檢測小麥中有無成穗抑制基因的方法及其專用引物的製作方法

2023-05-17 04:36:11 1

專利名稱：：檢測小麥中有無成穗抑制基因的方法及其專用引物的製作方法
技術領域：
：本發明涉及一種檢測小麥中有無成穗抑制基因的方法及其專用引物。
背景技術：
：小麥分櫱的成穗歷來是小麥育種和生產中重要而關鍵的問題，探討穗數形成機理、研究成穗數調控措施對小麥育種和生產具有十分重要的指導意義。長期以來人們對成穗機理的研究從栽培措施(Milton，LuizdeAlmeida，LuisSangoi，AldoMerottoJr.Tilleremissionanddrymassaccumulationofwheatcultivarsunderstress.ScientiaAgricola，2004，61(3)266-270)、環境因素(高爾明，趙全志，劉華山，等.砂姜黑土小麥分櫱成穗及其調控研究.土壤通報，2001，32(3)140-142.)、營養競爭(徐得平，王世之.小麥幼苗階段內同化物的運輸和分配.作物學報，1987，13(3)177-185)、內源激素的調控(馬興林，梁振興.冬小麥分櫱衰亡過程中內源激素作用的研究.作物學報，1997，23(2)200-207)等不同方面做了大量的工作，還從小麥主莖生育速度對分櫱成穗的影響(李建民.小麥主莖生育速度對分櫱形成及其成穗的影響[J].中國農業大學學報.1997，2(3)31-35.)及其它因素的變化與成穗的相關(米國華，梁振興，梅楠.冬小麥縮短莖的維管束系統與葉櫱同伸關係[J].作物學報，1992，(6)401-405)等方面也做了一定的研究。品種的遺傳特性決定著成穗數的多少，決定著小麥高產的產量結構類型，不同類型的小麥品種其分櫱成穗率不同，最終的成穗數也不同(吳兆蘇.小麥育種學.北京農業出版社，1990，201-209)。Atsmon和Jacobs(1977)發現了一個分櫱受抑制的以色列獨稈小麥突變-492(Atsmon，D.，Jacobs，E.Anewlybred『Gigas』fromofbreadwheat(TriticumaestivumL.)morphologicalfeaturesandthermophotoperiodicreponses[J].CropScience，1977，1731-35)，Christoper對此由Us1、Us2兩對隱性基因控制的獨稈性狀用單體分析定位於4A和5B上(Christopher，D.A.，Atsmon，D.，Feldman，M.Modeofinheritanceandchromosomalallocationofstuntinggenesincommonwheat[J].CropScience，1985，25147-151.)，Atsmon對492株系進行了研究，表明高溫和長日照阻礙分櫱，在極端條件下對主莖成穗也有影響(Atsmon，D.，Bush，M.G.，Evans，L.T.Stuntingin『Gigas』wheatasinfluencedbytemperatureanddaylength.AustralianJournalPlantphysiology，1986，13381-389)，Richards與Spielmeyer認為這個材料的抑制分櫱受一對隱性基因(tin)控制，並對tin進行了定位與加密(Richards，R.A.Atillerinhibitiongeneinwheatanditseffectonplantgrowth.AustralianJournalofAgriculturalResearch，1988，39749-757；Spielmeyer，W.，Richards，R.A.Comparativemappingofwheatchromosome1ASwhichcontainsthetillerinhibitiongene(tin)withricechromosome5S.TheoreticalandAppliedGenetics，2004，1091303-1310)，Duggan等進一步研究了tin基因的利用價值(Duggan，B.L.，Richards，R.A.，vanHerwaarden，A.F.，etc.Agronomicevaluationofatillerinhibitiongene(tin)inwheat.I.Effectonyield，yieldcomponents，andproteincontent.AustralianJournalofAgriculturalResearch，2005，56169-178；Duggan，B.L.，Richards，R.A.，vanHerwaarden，A.F.，etc.Agronomicevaluationofatillerinhibitiongene(tin)inwheat.II.Growthandpartitioningofassimilate.AustralianJournalofAgriculturalResearch，2005，56179-186)，但對控制小麥成穗相關基因的研究尚未見報導。隨著分子生物學技術的飛速發展，DNA分子標記技術以其標記多態性高、檢測不受季節限制、不受環境條件的影響、顯性或共顯性遺傳等優點，使其成為研究基因的分子標記和基因定位最有效的方法之一。微衛星(microsatellite)又稱SSR(simplesequencerepeat)，分布於小麥的整個基因組中，且存在較大的遺傳變異，在小麥中能夠檢測到很高的多態性。與RFLP標記對比，大多數小麥SSR標記都是基因專化性的，只在小麥A、B、D基因組含有一個SSR的特定位點擴增，由於利用方便和信息量高，SSR已代替RFLP進行小麥的遺傳作圖。目前有一千多個SSR標記已作圖(http//wheat.pw.usda.gov/ggpages/DEM/ggtabledefs.html)，為小麥目的基因的準確鑑定和定位提供了有力的工具。近年來，EST-SSR作為新型分子標記技術得以迅速發展起來，EST和cDNA中含有SSR，稱之為EST-SSR(或cSSR)，與傳統的SSR相比，它反映了基因的編碼部分，可以直接獲得基因表達的信息，為功能基因提供「絕對」的標記。目前，已有500多對EST-SSR標記被定位在小麥染色體上(http//wheat.pw.usda.gov/ITMI/EST-SSR/LaRota/)，為基因精細定位與分子輔助選擇標記的篩選提供了更為有力的工具。
發明內容本發明的目的是提供一種檢測小麥中有無成穗抑制基因的方法及其專用引物。本發明所提供的檢測小麥中有無成穗抑制基因的引物，是由序列表中序列1和序列2組成的一對寡核苷酸。由序列表中序列1和序列2組成的一對寡核苷酸的名稱為Ksum104。本發明的另一個目的是檢測小麥中有無成穗抑制基因的方法，是以待測小麥的基因組DNA為模板，用由序列表中序列1和序列2的核苷酸序列組成的一對引物進行PCR擴增，如果得到的PCR擴增產物中有大小為380-390bp的條帶，則所述待測小麥為具有成穗抑制基因的小麥。可通過濃度為6％的聚丙烯醯胺凝膠電泳檢測擴增產物中是否有380-390bp條帶。所述方法中，如果得到的PCR擴增產物中有大小為388bp的條帶，則所述待測小麥為具有成穗抑制基因的小麥。擴增反應程序先94℃變性4min；再94℃1min、60℃退火50sec、72℃1min，循環35次；最後72℃延伸10min。作為影響小麥單株產量的重要因素，小麥分櫱的成穗問題，長期以來倍受小麥育種者的關注。有關小麥成穗方面的研究，儘管人們從成穗機理的許多方面進行了大量的工作，但是對品種自身遺傳特性，尤其從基因對成穗控制方面，至今未見報導。可能是長期以來缺乏成穗受環境、生理及栽培條件影響較小的特殊材料所致。本發明利用小麥-冰草衍生後代中出現的受外部條件影響很小的一個分櫱正常而成穗顯著受抑制的特殊材料，對成穗的遺傳機理進行研究，利用成穗受抑制小麥3558-2與京4841的雜交後代F1表現及F2分離群體確定抑制成穗的性狀受一對隱性基因控制，並用小麥SSR標記把SiFC定位在1A染色體短臂的近端部。本發明的分子標記和成穗顯著受抑制基因的定位，對小麥單株成穗機理研究和小麥育種具有重要意義。也在作物種質資源遺傳背景的揭示、遺傳種質資源的有效利用及作物分子育種上具有重要的理論和實踐意義。本發明的檢測小麥中有無成穗抑制基因的方法可用於育種的早代選擇，大大縮短育種周期，加快育種速度，降低育種成本，具有操作簡單，成本低廉，周期短的優點，適於推廣應用，為小麥育種提供了技術支持，為選育高產小麥種質提供了一種快捷的選擇方法。圖1為成穗受抑制材料的系譜圖2為成穗受抑制材料3558-2的大田表現圖3為Ksum104在雙親、F1與F2的兩個池間的擴增結果圖4為(3558-2×京4841)F2群體部分單株的擴增結果具體實施例方式下述實施例中的實驗方法，如無特別說明，均為常規方法。下述實施例中小麥材料均購自中國農業科學院作物科學研究所種質資源研究中心。實施例1、用專用引物Ksum104檢測小麥中有無成穗抑制基因的可行性驗證1、檢測小麥中有無成穗抑制基因的專用引物Ksum104及其分子標記的獲得(1)成穗受抑制材料獲得及其農藝特性由普通小麥Fukuho(TriticumaestivumL.)—冰草Z559(AgropyroncristatumL.Gaertn.基因組為PPPP)衍生後代中大穗多花材料4185與有臘雜交，F4出現一株分櫱正常而成穗顯著受抑制的單株(4773-3)，經過三代連續篩選，獲得六個穩定的成穗受抑制株系3558-1、3558-2、3559-3、3560-1、3561-1、3561-3，其株高73-80cm，冬櫱3-8個，春櫱6-18個，單株成穗0-2個，多為主莖成穗，分櫱不成穗。其中，3558-2的大田表現如圖2所示。(2)獲得標記的方法首先以成穗受抑制小麥材料3558-2為母本，正常成穗小麥材料京4841為父本進行雜交，構建F2分離群體。其次根據Michelmore等提出分離群體分組分析法(BulkedSegregantanalysis，BSA)，在F2中隨機選取15個成穗受抑制單株(成穗性狀與成穗受抑制小麥材料3558-2相同)的基因組DNA等量混合，構建形成成穗受抑制基因池(SpikeInhibitionPool，Sip)；15個正常成穗單株(成穗性狀與京4841相同)的基因組DNA等量混合，構建形成正常成穗基因池(SpikenormalPool，Snp)，進行微衛星擴增及電泳分析篩選分子標記。再利用F2分離群體進行性狀的遺傳分析和標記的驗證。最後用MapmakerEXP3.0b計算分子標記與成穗受抑制基因基因之間的遺傳距離。其中，微衛星擴增及電泳分析方法如下所用引物根據網站http//wheat.pw.usda.gov/ggpages/DEM/ggtabledefs.html與http//wheat.pw.usda.gov/ITMI/EST-SSR/LaRota/發布的SSR與EST-SSR引物序列，由上海生工生物技術有限公司(ShanghaiSangonCo.Ltd.，上海)合成。乾粉狀的引物用超純水溶解到20μmol/L，使用前以1×TE稀釋到2μmol/L。反應在MJ-200上擴增，SSR擴增反應體系為20μl，其中10×PCR緩衝液2.0μl，dNTP0.2mmol/L，Mg2+2.5mmol/L，SSR引物0.25μmol/L，Taq酶1.25U，模板DNA70ng。用PTC-200擴增儀進行擴增反應。擴增反應程序先94℃變性4min；再94℃1min、(60、55或50℃)退火50sec、72℃1min，循環35次；最後72℃延伸10min。6％聚丙烯醯胺凝膠電泳，變性膠電泳參數為恆定功率80W，銀染顯色。結果如圖3所示，Ksum104在雙親、F1與F2的兩個池間的擴增產物具有多態性。圖3中，M為pUCMixMarker(上海生工)；P1為成穗受抑制小麥材料3558-2；P2為正常親本京4841；Sip為成穗受抑制基因池；Snp為正常成穗基因池。箭頭所指為與成穗受抑制連鎖的標記。多態性條帶大小為380-390bp。測序結果表明，該條帶的大小為388bp。篩選出的SSR標記所用引物Ksum104的染色體位點、引物序列和退火溫度如表1所示。表1.篩選出的SSR標記所用引物的染色體位點、引物序列和退火溫度2、用專用引物Ksum104檢測小麥中有無成穗抑制基因的可行性驗證(1)F2群體的遺傳分析和標記驗證用成穗受抑制小麥材料3558-2作母本，京4841作父本進行雜交，兩個雜交組合F1單株都能正常成穗，成穗性狀與京4841相同，沒有出現成穗受抑制的單株，推測抑制成穗的性狀受隱性基因控制。對F2進行統計分析發現，F2單株成穗呈規律性的分離，其正常成穗株數(成穗性狀與京4841相同)與成穗顯著受抑制株數(成穗性狀與成穗受抑制小麥材料3558-2相同)的比例為3∶1，xc2檢驗的吻合性好(表2)，說明該抑制成穗的性狀受1對隱性主基因控制，定名為SiFc。對F2群體及其在SSR分子標記的分離比例進行xc2檢驗的吻合性很好(表2)，說明Ksum104引物所擴增的成穗受抑制親本3558-2的標記帶可以作為定位成穗受抑制的分子標記。表2F2群體及其在SSR分子標記上的分離與xc2測驗(2)分子標記與成穗受抑制基因之間的遺傳距離與基因定位根據軟體MapmakerEXP3.0b的分析與計算，引物Ksum104所擴增的分子標記與成穗受抑制基因SiFc連鎖，它們之間的遺傳距離為4.5cM。(3)對F2群體部分單株進行微衛星擴增及電泳分析按照步驟1的方法用Ksum104對以成穗受抑制小麥材料3558-2為母本，正常成穗小麥材料京4841為父本進行雜交得到的F2群體部分單株(187株F2成穗受抑單株和59株F2正常單株)的基因組DNA進行微衛星擴增及電泳分析，結果如圖4所示，表明在F2成穗受抑單株(成穗性狀與成穗受抑制小麥材料3558-2相同)和母本成穗受抑制小麥材料3558-2中均擴增到388bp的條帶，父本京4841和部分F2正常單株(成穗性狀與京4841相同)中未擴增到388bp的條帶，15株F2正常單株(成穗性狀與京4841相同)中也擴增到388bp的條帶，其中13株為雜合基因帶型，2株為交換株帶型。圖4中，M為pUCMixMarker(上海生工)；P1為成穗受抑制小麥材料3558-2；P2為正常親本京4841；#，為發生交換的植株；箭頭示Ksum104引物所擴增的388bp的條帶。對該13株可擴增到388bp條帶的雜合基因帶型的F2正常單株分別自交，F3分離為3/4的正常單株(成穗性狀與京4841相同)(300株，這些植株的編號為F3N1-300)和1/4的成穗受抑單株(成穗性狀與成穗受抑制小麥材料3558-2相同)(100株，這些植株的編號為F3I1-100)。用Ksum104分別對300株F3正常單株F3N1-300和F3成穗受抑單株F3I1-100的基因組DNA進行微衛星擴增及電泳分析，結果表明這100株成穗受抑單株F3I1-100均擴增到388bp的條帶，300株F3正常單株F3N1-300中有200株擴增到388bp的條帶，其餘100株不能擴增得到388bp的條帶。說明上述擴增到388bp條帶的13株F2正常單株(成穗性狀與京4841相同)中的確含有成穗抑制基因。說明本發明的檢測小麥中有無成穗抑制基因的方法是正確的。也說明引物Ksum104所擴增的分子標記與該成穗受抑制基因SiFc連鎖。序列表1602210121121212DNA213人工序列2202234001gcaaatccccgagcaatccc20210221121212DNA213人工序列2202234002tagacaccaactccgatgcc20權利要求1.一種檢測小麥中有無成穗抑制基因的引物，是由序列表中序列1和序列2組成的一對寡核苷酸。2.一種檢測小麥中有無成穗抑制基因的方法，是以待測小麥的基因組DNA為模板，用由序列表中序列1和序列2的核苷酸序列組成的一對引物進行PCR擴增，如果得到的PCR擴增產物中有大小為380-390bp的條帶，則所述待測小麥為具有成穗抑制基因的小麥。3.根據權利要求2所述的方法，其特徵在於所述方法中，如果得到的PCR擴增產物中有大小為388bp的條帶，則所述待測小麥為具有成穗抑制基因的小麥。4.根據權利要求2所述的方法，其特徵在於所述方法中，通過濃度為6％的聚丙烯醯胺凝膠電泳檢測擴增產物中有大小為380-390bp的條帶。5.根據權利要求2、3或4所述的方法，其特徵在於所述方法中，PCR擴增反應程序為先94℃變性4min；再94℃1min、60℃退火50sec、72℃1min，循環35次；最後72℃延伸10min。全文摘要本發明公開了一種檢測小麥中有無成穗抑制基因的方法及其專用引物。該檢測小麥中有無成穗抑制基因的引物，是由序列表中序列1和序列2組成的一對寡核苷酸。該檢測小麥中有無成穗抑制基因的方法，是以待測小麥的基因組DNA為模板，用由序列表中序列1和序列2的核苷酸序列組成的一對引物進行PCR擴增，如果得到的PCR擴增產物中有大小為380－390bp的條帶，則所述待測小麥為具有成穗抑制基因的小麥。本發明的檢測小麥中有無成穗抑制基因的方法可用於育種的早代選擇，大大縮短育種周期，加快育種速度，降低育種成本，具有操作簡單，成本低廉，周期短的優點，適於推廣應用，為小麥育種提供了技術支持，為選育高產小麥種質提供了一種快捷的選擇方法。文檔編號C12N15/11GK1932035SQ200610113149公開日2007年3月21日申請日期2006年9月15日優先權日2006年9月15日發明者李立會,武軍,劉偉華,李洪傑,高愛農,楊欣明,李秀全申請人:中國農業科學院作物科學研究所