表達酶原形式的人蛋白c的載體和化合物的製作方法

2023-05-17 08:05:56

專利名稱：表達酶原形式的人蛋白c的載體和化合物的製作方法
技術領域：
本發明涉及編碼酶原形式人蛋白C的新DNA化合物和重組DNA克隆載體。這類酶原可以在體內僅由凝血酶以臨床意義上的速度活化，並且比天然蛋白C酶原更易受凝血酶/凝血調變蛋白(thrombomodulin)的活化。所述表達載體提供了一種在重組寄主細胞中表達這類人蛋白C酶原的簡單而有效的手段。天然人蛋白C酶原的活化需要用高水平的凝血酶、或凝血酶和凝血調變蛋白、或其它昂貴的酶處理。本發明提供一種產生酶原形式人蛋白C的方法，這種酶原形式的人蛋白C是凝血酶更好的底物，它們在低水平的凝血酶或凝血酶/凝血調變蛋白或其它酶的存在下便可活化。最重要的是，本發明的酶原形式人蛋白C即使在生理Ca2+存在下也可被凝血酶活化，所述生理Ca2+是凝血酶活化天然蛋白C酶原的抑制劑。所述新酶原形式的人蛋白C在活化肽區域的胺基酸殘基順序不同於本領域已知的那些，所述活化肽從酶原形式中除去便產生活化的人蛋白C。這些新型酶原形式的人蛋白C在治療血液失調(包括血凝固)方面顯示了特別的優越性。
蛋白C是一種依賴於維生素K的血漿蛋白，在控制止血作用方面具有重大的生理作用。蛋白C作為一個無活性分子被合成，此處稱之為「初生蛋白C」。初生蛋白C經複雜的處理，產生很多不同的無活性分子。如同下面所作出的更加充分的敘述。此處將蛋白C的無活性分泌形式稱作為「酶原蛋白C」。在血液中，通過涉及凝血調變蛋白-凝血酶複合物的反應，發生蛋白C的活化作用。經活化的蛋白C及其輔助因子蛋白S一起，是一種具有重要生理學意義的抗凝劑。活化的蛋白C能防止血管內血栓症，並控制原有血塊的擴大。活化形式蛋白C的作用機理以及無活性酶原活化成活性蛋白酶的機理在近些年內已被闡明(文獻綜述見J.E.Gardiner and J.H.Griffin，Progress in Hematology，Vol.ⅩⅢ，PP.265-278，ed.Elmer B.Brown，Grune and Stratton，Inc，1983和Esmon，N.L.，1989，Prog.Hemost.Thromb.9∶29-55)。
蛋白C的活化作用涉及凝血酶、凝血鏈鎖反應最終的絲氨酸蛋白酶、以及稱之為凝血調變蛋白的與內皮細胞膜相聯的糖蛋白。凝血調變蛋白與凝血酶形成一個牢固緊密的化學計量複合物。當凝血調變蛋白與凝血酶複合時，顯著地改變了凝血酶的功能性質。在正常情況下，凝血酶將纖維蛋白原凝成塊，使血小板活化，並將凝血因子Ⅴ和Ⅷ轉變成它們的活化形式Ⅴa和Ⅷa。最後，凝血酶使蛋白C活化，但是很慢，效能不高，而且該活化作用進一步受到生理Ca2+的抑制。相反，與凝血調變蛋白複合的凝血酶並不使纖維蛋白原凝成塊，不使血小板活化，或不將凝血因子Ⅴ和Ⅷ轉變成它們的活化相應物Ⅴa和Ⅷa，但是在生理Ca2+的存在下卻成為非常有效的蛋白C酶原的活化劑。通過凝血調變蛋白-凝血酶活化蛋白C酶原的速率常數比單獨用凝血酶時高1000倍以上。
為了了解活化蛋白C如何下調血液凝固，下面對凝固酶系統進行簡略的敘述。最好把凝固系統作為包括各酶原依次連續活化成為各種活性的絲氨酸蛋白酶的鏈鎖反應來考察。該鏈鎖反應最終產生凝血酶，它經過有限的蛋白分解，將血漿纖維蛋白原轉變成不溶性的凝膠纖維蛋白。在凝固鏈鎖反應中，兩件關鍵的事情是一、通過凝血因子Ⅸa使凝血因子Ⅹ轉變成Ⅹa;二、通過凝血因子Ⅹa，使凝血酶原轉變成凝血酶。這兩種反應在細胞表面發生，最顯著地在血小板表面，同時兩種反應均需輔助因子。主要的輔助因子(因子Ⅴ和Ⅷ)在系統中作為相應的無活性前體流通，但當開頭幾個凝血酶分子形成時，凝血酶便返回來通過有限的蛋白分解使輔助因子活化。被活化的輔助因子Ⅴa和Ⅷa加速了凝血酶原轉變成凝血酶，也加速了因子Ⅹ轉變成因子Ⅹa，速率大約提高5個數量級。活化蛋白C優先作用於蛋白的降解和水解，並不可逆地破壞凝血輔助因子Ⅴa和Ⅷa(無活性凝血因子Ⅴ和Ⅷ的活化形式)。反之，凝血因子Ⅴ和Ⅷ在體內對活化的蛋白C來說是非常差的底物。
活化蛋白C的一個重要輔助因子是蛋白S，它是另一種依賴維生素K的血漿蛋白。蛋白S使活化蛋白C介導的因子Ⅴa和Ⅷa的水解增加25倍。
蛋白C被公認為一種有價值的治療劑(例如1988年10月4日公開的見Bang等人的美國專利No.4，775，625，此處作為參考文獻)。經活化的蛋白C是一種比常用的抗凝劑(如肝素及口服羥基香豆精抗凝劑)具有更大治療指數的新抗血栓劑，在凝血酶再生之前，酶原蛋白C和活化蛋白C兩者均無效，因為將凝血因子Ⅴ和Ⅷ轉變成Ⅴa和Ⅷa需要凝血酶;這兩種輔助因子的活化形式對活化蛋白C來說是較好的底物。活化酶原蛋白C時也需要凝血酶，因為沒有凝血調變蛋白-凝血酶複合物，蛋白C酶原是不能有效地轉變成其活性相應物的。
活化蛋白C是一種符合要求的抗凝劑，因為活化蛋白C是通過使輔助因子Ⅴa和Ⅷa失活而起作用的。因為因子Ⅴ及Ⅷ轉變成它們的活化的相應物Ⅴa和Ⅷa時需要凝血酶，蛋白C僅僅在凝血酶再生之後才起到抗凝劑作用。與活化蛋白C相反，常規的抗凝劑只要給予病人在整個循環中維持恆定的抗凝狀態，因此，大大增加了並發出血症的危險，這種危險性超過了蛋白C或活化蛋白C所引起的危險性。所以，活化蛋白C是一種符合要求的、在臨床上廣泛作為肝素和羥基香豆精的代用品使用的抗凝劑。
在某些疾病狀態中(例如遺傳性的蛋白C缺乏)，蛋白C酶原具有重大治療意義。在先天性純合(homozgous)蛋白C缺乏情況下，患者在童年早期因暴發性紫癜而死亡，這是一種常見的彌散性血管內凝血異常致死形式。在雜合(heterozygous)蛋白C缺乏情況下，患者忍受劇烈的周期性的血栓栓塞發作。臨床上充分證實設計用來治療血友病B或凝血因子Ⅸ缺乏的血漿蛋白濃縮物(含蛋白C作為雜質)，對防治雜合蛋白C缺乏的血管內凝塊有作用。在血栓狀態下(如彌散性血管內凝固)以及在易發生血栓病的狀態下(如嚴重創傷，大外科手術和癌症)，也已注意到蛋白C的濃度出現反常的偏低。
為了能對本發明蛋白C活化作用的理解，下面給出初生人蛋白C的編碼順序及相應的胺基酸殘基順序。該胺基酸殘基順序及其相關部分也表示出「天然蛋白C」的特性。
其中A為脫氧腺苷酸，G為脫氧鳥苷酸、C為脫氧胞苷酸，T為胸苷酸，ALA為丙氨酸，ARG為精氨酸，ASN為天冬醯胺，ASP為天冬氨酸，-COOH為羧基端，CYS為半胱氨酸，GLN為穀氨醯胺，GLU為穀氨酸，GLY為甘氨酸，HIS為組氨酸，H N-為氨基端，ILE為異亮氨酸，LEU為亮氨酸，LYS為賴氨酸，MET為甲硫氨酸，PHE為苯丙氨酸，PRO為脯氨酸，SER為絲氨酸，THR為蘇氨酸，TRP為色氨酸，TYR為酪氨酸及VAL為纈氨酸。
上面給出的DNA順序得自由編碼人蛋白C的人肝mRNA製備的cDNA克隆。本領域專業人員會意識到由於遺傳密碼的簡併性會使人們構建出許多編碼同一種胺基酸殘基順序的不同DNA順序，因此上面給出的初生人蛋白C的cDNA順序僅僅是許多可能的人蛋白C的編碼順序中的一種。在構建cDNA克隆時，將5′poly G順序、3′poly C順序以及5′和3′Pst I限制性酶識別順序構建在編碼蛋白C的cDNA順序的兩端。將這些cDNA克隆的兩個進行操作以構建一個DNA分子，它既含有初生人蛋白C的編碼順序又含有編碼編碼區的5′和3′端不轉譯的mRNA的DNA部分。將該DNA分子插入質粒pBR322的Pst I位點，以構建質粒pHC7。因此質粒pHC7既含有上面所示的編碼順序，又分別在所述初生人蛋白C編碼順序的編碼鏈的5′和3′端含有以下附加順序(也只給出分子的一條鏈)5′-TGC AGG GGG GGG GGG GGG GGG GGG CTG TCA TGG CGG CAG GACGGC GAA CTT GCA GTA TCT CCA CGA CCC GCC CCT ACA GGT GCCAGT GCC TCC AGA -3′
由於DNA鹼基對的互補性質，雙鏈DNA分子的一條鏈的順序足以確定相對鏈的順序。質粒pHC 7可按常規方法從E.coli K12 RR1/pHC 7菌株中分離，該菌株已保藏在北方地區研究實驗室(the Northern Regional Research Laboratory(NRRL)，Peoria Illinois)並成為NRRL保藏永久性原種培養物的一部分。E.coli K12 RR1/pHC 7可以從NRRL得到，保藏號為NRRL B-15926。質粒pHC 7的限制性位點和功能圖譜示於附圖
2。
初生蛋白C也可圖解說明如下
pre-pro-初生人蛋白C的胺基酸殘基1-42，它編碼人蛋白C的信號肽及前肽，對指導蛋白C的分泌和r-羧基化十分重要。LC-初生蛋白C的胺基酸殘基43-197，它一旦經轉譯後修飾，就構成雙鏈酶原(由單鏈酶原除去KR二肽而形成，如下所討論)和活化形式蛋白C的輕鏈(LC)。
KR-初生人蛋白C的胺基酸殘基198-199;這些殘基確信要被除去(基於與牛蛋白C的同源性)，可能通過包括先裂解(在殘基197-198之間或在199-200之間)然後與羧肽酶或氨酞酶作用形成雙鏈蛋白C的兩步程序。
AP-初生蛋白C的胺基酸殘基200-211，它構成活化肽，它從蛋白C的酶原形中除去後便得到活化蛋白C。
AHC-初生蛋白C的胺基酸殘基212-461，一旦經轉譯後修飾，組成活化蛋白C的活化重鏈(AHC)。
HC-蛋白C酶原的二鏈形式的重鏈，一旦經轉譯後修飾，組成胺基酸殘基200-461，即AP和AHC。
人蛋白C酶原是在肝中合成的絲氨酸蛋白酶前體，並存在於血液中以表達完整的生物活性，蛋白C需要進行轉譯後的修飾，該修飾過程需要維生素K。雙鏈的、由二硫鍵連接的蛋白C酶原，由一個單鏈酶原通過限制性蛋白水解作用而產生。這種限制性蛋白水解作用被確信包括裂解和除去。將該雙鏈酶原活化成活性絲氨酸蛋白酶的過程包括ARG-LEU肽鍵(殘基211和212)的蛋白水解裂解。後一裂解釋放出構成雙鏈酶原分子較大鏈(重鏈)氨基末端的十二肽(殘基200-211)，即活化肽。蛋白C受到明顯地糖基化作用，血漿中成熟的酶含約15-23%碳水化合物。蛋白C也含有若干不平常的胺基酸，包括r-羥基穀氨酸和β-羥基天冬氨酸(赤-L-β羥基天冬氨酸)。r-羧基穀氨酸(gla)由穀氨酸殘基經r-穀氨醯基羧化反應而形成，該反應藉助於需要維生素K作為輔助因子的肝微粒體羧化酶。
人蛋白C的活化作用也能用圖解表示並說明如下。本領域專業人員應該明白，圖解中所示的步驟順序不一定反映體內途徑的步驟順序。
pre-pro-LC-KR-AP-AHC初生蛋白C
本發明提供新的化合物、載體、轉化體和重組表達新蛋白C酶原的方法。
為了本發明的目的，在此處所公開的說明書和權利要求書中，下列術語定義如下。
Ad2LP表示腺病毒-2的較大晚期啟動子。
本發明所描述的蛋白質或肽鏈中的胺基酸殘基縮寫如下三字母縮寫 胺基酸殘基 一字母縮寫PHE 苯丙氨酸 FLEU 亮氨酸 LILE 異亮氨酸 IMET 甲硫氨酸 MVAL 纈氨酸 VSER 絲氨酸 SPRO 脯氨酸 PTHR 蘇氨酸 TALA 丙氨酸 ATYR 酪氨酸 YHIS 組氨酸 HGLN 穀氨醯胺 QASN 天冬氨醯胺 NLYS 賴氨酸 KASP 天冬氨酸 DGLU 穀氨酸 ECYS 半胱氨酸 CTRP 色氨酸 WARG 精氨酸 RGLY 甘氨酸 GApR-抗氨苄青黴素表型或授予該表型的基因。
BK-得自BK病毒的DNA。
Enh或增強子-BK病毒的增強子。
ep或SV40ep-含有T-抗原基因的SV40早期啟動子、T-抗原結合位點、SV40增強子和SV40複製起點的DNA片段。
r-羧化反應-在穀氨酸r碳原子上加上一個羧基的反應。
r-羧化蛋白-某些穀氨酸殘基已經過羧基化的蛋白。
GBMT轉錄單位-一種修飾性轉錄控制單位，包括在空間上緊靠腺病毒較大晚期啟動子調節元素上遊的BK病毒P2增強子、腺病毒-2較大晚期啟動子、一種定位激活所述啟動子的poly-GT元素和一種含有腺病毒拼接三重先導順序的DNA順序。GBMT轉錄單位是在質粒pGT-h的約900個鹼基對的HindⅢ限制性片段上。
IVS-編碼內涵子的DNA，也稱間插順序。
MMTpro-小鼠金屬硫因-Ⅰ基因的啟動子。
初生蛋白-未經任何轉譯後修飾剛從mRNA轉錄本轉譯產生的多肽。然而諸如穀氨酸殘基的r-羧基化以及天冬氨酸殘基的羥基化這樣的轉譯後修飾可以在蛋白從mRNA轉錄本全部被轉譯之前發生。
NeoR-一種新黴素抗性授予基因，該基因也可用於授予對抗生素G418的抗性。
pA-編碼多聚腺苷酸信號的DNA順序。
啟動子-引導DNA轉錄成RNA的DNA順序。
蛋白C的活性-人蛋白C的任何性質蛋白水解，醯胺解，酯解以及生物(抗凝固或纖維蛋白溶解)活性。測定蛋白抗凝活性的方法在本領域是眾所周知的，參見文獻(Grinnell等，1987，Biotechnology 51189)。
重組DNA克隆載體-包括(但不限於)染色體整合試劑、自主複製質粒和噬菌體在內的任何試劑，它包含一個可以添加或已經添加了一個或幾個DNA片段的DNA分子。
重組DNA表達載體-啟動子已被摻入並已定位驅動基因產物表達的任何重組DNA克隆載體。
重組DNA載體-任何重組的DNA克隆或表達載體。
複製子-控制並允許質粒或其它載體自主複製的DNA順序。
限制性片段-由一種或多種限制性核酸內切酶的作用而產生的任何線性DNA順序。
敏感型寄主細胞-沒有DNA片段授予其抗性就不能在一定的抗生素或其它毒性化合物存在下生長的寄主細胞。
TcR-抗四環素表型或授予該抗性的基因。
轉化作用-將DNA引入受納寄主細胞從而改變受納寄主細胞的基因型。
轉化體-經過轉化的受納寄主細胞。
轉譯活化順序-包括編碼核糖體結合位點和轉譯起始密碼子(如5′-ATG-3′)的任何DNA順序，它使mRNA轉錄子轉譯成肽或多肽。
酶原-蛋白水解酶的無酶活性的前體。此處所用蛋白C酶原是指蛋白C的分泌的、無活性形式，無論是單鏈還是雙鏈。
圖 1是質粒pLPC-N的限制性位點和功能圖譜。為本發明公開之目的，這些圖沒有嚴格按比例畫出。
圖 2是質粒pLPC-FN的限制性位點和功能圖譜。
圖 3是質粒pLPC-SC的限制性位點和功能圖譜。
圖 4是質粒pLPC-LIN的限制性位點和功能圖譜。
圖 5是質粒pLPC-FLIN的限制性位點和功能圖譜。
圖 6是質粒pGTC的限制性位點和功能圖譜。
圖 7是質粒pGT-d的限制性位點和功能圖譜。
圖 8是質粒pGT-h的限制性位點和功能圖譜。
本發明提供編碼表達新酶原形式的人蛋白C的DNA化合物。文獻(見Bang等人的美國專利4，775，624，1988年10月4日公開，系本文參考文獻)中已描述了一些產生天然人蛋白C酶原和初生人蛋白C的若干方法。這些先有技術方法提供了表達在胺基酸順序上與人血液中存在的酶原形式沒有差別的酶原形式人蛋白C的方法。由這些方法產生的蛋白C酶原無論在體內或體外都必須用如α-凝血酶、胰蛋白酶或凝血酶和凝血調變蛋白的混合物處理才能得到活化的蛋白C。而由重組DNA技術產生的在胺基酸順序上與人血液中天然存在的酶原形式人蛋白C相同的酶原形式人蛋白C在體內將只需由主要包括凝血酶-凝血調變蛋白複合物的天然活化途徑活化。天然人蛋白C酶原可僅由凝血酶活化，然而，活化作用需在無Ca2+條件和高水平的凝血酶和/或蛋白C酶原條件下進行，這不是體內活化蛋白C的主要途徑。
本發明提供可在體內僅由凝血酶以臨床意義上的速度活化的酶原形式人蛋白C。此外，這些酶原比天然人蛋白C酶原更易受凝血酶/凝血調變蛋白的活化。本發明還提供DNA化合物、重組DNA表達載體、轉化的細胞系和重組表達這些新酶原形式人蛋白C的方法。產生這些酶原形式人蛋白C的方法包括(A)用重組DNA載體轉化真核寄主細胞，所述載體包括(ⅰ)編碼胺基酸殘基順序的DNA順序，所述胺基酸殘基順序從氨基端到羧基端包括(a)分泌蛋白的γ-羧基化的信號肽和前肽;
(b)人蛋白C的輕鏈;
(c)選自LYS-ARG、ARG-LYS、LYS-LYS和ARG-ARG的二肽;
(d)以下的胺基酸殘基順序
其中R1選自ASP和LEU，R2選自GLN和HIS，R3選自GLU和LYS，R4選自ASP和LEU，R5為GLN，R6選自VAL和THR，R7選自ASP、PHE和TYR，R8為PRO，R9為ARG，R10選自LEU和THR，R11為ILE或缺失，R12為ASN，-COOH為羧基端;和(ⅱ)定位驅動所述DNA順序表達的啟動子。
(B)將步驟(A)中轉化的宿主細胞培養在允許所述DNA順序表達的條件下。
(C)從所述培養物中回收所述酶原形式的蛋白C。
下面更詳細地描述該方法及該方法中所用的化合物。
本發明還提供用於產生這些新酶原形式人蛋白C方法的DNA化合物。這些化合物都編碼含有指導分泌的信號肽的前肽和得自γ-羧基化(通過依賴於維生素K的γ-羧化酶的作用)的蛋白質的前肽。這類前肽順序在本領域內已眾所周知，例如見文獻(Suttie et al.，1987，Proc、Natl、Acad、Sci、84∶634-637)。為優選和構建方便，信號肽編碼順序和前肽編碼順序都將得自γ-羧基化蛋白的前肽的胺基酸殘基順序。這類γ-羧基化蛋白的實例包括(但不限於)因子Ⅶ、因子Ⅸ、因子Ⅹ、凝血酶原、蛋白S、蛋白Z和蛋白C。編碼人蛋白C前肽的DNA順序最為優選地用於本發明的載體。
本發明的DNA化合物進一步包括人蛋白C輕鏈的編碼順序，該順序在轉譯讀碼框中緊挨著前肽編碼順序的下遊。人蛋白C的輕鏈含有初生蛋白C的胺基酸殘基43到197，如前面背景部分所述，依賴維生素K的血漿蛋白質的氨基端部分如蛋白質C輕鏈的氨基端部分具有鈣結合位點。這些血漿蛋白質的鈣結合區域如因子Ⅶ、因子Ⅸ、因子Ⅹ、凝血酶原和蛋白S可以以與人蛋白C輕鏈的鈣結合區域相當的方式使用(見歐洲專利公告0215548A1號第12和13頁)。
本發明的DNA化合物進一步包括位於輕鏈編碼順序轉譯讀碼框內在輕鏈順序下遊與之緊接的二肽LYS-ARG(KR)的編碼順序。二元鹼性二肽如LYS-ARG位於初生蛋白輕鏈的羧基端。LYS-ARG二肽在蛋白質表達中的取向與本發明無關。就本發明的目的而言，二元鹼性二肽如LYS-LYS或ARG-ARG與二肽LYS-ARG相當。然而，就本發明的目的而言，優選LYS-ARG，這是天然人蛋白C中的二肽。
LYS-ARG二肽的密碼子的下遊緊接著是活化肽編碼順序。在本發明的化合物中，活化肽編碼順序的變化和重鏈的前3個aa(和相應的胺基酸順序)是增加這些新酶原的凝血酶敏感性的關鍵。
本領域專業人員會意識到本發明的酶原和天然人蛋白C酶原的主要區別如下所述。在天然人蛋白C中活化肽和重鏈的頭三個aa為
其中的數字涉及該胺基酸殘基在初生人蛋白C中的位置。根據本發明的公開，改變各種殘基會導致相應的酶原形式對僅由凝血酶產生的裂解更為敏感，而且對凝血酶一凝血調變蛋白複合物產生的裂解更為敏感。
本發明的各種胺基酸缺失和取代導致各種突變體的形成，對所產生的酶原而言，這些突變體增加了對凝血酶的敏感性。術語「所產生的酶原」說明雖然根據初生人蛋白C中胺基酸的位置描述了取代作用，但為了得到酶原形式初生蛋白C必須首先被分泌出來(除去第1～42個胺基酸殘基後產生的)。在初生人蛋白C的214位上(在活化肽中)用天冬醯胺殘基取代天冬氨酸殘基產生了本發明的新酶原。胺基酸殘基的缺失(不是取代)也產生新的蛋白C酶原。為便於理解和數位化，缺失用零(0)表示。當胺基酸缺失時，缺失殘基的兩端的胺基酸連接形成連續的酶原鏈。表1顯示本發明的各種新酶原形式的蛋白C。
表1酶原式R1R2R3R4R5R6R7R8R9R10R11R12203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214天然蛋白C ASP GLN GLU ASP GLN VAL ASP PRO ARG LEU ILE ASPN ASP GLN GLU ASP GLN VAL ASP PRO ARG LEU φASNFN ASP GLN GLU ASP GLN VALPHEPRO ARG LEU φASNSCLEUHISLYSLEUGLNTHRTYRPRO ARGTHRφASNLIN ASP GLN GLU ASP GLN VAL ASP PRO ARG LEU ILEASNFLIN ASP GLN GLU ASP GLN VALPHEPRO ARG LEU ILEASN＊ 下面劃線的表示取代或缺失因此，本發明優選的新酶原形式人蛋白C得自胺基酸殘基順序如下的初生人蛋白C分子的分泌和加工
其中R1選自ASP和LEU，R2選自GLN和HIS，R3選自GLU和LYS，R4選自ASP和LEU，R5為GLN，R6選自VAL和THR，R7選自ASP、PHE和TYR，R8為PRO，R9為ARG，R10選自LEU和THR，R11為ILE或缺失，R12為ASN，-COOH為羧基端。
本領域專業人員會認識到由於遺傳密碼的簡併性，許多種DNA化合物都可編碼上面給出的多肽。所以，下面描述的構建過程以及本發明所附的優選DNA化合物、載體和轉化體的實施例都僅僅是說明性的，不限制本發明的範圍。
本發明的所有DNA化合物都是通過人蛋白C基因的定點突變而製備的。然後將經突變的酶原編碼分子插入真核表達載體，以便由腺病毒-2的較大晚期啟動子驅動該酶原基因表達。所述載體還包括BK病毒的P2增強子部分以增強由啟動子驅動的表達。所述載體已轉化到大腸桿菌K12 AG1細胞中並保藏在北方地區研究實驗室(Northern Regional Research Laboratories，Peoria，Illinois 61604)並成為該實驗室永久性原種培養物的一部分。表Ⅱ給出了具體的培養物、保藏日期和保藏號。
表Ⅱ培養物 保藏號 保藏日E.coli K12 AG1/pLPC-N NRRL B-18612 01/09/90E.coli K12 AG1/pLPC-FN NRRL B-18613 01/09/90E.coli K12 AG1/pLPC-SC NRRL B-18614 01/13/90E.coli K12 AG1/pLPC-LIN NRRL B-18615 01/13/90E.coli K12 AG1/pLPC-FLIN NRRL B-18616 01/13/90利用常規方法獲得培養物並分離質粒，然後可直接轉染到真核寄主細胞中以產生酶原形式的人蛋白C。最好將質粒轉化到可表達腺病毒E1A早期基因產物的寄主細胞中，在這種寄主細胞中載體上的BK增強子在E1A的存在下可最有效地增強表達。專業人員會意識到許多寄主細胞都表達或可被用於表達大DNA病毒的早期基因產物。優選的細胞係為人腎293細胞系(得自美國典型培養物保藏中心(ATCC)，保藏號為ATCC CRL 1573)或金黃侖鼠細胞系AV12(ATCC 9595)。胚胎人腎細胞系293最為優選。
為了獲得更高水平的表達，可將編碼各種酶原形式蛋白C的基因從保藏的載體上切下來並連到含有GBMT轉錄控制單位的載體上。具體說，質粒pGTC含有由GBMT單位驅動的天然人蛋白C基因，它可(以E.coli K12 AG1的形式)從NRRL獲得，保藏號為NRRL B-18593。通過用限制性酶Bcl I消化在大腸桿菌的dam菌株中生長的質粒而除去天然基因。所述新酶原基因可通過用Bcl I消化而分別從其質粒上除去。將載體主鏈純化並脫磷酸化，然後將本發明的任何一種新酶原基因連到Bcl I上。將含有位於GBMT轉錄單位之後的用於表達的新酶原基因的質粒轉化到293細胞中，進行培養，並利用本領域熟知的技術從培養物中純化新酶原。從細胞培養物中純化人蛋白C的一種方法已公開於Yan所述的方法(歐洲專利公告0363126，1990年4月11日公開)，全部公開內容均作為本文參考。
本發明的化合物還包括本發明初生蛋白一經分泌產生的酶原形式。酶原形式蛋白C一經活化產生的活化蛋白C衍生物也是本發明的化合物。因此，本發明的化合物包括DNA編碼順序、驅動這些順序表達的表達載體、由這些編碼順序產生的mRNA轉錄本一經轉譯產生的初生蛋白、那些初生蛋白一經分泌產生的酶原和所述酶原的某些活化衍生物。
本發明的DNA化合物也可由化學方法合成，或通過將限制性片段的結合或通過本領域已知的技術相結合。DNA合成儀也可買到，並可用於構建本發明的化合物。
本發明的說明性載體含有BK增強子，它通過本發明編碼順序的腺病毒較大晚期啟動子定位刺激轉錄。本領域專業人員會意識到大量本領域已知的真核啟動子、增強子和表達載體都可用於本發明的方法。本領域專業人員還會意識到真核表達載體可以在沒有增強子部分的存在下發揮其功能。本發明的關鍵不在於特定的增強子(如果有的話)或用於驅動蛋白C酶原表達的啟動子，而在於新的編碼順序和由該順序產生的相應的蛋白質。
然而，載體的選擇如啟動子、增強子、和可選擇的標誌物會極大地影響真核寄主細胞產生的蛋白質的最終水平。歐洲專利公告0245949號(1987年11月19日公開，系本文參考文獻)公開了許多天然酶原蛋白C的表達載體，這些表達載體利用BK增強子刺激能定位驅動初生人蛋白C表達的真核啟動子。這些載體一旦轉化到也可表達大DNA病毒最早期基因產物(如腺病毒的E1A基因產物)的真核細胞，可驅動特別高水平的表達。這一點可由本發明公開的載體pGT-N、pGT-FN、pGT-SC、pGT-LIN和pGT-FLIN證明，GBMT-E1A基因產物的表達方法對用本發明的載體而言特別優選。
本發明不限於使用特定的真核寄主細胞。許多真核寄主細胞都可從保藏機構如美國典型培養物保藏中心(ATCC)(Rockville，MD20852)得到，並適用於本發明的載體。具體寄主細胞的選擇在某種程度上取決於用於驅動本發明蛋白C編碼DNA化合物的具體表達的載體。因為本發明的初生人蛋白C和初生人蛋白C衍生物需經歷隨後的轉譯後修飾作用，所以某些寄主細胞更優選地用於本發明的載體。根據歐洲專利公告0245949和Grinnel等人的論文(1987，Bio/Technolony 51189)，腺病毒轉化的人胚胎腎細胞對重組產生γ-羧基化蛋白如人蛋白C來說特別優選。一種這樣的腺病毒轉化的人胚胎腎細胞系是293細胞系，它可從ATCC得到，保藏號為ATCC CRL 1573。293細胞系也優選地適用於本發明的載體。
然而，有利於產生γ-羧基化蛋白如人蛋白C酶原的腺病毒轉化的細胞系不限於腺病毒轉化的人胚腎細胞。事實上，腺病毒轉化的細胞一般說來是產生γ-羧基化人蛋白C的特殊寄主。這一類型的特別優選的細胞系是可從ATCC得到的AV12-664(下文簡稱「AV12」)細胞系，保藏號為ATCC CRL 9595。AV12細胞系的構建是將人腺病毒12注入金黃侖鼠的頸背，然後從生成的腫瘤中分離細胞。後面的實例3描述了用例證性載體pGT-N轉化293和AV12細胞系。
本發明載體可轉化到各種真核寄主細胞特別是哺乳動物細胞中並在其中表達。不具有可用於分離和鑑定穩定的真核轉化株的可選擇標記的本發明載體不僅可用於瞬間分析的目的，也可用於共轉化之目的，共轉化方法公開於美國專利4，399，216(1983年8月26日公開)，在此併入本文作為參考。本發明的載體還包括可使其在大腸桿菌中複製的順序，因為在大腸桿菌中製備質粒DNA通常比在其它寄主中更為有效。
本發明載體上所含有的人蛋白C的編碼順序在那些其中與結構基因相連的特定啟動子起作用的寄主細胞中表達。適用於本發明的寄主細胞實例列於表Ⅲ，附帶適當的註解。
表Ⅱ寄主細胞 來源 購自 備註HepG-2 人肝胚細胞瘤 ＊ATCC＃HB8065 美國專利4，393，133描述了該細胞系的使用。
CV-1 非洲綠猴腎細胞 ATCC＃CCL70LLC-MK2 獼猴腎細胞 ATCC＃CCL7LLC-MK2 獼猴腎細胞 ATCC＃CCL7.1 比ATCC＃CCL7生長更衍生物 快。
3T3 小鼠胚成纖維細胞 ATCC＃CCL92CHO-K1 中國金黃侖鼠卵細胞 ATCC＃CCL61 需脯氨酸。CHO-K1衍生物如dhfr-衍生物DXB11可由該寄主產生。
HeLa 人子宮頸上皮樣細胞 ATCC＃CCL2RPMI8226 人骨髓瘤 ATCC＃CCL155 IgGλ-型輕鏈分泌H4IIEC3 小鼠肝細胞瘤 ATCC＃CRL1600 衍生物如8-氮雜鳥嘌呤抗性FAZA寄主細胞可由該寄主產生。
C127I 小鼠成纖維細胞 ATCC＃CRL1616HS-Sultan 人漿細胞細胞瘤 ATCC＃CRL1484BHK- 幼年金黃侖鼠腎細胞 ATCC＃CCL10
如表Ⅲ所示，許多哺乳類細胞都有必要的細胞識別機制和對本發明初生蛋白上信號肽的適當處理程序，並提供轉譯後修飾如糖基化、γ-羧基化和β-羥基化，如觀察到的血漿中的蛋白C。然而，如上所述，HPC的最佳轉譯後處理過程發生於腺病毒轉化的細胞中。對這類真核寄主細胞的轉化而言，存在許多載體(如下所討論)，但是，下面例舉的特定載體決非要限制本發明的範圍。
pSV2型載體包括構成一個限定的真核轉錄單位-啟動子(ep)、間插順序(IVS)和聚腺苷酸化(pA)位點的SV40基因組片段。在沒有SV40 T-抗原時，質粒pSV2型載體通過整合到寄主細胞染色體DNA中而轉化哺乳類和其它真核寄主細胞。已構建了各種質粒pSV2型載體(見Eukaryotic Viral Vectors，Gluzman編，Cold Spring Harbor Laboratories出版，Cold Spring Harbor，New York，1982)，如質粒pSV2-gpt、pSV2-neo、pSV2-dhfr、pSV2-hyg和pSV2-β-球蛋白，其中SV40啟動子驅動插入基因的轉錄。這些載體都適用於本發明的編碼順序，並可從ATCC(在Rockville，Maryland)或NRRL(在Peoria，Illinois)得到。
質粒pSV2-dhfr(ATCC 37146)含有受SV40早期啟動子控制的鼠二氫葉酸還原酶(dhfr)基因。在適當的條件下，獲知所述dhfr基因在寄主染色體中被放大或拷貝。該放大作用可以包括與dhfr基因緊密相連的DNA順序如本發明的初生人蛋白C編碼順序，見Schimke的綜述文章(1984，Cell 37705-713)，因此可用於增加本發明蛋白C酶原的產生。
被構建用來在哺乳類和其它真核寄主細胞中表達本發明初生蛋白C和蛋白C酶原的質粒可採用各種啟動子。本發明決不限於使用本文所列舉的特定的真核啟動子。Bucher等人公開的啟動子如SV40晚期啟動子或真核啟動子(Bucher et al.，1986，Nuc.Acids Res.14(24)1009)或得自真核基因(如誘導雌激素的雞卵清蛋白基因、幹擾素基因、誘導糖皮質激素的酪氨酸氨基轉移酶基因、胸苷激酶基因及較大早期和晚期腺病毒基因)的啟動子都可容易地分離和修飾以用於設計在真核寄主細胞中產生人蛋白C酶原的重組DNA表達載體。真核啟動子也可以串聯形式用於驅動本發明編碼順序的表達。而且，已知道許多還原病毒可感染很大範圍的真核寄主細胞。所述還原病毒DNA的長端重複常常編碼啟動子的活性，因此可用於驅動本發明編碼順序的表達。
質粒pRSVcat(ATCC 37152)含有勞斯氏肉瘤病毒(RSV)的部分長端重複，RSV已知可感染雞和其它寄主細胞。RSV的長端重複順序可以從質粒pRSVcat的～0.76kb Nde Ⅰ-HindⅢ片段分離。RSV的長端重複(Gorman et al.，1982，P.N.A.S.796777)適用於本發明的載體。質粒pMSVi(NRRL B-15929)含有鼠肉瘤病毒(MSV)的長端重複，該病毒已知可感染鼠類和其它寄主細胞。這些重複順序適合用作本發明載體的啟動子。小鼠金屬硫因(MMT)啟動子也已鑑定出有用於真核宿主細胞的特性，並且適用於本發明的載體。所述MMT啟動子存在於15kb的質粒pdBPV-MMTneo(ATCC 37224)中，該質粒可用作構建本發明其它質粒的起始原料。
本發明說明性DNA順序和質粒的許多修飾和變化都是可能的。例如，遺傳密碼的簡併性使得多肽編碼區域及轉譯終止信號的核苷酸可以被取代，而編碼出的多肽順序不變。這種可取代的順序可以從已知的人蛋白C胺基酸順序和DNA順序推導，並可通過以下常規合成或位點特異性變變方法而構建。合成方法可基本上按照Itakura等人的方法(1977，Science 1981056)和Crea等人的方法(1978，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 755765)進行。因此，本發明決不限於具體例舉的那些DNA順序和質粒。
在本發明的載體轉化到真核寄主細胞中後，可以根據可選擇表型來選擇轉化體。所述可選擇表型可以由存在於所述表達載體上或存在於與所述表達載體一起轉化到寄主細胞中的另一個載體上的可選擇標記授與。一旦選擇出轉化株，便需要鑑定哪種轉化株表達最高水平的所述表達載體編碼的所需蛋白。這種鑑定在進行共轉化方法後特別重要，共轉化產生許多只含有可選擇標記物的質粒而不含表達載體的轉化株。在後面的實例3和4中描述了一種方法，它不但可以鑑定表達和分泌所需蛋白的細胞，還相對所考察的其它細胞定量所分必的蛋白。該方法還可用於分離可分泌最高水平所需蛋白的活細胞。
活化酶原形式人蛋白C的方法是老的並為專業人員所熟知。蛋白C可僅由凝血酶活化、由凝血酶/凝血調變蛋白複合物活化、由Russell氏蝰蛇毒液活化或由各種其它方法活化。為了比較本發明酶原的各種活化速率，僅用凝血酶在3mM CaCl或8mM EDTA存在下進行了實驗。凝血酶的活化作用和蛋白C的活性分析(醯胺解和抗凝性)如文獻(Grinnell et al.，1987，Biotechnology 51189-1192，在此併入本文作為參考)所述進行。其它利用固相凝血酶活化蛋白C的方法公開於Yan的美國專利公告07/403，516號(Attorney Docket X-7307，1989年9月5日遞交，在此併入本文作的參考)。活化的相對速率示於表Ⅳ。
表Ⅳ酶原型凝血酶(3mM CaCl2) 凝血酶(8mM EDTA)野生型 1 1F167 20 2LIN 3 1.3FLIN 30 3FN ～450 5-6SC ～260 5-6酶原F167含有野生型活化肽，只是209位的胺基酸由天冬氨酸改為苯丙氨酸。酶原F167公開於歐洲專利公布0323149號(1989年7月5日公開，在此併入本文本作為參考)。F167、LIN和FLIN酶原突變體的功能性抗凝活性為野生型對照的100-109%。FN和SC突變體的活性由於醯胺解活性很低而低於對照的10%。
活化蛋白C在防止靜脈血栓擴大、動脈血栓形成和防止死亡和器官不能抵抗革蘭氏陰性膿毒症、內毒素血症和彌散性血管內血凝固等方面具有基本的抗凝血特性。在動物實驗中，天然酶原蛋白C的注入對休克性革蘭氏陰性敗血症和彌散性血管內凝固(DIC)的治療沒有作用。這些負結果表明在這種涉及大量產生凝血酶的分布廣泛的微血管血栓形成中不足量的凝血調變蛋白存在，與凝血酶複合，並活化所注入的酶原。
活化蛋白C與其它活化的絲氨酸蛋白酶一樣，主要的缺點是與其酶原前體相比，半衰期(T1/2)短。在狗體內T1/2為11分鐘，猴體內為22-26分鐘。與此相比，天然蛋白C酶原在人體內的T1/2為6小時。活化絲氨酸蛋白酶(包括活化蛋白C)與其酶原相比生物半衰期短的原因是複雜的，涉及細胞內機制和體液機制。活化的絲氨酸蛋白酶還與其通常存在於血漿中的抑制劑形成複合物。活化蛋白C(APC)還與一種新近描述為APC抑制劑的化合物及α-2巨球蛋白複合。而無活性的酶原(包括本發明的蛋白C酶原)不與絲氨酸蛋白酶抑制劑反應。
本發明蛋白C酶原的優點是它們比天然蛋白C酶原更容易被凝血酶活化，因為凝血酶在Ca2+存在下活化本發明酶原時，對與凝血調變蛋白複合的需求明顯降低。所以當本發明蛋白C酶原被給藥時，可以在血管內產生凝血酶的部位(即血管內任何發生血栓的部位)被活化。因此，這些重組蛋白C酶原可用作藥物前體，它們將在產生凝血酶的部位活化。由於這些凝血酶敏感性酶原可以以酶原形式給藥，所以它們不與蛋白C抑制劑形成複合物並且其生物半衰期與天然蛋白C酶原相同。
本發明的重組蛋白C酶原可用於防治各種涉及血管內凝固的獲得性疾病，包括深度靜脈血栓、肺栓塞、外周動脈血栓、起源於心臟或外周動脈的栓子、急性心肌梗塞、血栓突發及彌散性血管內凝固。這些蛋白C衍生物也可有效地用於治療患有繼發性深度靜脈血栓引起的雜合蛋白C不足的病人和患有紫癜暴發病的純合蛋白C缺乏的病人。
實驗和臨床數據表明常規的抗凝劑特別是華法令在治療侵襲性癌症方面很有用，其作用是阻止或減少這些惡性腫瘤遠距離轉移造成的損害。此外，已知炎性刺激物如內毒素、腫瘤壞死因子和間白細胞素1(interleukin 1)可排除內皮細胞表面的凝血調變蛋白，該凝血調變蛋白被認為是引發微血管和大血管血栓形成的原因。本發明的重組蛋白C酶原是治療這些臨床病症的另一個有吸引力的選擇。
活化蛋白C的治療吸引力在於可防止深度靜脈血栓形成和肺栓塞，這兩種病目前是用低劑量的肝素治療。這些酶原的其它優點是可以以濃縮藥團注射液形式給藥，而不是常規的Ⅳ輸入。活化蛋白C必須以連續Ⅳ輸入給藥，因為該蛋白的T1/2很短。
由於本發明蛋白C酶原的輸入而造成出血併發症的可能性很小。因此，這些酶原可以在與血栓切除術或栓塞切除術有關的外科手術中或手術後代替肝素，所述血栓切除術或栓塞切除術是在解決急性動脈梗阻時挽求局部缺血肢體免於切除的外科方法。由於這些酶原與活化蛋白C相比T1/2長且相對容易施用，所以它們比活化蛋白C更適用於治療心源性動脈栓子。以治療深度靜脈血栓-肺栓塞的劑量長期使用這些酶原，有防止心臟栓子的用途。
本發明的蛋白C酶原同樣可用於治療起源於外周動脈(最顯著的是頸動脈)血栓的栓子，這些疾病在目前所用的治療體制下沒有令人滿意的治療和防治方法，目前所用的治療體制包括能夠抑制血小板功能的藥物、口服抗凝劑或其結合物。如在心臟栓子的情況中一樣，這些酶原可以以心臟栓子情況中同樣的方法長期使用，並在防治起源於頸動脈血栓並導致栓塞發作的栓子方面有很大潛能。
本發明的蛋白C酶原也用於血栓發作。目前，中風一般不是用常規抗凝劑治療。用肝炎素或口服抗凝劑治療中風，雖然偶然有效果，但要冒很大的風險，即出血到梗塞的腦區域從而加重伴有中風的神經缺損。本發明的酶原由於其引起出血併發症的潛能低及其選擇性，可以給中風病人使用，並對阻止閉塞性動脈血栓的局部擴展從而減小由中風引起的神經缺損很有益處。
本發明的酶原還可用於治療急性心肌梗塞，因為本發明的酶原一旦被活化便具有纖維蛋白溶原的性質。在心肌梗塞急性期，本發明酶原可以和組織血纖維蛋白溶酶原激活劑一起使用。在冠狀動脈血栓閉塞解決後，本發明的酶原可再使用幾天以防止急性心肌再梗塞。
活化的蛋白C用於治療播散性血管內凝固。對患有播散性血管內凝固(DIC)的病人在廣泛的臨床試驗中已使用了肝素和口服抗凝劑，但結果令人失望。而本發明的活化蛋白C及酶原在治療DIC時比常規抗凝劑有明顯的優點。如上所述，在動物實驗中已發現蛋白C酶原在防止革蘭氏陰性敗血症和DIC引起的死亡和器官損傷中沒有作用。相反，本發明的蛋白C酶原對凝血酶的活化作用高度敏感，在治療彌散性血管內凝固中將很有作用。
常規抗凝劑(特別是華法令)可用於治療侵害性惡性腫瘤。許多腫瘤細胞都產生引起凝固系統活化從而導致局部纖維蛋白沉積的物質。這些纖維蛋白的沉積形成「巢」，癌細胞在其中可進行分裂形成骨髓硬化性損傷。然而，不可能將華法令或其它常規抗凝劑與更強烈並更有效形式的化療結合使用，因為這種治療會使血小板急劇下降，而用華法令治療的血小板減少症會將病人置於不可接受的高風險的嚴重出血併發症中。本發明的活化蛋白C衍生物和活化蛋白C一樣比常規抗凝劑有更高的選擇性，並且比肝素或口服抗凝劑有更高的治療指數，可以相對安全地用於血小板減小症的病人，因此使得用有效的強烈的化療與本發明的蛋白C酶原結合治療侵害性癌症的病人成為可能。
本發明的酶原及其活化形式可按照已知方法配製製備藥用組合物，其中本發明的人蛋白C酶原或活化的蛋白C與可藥用載體混合。合適的載體及其配製劑(包括其它人蛋白如人血清清蛋白)在例如文獻(Remington′s Pharmceutical Sciences第16版，1980，Mack出版公司，由Osol等人編輯)中已知描述，該文獻在此併入本文作為參考。這類組合物含有有效量的蛋白C酶原或其活化對應物以及合適量的可藥用載體，以製備適於有效施用於寄主的藥用組合物。所述蛋白C組合物可以經非腸道途徑給藥或通過其它能保證其以有效形式傳遞到血管中的其他方法給藥。
還須注意，本發明的酶原可用於體外製備活化蛋白C。儘管已經知道在真核細胞中直接產生活化蛋白C的重組方法，但這些方法需要活化的蛋白C在培養基中維持較長一段時間。由於活化蛋白C相對不穩定，這些直接表達方法只能產生少量的活化蛋白C。相反，本發明的酶原即使在Ca2+存在下也可僅由凝血酶活化，因此，比已知的產生活化蛋白C的方法有顯著的優越性。
以下實例說明本發明的方法，描述本發明具有代表性的化合物、載體和轉化株，但不限制本發明。
實例1質粒pLPC-FLIN從NRRL得到大腸桿菌K12 AG1/pLPC-FLIN的凍乾物，登記號為NRRLB-18616。將這些凍乾物倒入裝有10ml LB培養基(10g細菌用胰化腖、5g細菌用酵母抽提物、每升10g NaCl;調pH至7.5)的管中，於32℃培養2小時，此時在培養物中加50μg/ml氨苄青黴素，然後於37℃下培養過夜。
取一小部分過夜培養物，以某種方式置於含50μg/ml氨苄青黴素的LB-瓊脂(加有15g/l細菌用瓊脂的LB培養基)平板上，從而獲得大腸桿菌K12 AG1/pLPC-FLIN的單菌落分離菌。將得到的單菌落接種到10ml含50μg/ml氨苄青黴素的LB培養基中，於37℃下劇烈振蕩培養過夜。取10ml過夜培養物接種到500ml含50μg/ml氨苄青黴素的LB培養基中，於37℃下劇烈振蕩培養，直到培養物達到靜止期。
以下操作沿用Maniatis等人的方法(Molecular Cloning，Cold Spring Harbor Laboratory，1982)。
於4℃下以4000g離心10分鐘收集細胞，棄去上清液。用100毫升冰冷的STE緩衝液(0.1M NaCl;10mM Tris-HCl，pH7.8;1mM EDTA)洗滌細胞沉澱。洗滌後，將細胞沉澱再懸浮於10ml含5mg/ml溶菌酶的溶液1(50mM 葡萄糖;25mM Tris-HCl，pH8.0;10mM EDTA)中，室溫下放置10分鐘。然後向經溶菌酶處理的細胞中加入20ml溶液2(0.2N NaOH和1% SDS)，用倒轉法小心混合該溶液。將該混合物在冰上保溫10分鐘。
向溶解的細胞混合物中加入15ml冰冷的5M乙酸鉀，pH4.8，倒轉混合該溶液。將該溶液在冰上保溫10分鐘。5M乙酸鉀溶液的製備方法是在28.5ml水和60ml 5M乙酸鉀中加入11.5ml冰乙酸;所得的鉀濃度為3M，乙酸濃度為5M。
於4℃下，將溶解的細胞混合物以20，000rpm在Beckman SW27(或同等規格的轉子)中離心20分鐘。細胞的DNA和碎片在管底形成沉澱。回收到約36ml上清液，加入0.6倍體積的異丙醇並混合，所得溶液在室溫下放置15分鐘。室溫下以12，000g離心30分鐘收集質粒DNA。棄去上清液，用70%乙醇於室溫下洗滌DNA沉澱。倒出乙醇洗滌液，將沉澱置於真空乾燥器中乾燥。然後將沉澱再懸浮於8ml TE緩衝液中(10mM Tris-HCl，pH8.0，1mM EDTA)。
向DNA溶液中加入8克CsCl。在每10ml CsCl-DNA溶液中加入約0.8ml 10mg/ml溴乙錠溶液。該溶液的最終密度約為1.55g/ml，溴乙錠濃度約為600μg/ml。將溶液移至Beckman 50型離心管中，管頂用石蠟油裝滿，密封后於20℃下以45，000rpm離心24小時。離心後，在可見光下可看見兩條DNA帶。取下離心管蓋後，用帶有21號皮下注射針頭的注射器沿離心管壁插入而吸出較低的DNA帶。
用水飽和的1-丁醇萃取若干次，除去溴化乙錠。用TE緩衝液透析除去CsCl。先後用緩衝的苯酚和氯仿萃取，沉澱出DNA，用70%乙醇洗滌，乾燥。得到約1mg質粒pLPC-FLIN，於4℃下在TE緩衝液中以約1μg/μl的濃度貯存。質粒pLPC-FLIN的限制位點和功能圖譜示於附圖5。質粒pLPC-FN、pLPC-SC、pLPC-LIN、和pLPC-N以同樣的方式從其相應的宿主細胞(也得自NRRL)中分離。它們各自的限制性位點和功能圖譜示於附圖。
實例2構建質粒pGT-FLIN質粒pLPC-N、pLPC-FN、pLPC-SC、pLPC-LIN和pLPC-FLIN可直接轉化到真核宿主細胞(優選293細胞)中產生高水平的人蛋白C酶原。如果編碼突變型酶原的基因被連到某一載體上，這樣該基因的表達由GBMT轉錄單位驅動，則可以得到高水平的表達和分泌產物。
質粒pGTC是這類載體中的一種，在該質粒中野生型人蛋白C酶原基因由GBMT轉錄單位驅動。野生型蛋白C基因可從載體的Bcl I限制性片段上容易地除去，本發明的任何基因可插入載體的Bcl I限制性片段。Bcl I對質粒DNA的消化受到順序5′-GATC-3′中的腺嘌呤的甲基化的抑制。因此，要從沒有腺嘌呤甲基化酶的大腸桿菌寄主細胞中製備質粒pGTC，腺嘌呤甲基化酶由dam基因編碼，該基因的產物使順序5′-GATC-3′中的腺嘌呤殘基甲基化。大腸桿菌K12 GM48(NRRL B-15725)缺乏功能性的dam甲基化酶，因此是製備質粒pGTC DNA的合適寄主，該質粒DNA是構建質粒衍生物的起始材料。
將大腸桿菌K12 GM48細胞進行培養，並使其適於轉化，基本按照實例1的方法用質粒pGTC轉化大腸桿菌K12 GM48細胞。將轉化的細胞置於含有氨苄青黴素的L-瓊脂上，一旦具有氨苄青黴素抗性的大腸桿菌K12 GM48/pGTC轉化株形成菌落，便可基本按照實例1的方法用一個這種菌落製備質粒pGTC DNA。得到1mg質粒pTGC DNA，並將其懸浮於1ml TE緩衝液中。同樣可以製備允許Bcl I消化的質粒pGT-h和pGT-d。質粒pGT-d含有GBMT轉錄單位，但在Bcl I位點無基因，所以任何基因可以容易地插入。質粒pGT-d還含有鼠類dhfr基因，因此可利用氨甲蝶呤抗性表型選擇任何轉化株或進行放大。質粒pGT-h含有GBMT轉錄單位、易於插入目的基因的Bcl I位點和授予潮黴素抗性的基因。含有這些質粒的大腸桿菌K12 AG1菌株於1990年1月18日保藏於NRRL。這些菌株的保藏號為NRRL B-18591(大腸桿菌K12 AG1/pGT-d)、NRRL B-18592(大腸桿菌K12 AG1/pGT-h)和NRRL B-18593(大腸桿菌K12 AGl/pGTC)。以上菌株均可從NRRL得到。這些質粒的限制性位點和功能圖譜示於附圖。
將約10μL實例1製備的質粒pLPC-FLIN DNA與20μl 10X Bcl I限制性緩衝液(100mM Tris-HCl(pH7.4)、1.5M KCl、100mM MgCl2和10mM DTT)、20μl 1mg/ml BSA、5μl限制性酶Bcl I(～50單位，如Bethesda Research Laboratories(BRL)所限定，本文所用的所有限制性酶都得自BRL)及145μl水混合，所得反應混合物在37℃下保溫2小時。本文所描述的限制性酶反應都常規地由苯酚結束，並用氯仿提取，然後沉澱DNA，用乙醇洗滌，在TE緩衝液中再懸浮DNA。然後將消化的DNA通過1%的瓊脂糖製備凝膠電泳，並利用BioRad Prep-A-Gene藥盒，按照廠商的指示純化含有突變基因的約1400鹼基對的限制性片段。
然後基本上按照實例1所述的方法從大腸桿菌K12 AG1/pGTC(NRRLB-18593)中分離質粒pGTC，並如實例2從GM 48細胞中製備。然後如上所述用限制性酶Bcl I消化質粒pGTC DNA，然後分離並純化較大的載體片段。將該載體片段用TE(pH8.0)調到90μl，然後加入10μl(0.05單位)小牛腸道鹼性磷酸酶以使載體末端去磷酸化。將該混合物在37℃下保溫30分鐘，然後加入10μl 500mM EGTA，將反應物在65℃下保溫45分鐘以使所述酶失活。反應物然後用苯酚/氯仿提取，用乙醇沉澱，洗滌並再懸浮於20μl水中。
將約7μl(10ng)Bcl I消化的載體主鏈與約1μl(100ng)約1400鹼基對的質粒pLPC-FLIN的Bcl I限制性片段、1μl 10X連接酶緩衝液(0.5M Tris-HCl，pH7.6，100mM MgCl，100mM DTT和500μg/ml BSA)及1μl T4 DNA連接酶混合。將該連接反應物在16℃下保溫12-16小時。該連接反應可產生含有從GBMT轉錄單位中定向轉錄的突變酶原基因的質粒，或所述基因被反向連接的質粒。這些含有以適當取向轉錄的所述基因的質粒命名為質粒pGT-FLIN。
冰冷的感受態大腸桿菌K12 AG1細胞得自Strategene(3770 Tansey Road，San Diego，California 92121)。將約5μl所述連接反應物與100μl感受態細胞混合，然後將該細胞-DNA混合物在冰上保溫1小時，在42℃下熱休克45秒，再在冰上冷卻約2分鐘。將該細胞-DNA混合物稀釋到Falcon 2059試管中的1.0ml LB培養基中，並在37℃下培養1小時。將100μl試樣平鋪於含有氨苄青黴素的LB-瓊脂平皿上，在37℃下培養至菌落出現。
將上述菌落分開單個培養，並通過限制性酶分析而考察單個菌落中的質粒DNA。質粒DNA的分離按照實例1的方法以較小規模進行，但省去CsCl步驟直至鑑定出適當的大腸桿菌K12 AG1/pGT-FLIN轉化株。這時進行大規模的高純度的質粒製備。按照實例1和2的步驟，任何突變酶原基因都可容易地克隆到任何GBMT載體中去。
實例3用質粒pGT-FLIN構建腺病毒轉化的人胚胎腎細胞系293和腺病毒轉化的金黃侖鼠細胞系AV12轉化株人胚胎腎細胞系293得自ATCC，登記號為ATCC CRL 1573。腺病毒轉化的金黃侖鼠細胞系AV12也得自ATCC，登記號為ATCC CRL 9595。下面描述以293細胞為寄主細胞系的轉化方法，但是該方法對大多數真核細胞系(包括AV12細胞系)都普遍適用，並表達本發明的載體。
293細胞以登記號CRL 1573得自ATCC，在-25平方毫米的小瓶中在加有10%熱失活馬血清的Eagle氏最低限基本培養基(Gibco)中含有融合單層的約5.5×106個細胞。將該小瓶在37℃下培養，培養基一星期換兩次。培養基由DMEM(Gibco)加上10%小牛血清、50μg/ml慶大黴素和10μg/ml Aqua MEPHYTON植物甲萘醌維生素Kl(Merck Sharp and Dohme，Merch and CO.，Inc.，West Point，PA 19486)組成。將這些細胞傳代培養，方法是除去培養基，用Hank氏平衡鹽溶液(Gibco)衝洗，加入0.25%的胰蛋白酶(含有0.2g/L EDTA)1-2分鐘，用新鮮培養基衝洗，吸出，以1∶5或1∶10的傳代培養比例分配到新的培養瓶中。
在轉化的前一天，將這些細胞以每100mm盤0.7×106個細胞進行接種。滅菌，將溶於水中的乙醇沉澱的質粒DNA用於製備含有25μg/ml轉化用質粒DNA和250mM CaCl的2X DNA-CaCl2溶液。製備含有280mM NaCl、50mM Hepes和1.5mM磷酸鈉的2X HBSS，pH調至7.05-0.15。將2X DNA-CaCl溶液滴加到等體積的無菌2X HBSS中。在加入DNA時，將1枝帶有棉花塞的無菌1ml塑料吸管插入含有2X HBSS混合物管中並吹入氣泡。在室溫下不攪拌放置30-45分鐘，以形成磷酸鈣-DNA沉澱。
用塑料吸管輕輕吹氣而將沉澱混合，並將1ml沉澱(每平皿)直接加到10ml含有受納細胞的生長培養基中。在37℃下培養4小時後，換用新鮮培養基，細胞在提供選擇壓力前再培養72小時。對那些不含有在真核細胞中起作用的可選擇標記的質粒，如質粒pGT-FLIN，轉化過程利用一種質粒混合物，即缺少可選擇標記的本發明表達載體和一種含有可在真核細胞中起作用的可選擇標記的表達載體。許多載體都可用於這類共轉體系，包括質粒pSV2-dhfr(ATCC 37146)、pSV2-neo(ATCC 37149)、pSV2-gpt(ATCC 37145)和pSV2-hyg(NRRL B-18039)。質粒pSV2-hyg授予真核寄主細胞對潮黴素B的抗性。該共轉化技術可用選擇標記選擇含質粒的細胞。對這些細胞進行進一步的考察以鑑定出含有兩種轉化質粒的細胞。當然，本發明還包括含有對真核細胞可選擇標記的表達載體，因此不需使用共轉化技術。
對用授予潮黴素抗性的基因的質粒(如質粒pGT-FLIN-h)轉染的細胞，將潮黴素B加入生長培養基中至最終濃度為約200μg/ml。然後將所述細胞與培養基在37℃下培養2-4周，3-4天換一次培養基。將所得潮黴素抗性菌落轉移到鑑定用的單個培養瓶中，質粒pSV2-neo授予新黴素抗性(G418也用於代替新黴素)，G418抗性菌落的選擇基本上按照潮黴素抗性細胞的選擇方法進行，只是G418的最終濃度加到400μg/ml。
用二氫葉酸還原酶(dhfr)基因或授予氨甲蝶呤抗性的dhfr基因衍生物作為選擇性標記將基因或質粒引入dhfr-缺陷型細胞系中，然後用氨甲蝶呤放大質粒拷貝數量的方法在文獻中已有記載。293細胞為dhfr陽性，因此含有包含dhfr基因的質粒的轉化株不是僅僅基於dhfr陽性表型進行選擇，它還能夠在缺少次黃嘌呤和胸腺嘧啶的培養基中生長。缺少功能性dhfr基因並用含dhfr的質粒轉化的細胞系可根據dhfr表型進行選擇。儘管用dhfr在產dhfr的細胞中作為可選擇和可放大標記的方法還未很好地研究，文獻中的記載證明dhfr可在產生dhfr的細胞中用作選擇性標記和用於基因放大作用。本發明不被用於表達載體的可選擇標記所限制。而且，還可使用可放大標記，如金屬硫因基因、腺苷脫氨酶基因或多基因抗性類成員如P-糖蛋白基因。
用質粒pGT-FLIN和授予潮黴素抗性的載體的混合物轉化293和AV12細胞系，然後選擇潮黴素抗性細胞，產生許多轉化株。(其它轉化株通過用質粒pSV2-neo作為共轉化載體並選擇G418抗性細胞而得到)。本實例的方法可用於本發明的每一個HPC酶原質粒。
實例4選擇分泌人蛋白C酶原突變型的細胞將實例3得到的潮黴素抗性轉化株以每個組織培養皿幾百個細胞克隆的密度培養在100mm組織培養皿中。潷出培養基，細胞用5ml Hank氏平衡鹽溶液(Gibco)衝洗兩次。通過將1ml 1.8%瓊脂(47℃)與3ml Dulbecco;s Modified Eagle′s(DME)鹽(Gibco，37℃)混合而製備無菌的0.45%瓊脂溶液(Sigma Type 4 agarose，catalogue ＃A3643，Sigma Chemical Co.，P.O.Box 14508，St.Louis，MO 63178)，並將2ml該0.45%瓊脂溶液鋪於所述細胞上。
將硝酸纖維濾膜(Schleicher和Schuell公司，Keene，NH 03431)煮沸，然後高壓滅菌2小時以除去對細胞有毒的溼潤劑。將濾膜置於瓊脂糖層上，除去氣泡後在37℃下培養1-3小時。然後除去濾膜並放入PBS(50mM Tris-HCl，pH＝7.2，和150mM NaCl)，所述濾膜預先標記以表明其在平皿中的原始取向以便於以後的菌落鑑定。
為保持濾膜分析期間細胞在平皿上存活，在細胞上蓋一個含有2ml 1.8%瓊脂(47℃)、2ml DME鹽(37℃)和4ml加有20%胎牛牛血清的DME鹽溶液(37℃)的8ml混合物。然後將細胞置於37℃培養箱中。
在濾膜上的所有洗滌和反應當濾膜在搖動的平面上時完成。將所述濾膜首先通過在含5%牛奶的PBS中於室溫下保溫而阻滯，然後在PBS中衝洗4次(每次5分鐘)。將10μg/ml生物素化的羊抗人蛋白C多克隆抗體的2.5%牛血清清蛋白溶液加到該濾膜上(以足夠的量蓋在濾膜上)，然後將該濾膜在37℃下培養1小時。
用於後面製備抗蛋白C抗體的蛋白C的純化，可按照Kisiel所述方法(1979.J.Clin.Invest.64761)而完成。多克降抗體可利用E.A.Kabat公開的方法而製備(Structural Concepts in Immunology andImmunochemistry，published in 1968 by Holt，Rhinehart，and Winston)。單克隆抗體也適用於所述檢測，單克隆抗體可如Kohler和Milstein公開的方法(1975，Nature，256495)或如美國專利4，696，895、EPO Pub.205046號、Laurell等人(1985，FEBS 191(1)75)、Suzuki等人(1985，J.Biochem、97127-138)和EPO Pub.138222號公開的方法製備。用於所述分析的抗生素D和生物素化的馬辣根過氧化物酶(HRP)以Vectastain藥合(Veotor Laboratories，Inc.，30 Ingold Road，Burlingame，CA 94010)得到。生物素也得自Vector Labora tories，Inc.
膜濾用PBS在4℃下衝洗四次。然後，製備抗生素D和生物素化的辣根過氧化物酶，並按照Vectastain(Vector Laboratories)藥合廠商的指示加入。將所述濾膜與HRP-結合的抗生素D一起在4℃下保溫1小時(當分泌蛋白量小時，也可用更長時間，如過夜);然後，濾膜在4℃下用PBS衝洗四次。
為顯示濾膜上指示劑的顏色，將溶於冰冷的100%甲醇中的約30mg HRP(4-氯-1-萘酚，Sigma)加到50ml PBS和30μl 30%HO中。再將該混合物加到硝酸纖維濾膜上，室溫下保溫至顯色。分泌本發明人蛋白C酶原最多的菌落，在濾膜上的指徵不僅顯色最早，而且顏色較深。
濾膜顯色後，用原來的平皿再次印跡濾膜以確定菌落與濾膜上印跡的關係。然後選出分泌本發明人蛋白C酶原最多的菌落並用於生產所述酶原。
本領域專業人員會明白上述檢測僅僅是說明鑑定高度分泌細胞系的方法。許多檢測法都可成功地用於該方法。例如，可以用雙抗體反應，即用羊抗蛋白C抗體(IgG)和生物素化的抗羊IgG抗體代替生物素化的羊抗蛋白C抗體。
酶原突變體可從細胞培養物中純化。從表達所述重組產物的細胞中除去上清液並在Pharmacia Fast flow-Q柱上純化。將約1ml樹脂用20mM Tris-HCl(pH7.4)、0.15M NaCl、5mM EDTA和4mM苄脒平衡。將培養物上清液通過加入Tris-HCl(pH8.0)調到pH7.4，並調到5mM EDTA和4mM苄脒。將該上清液上樣到柱中的樹脂上，用3倍柱體積的Tris-HCl(pH7.4)、0.15M NaCl洗柱。利用含10mM CaCl、150mM NaCl的20mM Tris-HCl(pH7.4)的洗脫緩衝液從柱中洗下重組產物。
產物的比活按照Grinnell等人的方法(1987，Biotechnology 51189-1192)測定如下將從柱中洗脫下的濃縮產物先用固相凝血酶-凝血調變蛋白複合物活化。產物的醯胺解活性通過水解三肽底物S-2366(得自Helena Labs)而測定。產物的抗凝活性利用得自Helena的試劑通過延長活化的部分凝血致活酶的時間而測定。
權利要求
1.一種製備重組DNA載體的方法，包括將(Ⅰ)重組DNA克隆載體和(Ⅱ)含有一種蛋白質編碼順序的DNA化合物相連接，所述蛋白質從氨基端到羧基端含有a)一種γ-羧基化的分泌蛋白的信號肽和前肽；b)人蛋白C輕鏈；c)選自賴氨酸-精氨酸、精氨酸-賴氨酸、賴氨酸-賴氨酸及精氨酸-精氨酸的二肽；及d)胺基酸殘基順序ASP THR GLU R1R2R3R4R5R6R7R8R9R10R11R12GLY LYS MET THR ARG ARG GLY ASP SER PRO TRP GLN VAL VAL LEU LEU ASP SER LYS LYS LYS LEU ALA CYS GLY ALA VAL LEU ILE HIS PRO SER TRP VAL LEU THR ALA ALA HIS CYS MET ASP GLU SER LYS LYS LEU LEU VAL ARG LEU GLY GLU TYR ASP LEU ARG ARG TRP GLU LYS TRP GLU LEU ASP LEU ASP ILE LYS GLU VAL PHE VAL HIS PRO ASN TYR SER LYS SER THR THR ASP ASN ASP ILE ALA LEU LEU HIS LUE ALA GLN PRO ALA THR LEU SER GLN THR ILE VAL PRO ILE CYS LEU PRO ASP SER GLY LEU ALA GLU ARG GLU LEU ASN GLN ALA GLY GLN GLU THR LEU VAL THR GLY TRP GLY TYR HIS SER SER ARG GLU LYS GLU ALA LYS ARG ASN ARG THR PHE VAL LEU ASN PHE ILE LYS ILE PRO VAL VAL PRO HIS ASN GLU SER GLU VAL MET SER ASN MET VAL SER GLU ASN MET LEU CYS ALA GLY ILE LEU GLY ASP ARG GLN ASP ALA CYS GLU GLY ASP SER GLY GLY PRO MET VAL ALA SER PHE HIS GLY THR TRP PHE LEUVAL GLY LEU VAL SER TRP GLY GLU GLY CYS GLY LEU LEU HIS ASN TYR GLY VAL TYR THR LYS VAL SER ARG TYR LEU ASP TRP ILE HIS GLY HIS ILE ARG ASP LYS GLU ALA PRO GLN LYS SER TRP ALA PRO-COOH其中R1選自ASP和LEU、R2選自GLN和HIS，R3選自GLU和LYS，R4選自ASP和LEU，R5為GLN，R6選自VAL和THP，R7選自ASP、PHE和TYR，R8為PRO，R9為ARG，R10選自LEU和THR，R11為ILE或缺失，R12為ASN，-COOH為羧基端。
2.權利要求1的方法，其中由所述DNA編碼的多肽為
其中R1為ASP、R2為GLN、R3為GLU、R4為ASP、R5為GLN、R6為VAL、R7為ASP、R8為PRO、R9為ARG、R10為LEU、R11缺乏、R12為ASN。
3.產生選自質粒pLPC-N和pGT-N的權利要求2的方法。
4.權利要求1的方法，其中由所述DNA編碼的多肽為
其中R1為ASP、R2為GLN、R3為GLU、R4為ASP、R5為GLN、R6為VAL、R7為PHE、R8為PRO、R9為ARG、R10為LEU、R11缺失、R12為ASN。
5.產生質粒pLPC-FN的權利要求4的方法。
6.權利要求1的方法，其中所述DNA編碼的多肽為
其中R1為ASP、R2為GLN、R3為GLU、R4為ASP、R5為GLN、R6為VAL、R7為PHE、R8為PRO、R9為ARG、R10為LEU、R11缺失、R12為SAN。
7.產生質粒pLPC-SC的權利要求6的方法。
8.權利要求1的方法，其中由所述DNA編碼的多肽為
其中R1為ASP、R2為GLN、R3為GLU、R4為ASP、R5為GLN、R6為VAL、R7為ASP、R8為PRO、R9為ARG、R10為LEU、R11為ILE、R12為ASN。
9.產生質粒pLPC-LIN的權利要求8的方法。
10.權利要求1的方法，其中所述DNA編碼的多肽為
其中R1為ASP、R2為GLN、R3為GLU、R4為ASP、R5為GLN、R6為VAL、R7為PHE、R8為PRO、R9為ARG、R10為LEU、R11為ILE、R12為ASN。
11.產生質粒pLPC-FLIN的權利要求10的方法。
12.一種一經從真核寄主細胞的分泌便重組產生酶原形式人蛋白C的方法，該方法包括(A)用重組DNA載體轉化一種真核寄主細胞，所述載體包括(ⅰ)編碼一種胺基酸殘基順序的DNA順序，所述胺基酸殘基順序從氨基端到羧基端包括a)一種γ-羧基化的分泌蛋白的信號肽和前肽;b)人蛋白C的輕鏈;c)一種選自LYS-ARG、ARG-LYS、LYS-LYS和ARG-ARG的二肽;和d)以下的胺基酸殘基順序
其中R1選自ASP和LEU，R2選自GLN和HIS，R3選自GLU和LYS，R4選自ASP和LEU，R5為GLN，R6選自VAL和THR，R7選自ASP、PHE和TYR，R8為PRO，R9為ARG，R10選自LEU和THR，R11為ILE或缺失，R12為ASN，-COOH為羧基端;和(ⅱ)定位驅動所述DNA順序表達的啟動子，(B)將步驟(A)中轉化的寄主細胞培養在允許所述DNA順序表達的條件下，和(C)從所述培養物中回收所述酶原形式的蛋白C。
13.權利要求12的方法，其中在部驟(B)中培養的所述寄主細胞選自293/pLPC-N、293/pGT-N、293/pLPC-FN、293/pLPC-SC、293/pLPC-LIN和293/pLPC-FLIN寄主細胞。
全文摘要
本發明描述了一種重組產生酶原型人蛋白C的方法，所述酶原型蛋白C不同於天然酶原蛋白C，它們對凝血酶和凝血酶/凝血調變蛋白的活化作用更為敏感。本發明還公開了該方法所用的DNA化合物、載體和轉化體。
文檔編號C12P21/02GK1054798SQ9110119
公開日1991年9月25日 申請日期1991年2月23日 優先權日1989年12月5日
發明者布魯斯·E·格裡茨, 布賴恩·威廉·格林內爾 申請人:伊萊利利公司