，300ml，氫氧化物形式；水至水/醋酸-0.75N的梯度)，用醋酸將相應級分的pH降低至6.0。然後，在反相柱(C-18二氧化矽)上捕獲該溶液，並用如上所述的甲醇/水梯度洗脫。合併產物級分，濃縮，重新溶於水中，並冷凍乾燥，得到453mg(44％)白色固體(1)。該化合物的結構數據如下1H-NMR(500MHz；D2O)δ2.83(t，2H，O-C-CH2-S)，3.05(q，1H，S-CHH-CHN)，3.18(q，1H，(q，1H，S-CHH-CHN)，3.38(s，3H，CH3O)，3.7(t，OCH2CH2O)，3.95(q，1H，CHN)。通過SDSPAGE，證實了產物的純度。4.2化合物2(半胱氨酸-PEG2)的合成將三乙基胺(約0.5mL)逐滴加入化合物1(440mg，22μmol)溶解在無水CH2Cl2(30mL)中的溶液中，直到溶液呈鹼性。經1小時，在室溫，分幾部分加入20千道爾頓mPEG-O-對硝基苯基碳酸酯(660mg，33μmol)和N-羥基琥珀醯亞胺(3.6mg，30.8μmol)在CH2Cl2(20mL)中的溶液。在室溫攪拌反應混合物24小時。然後，通過旋轉蒸發去除溶劑，將殘餘物溶於水(100mL)，用1.0NNaOH將pH調至9.5。在室溫攪拌鹼性溶液2小時，然後用醋酸中和至pH7.0。然後，將溶液上樣至反相色譜(C-18二氧化矽)柱。用甲醇/水的梯度洗脫柱(在約70％甲醇洗脫產物)，通過蒸氣光散射監視產物洗脫，並收集相應的級分，用水(500mL)稀釋。對該溶液進行色譜(離子交換，XK50Q，BIG珠子，300ml，氫氧化物形式；水至水/醋酸-0.75N的梯度)，用醋酸將相應級分的pH降低至6.0。然後，在反相柱(C-18二氧化矽)上捕獲該溶液，並用如上所述的甲醇/水梯度洗脫。合併產物級分，濃縮，重新溶於水中，並冷凍乾燥，得到575mg(70％)白色固體(2)。該化合物的結構數據如下1H-NMR(500MHz；D2O)δ2.83(t，2H，O-C-CH2-S)，2.95(t，2H，O-C-CH2-S)，3.12(q，1H，S-CHH-CHN)，3.39(s，3HCH3O)，3.71(t，OCH2CH2O)。通過SDSPAGE，證實了產物的純度。實施例5UDP-GalNAc-6-NHCO(CH2)2-O-PEG-OMe(1KDa)的製備將氨基半乳糖基-1-磷酸-2-NHCO(CH2)2-O-PEG-OMe(1千道爾頓)(58mg，0.045mmol)溶於DMF(6mL)和吡啶(1.2mL)中。然後，加入UMP-morpholidate(60mg，0.15mmol)，並在70℃攪拌得到的混合物48小時。通過用氮在反應混合物中鼓泡，去除溶劑，通過反相色譜(C-18二氧化矽，10-80％的階梯梯度，甲醇/水)純化殘餘物。收集需要的級分，並在減壓下乾燥，產生50mg(70％)白色固體。TLC(二氧化矽，丙醇/H2O/NH4OH，(30/20/2)，Rf＝0.54)。MS(MALDI)觀測值，1485，1529，1618，1706.實施例6單罐中的GnT1和GalT1反應6.1單罐中的反應通過在32℃，在含有150mMNaCl，5mMUDP-GlcNAc，5mMUDP-Gal，5mMMnCl2，0.02％疊氮化鈉，30mU/mL純化的GlcNAc轉移酶-1和200mU/mL純化的半乳糖轉移酶-1的100mMTrisHClpH7.5或MESpH6.5中孵育EPO(1mg/mL)16h，進行單罐中的GlcNAc轉移酶-1和半乳糖轉移酶-1反應。6.2在Superdex75上純化EPO以5mL/min的流速，用含有150mMNaCl的100mMMES緩衝液pH6.5平衡Superdex75柱。將來自步驟6.1(上面的)的產物EPO裝載到柱上，並用平衡緩衝液洗脫。通過在280nm的吸光度和電導率，監視洗脫物。使用SDS-PAGE來確定哪個收集的峰級分含有EPO，並用於其它實驗中。6.3ST3Gal-III反應通過在32℃，在含有150mMNaCl，0.5mMCMP-N-乙醯基-神經氨酸-20千道爾頓-PEG，0.02％疊氮化鈉，和200mU/mL純化的ST3Gal-III的100mMTrisHClpH7.5或MESpH6.5中孵育1mg/mLEPO-Gal(來自上面的步驟6.2)16h，進行ST3GalIII反應。實施例7單罐中的GnT1，GalT1和ST3Gal-III(使用CMP-NAN-20KPEG)反應在100mMMES緩衝液pH6.5中，用30mU/mLGlcNAc轉移酶-1，200mU/mL半乳糖轉移酶-1和500mU/mLST3GalIII、糖核苷酸和CMP-N-乙醯基-神經氨酸-20KdPEG孵育EPO(1mg/mL)，並使用SDS-PAGE分析。與在兩步酶重構反應中得到的結果類似，在單罐三酶製備中觀察到了3個條帶的PEG化的EPO。實施例8雙觸角的PEG-EPO的生產8.1GlcNAc向rEPO的添加在32℃，用3mMUSP-GlcNAc，50mU/mgGlcNAc轉移酶-1和50mU/mgGlcNAc轉移酶-II孵育在0.1MTris，0.15MNaCl，5mMMnCl2和0.02％疊氮化鈉pH7.2中的於杆狀病毒(1mg/mL)中表達的重組的EPO24小時。8.2半乳糖的添加向步驟8.1(上面的)的GlcNAc-標記的肽中，加入3mMUDP-Gal和0.2U/mg半乳糖轉移酶-1。將混合物在32℃孵育36小時。通過Superdex75柱上的凝膠過濾色譜，在Tris-緩衝的鹽水中，分離半乳糖基化的產物。將純化的產物濃縮至1mg/mL。8.3唾液酸或唾液酸PEG的添加在32℃，用200mU/mgST3GalIII和0.5mMCMP-唾液酸或CMP-唾液酸-PEG(其中PEG具有分子量5千道爾頓，10千道爾頓或20千道爾頓)，在0.1MTris，0.1MNaClpH7.2中孵育來自步驟8.2(上面的)的半乳糖基化的產物(1mg/mL)24小時。實施例9通過CST-II進行N-連接的30KPEG化濃縮在CHO(中國倉鼠卵巢)細胞中表達的糖基化的EPO(5mg，0.166μmol，5ml)並用tris緩衝液(50mMTris，0.15MNaCl，0.001MCaCl2+0.005％NaN3)緩衝交換至5ml的終體積。然後，加入CMP-唾液酸-PEG(30千道爾頓，25mg，0.833μmol；30K道爾頓CMP-唾液酸-PEG的結構見圖3B)，0.25mL100mMMnCl20.25ml，和來自空腸彎曲桿菌空腸亞種的雙功能的唾液酸轉移酶CST-II(1.4U/mL，0.5ml，0.7U)。將得到的混合物在32℃搖動48小時。在反應結束時，通過超濾至1mL終體積，濃縮混合物，然後用25mMNaOAc+0.005％Tween-80(pH6.0)緩衝交換至2.5ml。使用25mMNaOAc+2MNaCl+0.005％Tween-80(pH6.0)作為洗脫劑，進行Q-SepharoseIEX色譜。收集峰2，並通過超濾濃縮至1.5ml，然後使用1XPBS(pH5.5+0.005％Tween80)作為洗脫劑，進行superdex-200純化(柱Superdex200，16/60GL，Amersham)。收集峰2，並濃縮至1.5ml。將得到的物質無菌過濾，並使用10mMNaOAc(0.75％NaCl，pH5.5)，配製至2.5mL終體積。蛋白濃度264μg/ml；得到了660μg蛋白(BCA測定)。實施例10下面的實施例說明了使用ST3GalIII製備O-連接的40千道爾頓PEG連接的EPO的方法。10.1去唾液酸化在該步驟中，將在中國倉鼠卵巢細胞(CHO細胞)中生長的EPO去唾液酸化。GlcNAc-Gal連接用作在下面的步驟10.2中轉移修飾的唾液酸PEG的受體。用Tris緩衝液(20mMTris，50mMNaCl，5mMCaCl2，0.02％NaN3，pH7.2)緩衝交換在CHO(中國倉鼠卵巢)細胞中表達的糖基化的EPO溶液10ml(10mg，0.33μmol)，得到10ml終體積。然後，將來自產脲節桿菌(ArthrobacterUreafaciens)的750mU2，3，6，8-神經氨酸酶(neuramidase)加入溶液。在32℃，搖動得到的混合物48小時。將該步驟的產物直接用於該方法的下一個步驟(見下面)。10.2O-連接的40KPEG化在該步驟中，使用O-唾液酸轉移酶將修飾的唾液酸-PEG基團轉移至來自上面的步驟10.1的去唾液酸化的EPO。將CMP-唾液酸-PEG(40千道爾頓，33mg，0.825μmol；40千道爾頓CMP-SA-PEG的結構見圖3A)，O-唾液酸轉移酶(1.4U/ml，300mU)，和0.25mL100mMMnCl2加入一半上面的混合物。在32℃，搖動該混合物48小時。48小時後，通過超濾(MWCO5K)，將反應混合物濃縮至2.8ml，然後用25mMNaOAc+0.001％Tween-80(pH6.0)緩衝交換至3ml終體積。在SP(5mL)上離子交換純化終產物3次(3次注射，每次1ml)。收集PEG化的EPO(峰2)，通過超濾濃縮至2ml終體積，用於SEC純化。在superdex200上的純化，能提供目標蛋白的解析EPO-GlcNAc-Gal-SA-PEG(40K)用於反應的最終步驟。10.3CHO-EPO-GalNAc-Gal-SA-PEG(40K)的完全末端唾液酸化在方法的該步驟中，將唾液酸添加到不攜帶修飾的唾液酸殘基的糖基結構的末端。通過超濾(MWCO5K)濃縮合併的PEG化的EPO(大約2mg，來自上面的步驟b中的反應)，然後用tris緩衝液(0.05MTris，0.15MNaCl，0.001MCaCl2+0.005％NaN3)緩衝交換至2mL終體積。然後，加入CMP-N-乙醯基神經氨酸(CMP-NANA；1.5mg，2.4μmol)，ST3GalIII(8.9U/mL，10μl，0.089U)和50μl100mMMnCl2。將得到的混合物在32℃搖動24小時，然後濃縮至1ml終體積。使用1XPBS(pH5.5+0.005％Tween80)作為洗脫劑，將該溶液直接進行Superdex200純化。收集峰1，並稀釋至10ml。蛋白濃度52.8ug/ml(BCA)。得到了共528μg蛋白。最終的肽產物的略圖顯示在圖4A中。實施例11在該實施例中，使用ELISA測定，對比了靜脈內施用的CHO-衍生的EPO(略圖顯示在圖5)和CHO-衍生的EPO的糖PEG化的變體的藥物動力學特徵。給大鼠單次30μg/kg靜脈內給藥後，通過ELISA，對比了2批非-PEG化的CHO-衍生的促紅細胞生成素、通過本發明的方法生產的30KPEG化的CHO-衍生的促紅細胞生成素(圖4B)和通過本發明的方法生產的40KPEG化的CHO-衍生的促紅細胞生成素(圖4A)的藥物動力學。11.1製備ELISA平板以100μL/孔，將針對人EPO的捕獲抗體分配進96-孔平板的所有孔中。用平板密封膠覆蓋平板，並在37℃孵育2小時。通過用含有0.2％Tween-20的Tris-緩衝的鹽水(TBST)洗滌2次，從平板去除捕獲抗體。第三次洗滌後，將3％牛奶封閉溶液(TBST+3％牛奶)加入平板，用平板密封膠覆蓋平板，並在4℃孵育過夜。在早晨，通過用TBST洗滌3次，去除封閉溶液。用大鼠血漿適當地稀釋大鼠血漿樣品和標準蛋白，並以100μL/孔分配到孔中。用平板密封膠覆蓋平板，並在4℃孵育過夜。次日早晨，使用標準蛋白，為測試其藥物動力學性質的每種EPO蛋白產生標準的線性回歸。進行標準蛋白的反相-HPLC分析，並通過計算與測試的蛋白相對應的峰下面積，檢測濃度。11.2製備和添加試樣稀釋每種試樣，並以100μL/孔，將稀釋的樣品分配進ELISA平板。然後，用平板密封膠覆蓋平板，並在4℃孵育過夜。11.3測量銪計數在早晨，去除大鼠血清樣品，並用TBST洗滌平板3次。將事先用銪標記並經凝膠過濾柱純化的檢測抗體即小鼠抗-人EPO應用到ELISA平板上。在100rpm攪拌下，在室溫孵育平板1小時。通過用TBST洗滌平板6次，去除檢測抗體。以200μL/孔，將增強溶液加入平板，在室溫孵育平板20分鐘。使用銪計數程序，用Wallac平板讀數器閱讀螢光。11.4結果11.4a產生標準的線性回歸使用來自每個平板的標準蛋白的銪計數，產生標準的線性回歸曲線和方程。使用該方程，將銪計數轉化成每個樣品孔相應的EPO量。11.4b藥物動力學結果結果如圖6所示。非-PEG化的EPO的檢測極限是大約0.4ng/mL，30千道爾頓和40千道爾頓PEG化的EPO的檢測極限是大約0.8ng/mL。30千道爾頓PEG化的CHO-衍生的EPO和40千道爾頓PEG化的CHO-衍生的EPO與它們的非-PEG化的對應物相比，清楚地表現出非常優越的靜脈內清除參數。如從該圖可以看出的，各種EPO同種型的次序為40千道爾頓PEG化的CHO-衍生的EPO～30千道爾頓PEG化的CHO-衍生的EPO非-PEG化的對應物。實施例12在該實施例中，使用ELISA測定，檢測了皮下施用的CHO-衍生的促紅細胞生成素(EPO)、高度糖基化的非-糖PEG化的EPO、昆蟲細胞生長的糖PEG化的EPO和CHO細胞衍生的糖PEG化的EPO的藥物動力學特徵。在給大鼠施用單次的10μg/kg皮下劑量後，通過ELISA，對比了非-糖PEG化的CHO-衍生的EPO、非-PEG化的高度糖基化的CHO衍生的EPO、糖PEG化的昆蟲細胞衍生的EPO、10KN-連接的PEG化的昆蟲細胞-衍生的促紅細胞生成素(略圖見圖7)，和40千道爾頓O-連接的PEG化的CHO-衍生的促紅細胞生成素(見圖4A)的藥物動力學。製備了ELISA平板，並如實施例10所述封閉。還製備了標準蛋白，並如上所述測定銪計數。12.1製備和添加大鼠樣品在皮下(S.C.)注射後，與等量的靜脈內注射相比，循環中的EPO的量減少。在注射後30分鐘至48小時，一般能測量到S.C.注射的EPO蛋白的血漿濃度。12.2藥物動力學結果這些實驗的結果如圖8所示。圖8顯示了對於每個EPO變體組，在注射時間＝0小時後不同的時間點，大鼠血清樣品中的以ng/mL計的EPO的平均量和標準偏差。非-PEG化的EPO和PEG化的EPO的檢測極限是大約0.3ng/mL。在昆蟲細胞中生長的10KPEG化的EPO和40千道爾頓PEG化的CHO-EPO的情況下，吸收似乎是逐漸的，建立了這樣的情形，其中許多這樣的EPO變體保持被吸收遠遠超過峰血清水平(Cmax)。在昆蟲細胞中生長的10KPEG化的EPO變體在注射後24-36小時的時間範圍達到Cmax。但是，40千道爾頓PEG化的CHO-EPO變體在注射後40-60小時達到Cmax。另外，在注射當前注射劑量後96小時，存在可觀水平的PEG化的變體。血清排序t1/2如下40千道爾頓PEG化的CHO-EPO在昆蟲細胞中生長的10KPEG化的EPO變體高度糖基化的CHO-EPO非-PEG化的CHO-EPO.實施例13將2種非-PEG化的EPO變體(A和B)與兩種糖PEG化的變體(30千道爾頓和40千道爾頓PEG)和高度糖基化的PEG在刺激培養的攜帶EPO受體的TF1細胞增殖方面的相對活性進行了對比。糖PEG化的EPO肽在該測定中的活性類似於高度糖基化的EPO變體。實施例14各種濃度的未PEG化的EPO(A和B)和糖PEG化的30千道爾頓和40千道爾頓PEG變體對同位素-標記的EPO向重組的嵌合EPO受體的結合的抑制。就受體親合力(Ki)而言，未PEG化的EPO和糖PEG化的變體是類似的。應當理解，本文所述的實施例和實施方案僅僅用於說明性的目的，本領域的技術人員參考它們，能提出各種改進或變化，所述改進和變化也包括在該應用的精神和範圍以及所附權利要求書的範圍內。在本文中引用的所有出版物、專利和專利申請，都在這裡為所有目的整體引作參考。權利要求1.促紅細胞生成素肽，其包含基團其中D是選自-OH和R1-L-HN-的成員；G是選自R1-L-和-C(O)(C1-C6)烷基的成員；R1是包含選自含有直鏈或分支的聚乙二醇殘基的基團的成員的基團；和L是連接物，它是選自鍵、取代的或未取代的烷基和取代的或未取代的雜烷基的成員，從而當D是OH時，G是R1-L-，且當G是-C(O)(C1-C6)烷基時，D是R1-L-NH-。2.根據權利要求1的肽，其中L-R1具有式其中a是0-20的整數。3.根據權利要求1的肽，其中R1具有選自下述的結構其中e和f是獨立地選自1-2500的整數；且q是0-20的整數。4.根據權利要求1的肽，其中R1具有選自下述的結構其中e，f和f』是獨立地選自1-2500的整數；且q和q』是獨立地選自1-20的整數。5.根據權利要求1的肽，其中R1具有選自下述的結構其中e，f和f』是獨立地選自1-2500的整數；且q，q』和q」是獨立地選自1-20的整數。6.根據權利要求1的肽其中R1具有選自下述的結構其中e和f是獨立地選自1-2500的整數。7.根據權利要求1的肽，其中所述的基團具有式8.根據權利要求1的肽，其中所述的基團具有式9.根據權利要求1的肽，其中所述的基團具有式其中AA是所述肽的胺基酸殘基。10.根據權利要求9的肽，其中所述的胺基酸殘基是選自絲氨酸或蘇氨酸的成員。11.根據權利要求10的肽，其中所述的肽具有SEQ.ID.NO1的胺基酸序列。12.根據權利要求11的肽，其中所述的胺基酸殘基是在SEQ.ID.NO1的位置126處的絲氨酸。13.根據權利要求1的肽，其中所述的肽包含至少一個根據下式的所述基團其中AA是所述肽的胺基酸殘基，且t是等於0或1的整數。14.根據權利要求13的肽，其中所述的胺基酸殘基是天冬醯胺殘基。15.根據權利要求14的肽，其中所述的肽具有SEQIDNO1的胺基酸序列，且其中所述的胺基酸殘基是天冬醯胺殘基，其是選自N24，N38，N83，和其組合的成員。16.根據權利要求1的肽，其中所述的肽包含至少一個根據下式的所述基團其中AA是所述肽的胺基酸殘基，且t是等於0或1的整數。17.根據權利要求16的肽，其中所述的胺基酸殘基是精氨酸殘基。18.根據權利要求17的肽，其中所述的肽具有SEQIDNO1的胺基酸序列，且其中所述的胺基酸殘基是天冬醯胺殘基，其是選自N24，N38，N83，和其組合的成員。19.權利要求1的肽，其中所述的肽包含至少一個根據下式的所述基團其中AA是所述肽的胺基酸殘基，且t是等於0或1的整數。20.根據權利要求1的肽，其中所述的肽包含至少一個根據下式的所述基團其中AA是所述肽的胺基酸殘基，且t是等於0或1的整數。21.根據權利要求20的肽，其中所述的胺基酸殘基是天冬醯胺殘基。22.根據權利要求21的肽，其中所述的肽具有SEQIDNO1的胺基酸序列，且其中所述的胺基酸殘基是天冬醯胺殘基，其是選自N24，N38，N83，和其組合的成員。23.根據權利要求1的肽，其中所述的肽是生物活性的促紅細胞生成素肽。24.根據權利要求23的肽，其中所述的肽具有促紅細胞生成活性。25.根據權利要求24的肽，其中所述的肽基本上不具有促紅細胞生成活性。26.根據權利要求25的肽，其中所述的肽是組織保護性的。27.製備PEG-化的包含下述基團的促紅細胞生成素的方法其中R1是包含直鏈或分支的聚乙二醇殘基的基團；且L是連接物，它是選自取代的或未取代的烷基和取代的或未取代的雜烷基的成員，所述的方法包含(a)在適於轉移的條件下，使包含下述糖基的底物促紅細胞生成素肽接觸具有下式的PEG-唾液酸供體基團和能將所述的PEG-唾液酸轉移到所述糖基的Ga1上的酶。28.權利要求27的方法，還包含，在步驟(a)之前(b)在合適的宿主中表達所述的底物促紅細胞生成素肽。29.權利要求28的方法，其中所述的宿主選自昆蟲細胞和哺乳動物細胞。30.權利要求29的方法，其中所述的昆蟲細胞是草地夜蛾(Spodopterafrugiperda)細胞系。31.治療有此需要的對象中的病症的方法，所述的病症的特徵在於所述對象中受損的紅細胞生產，所述的方法包含給對象施用能有效地改善該對象中的所述病症的量的根據權利要求1的肽的步驟。32.增強哺乳動物中的紅細胞生產的方法，所述的方法包含給所述哺乳動物施用根據權利要求1的肽。33.治療有此需要的對象中的組織損傷的方法，所述損傷的特徵在於，由局部缺血、外傷、炎症或接觸毒性物質導致的損害，所述的方法包含給對象施用能有效地改善與該對象中的組織損傷相關的損害的量的根據權利要求1的促紅細胞生成素肽的步驟。34.藥物製劑，其包含根據權利要求1的促紅細胞生成素肽和藥學上可接受的載體。全文摘要本發明提供了促紅細胞生成素和PEG基團之間的綴合物。該綴合物通過置於肽和修飾基團之間且共價地結合於其上的完整的糖基連接基團相連接。通過糖基轉移酶的作用，從糖基化的肽形成綴合物。糖基轉移酶能將修飾的糖基團連接到肽的糖基殘基上。還提供了製備該綴合物的方法，用該綴合物治療各種疾病狀況的方法，和包含該綴合物的藥物製劑。文檔編號C07K7/00GK1897962SQ200480038545公開日2007年1月17日申請日期2004年11月24日優先權日2003年11月24日發明者S·德弗裡斯,R·J·拜爾,D·A·佐夫申請人:尼奧斯技術有限公司