大豆根的維管束特異表達啟動子及其應用的製作方法

2023-05-03 19:35:51 1

本發明涉及植物基因工程領域，特別是涉及一種大豆根的維管束特異表達的GmPHT1.14啟動子及其應用。

背景技術：

啟動子是基因中重要的順式作用元件，一般位於轉錄起始位點上遊幾十個鹼基處。啟動子根據轉錄模式不同可分為三種：組成型啟動子、組織或器官特異性啟動子和誘導型啟動子。組織或器官特異性啟動子的活性是受特定的組織細胞結構和化學、物理信號誘導調節的，即這類啟動子的表達具有特定的時空性。在這類啟動子的驅動下，基因的表達往往只限於某些特定的器官或組織部位或特定的發育時期。組織或器官特異性啟動子不僅能使目的基因的表達產物在一定器官或組織部位積累，提高區域表達量，同時也可以避免目標基因在其他組織器官中表達造成的不利影響。

到目前為止，已有大量的組織或器官特異性啟動子被分離出來，其中包括葉片特異啟動子、花特異啟動子和種子特異啟動子及根特異啟動子等。根是植物體吸收水分和營養物質的重要器官，根特異表達系統可用於研究植物的高滲脅迫耐受、植物修復和根際分泌等。Borisjuk等用根特異啟動子mas2、GFP和菸草鈣網蛋白(calreticulin)基因構建融合表達載體。轉基因菸草水培研究結果表明：根細胞不僅能夠高效產生GFP，而且可將目的蛋白質分泌到液體培養基中(Borisjuk et al.,1999)。此外，應奇才等運用松樹根特異性啟動子PmPgRP10驅動CMO/BADH雙價基因並轉入水稻。對轉基因植株根和葉的CMO酶、BADH酶活性及其它生理生化指標進行了測定，結果表明：CMO/BADH雙價基因可在根部特異性表達(應奇才，2006)。

GmPHT1.14基因屬於植物磷轉運蛋白的家族成員，在調控磷的轉運過程中起著重要的作用。因此有必要研究和獲得調控大豆磷轉運基因GmPHT1.14的啟動子序列，從而為深入研究植物磷轉運過程提供有效手段和途徑。

技術實現要素：

本發明的目的在於提供調控大豆磷轉運基因GmPHT1.14的啟動子序列，從而為在各種作物、林木、蔬菜、花卉、牧草等植物的根的維管束中特異表達目標基因提供有效途徑。

為達到以上目的，本發明提供了一種大豆根的維管束特異表達的GmPHT1.14啟動子，其具有：

1)SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；或

2)SEQ ID No.1所示核苷酸序列經取代、缺失和/或添加一個或幾個核苷酸所獲得的具有同等功能的由1)衍生的核苷酸序列。

應當理解，本領域技術人員可根據本發明公開的大豆磷轉運基因GmPHT1.14的啟動子(SEQ ID No.1)，在不影響其活性的前提下，取代、缺失和/或增加一個或幾個核苷酸，得到所述啟動子的突變序列。例如在非活性區段，在不改變啟動子功能的情況下，進行以下取代方式中的至少一種所獲得的核苷酸序列：將第637位的T取代為A,將第2233位的A取代為T,將第3096位的G取代為C。

本發明還提供了含有GmPHT1.14啟動子的載體、宿主細胞、轉化植物細胞或表達盒。

在本發明中，可選用本領域已知的各種載體，只要適合GmPHT1.14啟動子的表達即可，例如可以為市售的載體及質粒。

本發明還提供了GmPHT1.14啟動子或含有其的上述生物材料在調控下遊基因在植物根的維管束中特異表達中的應用。

本發明還提供了GmPHT1.14啟動子或含有其的上述生物材料在提高下遊基因在植物根的維管束中表達量的應用。

本發明還提供了GmPHT1.14啟動子或含有其的上述生物材料在製備轉基因植物中的應用。

本發明還提供了GmPHT1.14啟動子或含有其的上述生物材料在植物根發育調節中的應用。

本發明還提供了GmPHT1.14啟動子或含有其的上述生物材料在植物種質資源改良中的應用。

本發明還提供了GmPHT1.14啟動子或含有其的上述生物材料在植物育種中的應用。

優選地，上述植物為作物、林木、蔬菜、花卉、牧草。

更優選地，上述植物為作物。最優選為大豆。

本發明還提供了從大豆基因組中克隆得到4987bp的GmPHT1.14啟動子序列所用的特異性引物，其包括正向引物：5』-attgGAGCTCAGTGAAAGTAACATGGACCTAT-3』和反向引物：5』-gagtCTGCAGTAATTACTACTAAAATTGTTGGC-3』

含有上述特異性引物的試劑盒也屬於本發明的保護範圍。

上述特異性引物也可用於檢測本發明所述的大豆磷轉運基因GmPHT1.14的啟動子。

本發明首次分離了大豆根的維管束中特異表達的GmPHT1.14啟動子，利用GmPHT1.14啟動子表達GUS基因，結果表明GmPHT1.14啟動子可明顯促進植物根的維管束中GUS基因的表達量，因而，GmPHT1.14啟動子在植物根的維管束具有特異性，適合在各種作物、林木、蔬菜、花卉、牧草等植物的根的維管束中特異表達目標基因並能夠提高目標基因的表達量。

附圖說明

圖1為GmPHT1.14-GUS僅在大豆根的維管束中表達。A圖為根瘤誘導前的染色結果。B圖為根瘤誘導後的染色結果。

具體實施方式

以下實施例用於說明本發明，但不用來限制本發明的範圍。

若未特別指明，實施例中所用的化學試劑均為常規市售試劑，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段。

實施例1大豆GmPHT1.14啟動子的克隆

利用正向引物5』-attgGAGCTCAGTGAAAGTAACATGGACCTAT-3』和反向引物：5』-gagtCTGCAGTAATTACTACTAAAATTGTTGGC-3』從大豆基因組中PCR擴增並測序獲得長度為4987bp的GmPHT1.14啟動子，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。PCR產物兩端分別帶有Sac I和Pst I的酶切位點及保護鹼基。

上述PCR擴增體系為：(20μl體系)

PCR程序：95℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃3min，共25個循環；72℃10min。

實施例2大豆GmPHT1.14啟動子調控下遊基因GUS的表達情況

根據實施例1中PCR克隆得到GmPHT1.14啟動子，切膠回收產物用Sac I和Pst I雙酶切。將載體pCAMBIA3301(pCAMBIA3301購自澳大利亞Cambia公司)先用HindⅢ和Nco I雙酶切掉35S啟動子後用Klenow補齊成平末端，Solution I自連後轉化至DH5α中擴繁。提質粒後再用SacI和Pst I雙酶切，回收後與GmPHT1.14啟動子的回收片段用Solution I連接。獲得雙元表達載體pGmPHT1.14::GUS，將植物表達載體pGmPHT1.14::GUS轉化至大腸桿菌DH5α中擴繁。

大腸桿菌感受態細胞的轉化，包括：(1)製備含卡那黴素的LB固體培養基；(2)取出貯存於-80℃的感受態細胞，冰浴中融化後，加入5μl連接產物輕輕混勻，冰浴中放置30分鐘；(3)42℃熱激30秒，然後立即置於冰浴中3分鐘；加入300μl不含抗生素的LB液體培養基，37℃搖床振蕩培養1小時(160rpm)；(4)取適量培養液均勻塗於選擇性培養基上，37℃倒置培養16小時，用滅菌牙籤挑取5-10個(或更多)菌落，置於200μl選擇性液體LB培養基中搖菌培養；(5)PCR檢測篩選到的陽性克隆擴繁提質粒後轉化農桿菌EHA105。通過髮根農桿菌介導轉化方法，將pGmPHT1.14::GUS轉入大豆天隆一號，獲得轉化pGmPHT1.14::GUS的髮根50條。

GUS活性分析表明，GmPHT1.14啟動子在植物的根的維管束中特異表達，見圖1，由圖1的根瘤誘導前的表達和誘導後的表達對比來看，GmPHT1.14啟動子能夠在植物根的維管束中特異表達，可見該啟動子可用於包括各種作物、林木、蔬菜、花卉、牧草等在內的各種植物根的維管束中特異表達目標基因。

髮根農桿菌介導的大豆轉化方法：

(1)將大豆用氯氣燻蒸法滅菌12個小時後，取出置於超淨臺吹淨剩餘氯氣後，用滅菌的超純水浸泡16小時備用；

(2)將帶有pGmPHT1.14::GUS的農桿菌K599挑單克隆活化後，試管小搖後用YEP大搖至菌液OD在0.8-1.0之間，4000轉，22℃離心10min後，重懸於LCCM(1/10X Gamborg B5鹽,30g/L蔗糖,3.9g/L MES,pH 5.4.滅菌後加入40mg/L乙醯丁香酮)中；

(3)將浸泡好的大豆的胚根切下，以下胚軸為外植體，將外植體浸於重懸菌液中30min完成侵染，在濾紙上吸乾浸染液，將侵染後的大豆外植體置於CCM(1/10X Gamborg B5鹽,30g/L蔗糖,3.9g/L MES,4.25g/L瓊脂,pH 5.4.滅菌後加入Cysteine 400mg/L,and 40mg/L乙醯丁香酮)上避光培養3天；

(4)將共培養後的大豆外植體的下胚軸插入髮根誘導培養基(1X Gamborg B5鹽,30g/L蔗糖,and 0.59g/L MES,7g/L瓊脂，pH5.7.滅菌後加入Cefotaxime 100mg/L)中，長日光照下培養10-14天誘導髮根，髮根生長至2cm時，取材。

(5)將誘導成熟的髮根(根長≥3cm)取出洗淨培養基，置於根瘤菌HH103懸浮液中浸染30min，完成根瘤菌接種，將接種後的髮根複合植株置於澆灌BD營養液的蛭石中，長日光照培養12-14天後可見幼嫩根瘤，取材。

轉化株的GUS染色：

(1)將組織樣品加入90％丙酮中，置於冰上20～30分鐘；

(2)經丙酮處理後，用50mM磷酸緩衝液(pH7.2)、2mM K4Fe[CN]6及2mM K3Fe[CN]6溶液潤洗組織；

(3)將樣品放在X－Gluc染色液中(50mM磷酸緩衝液(pH7.2),1mM X-gluc,2mM K4Fe[CN]6,2mM K3Fe[CN]6)，抽氣10分鐘，然後37℃染色過夜；

(4)第二天用70％乙醇脫色；

(5)在載玻片上加幾滴HCG溶液，將脫色後的樣品置於其中；

(6)壓片，透明15分鐘或者過夜透明(根據組織的發育時期而定)。

GUS染色液配方：

20mM X-gluc(MW＝521.8)

用DMSO或N,N-二甲基甲醯胺溶解，100mg X-gluc需用9.58ml DMSO溶解,終濃度為20mM。

50mM磷酸緩衝液(pH7.0)

A液：NaH2PO4·2H2O 3.12g溶於無菌蒸餾水，定容至100ml；

B液：Na2HPO4·12H2O 7.17g溶於無菌蒸餾水，定容至100ml；

取39mlA液與61mlB液混合。

染色液配製：5mM鐵氰化鉀；5mM亞鐵氰化鉀；10mM EDTA；50mM磷酸緩衝液；1mM X-gluc。

雖然，上文中已經用一般性說明及具體實施方案對本發明作了詳盡的描述，但在本發明基礎上，可以對之做一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬於本發明要求保護的範圍。