一株高效處理含氮汙水的施氏假單胞菌及其應用的製作方法

2023-05-03 14:54:26

一株高效處理含氮汙水的施氏假單胞菌及其應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一株高效處理含氮汙水的施氏假單胞菌及其應用。本發明所提供的施氏假單胞菌是施氏假單胞菌（Pseudomonas?stutzeri）DN-LWX19，其在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保藏編號為CGMCC?No.8521。本發明的施氏假單胞菌（Pseudomonas?stutzeri）DN-LWX19對初始NO3--N濃度為32mg/L的模擬汙水，NO3--N去除率24h能達到98%，32h?NO3--N去除率達100%，且無亞硝酸鹽積累。32小時反硝化完全時消耗碳氮比為4.4:1。
【專利說明】一株高效處理含氮汙水的施氏假單胞菌及其應用
【技術領域】
[0001 ] 本發明涉及一株高效處理含氮汙水的施氏假單胞菌及其應用。
【背景技術】
[0002]汙水再生利用是緩解水資源短缺、防治水環境汙染、改善水環境質量的有效途徑。但由於城市汙水二級出水中，含有一定量的氮磷等營養物質，直接補給城市景觀水體、河流和湖泊，存在造成水體富營養化的風險。目前的脫氮技術仍以生物脫氮技術最為高效且應用廣泛。
[0003]傳統生物脫氮中氮素的轉化過程包括氨化、硝化和反硝化。其中反硝化過程是將氮素轉化為氣態氮從水體最終去除的過程。反硝化作用通過反硝化菌的生命活動實現的，因此高效反硝化菌的發現對生物脫氮意義重大。
[0004]反硝化細菌的種類很多，大約有50多個屬，130多個種，自然界最普遍的反硝化細菌有假單胞菌屬(Pseudomonaceae),產鹼桿菌屬(Alcaligenes),還有科奈瑟菌科(Neisseriaceae),硝化細菌科(Nitro bacteraceae),紅螺菌科(Rhodospirillaceae),芽抱桿菌科(Bacillaceae),纖維粘菌科(Cytophagaceae),螺菌科Spirillaceaee),根瘤菌科(Rhizobi aceae),鹽桿菌科(Halobacteri aceae)等。其中假單胞菌屬是微生物的重要類群，也是分布最廣的微生物之一。多樣的生境造就了假單胞菌擁有較廣的生長溫度、PH值範圍，較多的營養代謝類型，因此可以在更為複雜的環境中進行反硝化作用。

【發明內容】

[0005]本發明所要解決的技術問題是提供一株高效處理含氮汙水的反硝化細菌，該反硝化細菌投入模擬汙水中(SBR反應器出水添加少量碳源)能在短時間內實現完全反硝化。
[0006]本發明所提供的反硝化細菌是施氏假單胞菌(Pseudomonas stutzeri)DN-LffX19,該菌株已於2013年11月29日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為:北京市朝陽區北辰西路I號院3號)，保藏編號為CGMCC N0.8521。
[0007]施氏假單胞菌(Pseudomonasstutzeri) DN-LWX19CGMCC N0.8521 的 16s rDNA 序列如序列表中序列I，施氏假單胞菌(Pseudomonas stutzeri) DN-LWX19CGMCC N0.8521的形態特徵如下:菌落圓形、皺摺狀、黃色；菌體短杆狀、長度10 μ m ;革蘭氏染色陰性。施氏假單胞菌(Pseudomonas stutzeri) DN-LWX19CGMCC N0.8521 的生理生化特徵如表 2。
[0008]本發明的另一個目的是提供一種反硝化菌劑，該反硝化菌劑的活性成分為所述的施氏假單胞菌(Pseudomonas stutzeri) DN-LWX19CGMCC N0.8521。
[0009]所述菌劑還可包括載體。所述載體可為固體載體或液體載體。所述固體載體為礦物材料、植物材料或高分子化合物；所述礦物材料為粘土、滑石、高嶺土、蒙脫石、白碳、沸石、矽石和硅藻土中的至少一種；所述植物材料為玉米粉、豆粉和澱粉中的至少一種；所述高分子化合物為聚乙烯 醇和/或聚二醇。所述液體載體可為植物油、礦物油或水；所述有機溶劑為癸烷和/或十二烷。所述菌劑中，所述活性成分可以以被培養的活細胞、活細胞的發酵液、細胞培養物的濾液或細胞與濾液的混合物的形式存在。所述菌劑的劑型可為多種劑型，如液劑、懸浮劑、粉劑、顆粒劑、可溼性粉劑或水分散粒劑。
[0010]根據需要，所述菌劑中還可添加表面活性劑(如吐溫20、吐溫80等)、粘合劑、穩定劑(如抗氧化劑)、pH調節劑等。
[0011]含有所述施氏假單胞菌(Pseudomonasstutzeri)DN_LWX19CGMCC N0.8521 的反硝化生物膜或反硝化生物膜反應器也屬於本發明的保護範圍。
[0012]該反硝化生物膜具體是由人工填料或天然材料作為載體，所述施氏假單胞菌(Pseudomonas stutzeri) DN-LWX19CGMCC N0.8521 附著絮凝其表面形成的膜狀物。
[0013]上述施氏假單胞菌(Pseudomonasstutzeri ) DN-LWX19CGMCC N0.8521、上述反硝化菌劑、上述反硝化生物膜或反硝化生物膜反應器在去除硝酸鹽氮(N03_-N)和/或亞硝酸鹽氮(Ν02_-Ν)中的應用也屬於本發明的保護範圍。
[0014]上述應用中，去除硝酸鹽氮(N03_-N)和/或亞硝酸鹽氮(Ν02_-Ν)可為去除液體中的硝酸鹽氮(no3_-n)和/或亞硝酸鹽氮(no2_-n)。所述液體可為含硝酸鹽氮(no3_-n)和/或亞硝酸鹽氮(no2_-n)的任何液體，如含硝酸鹽氮(no3_-n)和/或亞硝酸鹽氮(no2_-n)的水體。
[0015]所述施氏假單胞菌(Pseudomonasstutzeri)DN_LWX19CGMCC N0.8521 可在用於培養假單胞菌的培養基中培養。其適宜培養條件為:pH7.5，溫度30-35°C。
[0016]本發 明的施氏假單胞菌(Pseudomonas stutzeri) DN-LffX19從缺氧反硝化生物濾池中分離得到。本發明的施氏假單胞菌(Pseudomonas stutzeri) DN-LWX19在缺氧條件下對初始NO3--N濃度為32mg/L的模擬汙水，NO3^N去除率24h能達到98%，32hN03__N去除率達100%，且無亞硝酸鹽積累。32小時反硝化完全時消耗碳氮比為4.4:1。說明該菌株能有效脫除水體中的氮元素，在模擬汙水中短時間內可實現完全反硝化作用，處理效果高效穩定，應用廣泛。
[0017]保藏說明
[0018]菌種名稱:施氏假單胞菌
[0019]拉丁名:(Pseudomonasstutzeri )
[0020]菌株編號:DN-LWX19
[0021]保藏機構:中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心
[0022]保藏機構簡稱:CGMCC
[0023]地址:北京市朝陽區北辰西路I號院3號
[0024]保藏日期:2013年11月29日
[0025]保藏中心登記入冊編號:CGMCC N0.8521
【專利附圖】

【附圖說明】
[0026]圖1為施氏假單胞菌(Pseudomonas stutzeri) DN-LWX19掃描電鏡照片
[0027]圖2為施氏假單胞菌(Pseudomonas stutzeri) DN-LffX19投入模擬汙水中硝酸鹽去除效果
[0028]圖3為施氏假單胞菌(Pseudomonas stutzeri) DN-LffX19投入模擬汙水中亞硝酸鹽濃度變化[0029]圖4為施氏假單胞菌(Pseudomonas stutzeri) DN-LffX19投入模擬汙水中COD濃
度變化
【具體實施方式】
[0030]下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
[0031]下述實施例中的COD採用連華科技COD快速測定法，具體方法如下:儀器型號:連華科技COD快速測定儀5B-1型；試劑:連華科技COD水質監測專用耗材LH-DE-500型；測定步驟:取2.5mL待測水樣於試管中，加入0.7mLD試劑、4.8mLE試劑，混勻，COD快速測定儀165°C消解lOmin，取出後冷卻2min，加入2.5mL高純水，充分混勻，冷卻後於610nm波長下測定吸光度。COD 濃度(mg/L) =Abs61tlX 1505X3。
[0032]下述實施例中的NO3--N濃度採用過硫酸鉀氧化-紫外分光光度法，具體將待測菌懸液離心後取上清液用0.22 μ m濾膜過濾，將過濾得到的液體稀釋100倍進行測定。
[0033]下述實施例中的Ν02_-Ν濃度採用1-(萘基)-乙二胺分光光度法。
[0034]本發明中脫氮指水體中無機氮NCV-N、NO2^-N的去除。
[0035]下述實施例中的NO3--N去除率=(處理前NO3--N濃度一處理後Ν03__Ν濃度)/處理前no3_-n濃度。
[0036]本發明中消耗碳氮比為處理前後消耗COD濃度(mg/L)與處理前後去除的硝酸鹽氮濃度(mg/L)之比。
[0037]下述實施例中的COD去除率=(處理前COD值一處理後COD值)/處理前COD值。
[0038]下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0039]實施例1、施氏假單胞菌(Pseudomonas stutzeri) DN-LWX19的分離鑑定
[0040]一、施氏假單胞菌(Pseudomonas stutzeri) DN-LWXl9 的分離
[0041]將反硝化濾池(取樣當天水質見表1)出水口濾料10顆置於裝有40mL富集培養基(用牛肉膏5g、蛋白腖10g、硝酸鉀Ig和水配製成I升的液體，pH為7.0-7.2)的IOOmL三角瓶中30°C過夜培養，讓濾料上微生物分散富集生長，吸取ImL菌懸液至裝有9mL無菌水的離心管中，得到稀釋度KT1的菌懸液，依此方法將菌懸液用無菌水稀釋至10_15，得到一系列稀釋梯度的菌懸液。分別吸取0.1mL稀釋度10_8-10_15的菌懸液至反硝化菌分離培養基(用牛肉膏5g、蛋白腖10g、硝酸鉀lg、瓊脂18g和水配製成I升的液體。pH為7.0-7.2)，用玻璃棒塗布均勻，封口膜密封后倒置於30°C培養，至長出明顯菌落。
[0042]挑取形態不同的單菌落至富集培養基中過夜培養後，在平板上多次純化，直至顯微鏡下觀察顯示無雜菌為止，得到純化的菌株。對純化後的菌株進行硝酸鹽還原產氣實驗，挑選出反硝化徹底，產氣多，產氣快的菌株接種至斜面培養基(用牛肉膏Sg、蛋白腖log、硝酸鉀lg、瓊脂18g和水配製成I升的液體，pH為7.0-7.2)保存備用。對篩選到的一株編號為DN-LWX19的反硝化徹底,產氣多，產氣快的菌株進行下述硝酸鹽還原產氣實驗:於大試管中加入25mL反硝化培養基(每升反硝化培養基=CH3COONa 2g ；KH2PO40.4g ；;MgSO4.7H20 0.6g ；CaCl2.2H20 0.07g ；KN03 Ig ；Tris 緩衝液 12mL;微量元素 ImL (溶劑為高純水，溶質及其濃度如下=H3BO3 2.86g/L ；ZnSO4.7H20 0.22g/L ；CuSO4.5H20 0.08g/L ；MnSO4.4H20 2.03g/L ；Na2MoO4.2H20 1.26g/L ；pH7.0);用高純水定容至 IL ;pH 控制在7.0-7.2) 121°C條件下滅菌20分鐘，每個試管中接種ImL菌液，加ImL石蠟液封，矽膠塞密封后置於30°C恆溫培養箱靜置培養，72h後測定N03--N、NO2--N濃度(離心後0.22 μ m濾膜過濾)，Ν03_-Ν去除率95%，試管中有氣泡產生。
[0043]表1取樣當天進出水水質
[0044]
【權利要求】
1.施氏假單胞菌(Pseudomonasstutzeri)DN_LWX19在去除硝酸鹽氮和/或亞硝酸鹽氮中的應用；所述施氏假單胞菌(Pseudomonas stutzeri) DN-LWX19在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保藏編號為CGMCC N0.8521。
2.施氏假單胞菌(Pseudomonasstutzeri) DN-LWX19在生物脫氮中的應用；所述施氏假單胞菌(Pseudomonas stutzeri) DN-LffX19在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保藏編號為CGMCC N0.8521。
3.施氏假單胞菌(Pseudomonasstutzeri ) DN-LWX19在製備反硝化菌劑中的應用；所述施氏假單胞菌(Pseudomonas stutzeri) DN-LffX19在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保藏編號為CGMCC N0.8521。
4.施氏假單胞菌(Pseudomonasstutzeri)DN_LWX19在製備反硝化生物膜或反硝化生物膜反應器中的應用；所述施氏假單胞菌(Pseudomonas stutzeri ) DN-LWX19在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保藏編號為CGMCC N0.8521。
5.施氏假單胞菌(Pseudomonasstutzeri)DN_LWX19,其在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保藏編號為CGMCC N0.8521。
6.一種反硝化菌劑，其特徵在於:所述菌劑的活性成分為權利要求5所述的施氏假單胞菌(Pseudomonas stutzeri ) DN-LWX19。
7.含有權利要求5所述的施氏假單胞菌(Pseudomonasstutzeri)DN_LWX19的反硝化生物膜或反硝化生物膜反應器。
8.權利要求6所述 的反硝化菌劑、權利要求7所述的反硝化生物膜或反硝化生物膜反應器在去除硝酸鹽氮中的應用。
9.培養權利要求5所述的施氏假單胞菌(Pseudomonasstutzeri ) DN-LWX19的方法，包括將所述權利要求5所述的施氏假單胞菌(Pseudomonas stutzeri) DN-LffX19在用於培養假單胞菌的培養基中培養的步驟。
10.權利要求6所述的反硝化菌劑、權利要求7所述的反硝化生物膜或反硝化生物膜反應器的製備方法，包括將權利要求5所述的施氏假單胞菌(Pseudomonas stutzeri)DN-LWX19作為活性成分得到反硝化菌劑、反硝化生物膜或反硝化生物膜反應器。
【文檔編號】C12R1/38GK103789232SQ201410009181
【公開日】2014年5月14日 申請日期:2014年1月8日 優先權日:2014年1月8日
【發明者】孫迎雪, 廉巍雪, 周曉黎, 田媛 申請人:北京工商大學