一種提高靈芝生物產量和多糖含量的方法

2023-05-03 14:42:46 3

專利名稱:一種提高靈芝生物產量和多糖含量的方法
技術領域：
本發明屬於轉基因食用真菌技術領域：
。具體涉及一種通過轉基因技術將尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因轉入食用真菌靈芝中過量表達，從而提高靈芝生物產量和多糖含量的方法。
背景技術：
尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(UDP-glucosepyrophosphorylase, UGPase, EC 2. 7. 7. 9)是生物體內的一種重要酶類，與糖類代謝過程密切相關。UGPase可催化一依賴鎂的可逆反應，反應式如下UTP+G-1-P—— UDPG+PPi。尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG)是葡萄糖的主要活化形式，可作為葡萄糖基的供體，參與蔗糖、澱粉、纖維素、半纖維素、果膠質以及糖脂、糖蛋白、糖原、β-葡聚糖等多種碳水化合物的合成代謝(KleCZkOWSki，1994)。
至今有關UGPase過量表達的研究不多，有研究表明提高黃芪毛狀根中UGPase的活性，可提高黃芪多糖的含量。黃芪總多糖積累量和UGPase活性之間呈正相關，兩者的相關係數達到0. 928，可溶性多糖與UGPase活性的相關係數則達到0. 957(吳曉俊，劉滌， 胡之璧.黃芪毛狀根中尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶活性與多糖含量關係的研究，上海中醫藥大學學報，2000，14 ) 53-55) ；UGPase在菸草、楊樹中的過量表達顯示相應的轉基因生物可溶性糖含量增加，木質素、纖維素含量及整體生物量有不同程度的增加(Coleman HD, Ellis DD, Gilbert Μ, et al. Up—regulation ofsucrose synthase and UDP-glucose pyrophosphorylase impacts plant growthand metabolism. Plant Biotechnology Journal，2006，4 :87-101) ；UGPase在水稻中的過量表達可以使水稻結實粒數和單株粒重等產量性狀得到明顯改善(公開號CN 1614023A的發明專利申請)；也有報導在大腸桿菌中過量表達低聚糖合成途徑中兩個關鍵的酶UGPase和葡萄糖磷酸變位酶基因，使 UDPG的合成量提高，從而提高了低聚糖的含量(Mao Z. Shin HDand Chen RR. Engineering the Ε.coli UDP-glucose synthesis pathway foroligosaccharide synthesis. Biotechnology Progress,2006,22(2) :369-74)。
但是，UGPase在真菌中的過量表達未見相關技術報導。因真菌生長和菌絲結構的特殊性，上述現有的UGPase過量表達技術在真菌中沒有更多的可複製和參比性。
靈芝是重要的藥用真菌，靈芝多糖含量是靈芝的主要藥用成分之一，靈芝多糖作為靈芝中最主要的藥用成分，藥理活性廣泛，具有提高機體免疫功能、抗腫瘤、消除機體內自由基延緩衰老、抗輻射、提高肝臟解毒功能等作用，是決定靈芝品質的重要因素。而目前國內外在提高靈芝多糖產量方面的研究大多集中在菌種誘變選育和發酵條件的優化方面 (李剛，楊凡，李瑞雪等.原生質體紫外誘變選育靈芝新菌種的研究.微生物學報，2001， 41 (2) :229-233;孫金旭，朱會霞.生長因子對靈芝生長及多糖產量的影響.中國釀造， 2008，24:69-71)，這些方法也都在一定的程度上提高了靈芝多糖的含量。
目前為止，根據代謝工程的原理，利用基因工程來改造菌株，從而提高多糖含量的方法尚未見有報導。

發明內容
本發明的目的是克服現有技術的不足，通過轉基因技術將多糖合成相關功能基因轉入靈芝真菌中，獲得靈芝多糖含量穩定提高的轉基因靈芝菌株。
本發明的技術方案是通過大量實驗篩選對比研究，將從水稻中克隆的與多糖代謝相關的關鍵酶基因-尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因(Oryza sativa UDP-glucose pyrophosphorylase 2，0sUgp2, GenBank 登錄號為 AF249880)與構巢麴黴(Aspergillus nidulans) 3_ 舞酸甘油Ig月兌S1S!基因(Glyceraldehyde-3-phosphate Dehydrogenase, gpd) 的啟動子連接，構建了過量表達載體，命名為OsU-gpd。所述載體具有完整的左右邊界序列， 選擇標記基因為潮黴素抗性基因，適合農桿菌介導法轉化靈芝。
本發明進一步通過農桿菌介導法將表達載體OsU-gpd轉入靈芝，得到具有潮黴素抗性的轉化菌株。並對轉化菌株進行了 PCR(聚合酶鏈反應)、Southern雜交分析、 RT-PCR(逆轉錄-聚合酶鏈反應)、表達產物UGPase酶活性檢測等的一系列鑑定，證明獲得的轉化菌株外源基因0sUgp2成功插入受體靈芝基因組中，並成功表達，有效提高靈芝的生物產量和多糖含量。
本發明的有益效果是
本發明通過轉基因技術將多糖合成相關功能UGPase基因轉到紫芝菌株中去，獲得多糖含量明顯提高的轉基因靈芝，為提高靈芝多糖含量，培養靈芝新菌株開闢一條新的途徑。採用苯酚-硫酸法分別測定發酵第7天的紫芝菌絲體的胞內多糖含量、胞外多糖含量及菌絲體乾重。實驗結果表明第一代轉化菌株的多糖平均含量為9. 56mg/g菌粉，比野生型對照菌株提高了 12. 3% ；胞外多糖含量為82. 52mg/L與對照野生型菌株相比提高了 22.96%。此外，轉化菌株的生物量也得到增加，第一代轉化菌株的菌絲體乾重平均達到 6. 45g/L，比對照菌株提高了 7. 7%。採用SPSS13. 0數據統計分析軟體分析了 UGPase酶活力與多糖含量之間的相關性，結果表明紫芝菌絲體的總糖含量，胞內多糖含量和胞外多糖含量與UGPase的酶活力都顯示了較強的相關性，其相關係數分別為0. 826，0. 980和0. 815。 其中胞內多糖含量與UGPase酶活力的相關性最高達0. 98，說明了 UGPase主要參與了胞內多糖的合成。本發明得到的轉0sUgp2的轉基因紫芝菌株，紫芝的多糖含量和生物量均得到明顯提高，為提高食用和藥用真菌多糖含量提供了新的實用技術和趨勢，具有良好的應用和開發前景。


圖1 0sUgp2過量表達載體OsU-gpd T-DNA區示意圖
圖2轉化紫芝菌絲體在含有20 μ g/mL潮黴素(Hyg)的MYG培養基平板上生長1 周的情況
圖3轉基因紫芝的PCR鑑定
圖4轉基因紫芝的Southern雜交分析
圖5 RT-PCR分析轉基因菌株外源基因0sUgp2的表達
具體實施方式
本發明方法適用於赤芝(G. Iucidunz)、紫芝(G. sinense)、松杉靈芝(G. tsugae)或樹舌(G. applenatum)等靈芝，實驗步驟大致相同。下面以紫芝為例，結合附圖和具體實施過程進一步詳細說明本發明，其它種類的靈芝不一一在實施例中贅述，但並不因此限定本發明範圍。
實施例1 農桿菌介導法轉化紫芝
(1)農桿菌介導的靈芝過量表達載體OsU-gdp的構建
本實施例轉化載體可選用通過農桿菌介導的常規二元表達載體，在T-DNA兩邊界間，插入真菌中表達的啟動子(本實施例中為gpd啟動子)，再加上本發明所述的目的基因 (尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因)，及選擇性標記基因(本例為潮黴素抗性基因)即可得到農桿菌介導的靈芝轉化載體。
本實施例中表達載體OsU-gdp，是採用上述常規方法，在由W^i啟動子驅動的 0sUgp2過量表達，用於農桿菌介導轉化水稻的表達載體(命名為OsU-ubi，載體結構見附圖 1)基礎上構建的。
以含gpd啟動子的pAN7-l質粒為模板，設計引物擴增gpd啟動子片段。所述 pAN7_l 質粒資料可參考 Punt P. J. et al ；Transformation ofAspergillus based on the hygromycin B resistance marker fromEscherichia coli. Gene,1987,56(1) :117-124,市面可購買得到。本實施例使用的PAN7-1質粒為中山大學李剛老師惠贈，李剛等人Q004) 構建了真菌表達質粒PAN7-1 (6. 7kb)，攜帶有構巢麴黴gpd (3-磷酸甘油醛脫氫酶)基因的啟動子。
引物序列為P_F :5，-AGCTCTAGAGAATTCCCTTGTATCTCTAC ；
P-Rl :5，-CTCACTAGTGTTCTTGGATGGGAAGATG。
在上遊引物的5』端設計)(ba I酶切位點，在下遊引物的5』端設計Spe I酶切位點。進行PCR擴增，擴增條件為(1)預變性94°C 1分鐘；(2)94°C 30秒，52°C 30秒，72°C 2 分6秒，進行5個循環；⑶94 V 30秒，55 °C 30秒，72 °C 2分6秒，進行25個循環；(4) 72 °C 延伸5分鐘。對PCR擴增產物進行)(ba I與Spe I雙酶切處理，並將其連接入經)(bal與 Spe I雙酶切處理的OsU-ubi中，使得OsU-ubi原有的Ubi啟動子被gpd啟動子所取代，獲得OsU-gpd表達載體，0sUgp2過量表達載體OsU-gpdT-DNA區示意圖見附圖1。該表達載體經測序鑑定序列正確後，導入農桿菌LBA4404，於_70°C中保存菌種。
(2)農桿菌介導的紫芝轉化及轉基因紫芝菌株的篩選
(A)紫芝菌絲體的培養
用滅過菌的離心管量取5mL活化好的紫芝菌絲體接種於裝有玻璃珠的50mL的 CYM液體培養基(10g/L麥芽糖，20g/L葡萄糖，2g/L酵母提取物，2g/L胰蛋白腖，0. 5g/L MgSO4. 7H20,4. 6g/L KH2PO4)中，28°C、120rpm/min，培養 7 天后可用於轉化。
紫芝菌絲體活化的過程將常規的紫芝菌種(Ganoderma sinense)斜面從4°C冰箱中取出，取斜面上約0. 5cm2大小的紫芝菌絲體1塊，接種至固體PDA培養基(馬鈴薯去皮切碎，煮成汁，4 層紗布過濾，20g/L 葡萄糖，lg/L KH2PO4,0. 5g/L Mgcl2,0. 01g/L VB1,15g/L 瓊脂條)平板上，置於培養箱中培養7天。用0. 5cm2大小的接種環挑取該平皿邊緣的菌絲體6塊，用無菌接種刀切碎後將其接種到無菌的液體PDA培養基(馬鈴薯去皮切碎，煮成汁，4層紗布過濾，20g/L葡萄糖，lg/L KH2PO4,0.5g/L Mgcl2,0. 01g/L VB1)中，28°C、150rpm/ min，培養7天，得到活化好的菌絲體。本實施例採用的紫芝菌種(Ganoderma sinense)從廣東省微生物研究所購買。
(B)農桿菌的活化
取出於_70°C中保存、含有重組質粒OsU-gpd的農桿菌菌種LBA4404，在含有卡那黴素(kan)和利福平(Rif)的YEB培養基(5g/L Nacl，10g/L酵母提取物，10g/L胰蛋白腖) 上進行劃線培養，黑暗培養2天後挑取單菌落接種到2ml (含卡那黴素)100 μ g/mL,利福平50 μ g/mL) YEB液體培養基中，於，200rpm/min振蕩培養過夜，第二天加入乙醯丁香酮(AS)至終濃度200 μ mol/L,繼續振蕩培養至OD55tl為0. 5左右，再於、150rpm/min 振蕩培養，每5分鐘測一次OD值，至OD值為0. 6 0. 8左右，即可用於侵染。
(C)農桿菌介導的紫芝菌絲體轉化
在超淨臺中用100目網篩過濾培養好的紫芝菌絲體，並用無菌水衝洗3 4次， 用ImL無菌水懸浮。取100 μ L懸浮的靈芝菌絲體與上述100 μ L活化好的農桿菌混勻， 塗布在CYM固體培養基(10g/L麥芽糖，20g/L葡萄糖，2g/L酵母提取物，2g/L胰蛋白腖， 0. 5g/L MgSO4. 7Η20，4· 6g/LKH2P04,15g/L瓊脂條)上，於培養箱中28°C黑暗共培養2天後， 在平板上倒入IOmL篩選培養基(CYM固體培養基+潮黴素(Hyg) 20 μ g/mL+頭孢唑林鈉 (Cefo) 500 μ g/mL)，於繼續培養3天，篩選轉化菌株，肉眼可見白色的再生菌落。繼續培養5天，將新長出的轉化菌株轉接到篩選培養基上篩選，每天轉接一次，轉接2 3次， 直到沒有農桿菌的生長，待菌絲體長大為直徑約5cm時，則保存菌種，用於下一步的檢測分析。
得到的轉化菌株在不含潮黴素抗生素的MYG培養基(10g/L麥芽糖，4g/L葡萄糖， 4g/L酵母提取物，lg/L胰蛋白腖，15g/L瓊脂條)上繼代培養5代後，再在添加有潮黴素 (Hyg)的MYG培養基上培養，篩選得到潮黴素抗性的紫芝轉化菌株，轉化紫芝菌絲體在含有 20 μ g/mL潮黴素的MYG平板上生長1周的情況見附圖2，其中，CK為野生型菌株；1 3為轉化菌株。
實施例2轉基因紫芝的PCR鑑定和Southern鑑定
(1)轉基因紫芝總DNA的製備(CTAB法)
稱取0. 2g左右真空抽乾的菌絲體於研缽中，加液氮研磨成粉末，轉移到2mL的離心管中，加CTAB抽提液[lOmmol/L Tris-HCL，2. 0 %十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)， 20mmol/L 乙二胺四乙酸(EDTA)，1. 4mol/LNaCl, ρΗ8· 0] ImL 禾口 CTAB 沉澱液(50mmol/L Tris-HCL, 1. 0% CTAB, 10mmol/L EDTA, pH 8. 0) 100 μ L 後混合，於 65 °C 靜置 1 小時後以 12000rpm離心10分鐘，取上清，加上清液的1/10體積的CTAB/NaCl溶液(1. 0 % CTAB, 0. 7mol/L NaCl)，混勻，然後再加入等體積的M 1的氯仿異戊醇溶液，混勻，抽提， 搖動幾分鐘，4°C、8000rpm條件離心10分鐘後取上清，再加入等體積氯仿，搖動5分鐘， SOOOrpm離心10分鐘，取上清，加入等體積的CTAB沉澱液，混勻，65°C下靜置30分鐘產生沉澱，於4°C、6000rpm離心10分鐘，倒去上清，用70%酒精洗滌2次，風乾，溶於50 μ L 0. 5XTE(5mmol/L Tris-HCL, 0. 5mmol/L EDTA, ρΗ8· 0)，_20°C保存備用。
(2)轉基因紫芝的PCR鑑定
取適量的轉基因紫芝總DNA進行Hpt (潮黴素基因)和0sUgp2 (目的基因)部分序列的PCR擴增，轉基因紫芝的PCR鑑定結果見附圖3所示，其中，a為Hpt基因擴增結果b 為0sUgp2基因擴增結果，M為DL2000 ；CK為野生型菌株；陽性對照為農桿菌質粒；1 3為轉化菌株號。
以含有目的基因的質粒為正對照，反應體系為25 μ 1，在200 μ 1的無菌PCR專用管中依次加入
PCR 擴增反應程序為⑴預變性 94°C 5min;(2)94°C 40s，55°C 40s, 72°C 60s， 共 30 個循環；(3)72 °C 延伸 IOmin ； (4)16 °C，5min。
用於檢測Hpt引物序列
Hpt F :5，-GGACGCAACGCCTACGACTGGAC ；
HptR 5 』 TCATCGCAAGACCGGCAACAGGA3』。
用於檢測0sUgp2的引物序列
OsUF :5，GTCAGTACTATGGCGGACGAGAAGC ；
OsUR 5 』 ACAGGATCCTTCGCTCAAAGGTCCTC3 』。
(3)轉基因紫芝菌株的Southern blot分析
取紫芝菌絲(約0.5g)，採用上述CTAB法抽提總基因組DNA，選用Hind III限制性內切酶酶切菌絲總基因組DNA(約1 2μ g)，酶切12小時左右。先取少量進行預電泳檢測酶切效果，然後用0. 8%的瓊脂糖凝膠進行反轉電泳。電泳16小時後將大於81Λ大片段的凝膠部分用紫外燈照射15分鐘左右，再用0. 4mol/L NaOH進行鹼轉移8 12小時，將膠上的DNA轉移到Hybond-N+尼龍膜上。轉移結束後，將尼龍膜放入一乾淨盒子，先用少量的 2XSSC溶液簡單漂洗後，再將煮沸的0.5XSSC/0.5% SDS溶液倒入，搖動數分鐘。將尼龍膜取出，室溫晾乾，之後用保鮮紙把膜包好，4°C下保存備用。
用隨機引物標記試劑盒(TakaRa公司)進行探針標記。參照說明書在1. 5mL離心管加入Hpt的DNA探針50ng，□ /Hind III探針10ng，隨機引物2 μ L，加水體積至14 μ L。 95°C變性3分鐘，冰浴5分鐘。再在離心管中加入10 X反應緩衝液，dNTP混合物各2. 5 μ L， IyLDNA聚合酶Klenow片段，5 μ L[ □ -32P] dCTP，37°C反應20分鐘。加入等體積0. 8mol/ LNaOH變性後用於雜交。
將上述轉移後的尼龍膜放入雜交管貼於管壁，按0. ImL雜交液/cm2膜面積的量加入雜交液，65°C預雜交3小時後，再將上述標記好的探針加入雜交管中，65°C雜交16 20 小時。倒出雜交液，少量的洗膜液(0.2XSSC/0. 1% SDS)簡單衝洗一次後，再換洗膜液在 65°C雜交爐中洗膜兩次，每次30分鐘。取出尼龍膜，用保鮮膜包好，用GM計數器測量膜上同位素的計數後，壓上分子磷屏兩天。然後用FX分子磷屏成像系統進行掃描分析雜交結果， 分析結果見附圖4，其中M為λ/Hind III marker ;CK為野生型菌株；1 3為轉化菌株號。
PCR鑑定結果和Southern blot的結果(附圖3和圖4)顯示外源基因0sUgp2已成功轉入紫芝受體菌絲體中，得到的1#，2#和3#三個獨立的轉化菌株中，1#和2#各有一個拷貝的插入，3#菌株有兩個拷貝的插入。
引物:
dNTP
0. 3ymol/L 100ymol/L 2. 5μ L
IOXBuffer
Taq 聚合酶
基因組DNA (20ng/ μ L)
ddH20
IU
1 μ L 補齊25 μ Lo[0059]實施例3轉基因紫芝多糖含量和生物量的測定
(1)紫芝菌株胞內和胞外多糖的提取含量測定
採用熱水浸提法提取胞內多糖取靈芝菌粉0. 2g，用85%乙醇15mL於60°C浸提 30分鐘，重複2次，以去除單糖、雙糖、低聚糖等幹擾性成分。預處理後的菌粉於沸水浴中提取1小時，過濾定容至50mL，用於測定多糖含量。
採用乙醇沉澱法提取胞外多糖取發酵液500 μ L，加入1.5mL的95%乙醇，於4°C 靜置過夜，約18小時後離心，去上清，沉澱用無水乙醇洗滌2次，晾乾後再溶於ImLddH2O,用
於測定多糖含量。
(2)紫芝菌株多糖含量的測定
採用苯酚-硫酸法測定多糖含量
a.標準曲線的製備精確稱取乾燥至恆重的葡萄糖lOOmg，置IOOmL容量瓶中，用 ddH20定容，製成1 μ g/μ L的標準溶液。分別準確吸取標準溶液20、40、60、80、100、12(^1^， 分置於試管中，並用蒸餾水定容至2. OmL，再各加5%苯酚l.OmL，搖勻，迅速滴加濃硫酸 5. OmL，搖勻後於適當溫度下顯色25分鐘。於490nm波長處測定吸光度，繪製標準曲線，並計算其標準曲線回歸方程。另取蒸餾水2mL，作為空白對照，同上操作加苯酚和硫酸進行顯色反應。
b.多糖含量的測定準確吸取上述(1)中提取的胞內多糖樣品溶液0. 5mL或胞外多糖樣品溶液200 μ L，用蒸餾水定容至2. OmL，再各加5%的苯酚1. OmL，搖勻，迅速滴加濃硫酸5. 0ml，搖勻後於適當溫度下顯色25分鐘，於490nm波長處測定吸光度，記錄讀數。根據回歸方程求出樣品溶液中葡萄糖含量。
每g菌粉胞內多糖含量的計算多糖含量(yg/g) = cXd/w
式中c為計算出來的樣品溶液所對應的葡萄糖含量；d為供試樣品溶液的稀釋因子；w為所稱取的菌粉的重量。
每L發酵液中胞外多糖的含量計算多糖含量(yg/L) = cXdX1000/v
式中c為計算出來的樣品溶液所對應的葡萄糖含量；d為供試樣品溶液的稀釋因子；V為發酵液的體積。計算結果見表1，表中1#、2#、3#代表隨機選取的三株紫芝轉化菌株。
表1轉基因紫芝菌株菌絲乾重和多糖含量測定結果(χ士 S)
8
權利要求
1.一種提高靈芝生物產量和多糖含量的方法，其特徵在於採用構巢麴黴(Aspergillus nidulans) 3-磷酸甘油醛脫氫酶基因啟動子gpd驅動GenBank登錄號為AFM9880的水稻尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因在靈芝中過量表達，提高靈芝生物產量、胞內和胞外多糖含量。
2.根據權利要求
1所述提高靈芝多糖含量的方法，其特徵在於是將從水稻中克隆的與多糖代謝相關的關鍵酶基因0sUgp2與構巢麴黴3-磷酸甘油醛脫氫酶基因啟動子連接，構建過量表達載體OsU-gpd ；選擇標記基因為潮黴素抗性基因，採用農桿菌介導法將表達載體OsU-gpd轉入靈芝，得到具有潮黴素抗性的轉化菌株，提高靈芝生物產量、胞內和胞外多糖含量。
3.根據權利要求
1所述提高靈芝多糖含量的方法，其特徵在於包括以下步驟(1)以含gpd啟動子的pAN7-l質粒為模板，設計引物擴增gpd啟動子片段獲得PCR擴增產物，連接農桿菌介導轉化水稻的表達載體OsU-ubi，並使OsU-ubi原有的ubi啟動子被gpd啟動子所取代，構建靈芝過量表達載體OsU-gpd，將表達載體OsU-gpd導入農桿菌 LBA4404 ；(2)將步驟(1)導入了表達載體的農桿菌LBA4404活化後介導轉化靈芝菌絲體，篩選轉基因靈芝菌株；(3)轉基因靈芝的PCR鑑定和Southern鑑定，測定多糖含量和生物量。
4.根據權利要求
3所述提高靈芝多糖含量的方法，其特徵在於步驟(1)所述引物序列為P-F :5』 -AGCTCTAGAGAATTCCCTTGTATCTCTAC ； P-R 1 :5』 -CTCACTAGTGTTCTTGGATGGGAAGATG。
5.根據權利要求
3所述提高靈芝多糖含量的方法，其特徵在於步驟( 所述農桿菌活化至OD值為0. 6 0. 8。
6.根據權利要求
3所述提高靈芝多糖含量的方法，其特徵在於步驟( 所述靈芝菌絲體轉化是取靈芝菌絲體與活化好的農桿菌混勻，塗布在CYM固體培養基上，於培養箱中黑暗共培養2天後，在平板上倒入篩選培養基於繼續培養3天，肉眼可見白色的再生菌落後繼續培養5天，將新長出的轉化菌株轉接到篩選培養基上篩選；所述篩選培養基為CYM固體培養基+潮黴素(Hyg) 20μ g/mL+頭孢唑林鈉 (Cefo)500y g/mL0
7.根據權利要求
3所述提高靈芝多糖含量的方法，其特徵在於步驟( 所述篩選是將新長出的轉化菌株轉接到篩選培養基上篩選，每天轉接一次，轉接2 3次至沒有農桿菌的生長，得到的轉化菌株在不含潮黴素抗生素的MYG培養基上繼代培養5代後，再在含潮黴素抗生素20 μ g/mL的MYG培養基上培養，篩選得到潮黴素抗性的靈芝轉化菌株；所述篩選培養基為含潮黴素20 μ g/mL和頭孢唑林鈉500 μ g/mL的CYM固體培養基；所述MYG培養基含10g/L麥芽糖，4g/L葡萄糖，4g/L酵母提取物，lg/L胰蛋白腖，15g/L瓊脂^^ ο
專利摘要
本發明公開了一種提高靈芝生物產量和多糖含量的方法。將來自水稻的尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因(OsUgp2)連接到過量表達載體中，通過農桿菌介導法將尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因轉入靈芝中，獲得的轉基因靈芝菌株中，尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因的表達增強，紫芝的生物量、胞內多糖和胞外多糖的含量均得到明顯的提高。本發明能有效提高靈芝等食用和藥用真菌中生物產量和多糖含量，為提高食用和藥用真菌多糖含量提供了一條新的途徑，具有良好的應用和開發前景。
文檔編號C12N15/80GKCN101717782 B發布類型授權 專利申請號CN 200910193618
公開日2012年1月25日 申請日期2009年11月3日
發明者張帆, 李剛, 穆虹, 鍾威 申請人:華南農業大學導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan專利引用 (5),