一種規模化培養肝細胞的方法

2023-05-04 06:18:06

專利名稱：一種規模化培養肝細胞的方法
技術領域：
本發明涉及一種規模化培養肝細胞的方法，具體涉及利用一種新型的肝 細胞特異性大孔微載體進行肝細胞規模化培養的方法。
背景技術：
生物人工肝於80年代後期開始逐漸發展起來，雖已經歷20餘年發展， 取得一定的進展，但仍未能廣泛而有效地運用於臨床，成為完全替代肝臟移 植手術以治療各種急慢性肝功能衰竭的最佳方法，其中如何實現體外肝細胞 數量多、功能強的規模化培養是目前強烈限制生物人工肝發展的瓶頸問題。
肝細胞是錨定依賴性細胞，其功能的有效發揮必須依賴於對支架材料等 支持物的貼附。理想的肝組織工程支架除了應具有無毒、良好的組織細胞相 容性與細胞粘附性能等基本要求外，具有足夠的細胞粘附表面積和利於氣體 和物質交換的孔隙率亦尤為重要。支架材料的選擇是肝臟組織工程中的熱點 問題，目前常見的肝組織工程支架材料有殼聚糖、海藻酸鈉、聚乙烯樹酯、 聚氨酯泡沫等天然或合成的材料。而在眾多的體外肝細胞規模培養方法中， 而目前研究表明，多孔微載體作為支架的三維培養正是實現肝細胞規模化培 養的一種有效方法，這種培養模式具有單層培養和懸浮培養兩種培養方法的 優點。但在肝細胞培養中，現存的多孔微載體均不夠理想，因而尋求一種理 想的具有肝細胞特異性的多孔微載體對目前實現肝細胞體外規模化培養具有 重要意義。謂崎
本發明的目的之一在於克服現有技術存在的缺陷，提供一種新型微載體， 具有與常規的實心支架材料相比具有更大的表面積/體積，且竇隙結構與體內 肝竇結構高度相似，因而更有利於肝細胞在支架材料上的黏附、更有利於細 胞間的相互接觸及氧氣、營養成分的傳送和代謝產物的排出，從而進一步提 高體外肝細胞的培養密度和肝細胞功能。
本發明的另一目的在於提供一種體外規模化培養肝細胞的方法，該方法 結合使用所述新型微載體和微重力旋轉培養系統，以實現肝細胞功能強、密 度高的規模化培養。
為實現上述目的，本發明的一個方面提供一種大孔微載體，其對肝細胞
具有高度的親和性，該大孔微載體的粒度為200-500|Lim，其是由絲素蛋白和 半乳糖基化殼聚糖在交聯劑的作用下製得的。
在本發明的實施反式中，可通過下述方法製備所述大孔微載體，該方法
包括
(a) 將絲素蛋白溶液與半乳糖基化殼聚糖溶液按比例混合，使得產生終 濃度為4-7 w/W的絲素-半乳糖基化殼聚糖混合溶液；
(b) 將乳化劑分散進入所述絲素-半乳糖基化殼聚糖混合溶液中，得到 白色乳液，並向該白色乳液中緩慢加入交聯劑，充分攪拌使水相交聯固化；
(c) 將步驟(b)中的白色乳液加入攪拌狀態的PH為9-10的極性溶劑 中，並繼續攪拌40-60分鐘，過濾得到互不粘連的微球；
(d) 固化所述微球並除去表面的油相，篩濾得到200-500^im的微球；
(e) 除去微球中的殘留的交聯劑，並冷凍乾燥，得到所述大孔微載體。 優選地，所述乳化劑為石蠟和/或司班80。所述交聯劑優選為戊二醛。所述極性溶劑優選為異丙醇和/或丙酮。
在本發明的另一個實施方式中，在所述步驟(e)中的冷凍乾燥之前還包 括用高濃度蔗糖溶液浸泡所述微球的步驟。
在本發明的另一個實施方式中，在所述步驟(e)之後還包括消毒步驟。 所述消毒步驟優選為以鈷60-Y射線輻照。
本發明的另一方面提供一種體外大規模培養肝細胞的方法，該方法包括:
(c) 提供所述大孔微載體；
(d) 將所述大孔微載體用於微重力旋轉培養系統中。 在本發明的一個實施方式中，在步驟(b)之前還包括用0. lmol/L、 pH
為7. 0的無鈣鎂磷酸鎂緩衝液(PBS)浸泡大孔微載體過夜並用含血清培養基 浸泡至少10個小時的步驟。
在本發明的實施方式中，所述微重力旋轉培養系統使用濃縮靜止接種法 接種細胞。優選地，所述濃縮靜止接種法中的細胞接種量為2X10Vml lX 107ml。優選地，所述濃縮靜止接種法中起始培養基量為培養瓶容積的40% 90%。優選地，所述濃縮靜止接種法中使用的靜止時間為12h 24h。優選地， 所述濃縮靜止接種法使用的初始旋轉速度為7. 6 9rpm。
在優選的實施方式中，所述濃縮靜止接種法中使用的培養基的血清濃度 為10% 15%。優選地，所述培養基為DMEN或PRMI 1640;優選地，所述培養 基含有濃度為20 mmol/L 50 ramol/L的HEPES。
本發明的優點在於利用一種新型的具有肝細胞特異性的絲素-半乳糖基 化殼聚糖大孔微載體在模擬微重力旋轉培養條件下進行肝細胞培養，建立了 一種簡單的、可靠的體外肝細胞高密度、高分化規模化培養方法，採用該方 法1)可高密度培養肝細胞，絲素-半乳糖基化殼聚糖大孔微載體具有高度類似於體內肝血竇樣的竇隙結構，不僅具有特異性肝細胞吸附的作用，為肝細 胞生長提供廣大的生長空間，還可實現有效的肝細胞與培養基間營養、氧氣
和代謝產物的有效流通，實現體外高密度培養， 一般可達107ml; 2)培養肝 細胞功能強，在微重力旋轉培養下持續的模擬微重力環境有利於肝細胞增值 分化，有利於細胞與細胞間接觸，形成三維結構樣組織，進一步增強體外培 養肝細胞功能；3)對肝細胞損傷小，微重力旋轉培養採用膜式氧和氣體交換， 無氣泡與渦流產生，產生的剪切力較小；4)細胞接種效率高，肝細胞是高耗 氧量細胞，特別是在培養起始貼壁期，需氧量最大，且對的剪切力都非常地 敏感；5)通過濃縮接種期細胞與微載體懸液，不僅提高了細胞與微載體的相 對濃度，增加了細胞與微載體間的接觸機會，還在旋轉培養瓶內產生了氣液 平面，縮短了細胞與氣液平面的距離，並通過扭開閥門和瓶蓋，可與外界(即 孵箱)進行有效的氣體交換。因而，該方法更有利於肝細胞在支架材料上的 黏附、更有利於細胞間的相互接觸及氧氣、營養成分的傳送和代謝產物的排 出，從而進一步提高體外肝細胞的培養密度和肝細胞功能。


圖1是本發明的大孔微載體在倒置顯微鏡下的圖片；
圖2是本發明的大孔微載體在電子顯微鏡下的圖片；
圖3a是利用本發明的絲素/半乳糖基化殼聚糖大孔微載體靜止培養的 CL-1細胞(第六天)在電子顯微鏡下的圖片；
圖3b是利用本發明的絲素/半乳糖基化殼聚糖大孔微載體微重力培養的 CL-1細胞(第六天)在電子顯微鏡下的圖片；
圖4是在靜止和微重力下絲素/半乳糖基化殼聚糖大孔微載體培養CL-1細胞的上清尿素濃度；
圖5a是利用實心微載體(cytodex)微重力培養的CL-1細胞(第六天) 在電子顯微鏡下的圖片；
圖5b是利用本發明的大孔微載體(絲素/半乳糖基化殼聚糖)微重力培 養的CL-l細胞(第六天)在電子顯微鏡下的圖片；
圖6是在利用圖5a和圖5b中的載體進行微重力培養的CL-1細胞上清尿 素濃度的比較；
圖7a是利用多孔微載體(cytodpore)微重力培養的CL-1細胞(第六天) 在電子顯微鏡下的圖片；
圖7b是利用本發明的大孔微載體(絲素/半乳糖基化殼聚糖)微重力培 養的CL-1細胞(第六天)在電子顯微鏡下的圖片；
圖8是利用圖7a和圖7b中的載體進行微重力培養的CL-1細胞上清尿素 濃度的比較。
具體實施例方式
為了更好地理解本發明的方法，下面將通過實施例和實驗證據進一步闡
述本發明及其優勢。在詳細描述以下實施例和實驗之前，首先需要定義和澄 清一些術語。
絲素蛋白是一種無生理活性的天然結構性蛋白，主要由三種簡單的氨基 酸甘氨酸、丙氨酸和絲氨酸組成，它們在蛋白總量中大概佔85%。目前研 究表明絲素蛋白不僅具有良好的生物相容性、無毒、無刺激性，還具有促進 細胞吸附和增殖的特性，因而在生物醫用領域得到了日益廣泛的應用。而將 其用於細胞培養的基質，或對一些生物高分子進行修飾，改善它們的生物性能，使其適用於組織工程，更是近年來絲素蛋白研究的熱點。
殼聚糖是近年來在生物醫藥、組織工程領域得到廣泛應用的一種天然生 物高分子，不僅具有生物功能性、生物相容性、低毒性及幾乎無過敏性等特 性而且還具有高化學反應活性，易於被一些化學試劑修飾，可通過各種方法 對其進行性質改良，而半乳糖基是肝細胞表面去唾液酸糖蛋白受體的特異性
配體，具有誘導和提高肝細胞在細胞外基質支架材料上的黏附性能。在EDC 和NHS的活化作用下，將半乳糖基引入到殼聚糖的結構中製備半乳糖基化殼 聚糖，對其材料表面進行改性，並將其與絲素蛋白進行複合製備形成絲素/半 乳糖基化殼聚糖大孔微載體，不僅可為體外肝細胞培養提供較大三維生長空 間還可顯著增強肝細胞的功能和提高細胞活力，是一種理想的具有肝細胞特 異性新型多孔微載體。
生物反應器是生物人工肝裝置及對肝功能衰竭治療效果最有影響的關鍵 部分。理論上，生物反應器應最大限度地模仿正常肝臟的組織結構，為培養肝 細胞提供類似於體內的生存及代謝環境。因此，理想的生物反應器應具備以下 功能細胞密度達l Xl(^個細胞/ml水平；反應裝置能根據需要任意增容， 細胞培養量可達數升；連續灌注培養實現有效的營養物質、氧氣及代謝產物 雙向物質傳輸；可進行自動化在線細胞狀態、培養液PH值、氧濃度等方面檢 測和調節功能，以便於醫護人員的監督和操作；肝細胞代謝功能至少達單層 培養的水平，並至少保持2周以上；便於運輸和裝配。現在常用的生物反應 器有以下幾類中空纖維生物反應器、轉瓶培養反應器、攪拌懸浮培養反應 器、空氣升液培養反應器和微重力旋轉培養反應器等。其中中空纖維生物反 應器的應用最為廣泛的，其優點是異種蛋白可以隔離，同時防止人體內針對 異種細胞抗原的預存抗體對裝載細胞的殺傷作用，因而比較適合異種細胞類(如豬肝細胞)生物反應器。但這類生物反應器存在以下問題(1)容積有 限，細胞裝載量小；(2)培養液與肝細胞交換面積有限，不利於肝細胞的功 能維持和擴增；(3)半透膜的側孔易被細胞團堵塞，影響交換效率；(4)因 為中空纖維不能耐受深低溫，不適合大規模凍存。其它類型的反應器如轉瓶 培養、攪拌培養等由於剪切力較大等缺點目前亦無法實現高效均一的細胞種 植，氧氣營養物質及細胞代謝產物的運輸，達到高密度、大容量地規模化培 養細胞，及細胞功能的長期維持。而最初由美國航空航天局設計並應用於微 重力生命科學領域的旋轉培養系統(RCCS)在目前的眾多組織工程生物反應 器中，經過近二十幾年的相關研究表明其較其它組織工程反應器具有持續模 擬微重力環境有利於細胞增值分化，有利於細胞與細胞間接觸，形成三維結 構樣組織；膜式氧和氣體交換，無氣泡與渦流產生，低剪切力等對細胞機械 損傷小等優點，目前已成功廣泛運用於兔角膜細胞、骨骼肌細胞、成骨細胞、 胚胎幹細胞、皮層神經元細胞、脂肪組織等多種組織工程領域中，是一種具 有較廣應用前景的生物反應器。
本發明一方面提供一種新型的大孔微載體，其可以用於體外肝細胞規模 化培養。本發明的另一方面提供一種利用該大孔微載體進行體外肝細胞規模 化培養的方法。實施例中使用的絲素蛋白和半乳糖基化殼聚糖分別可從市場 上購買得到，或者可通過下述方法製備而得。所使用的各種試劑、材料和儀 器都可從市場上購買得到。本文中所使用的縮寫、名稱具有本領域技術人員 所知的意義。
大孔微載體的製備及其應用
1.大孔微載體的製備
1)絲素蛋白的製備將生蠶絲在5g/L的碳酸鈉溶液中煮沸1小時，然後用大量去離子水或蒸餾水清洗以去除絲膠蛋白，60-70'C下烘乾，獲得絲素 蛋白。將適量絲素蛋白在80士-2。C下溶解在氯化鈣/水/乙醇(摩爾比1:8:2) 三元溶液中，在室溫條件下去離子水或蒸餾水透析3天，去除溶液中的鹽和乙 醇，過濾去除不溶的雜質，製備出絲素蛋白的水溶液。將絲素蛋白水溶液在 50士2'C下低速攪拌，蒸發部分水分，獲得濃度約7-10w/v呢的絲素蛋白溶液， 備用；
2) 半乳糖基化殼聚糖(GC)的製備稱取2.2g殼聚糖，溶於30-40ml 的1.0%-2.5%的醋酸水溶液中，再加適量TEMED/HC1的緩衝溶液(pH4. 7)將殼 聚糖溶液稀釋至4 w/v %，再分別加入0. 14g NHS、 0. 6 g EDC和2. 2 g乳糖 酸(LA)，在室溫下攪拌反應72 h後，蒸餾水透析3-4天，即得到半乳糖基 化殼聚糖(GC)溶液，蒸發部分水分濃縮備用。
3) 將l)中的絲素蛋白、2)中的半乳糖基化殼聚糖按4: 1、 7: 3、 6:
4、 5: 5、 5.5: 4.5等不同的比例混合均勻，絲素-半乳糖基化殼聚糖混合溶 液終濃度為4-7 w/v%;
4) 取一定量的液體石蠟加入燒杯中，然後加入3-5%的乳化劑(如司班 80)，混合均勻後以一定速度恆速攪拌，按5: 1、 4: l等油水比加入3)中絲 素-半乳糖基化殼聚糖混合溶液，在室溫下繼續恆速攪拌30-45min，分散均勻 得到白色乳液，向上述乳液中緩慢加入一定量的交聯劑如戊二醛溶液等，繼 續攪拌2-3h，使水相交聯固化；
5) 取一定體積的極性溶劑如異丙醇、丙酮等，再往其中加入適量去離子 水或蒸餾水將其稀釋，再滴加NaOH稀溶液，調節PH至9-10;
6) 將5)中溶液以200-400轉/分攪拌，將4)中的白色乳液緩慢加入其 中，繼續攪拌40-60分鐘；過濾得到互不粘連的微球，將微球置於4r冰箱中4-8小時，使微球充分固化；
7) 將微球用5)中稀釋後的極性溶劑、石油醚、去離子水洗滌，去除表 面的油相；然後篩分出200-500pm的微球；
8) 將篩分後的微球，用戊二醛中和劑甘氨酸溶液浸泡2-4小時，除去未 反應的戊二醛，再用大量蒸餾水洗滌；
9) 將8)中洗滌乾淨後的微球用高濃度蔗糖溶液浸泡數分鐘，然後倒去 多餘的蔗糖溶液；將上述浸泡過蔗糖溶液的微球置於冰箱中冷凍36-72小時， 然後冷凍乾燥，得到大孔微載體。
2、大孔微載體的應用
微重力旋轉培養下絲素/半乳糖基化殼聚糖大孔微載體規模化肝細胞培 養方法，具體步驟如下
1) 絲素/半乳糖基化殼聚糖大孔微載體預處理將所需數量的絲素/半乳 糖基化殼聚糖大孔微載體置於50ml塑料離心管中，用0. lmol/L、 pH為7. 0 無鈣鎂磷酸鎂緩衝液(PBS)浸泡過夜後，吸去PBS，再用PBS洗漆3次，經 12rC高壓滅菌30分鐘後，吸出PBS，用培養基洗滌2次，最後用含血清培養 基浸泡10小時以上，備用；
2) 濃縮靜止接種法接種細胞消化收集平板培養的肝細胞懸液，按所需 接種密度將細胞懸液放入上述微載體中，輕輕混勻，在無菌條件下取出無菌 高橫截面微重力旋轉培養瓶，打開瓶蓋和兩個孔閥門，用注射器將含絲素/半 乳糖基化殼聚糖大孔微載體的肝細胞懸液經注射空緩緩注入微重力旋轉培養 瓶中，繼續添加含血清培養基至60%體積，取出兩個注射器，蓋上瓶蓋並將其 稍稍扭松，靜止橫放於二氧化碳孵箱中，培養條件為溫度37°C， 二氧化碳 濃度5%。每8小時取出輕輕搖晃1分鐘。24小時後取出微重力旋轉培養瓶置於紫外消毒後的超淨臺中，用75%酒精擦拭瓶蓋和瓶壁3次，打開瓶蓋，將 兩支無菌10 ml注射器(其中一支裝有含血清的培養液，另一支不裝培養液) 分別連接在兩個取樣孔上，打開取樣孔閥門，將注射器中的培養液緩慢注入 容器內，容器內氣泡從另一支空的注射器中排出(培養過程中始終保持容器內 無氣泡，以避免形成渦流)，將整個容器充滿後再用75%酒精擦拭瓶口和瓶壁 3次，最後將其移入二氧化碳培養箱中，安裝在培養裝置上，並根據所接種微 載體和細胞的量調整容器的轉速，以微載體在旋轉過程中不貼附在容器的內 外壁上為宜。本試驗中設定旋轉初速度為7. 6 9rpm，
下面結合具體實施例對本發明作進一步的說明，但並非對本發明的限制； 實施例一、靜止/微重力旋轉培養下絲素/半乳糖基化殼聚糖培養人肝細 胞株CL-1細胞；
一、 完全培養基的配置每100ml DMEN (高糖型)培養基添加15ml胎 牛血清、3. 5mmolHEPES、青黴素10000U、鏈黴素10000U
二、 絲素/半乳糖基化殼聚糖大孔微載體預處理將0.1g絲素/半乳糖基 化殼聚糖大孔微載體置於50ml塑料離心管中，用0. lmol/L、 PH為7. 0無鈣 鎂磷酸鎂緩衝液(PBS)浸泡過夜後，吸去PBS，再用PBS洗滌3次，經121°C 高壓滅菌30分鐘後，吸出PBS，用培養基洗滌2次，最後用1)配置的完全 培養基浸泡10小時以上，備用；
三、 靜止/微重力旋轉條件下絲素/半乳糖基化殼聚糖大孔微載體培養人 肝細胞(CL-1)
1、微重力旋轉培養組(濃縮靜止接種法接種細胞)消化收集平板培養 的人肝細胞株(CL-1)懸液，總量為2X107的CL-1細胞懸液放入上述微載 體中，輕輕混勻，在無菌條件下取出50ml無菌高橫截面微重力旋轉培養瓶，打開瓶蓋和兩個孔閥門，用注射器將含絲素/半乳糖基化殼聚糖大孔微載體的 肝細胞懸液經注射空緩緩注入微重力旋轉培養瓶中，繼續添加含l)配置的完
全培養基至30ml，取出兩個注射器，蓋上瓶蓋並將其稍稍扭松，靜止橫放於 二氧化碳孵箱中，培養條件為溫度37°C， 二氧化碳濃度5%。每8小時取 出輕輕搖晃1分鐘。24小時後取出微重力旋轉培養瓶置於紫外消毒後的超淨 臺中，用75%酒精擦拭瓶蓋和瓶壁3次，打開瓶蓋，將兩支無菌10 ml注射器 (其中一支裝有l)配置的完全培養基，另一支不裝培養基)分別連接在兩個取 樣孔上，打開取樣孔閥門，將注射器中的培養液緩慢注入容器內，容器內氣 泡從另一支空的注射器中排出(培養過程中始終保持容器內無氣泡，以避免 形成渦流)，將整個容器充滿後再用75%酒精擦拭瓶口和瓶壁3次，最後將其 移入二氧化碳培養箱中，安裝在培養裝置上，並根據所接種微載體和細胞的 量調整容器的轉速，以微載體在旋轉過程中不貼附在容器的內外壁上為宜。 本試驗中設定旋轉初速度為7. 6rpm。每天換液量30ml，並調整轉速1次。
2、靜止培養組(濃縮靜止接種法接種細胞)消化收集平板培養的人肝 細胞株(CL-1)懸液，總量為2X107的CL-1細胞懸液放入上述微載體中，輕 輕混勻，在無菌條件下取出50ml無菌高橫截面微重力旋轉培養瓶，打開瓶蓋 和兩個孔閥門，用注射器將含絲素/半乳糖基化殼聚糖大孔微載體的肝細胞懸 液經注射空緩緩注入微重力旋轉培養瓶中，繼續添加含1)配置的完全培養基 至30ml，取出兩個注射器，蓋上瓶蓋並將其稍稍扭松，靜止橫放於二氧化碳 孵箱中，培養條件為溫度37°C， 二氧化碳濃度5%。每8小時取出輕輕搖 晃1分鐘。24小時後取出微重力旋轉培養瓶置於紫外消毒後的超淨臺中，用 75%酒精擦拭瓶蓋和瓶壁3次，打開瓶蓋，將兩支無菌10 ml注射器(其中一 支裝有1)配置的完全培養基，另一支不裝培養基)分別連接在兩個取樣孔上，打開取樣孔閥門，將注射器中的培養液緩慢注入容器內，容器內氣泡從另一 支空的注射器中排出(培養過程中始終保持容器內無氣泡，以避免形成渦
流)，將整個容器充滿後再用75%酒精擦拭瓶口和瓶壁3次，最後將其移入二 氧化碳培養箱中，每天換液量30ml。
四、 生物功能檢測於每天換液時留取上清作樣品，2 000 r/min離心 10 min，，在Beckman全自動生化系統檢測上清尿素含量；
五、 掃描電鏡留取樣品，PBS清洗三次，加2%戊二醛固定0. 5小時， 1%鋨酸固定0.5小時，接著用酒精梯度脫水，再用乙酸異戊脂置換4小時以 上，臨界乾燥器乾燥後真空噴濺鉑金離子，日本S450掃描電子顯微鏡觀察細 胞生長情況並攝影。
實驗結果本發明選用微重力絲素/半乳糖苷化殼聚糖大孔微載體為體外 肝細胞規模化培養模式，較常規的靜止三維培養更有利於肝細胞增殖分化及 細胞-細胞間接觸，形成緻密三維結構樣組織，實現體外肝細胞大規模高密度 培養；可進一步增強肝細胞的功能(見圖3a、圖3b和圖4)。
實施例二、微重力旋轉培養下微載體培養人肝細胞株CL-1細胞(絲素/ 半乳糖基化殼聚糖大孔微載體SF/GC、實心微載體cytodex 3);
一、 完全培養基的配置每100ml DMEN (高糖型)培養基添加15ml胎 牛血清、3. 5mmolHEPES、青黴素10000U、鏈黴素10000U
二、 微載體預處理
1、絲素/半乳糖基化殼聚糖大孔微載體預處理將0.2g絲素/半乳糖基 化殼聚糖大孔微載體置於50ml塑料離心管中，用o. lmol/L、 PH為7. 0無轉 鎂磷酸鎂緩衝液(PBS)浸泡過夜後，吸去PBS，再用PBS洗滌3次，經121°C高壓滅菌30分鐘後，吸出PBS，用培養基洗滌2次，最後用1)配置的完全 培養基浸泡10小時以上，備用；
2、實心微載體(cytodex3)預處理將0. 25g實心微載體(cytodex3) 置於50ml塑料離心管中，用o. lmol/L、 PH為7. 0無鈣鎂磷酸鎂緩衝液(PBS) 浸泡過夜後，吸去PBS，再用PBS洗滌3次，經12rC高壓滅菌30分鐘後， 吸出PBS,用培養基洗滌2次，最後用1)配置的完全培養基浸泡10小時以 上，備用；
三、微重力旋轉培養下微載體培養人肝細胞株CL-1細胞 1、微重力絲素/半乳糖基化殼聚糖大孔微載體培養人肝細胞(CL-1):消 化收集平板培養的人肝細胞株(CL-1)懸液，總量為2X107的CL-1細胞懸 液放入上述微載體中，輕輕混勻，在無菌條件下取出50ml無菌高橫截面微重 力旋轉培養瓶，打開瓶蓋和兩個孔閥門，用注射器將含絲素/半乳糖基化殼聚 糖大孔微載體的肝細胞懸液經注射空緩緩注入微重力旋轉培養瓶中，繼續添 加含1)配置的完全培養基至30ml，取出兩個注射器，蓋上瓶蓋並將其稍稍 扭松，靜止橫放於二氧化碳孵箱中，培養條件為溫度37°C， 二氧化碳濃度 5%。每8小時取出輕輕搖晃1分鐘。24小時後取出微重力旋轉培養瓶置於紫 外消毒後的超淨臺中，用75%酒精擦拭瓶蓋和瓶壁3次，打開瓶蓋，將兩支無 菌10 ml注射器(其中一支裝有1)配置的完全培養基，另一支不裝培養基) 分別連接在兩個取樣孔上，打開取樣孔閥門，將注射器中的培養液緩慢注入 容器內，容器內氣泡從另一支空的注射器中排出(培養過程中始終保持容器內 無氣泡，以避免形成渦流)，將整個容器充滿後再用75%酒精擦拭瓶口和瓶壁 3次，最後將其移入二氧化碳培養箱中，安裝在培養裝置上，並根據所接種微 載體和細胞的量調整容器的轉速，以微載體在旋轉過程中不貼附在容器的內外壁上為宜。本試驗中設定旋轉初速度為7.6rpm。每天換液量30ml，並調整 轉速1次。
2、微重力實心微載體(cytodex3)培養人肝細胞(CL-1):消化收集平 板培養的人肝細胞株(CL-1)懸液，總量為2X107的CL-1細胞懸液放入上 述微載體中，輕輕混勻，在無菌條件下取出50ml無菌高橫截面微重力旋轉培 養瓶，打開瓶蓋和兩個孔閥門，用注射器將含cytodex 3微載體的肝細胞懸 液經注射空緩緩注入微重力旋轉培養瓶中，繼續添加含1)配置的完全培養基 至30ml，取出兩個注射器，蓋上瓶蓋並將其稍稍扭松，靜止橫放於二氧化碳 孵箱中，培養條件為溫度37°C， 二氧化碳濃度5%。每8小時取出輕輕搖 晃1分鐘。24小時後取出微重力旋轉培養瓶置於紫外消毒後的超淨臺中，用 75%酒精擦拭瓶蓋和瓶壁3次，打開瓶蓋，將兩支無菌10 ml注射器(其中一 支裝有1)配置的完全培養基，另一支不裝培養基)分別連接在兩個取樣孔上， 打開取樣孔閥門，將注射器中的培養液緩慢注入容器內，容器內氣泡從另一 支空的注射器中排出(培養過程中始終保持容器內無氣泡，以避免形成渦 流)，將整個容器充滿後再用75%酒精擦拭瓶口和瓶壁3次，最後將其移入二 氧化碳培養箱中，安裝在培養裝置上，並根據所接種微載體和細胞的量調整 容器的轉速，以微載體在旋轉過程中不貼附在容器的內外壁上為宜。本試驗 中設定旋轉初速度為7. 6rpm。每天換液量30ml，並調整轉速1次。
四、 生物功能檢測於每天換液時留取上清作樣品，2 000 r/min離心 10 min，，在Beckman全自動生化系統檢測上清尿素含量；
五、 掃描電鏡留取樣品，PBS清洗三次，加2%戊二醛固定0. 5小時， 1%鋨酸固定0.5小時，接著用酒精梯度脫水，再用乙酸異戊脂置換4小時以 上，臨界乾燥器乾燥後真空噴濺鉑金離子，日本S450掃描電子顯微鏡觀察細胞生長情況並攝影。
實驗結果本發明以絲素/半乳糖苷化殼聚糖大孔微載體為體外肝細胞規
模化培養支架材料，較常規的實心支架材料(cytodex 3)具有更大的表面積 /體積，高度的竇隙結構與體內肝竇結構相似，更有利於細胞間的相互接觸及 氧氣、營養成分的傳送和代謝產物的排出，從而進一步提高體外肝細胞培養 密度及其功能(見圖5a、圖5b和圖6)。
實施例三、微重力旋轉培養下微載體培養人肝細胞株CL-1細胞(絲素/ 半乳糖基化殼聚糖大孔微載體SF/GC、多孔微載體cytopore);
一、 完全培養基的配置每100ml DMEN (高糖型)培養基添加15ml胎 牛血清、3. 5mmolHEPES、青黴素10000U、鏈黴素10000U
二、 微載體預處理
1、 絲素/半乳糖基化殼聚糖大孔微載體預處理將0.2g絲素/半乳糖基
化殼聚糖大孔微載體置於50ml塑料離心管中，用o. lmol/L、 PH為7. 0無鈣 鎂磷酸鎂緩衝液(PBS)浸泡過夜後，吸去PBS，再用PBS洗滌3次，經121°C 高壓滅菌30分鐘後，吸出PBS，用培養基洗滌2次，最後用1)配置的完全 培養基浸泡10小時以上，備用；
2、 多孔微載體(cytopore)預處理將0. 2g多孔微載體(cytopore) 置於50ml塑料離心管中，用o. lmol/L、 PH為7. 0無鈣鎂磷酸鎂緩衝液(PBS) 浸泡過夜後，吸去PBS，再用PBS洗滌3次，經12rC高壓滅菌30分鐘後， 吸出PBS,用培養基洗滌2次，最後用1)配置的完全培養基浸泡10小時以 上，備用；
三、 微重力旋轉培養下微載體培養人肝細胞株CL-1細胞1、 微重力絲素/半乳糖基化殼聚糖大孔微載體培養人肝細胞(CL-1):消 化收集平板培養的人肝細胞株(CL-1)懸液，總量為2X107的CL-1細胞懸 液放入上述微載體中，輕輕混勻，在無菌條件下取出50ml無菌高橫截面微重 力旋轉培養瓶，打開瓶蓋和兩個孔閥門，用注射器將含絲素/半乳糖基化殼聚 糖大孔微載體的肝細胞懸液經注射空緩緩注入微重力旋轉培養瓶中，繼續添 加含1)配置的完全培養基至30ml，取出兩個注射器，蓋上瓶蓋並將其稍稍 扭松，靜止橫放於二氧化碳孵箱中，培養條件為溫度37°C， 二氧化碳濃度 5%。每8小時取出輕輕搖晃1分鐘。24小時後取出微重力旋轉培養瓶置於紫 外消毒後的超淨臺中，用75%酒精擦拭瓶蓋和瓶壁3次，打開瓶蓋，將兩支無 菌10 ml注射器(其中一支裝有1)配置的完全培養基，另一支不裝培養基) 分別連接在兩個取樣孔上，打開取樣孔閥門，將注射器中的培養液緩慢注入 容器內，容器內氣泡從另一支空的注射器中排出(培養過程中始終保持容器內 無氣泡，以避免形成渦流)，將整個容器充滿後再用75%酒精擦拭瓶口和瓶壁 3次，最後將其移入二氧化碳培養箱中，安裝在培養裝置上，並根據所接種微 載體和細胞的量調整容器的轉速，以微載體在旋轉過程中不貼附在容器的內 外壁上為宜。本試驗中設定旋轉初速度為7.6rpm。每天換液量30ml，並調整 轉速1次。
2、 微重力多孔微載體(cytopore)培養人肝細胞(CL-1):消化收集平 板培養的人肝細胞株(CL-1)懸液，總量為2X107的CL-1細胞懸液放入上 述微載體中，輕輕混勻，在無菌條件下取出50ml無菌高橫截面微重力旋轉培 養瓶，打開瓶蓋和兩個孔閥門，用注射器將含多孔微載體(cytopore)的肝 細胞懸液經注射空緩緩注入微重力旋轉培養瓶中，繼續添加含1)配置的完全 培養基至30ml,取出兩個注射器，蓋上瓶蓋並將其稍稍扭松，靜止橫放於二氧化碳孵箱中，培養條件為溫度37°C， 二氧化碳濃度5%。每8小時取出 輕輕搖晃1分鐘。24小時後取出微重力旋轉培養瓶置於紫外消毒後的超淨臺 中，用75%酒精擦拭瓶蓋和瓶壁3次，打開瓶蓋，將兩支無菌10 ml注射器(其 中一支裝有1)配置的完全培養基，另一支不裝培養基)分別連接在兩個取樣 孔上，打開取樣孔閥門，將注射器中的培養液緩慢注入容器內，容器內氣泡 從另一支空的注射器中排出(培養過程中始終保持容器內無氣泡，以避免形 成渦流)，將整個容器充滿後再用75%酒精擦拭瓶口和瓶壁3次，最後將其移 入二氧化碳培養箱中，安裝在培養裝置上，並根據所接種微載體和細胞的量 調整容器的轉速，以微載體在旋轉過程中不貼附在容器的內外壁上為宜。本 試驗中設定旋轉初速度為7. 6rpm。每天換液量30ml，並調整轉速1次。
四、 生物功能檢測於每天換液時留取上清作樣品，2 000 r/min離心 10 min，，在Beckman全自動生化系統檢測上清尿素含量；
五、 掃描電鏡留取樣品，PBS清洗三次，加2%戊二醛固定0.5小時， 1%鋨酸固定0.5小時，接著用酒精梯度脫水，再用乙酸異戊脂置換4小時以 上，臨界乾燥器乾燥後真空噴濺鉑金離子，日本S450掃描電子顯微鏡觀察細 胞生長情況並攝影。
實驗結果半乳糖基是肝細胞表面去唾液酸糖蛋白受體的特異性配體， 本發明所使用絲素/半乳糖苷化殼聚糖大孔微載體在EDC和NHS的活化作用 下進行半乳糖基化改性，較常規的多孔微載體(cytopore)更有利於肝細胞 在支架材料上的黏附，可進一步促進體外肝細胞的培養密度及其肝細胞功能 (見圖7a、圖7b和圖8)。
雖然本發明已經參考具體的實施方式進行描述，但是本領域技術人員通 過閱讀上述描述後，將可以對本發明做出顯而易見的修改和修飾，而不違背本發明的意圖和本質。本發明有意將這些修改和修飾包括在權利要求的範圍 內。
權利要求
1.一種大孔微載體，其粒度為200-500μm，由絲素蛋白和半乳糖基化殼聚糖在交聯劑的作用下製得。
2. —種製備權利要求1的大孔微載體的方法，其包括(a) 將絲素蛋白溶液與半乳糖基化殼聚糖溶液按比例混合，使得產生終 濃度為4-7 w/W的絲素-半乳糖基化殼聚糖混合溶液；(b) 將乳化劑分散進入所述絲素-半乳糖基化殼聚糖混合溶液中，得到 白色乳液，並向該白色乳液中緩慢加入交聯劑，充分攪拌使水相交聯固化；(c) 將步驟(b)中的白色乳液加入攪拌狀態的pH為9-10的極性溶劑 中，並繼續攪拌40-60分鐘，過濾得到互不粘連的微球；(d) 固化所述微球並除去表面的油相，篩濾得到200-500jum的微球；(e) 除去微球中的殘留的交聯劑，並冷凍乾燥，得到所述大孔微載體。
3. 如權利要求2所述的方法，其特徵在於，所述乳化劑為石蠟和/或司 班80。
4. 如權利要求2所述的方法，其特徵在於，所述交聯劑為戊二醛。
5. 如權利要求2所述的方法，其特徵在於，所述極性溶劑為異丙醇和/ 或丙酮。
6. 如權利要求2所述的方法，其特徵在於，在所述步驟(e)中的冷凍 乾燥之前還包括用高濃度蔗糖溶液浸泡所述微球的步驟。
7. 如權利要求2所述的方法，其特徵在於，在所述步驟(e)之後還包 括消毒步驟。
8. 如權利要求7所述的方法，其特徵在於，所述消毒步驟優選為以鈷 60-Y射線輻照。
9. 一種體外大規模培養肝細胞的方法，該方法包括(a) 提供所述大孔微載體；(b) 將所述大孔微載體用於微重力旋轉培養系統中。
10. 如權利要求9所述的方法，其特徵在於，在步驟(b)之前還包括用 0. lmol/L、 pH為7. 0的無鈣鎂磷酸鎂緩衝液(PBS)浸泡大孔微載體過夜並用 含血清培養基浸泡至少10個小時的步驟。
11. 如權利要求9所述的方法，其特徵在於，所述微重力旋轉培養系統 使用濃縮靜止接種法接種細胞，所述濃縮靜止接種法中的細胞接種量為2X 105/ml lX106/ml。
12. 如權利要求ll所述的方法，其特徵在於，所述濃縮靜止接種法中起 始培養基量為培養瓶容積的40% 90%。
13. 如權利要求ll所述的方法，其特徵在於，所述濃縮靜止接種法中使 用的靜止時間為12h 24h。
14. 如權利要求ll所述的方法，其特徵在於，所述濃縮靜止接種法使用的初始旋轉速度為7. 6 9 rpm。
15. 如權利要求ll所述的方法，其特徵在於，所述濃縮靜止接種法中使 用的培養基中含10% 15%的血清。
16. 如權利要求15所述的方法，其特徵在於，所述培養基為DMEN或PRMI 1640。
17. 如權利要求15所述的方法，其特徵在於，所述培養基含有濃度為20 ,1/L 50咖ol/L的HEPES。
全文摘要
本發明提供了一種新型的具有肝細胞特異性的絲素-半乳糖基化殼聚糖大孔微載體及其製備方法，以及利用它在微重力旋轉培養條件下進行肝細胞培養的方法。本發明提供的新型微載體與常規的實心支架材料相比具有更大的表面積/體積，且竇隙結構與體內肝竇結構高度相似，因而更有利於肝細胞在支架材料上的黏附、更有利於細胞間的相互接觸及氧氣、營養成分的傳送和代謝產物的排出，從而進一步提高體外肝細胞的培養密度和肝細胞功能。
文檔編號C08L89/00GK101624473SQ200910041770
公開日2010年1月13日 申請日期2009年8月11日 優先權日2009年8月11日
發明者勇 劉, 周煥城, 志 張, 蔣澤生, 毅 高, 龔獨輝 申請人:南方醫科大學珠江醫院