植物種的轉化和外源基因的表達的製作方法

2023-05-03 20:27:21 1

專利名稱:植物種的轉化和外源基因的表達的製作方法
本發明涉及一種改良植物的基因型和表型的方法，該方法對植物子葉組織，特別是對用一種由植物飼養細胞製備的培養基預處理的子葉引入一種農業土壤桿菌(Agrobacterium)的轉化系統。該方法能高效地用於轉化植物以達到增強性能和/或提供新的表型。
植物育種方法的應用一直受到限制是由於很難在植物種間進行基因轉移，因此開發一種方法用於植物種的遺傳工程可能是具有吸引力的，但是植物細胞與其他類型的細胞對轉化系統的要求實質上是很不相同的。首先，植物細胞不同於單細胞微生物，它們的增殖率低;其次，對於生存、增殖和再生來說，植物細胞對它們所處的環境極為敏感;第三，為了確定外源基團是否已起作用地被整合在植物細胞內，需要證實再生植株是否已表達了基因產物;最後，使植物細胞具有硬質的細胞壁進行遺傳工程將更加困難。
由於在植物細胞操作和基因有效表達的證實之間有著相當長的時間間隔，因此，在轉化、細胞生長及再生植株的每個階段要求實現高效率是必不可少的。另外還應考慮到使特定技術和該技術中所利用的材料與特定植物種之間的相匹配問題。此外，為了從轉化細胞的愈傷組織獲得再生植株，還需進一步機慮轉化培養物的連續手工操作。
A.L.Gunay et al.Plant Science Letters(1978)11365-372，介紹了從紅胡椒子葉離體再生胡椒;J.R.Liu et al.，Plant Cellorgan Culture(1983)2293-304，介紹了從包括子葉在內的蘋果幼苗外植體的再生;B.R.Thomas et al.，Theor.Appl.Genet.(1981)59215-219，介紹了蕃茄再生培養基;The 1985 Calgene U.S.Patent Application Serial No.798，050 by Fillatti et al.介紹了本發明的農業土壤桿菌;in Horsch et al.Science(1985)2281229-1231介紹了用葉圓片法根癌農業土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciene)轉化植物;也可參考Herrera-Estrella et al.，Nature(1983)303209-213;Fraley et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1983)804803-4807;and Bevan et al.，Nature(1983)304184-187，in Stalker et al.，J.Biol.Chem.(1985)2604724-4728，介紹了草甘膦抗性aro A基因;而由deGreve，J.Mol.Appl.Genet.(1983)1499-511;Salomon et al.，EMBO J.(1984)3141-146;Velten et al.，ibid.(1984)32723-2730;Garfinkel et al.，Cell(1983)27143-153;and Barker et al.，Plant Mol.Bio(1983)2335-350.介紹了轉錄起始區和終止區;Comai et al.，Nature(1985)317741-744，介紹了對草甘膦提供耐性的鼠傷寒沙門氏菌突變基因aro A在植物體中的表達;其它討論蕃茄子葉再生的報導包括Orsay，French Theor.Appl.Genet.68(4)，1984，317-322;Seeni，S.et al.，Canadian J.Botany 59(10)，1981，1941-1943;and Vnuchkova，V.A.，Fiziol Rast(Moscow，USSR)，24(5)，1977，1094-1100。
本發明提供的方法是產生轉化的植物種，所得到的植物種含有能穩定表達的新核苷酸構建物。這些方法是採用改裝的(disarmed)農業土壤桿菌和植物子葉組織的高效率轉化技術。植物子葉組織正常情況是與由植物飼養細胞所限定的培養基預培育。這種方法可得到高比例的正常轉化細胞，而後這些正常轉化的細胞能再生成植株，這些植株能生長成植物並結實。該技術能為穩定表達的引入的基因提供保證，尤其是引入的外源基因使植物具備新的表型。
本發明提供了包括用植物子葉組織將新的核苷酸構建物引入植物種的細胞的新方法和新產品。這些被轉化的細胞的再生形成表達存在於該核苷酸構建物中的一種或多種基因的植物體，從而至少提供一種不同於原來栽培品種的植物的性狀，尤其是表型性狀。
所用的方法是利用受傷的子葉組織與限定的培養基一起預培育，所預培育的植物子葉組織與經過改裝並被轉化的農業土壤桿菌在適當的營養培養基中共培養，這種農業土壤桿菌具有轉化植物細胞的能力，並且有一種DNA的構建物連結在T-DNA的一個邊界上。這種構建物的製備是通過連結異源的DNA片段，其中包括至少能在寄主體內轉錄的一個基因。當構建物中有一種選擇標記物時，共培養的細胞可轉移到再生培養基中，該再生培養基通常含有為轉化細胞而選用的殺菌劑。帶葉分枝形成後，將分枝轉移到選擇的生根培養基中形成完整的小植株，而後小植株可能會長大以提供種子，插條等等，以便繁殖新的植物。所以，該方法能保證高效率轉化植物細胞及由這些轉化細胞再生出植物體。
可被轉化的植物種都是那些大批生產有待於培養和經營的植物，這些植物包括蔬菜、水果、觀賞花、木本植物種等等，如下述的雙子葉植物和多子葉植物蕃茄、松屬、胡椒、萵苣、黃瓜、大豆、芸苔屬(油菜子)、楊樹、觀嘗花等等。
用滅菌的種子作植物子葉的來源，這些子葉可以是成熟的或不成熟的、可以是已經從種子內伸出的或還存在於種子內的、也可切開種子並從種皮內解剖出子葉。許多植物的子葉會是已經伸出來的，但有少數幾種，如松樹，其子葉可能是未成熟的，而要從種子內獲得。
為了得到伸出的子葉，通常要在合適的萌發培養基中，萌發至少4天，但要少於約15天，最好為6到8天。所得到的子葉組織用作轉化織織的來源，子葉受到損傷作為再生部位，再生發生在靠近基部的受傷細胞部位是較好的。最方便的是將子葉切成幾片，通常切成三片，而利用中間的那片。
將受傷的子葉組織轉移到飼養平板上，飼養平板上的細胞對受傷的子葉組織作為一種滋養培養物並提高轉化效率。
任何適合的植物細胞懸浮液均可作飼養培養物，如菸草(Nieotiana)或玉米，尤其是前者。然而菸草飼養細胞對於某些作物，例如蕃茄是最佳的，玉米即其他的植物飼養細胞作為飼養細胞也有用。與飼養細胞所限定的培養基的預培育的時間通常至少6小時，但不得超過約48小時，通常是用12到24小時。
製備飼養平板是通過用植物懸浮液培養物，如菸草細胞約104-1010細胞/毫升，通常107-108細胞/毫升，置於軟的瓊脂培養基內，一般為含有約0.5%至1%瓊脂和適宜的生長培養基，如Murashige和Skoog基本有機培養基、適量的激素，即植物生長素，如2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)、激動素和維生素，如硫胺素，再與培養基一起適當調pH至5-6，最好為pH5.5。激動素和硫胺一般約為0.75-1.5毫克/升，而2，4-D一般約為0.05-0.2毫克/升。最理想是臨用前配製飼養平板，通常在使用前至少一天或兩天配製。
用多孔蓋覆蓋飼養平板(軟瓊脂層)以防止飼養細胞與子葉外植體進行接觸，該多孔蓋使外植體浸於所限定的培養基中。用無菌濾紙圓片很容易製成上述多孔蓋。接著讓子葉預保溫，隨後將子葉轉移到含有轉化植物細胞的DNA構建物的農業土壤桿菌的肉湯液體培養基的培養物內，使該DNA構建物的遺傳能力轉移到植物細胞內。一般農業土壤桿菌的數量約為106-1010細胞/毫升，通常約為108-1010細胞/毫升，隨特定菌株的不同不各有差異。
子葉在細菌液體培養物中接觸農業土壤桿菌的時間通常至少約1分鐘，不超過1小時，平均約30分鐘。該細菌液體培養物如MG/L(同LBMG;見Garfinkel et al.，J.Bacteriol.(1980)144732-743)。接著從細菌肉湯液體培養基中將子葉切片轉移，除去過量的表面液體並將子葉切片放回到飼養平板上。在飼養平板上的細菌共培養時間通常至少為6小時、12小時、不超過約4天，平均約1-3天。隨後將與細菌共培養後的子葉片轉移到再生培養基中。
再生培養基通常含有一種殺菌劑，如羧苄青黴素(500毫克/升)，並可含有選擇轉化細胞的選擇試劑，例如帶有卡那黴素抗性基因(APH3′Ⅱ)，加入的卡那黴素至少約30毫克/升，通常不超過約500毫克/升，最好約為50-100毫克/升。再生培養基還常有一種適當的鹽源，如Murashige Skoog鹽培養基;一種適當的碳源，如蔗糖;及其它適合的附加物，如激素、玉米素等約0.75-2.25毫克/升，肌醇約50-200毫克/升等等。還可補充加入維生素，如Nitsch維生素，約加入1000X母液的0.5-1.5毫升/升，1.0毫升/升在再生培養基中是常見的。在100毫升最終體積中，1000X母液的Nitsch維生素含有50毫克鹽酸硫胺素、200毫克甘氨酸、50毫克煙酸、50毫克鹽酸吡哆素、50毫克葉酸、50毫升生物素並用水定容;碳源為10-30克/升。再生培養基通常含有約0.5-1.0%瓊脂，將再生培養基調pH至pH6±0.5。
在2-3周內通常出現帶葉的分枝，當長至1-2釐米長時，立即將它們在基部切斷並轉移到一種生根培養基中，這種培養基也可能是幼苗生長的培養基，同時加入羧苄青黴和卡那黴素硫酸鹽。
可用各種改裝的菌株以保證高效率轉化植物。這些改裝的菌株會全部或部分缺失T-DNA區，尤其是缺失激素基因區，也可能缺失一或二個邊界，該區與冠癭鹼的表達有關，Ti或Ri質粒缺失一個與構建物順序顯著同源的區域是最理想的。
所用的農業土壤桿菌系統包括使用一種改裝的株系例如根癌農業土壤桿菌PC2760(G.Coms et al.，Plasmid(1982)715-29;G.Coms et al.，Gene(1981)1433;A.Hoekema et al.，Nature(1983)303179-181;European Patent Application 84-200239.6，2424183)。
在植物細胞轉化過程中所用的農業土壤桿菌本身用一種寄主範圍廣泛的質粒轉化，這種廣譜質粒可以從E.Coli穿梭至農桿菌。要實現這一點可用含有一個P-1不親和群質粒複製子，例如RK2和能在E.Coli中提供多個拷貝，通常至少是5個，最好至少是10個直至200個拷貝的質粒的複製子。廣譜質粒的特徵是有至少一個T-DNA邊界順序，尤其是右邊界順序，或者由企圖整合進入植物種的基因組內的各種構建物在一個方向將兩個邊界順序分開。
被轉化的植物細胞可以是培養的細胞、亦可以是愈傷組織中的無結構的細胞團、或者是結構的葉片外植體、帶葉分枝培養物、種子、果實、葉片、根等、或者是有結構的完整的植物體。外源構建物通常存在於全部或基本上全部的植物組織的細胞中，然而外源構建物的表達可能僅限於特定的細胞或植物發育的特定階段。這種外源構建物將包括轉錄和轉譯起始信號和終止信號，以有意義的基因的5′端為起始信號，而以其3′端為終止信號。
RNA聚合酶結合位點(啟動子)的轉錄起始區對植物寄主可以是天然存在的或可能為其他來源，該區在蕃茄寄主體內是起作用的。其他來源包括農業土壤桿菌T-DNA基因，如胭脂鹼、章魚鹼、mannopine或其他冠癭鹼生物合成的轉錄起始區、植物或不同於寄主的其它植物的轉錄起始區、各種病毒，尤其是各種寄主特異著毒的轉錄起始區，或部分或全部人工合成的轉錄起始區。
轉錄起始區不僅包括RNA聚合酶結合位點，而且還可包含能保證轉錄的調節區。該區的調節包括化學或物理阻遏或誘導，如代謝物或光或與葉、根、種子等等有關的以細胞分化為基礎的調節。因此，可從適當的基因得到轉錄起始區或其調節部分，如光誘導的1，5-雙磷酸核酮糖羧基酶基因、逆境誘導基因、受溫度調節的熱休克基因、創傷誘導基因、分生組織特異基因等。
3′端終止區可來自與轉錄起始區相同或不相同的基因，如該區有意義的基因具有一個在蕃茄種中起作用的轉錄終止區，該區可與這個基因一起保留下來。
構建一個能表達的盒帶(Cassette)包含轉錄起始區，在轉錄起始區的轉錄調節控制下的有意義的基因、起始密碼子、基因的編碼順序、有或無基因內區轉譯終止密碼子，隨後是轉錄終止區。轉錄終止區包括終止區、通常還包括多腺苷酸化的信號順序以及與轉錄終止有關的其它順序。轉錄方向是從5′→3′的方向。表達的盒帶通常約少於10Kb基，經常約少於6Kb，至少約為1Kb，更常見至少約為2Kb。
有意義的基因可來自於染色體基因、cDNA、人工合成基因、或由此形成的結合物。該基因的表達產物存在於除細胞質之外的其它部位，其構建通常要包括導致將該基因表達產物轉移到特定部位的特定胺基酸順序。該特定部位可以是細胞器，如葉綠體、線粒體或細胞核、細胞質膜。該基因表達產物亦可分泌到細胞的外周胞質區或外界環境中。各種分泌引導體(leaders)、膜整合順序以及為了將肽表達產物定向地引入特定部位的轉運順序都在文獻中有描述，例如參閱Cashmore et al.，Biotechnology(1985 3803-808，Wickner and Lodish，Science(1985)203400-407。
用於植物種的有意義基因包括各種各樣的表型性狀或非表型性狀基因，表型性狀基因中有酶的，這些酶能提供抗逆境，如抗由熱和鹽分而引起的脫水、抗昆蟲、抗除草劑、抗有毒金屬或微量元素等。這些抗性可能是由於標部位的改變、受體細胞內目標蛋白量的提高，增加與某種產物的生物合成途徑有關的一種或多種酶，保護受體抵抗逆境等等。這些基因可從原核生物或真核生物、細菌、真菌如酵母、病毒、植物、哺乳動物得到、或全部或部分由人工合成。所述基因包括抗草甘膦3-烯醇丙酮基二氧膦基莽草酸鹽合成酶基因、腈水解酶、脯氨酸和穀氨醯胺生物合成途徑中有關的基因、金屬巰基蛋白基因、組氨酸三甲基內鹽基因、硫酯酶Ⅱ基因、醯基載體蛋白質基因、乙醯基醯基轉移酶基因等。其它有意義的基因是涉及調節生長的基因，如源/匯點(碳素分配)關係的控制，如固體含量的變化、或激素調節、光合效率、如改變RuBP羧基酶的效率、或改變植物品味的質量或營養價值、改變固體液體比例、粘性或植物果實的數量、大小、色澤、磨損抗性或硬度等基因。
也可用一個或多個表達盒帶，在這裡可以首尾相接的方式利用表達盒帶以便各個基因表達，這些基因可以彼此獨立地表達產物，也可能是同時受到調節。這些表達產物可以獨立地起作用、亦可結合起來起作用。
用農業土壤桿菌的方法被轉化到植物細胞中的表達盒帶通常靠近T-DNA右邊界或T-DNA的兩個邊界至少約1Kb之內。這些邊界可由任何Ti質粒或Ri質粒獲得，並可用常規方法與表達盒帶連結。為了從除了Ti或Ri質粒之外的質粒直接轉移以構建表達盒帶，並通過同源重組方法將其整合進入Ti或Ri質粒的T-DNA區。因此，該表達盒帶可在其一個或兩個邊緣處具有的DNA順序與存在於Ti質粒或Ri質粒中的T-DNA區的順序同源，要改裝Ti質粒使之缺失表達對瘤形成所必需的蛋白質產物的基因。
通常在至少具有一個複製系統的載體上攜帶表達盒帶，為便種起見常用的是具有一個在大腸腸桿菌中起作用的複製系統，如ColEl、pSC101、pACYC184等。在該方法每次操作後的每個階段，使得得到的構建物克隆化、作順序測定，並作測定後的矯正處理。除用大腸桿菌複製系統的部位外，還可用廣譜的複製系統，如P-1不親和質粒，如pRK290的複製系統，這些質粒與被改裝的Ti質粒一起對於T-DNA轉移到植物種寄主體內是特別有效的。
除了這種複製系統外，通常還至少存在一種標記物，該標記物可用於一種或多種寄主中，還可為個別的寄主提供各種不同的標記物，即為了在原核寄主體內的選擇可用一種標記物，而對真核寄主，尤其是植物種寄主中的選擇要用另一種標記物。這些標記物可保護宿主抗殺生物劑，如抗菌素、毒素、重金屬等;或起互補作用，對營養缺陷型宿主提供原養型。所用的各種基因包括新黴素磷酸轉移酶(NPTⅡ)、潮黴素磷酸轉移酶(HPT)、氯黴素氨基轉移酶(CAT)、腈水解酶、艮他黴素抗性基因等。對植物寄主的選擇而言，特定有意義的標記物包括提供卡那黴素抗性或G418抗性的NPTⅡ、通過潮黴素抗性的HPT、提供氯黴素抗性的CAT、提供草甘膦抗性的aro A突變基因等。
用限制性核酸內切酶切割一種相當重複的體系，依次引入包括各種構建物、表達盒帶、標記物等的各種片仔，並將特定構建體或片段插入有效的部位。在連接和克隆後，為了進一步的操作，可再分離出載體。所有這些技術在文獻中都有詳細地說明。在Maniatis et al.，Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY，1982.中，還可找到特例。
現在可用適宜選擇的方法分離出含有所期望結構建物的被轉化植物細胞，這些轉化細胞在一種選擇的培養基中長成愈傷組織。該選擇的培養基可能含有一種殺生物劑，即抗生素如G418、潮黴素、博萊黴素等，決定於構建物中所含有的特定標記物來保證抗性，根據植物細胞的敏感性，殺生物劑的濃度可以不同。無選用標記的，或該標記基因的表達已證明不宜用於選擇，則可用南方(Sourhern)、北方(Northern)、或西方(Western)印跡法來檢測轉化細胞中的核苷酸順序和蛋白質。
一旦愈傷組織形成帶葉的分枝後，可將這些帶葉分枝轉移到生根培養基中，以產生能表達有意義基因的小植株。
所得到的小植物將具有各種不同的所期望的表型，如對熱、鹽度、除草劑等逆境的抗性、被改進的加工特性，被改進的能接受感覺的特性，植物特殊產物，如植物油的優先形成、細菌或哺乳動物蛋白質的產生等等。
以下提供的實施例，僅用以說明本發明但不限於本發明。
大腸桿菌MM294菌株(Hanahan，J.Mol.Biol.(1983)116557-580)被用作含有pRK290型複製子的雙元載體的受體，上面已介紹了土壤桿菌C58菌株，PC2760是土壤桿菌LBA4404菌株(Hoekema et al.，Nature(1983)303179-180)的另一個名稱。通過將pTIA6轉化到A114.菌株(NT1)(Nester and Kosuge et al.，Nature(1983)303179)來產生K12菌株。用於大腸桿菌的抗菌素水平為毫克/升，卡那黴素為30、氯黴素為50、青黴素300、四環素為10、及艮他黴素為20。除非另有說明，用於土壤桿菌的其它抗菌素水平也是以毫克/升計，各為100毫克/升卡那黴素或艮他黴素和50毫升/升羧苄青黴素或氯黴素。
限制性核酸內切酶和T4連接酶由市場購得，並按照生產者的建議來使用，可用上述Maniatis等人所介紹的標準方法進行克隆和分子分析。
實施例1質粒的構建將含有APHⅡ(Jorgensen et al.，Mol.Gen，(1979)17765)的完整結構基因的Tn5的BglⅡ-SmaⅠ片段克隆到pUC8(Vieira and Messing，Gene(1982)19259)中，由於有一個很貼近SmaⅠ位點的EcoRⅠ位點，可將上述片段轉化成HindⅢ-EcoRⅠ片段。然後將含有APHⅡ基因的3′部分的PstⅠ-EcoRⅠ片段與EcoRⅠ-BamHⅠ-SalⅠ-PstⅠ銜接物一起組入pUC7(pCGN546W)的EcoRⅠ位點中。由於該構建體不提供卡那黴素抗性，因此卡那黴素抗性是通過將APHⅡ基因的BglⅡ-PstⅠ片段插入BamHⅠ-PstⅠ位點(pCGN546X)來獲得。這個步驟是使APHⅡ基因重新組裝，以使EcoRⅠ位點位於該基因的側面。有一個ATG密碼子是在從帶有APHⅡ起始密碼子ATG的解讀密碼以外的上遊。通過將APHⅡ的5′端的Sau 3A-PstⅠ片段插入pCGN546W的BamHⅠ-PstⅠ位點可獲得質粒pCGN550，由於APHⅡ5′端的Sau 3A-PstⅠ片段缺失不需要的ATG，因此可避免產生不期望的ATG。
然後將含有APHⅡ基因(1ATG)的EcoRⅠ片段克隆到pCGN451的EcoRⅠ單一位點中，該位點含有能表達的章魚鹼合成酶盒帶，得到pCGN552(1ATG)。
將含有章魚鹼盒帶5′一非編碼區的1556bp的質粒與PTiA6的章魚鹼合成酶的3′非編碼區融合，此種融合是通過一種EcoRⅠ的銜接物。如由Barker et al.，Plant Mol.Biol.(1983)2325所確定的，對於3′區來說pTi的相同區為11，207到12，823鹼基對，5′區的相同區為13，643到15，208鹼基對。
得到的5′片段如下含有編碼區的5′端的一個小的再克隆片段，如BamHⅠ-EcoRⅠ片段克隆在pBR322中，即為質粒pCGN407。BamHⅠ-EcoRⅠ片段具有編碼區XmnⅠ位點，而pBR322則具有2個XmnⅠ位點。pCGN407用XmnⅠ消化，用Bal 31核酸切割，並將EcoRⅠ銜接物加入到這些片段中。在EcoRⅠ和BamHⅠ消化後，按大小分離這些片段，隨後將各分離部分克隆化和順序化。有一種情況是，整個編碼區和5′非翻譯序列的10bp已經被除去，留下5′非轉錄區、mRNA帽子位點和5′完整非翻譯區至一個BamHⅠ位點的16個鹼基對。通過在7%丙烯醯胺凝膠上按大小分離可得到此小片段，同時洗脫出長約130鹼基對的幾個片段。將此分離的DNA連結進入M13mp9，並對上述幾個克隆進行順序測定，再將此順序與已知的章魚鹼合成酶基因的順序進行分析比較。M13構建體稱為pI4，用BamHⅠ和EcoRⅠ消化pI4質粒得小片段，將該小片段與含有pTIA6(Garfinkel and Nester，J.Bacteriol.(1980)144732)上遊5′順序的XhoⅠ至BamHⅠ的片段連接，並同時與含有3′順序的EcoRⅠ至XhoⅠ片段連結。將所得到的XhoⅠ片段克隆到pUC8衍生質粒，即為pCGN426的XhoⅠ位點。該質粒與pUC8不同之處在於只含有用DNA多聚酶Ⅰ插入唯一EcoRⅠ位點。當XhoⅠ銜接物插入pUC8的HincⅡ單一位點時，由於HincⅡ限制性核酸內切酶汙染核酸酶而失去PstⅠ和HindⅢ位點。得到的pCGN451質粒含有單一的EcoRⅠ位點，以便在5′非編碼區(該5′非編碼區含有包括T-DNA的右邊緣的1550鹼基對的5′非轉錄順序、mRNA帽子位點和16鹼基對的5′非轉譯順序);和3′區(該3′區含有267鹼基對的編碼區、終止密碼子、196鹼基對的3′非轉譯DNA、多腺苷酸A位點和1，153鹼基對的3′非轉錄順序之間插入蛋白質的編碼順序。
所得到質粒PCGN451有恰當排列方向的OCS5′和OCS3′，此質粒用EcoRⅠ消化，從pCGN551消化得來的EcoRⅠ片段含有完整的卡那黴素抗性基因，此基因被插入EcoRⅠ位點，使得pCGN552具有的卡那黴素抗性基因處於恰當的排列方向。
用此OCS/KAN(章魚鹼合成酶基因/卡那黴素抗性基因)為反式二元載體pCGN587提供一種可選擇的標記。
所設計的章魚鹼合成酶啟動子盒帶的5′部分是由TiA6DNA的XhoⅠ片段的15208-13644鹼基對(Barker′的編號組成的，該5′部分還含有與T-DNA轉移有連帶關係的T-DNA界面順序(邊緣)。在質粒pCGN587中，從pCGN552中的OCS/KAN基因能提供一種可選擇的標記和右邊緣，由HindⅢ-EcoⅠ片段再克隆的左界面區為pCGN565中的KpnⅠ-EcoRⅠ片段得到pCGN580。pCGN565是一種以pUC8-Cm為基礎的克隆載體，但含有pUC18銜接物，pCGN580與BamHⅠ聯成線狀用以取代pVCK102的較小的BglⅡ片段(Knauf and Nester，Plasmid(1982)845)，產生pCGN585。
通過用含有OCS/KAN基因的pCGN552的XhoⅠ片段代替pCGN585的較小的SalⅠ片段，可得到pCGN587。
pPMG85的構建由pTiA6(Salomom et al.，EMBO J.(1984)3141∶146)的mannopine合成酶基因(mas)5′區來構建pPMG85。該基因從(Knauf and Nester，Plasmid(1982)845-54)的pTiA6的T-DNA的一個柯氏質粒(cosmid)克隆而獲得，此質粒稱為PVCK232。用EcoRⅠ消化pVCK232，所得到的稱為Eco13或EcoC的其中一個片段被克隆在pACYC184中，得到質粒pCGN14。用CalⅠ和SphⅠ消化pCGN14，得到一種片段的混合物，其中有所需要的片段，該所需要的片段是從ClaⅠ位點20128處到SphⅠ位點21562切下來(Barker et al.，Plant Mol.Bio(1983)2335-350)而得到的。此片段含有mas 5′區並被克隆在pUC 19(Yanisch-Perron et al.，Gene(1985)33103-119)，pUC19，SphⅠ和AccⅠ變成線性分子的得到質粒pCGN40。將pPMG34(Stalker et al.，J.Biol.Chem.(1985)2604724-4728)的aro A BamHⅠ片段，以適當的排列方向克隆進入pCGN40中，在這裡，aroA基因和mas啟動子區融合，得到pPMG67。
要得到一個多腺苷酸化的信號，可用pTiA6(Garfinkel et al.，Cell(1983)27143-153)的tml3′區。含有該區的T-DNA BamHⅠ片段(9062-13774;Barker編號)定向地從pVCK232被克隆在pACYC184中。在此處，13774核苷酸是靠近載體的HindⅢ位點。用SmaⅠ消化得到的質粒，該質粒在tml3′區的11210核苷酸(Barker的編號)切斷至插入一個八聚體XhoⅠ銜接物(由新英格蘭生物實驗室合成，用HindⅢ、XhoⅠ消化所得到的質粒pBamⅩ，通過用HindⅢ和SalⅠ消化pPMG67得到含有大部分mas5′區和aro A基因的片段克隆進入線狀的pBamⅩ，所得到的質粒pPMG73含有5′-mas-aroA-tml-3′雜合基因。
考慮到在農業土壤桿菌中進行有效選擇，可將pUC4K(Vieira and Messing，Gene(1982)19259-268)的卡那黴素抗性基因從SalⅠ處切割並克隆在存在於已知的pPMG76的mas5′區的aro A末端的XhoⅠ位點。
將在pRiA4T-LT-DNA(White and Nester，J.Bacteriol(1980)1411134;Taylor et al.，Mol.Gen.Genet.(1985)201546)的Hind17區中的一個2.0Kb EcoRⅠ片段克隆在pPMG76的氯黴素抗性基因EcoRⅠ位點中，得到pPMG82。
為選擇抗卡那黴素的轉化植株，黴構建msa-npt雜合基因(見Velten et al.，EMBO J.(1984)32723-2730用一種類似的構建)。通過用EcoRⅤ(21552;Barker的編號)和EcoRⅠ(在pUC19多聚銜接物)消化pCGN40以切割mas5′區並克隆在用SmaⅠ和EcoRⅠ消化的pCGN451中。限制性缺失pCGN451的全部ocs5′區並在該位插入mas5′區。此外，pUC19多聚銜接物從XbaⅠ到EcoRⅠ的部分被插入在mas啟動區和ocs多腺苷酸化作用的位點之間，為待表達基因的插入可選擇不同的位點。將帶有Tn5 npt基因(Rothstein et al.，Cell(1980)19795-805)的pCGN552的EcoRⅠ片段插入質粒pCGN46的EcoRⅠ位點中，此處除去了5′區未轉譯的ATG順序。
通過用XhoⅠ消化以切斷mas-npt-ocs雜合基因，並將其克隆在pPMG82的SalⅠ位點中，得到pPMG85。
所得到的質粒pPMG85包含從EcoRⅠ位點起始、來自pACYC184的一個EcoRⅠ-HindⅢ 1.5Kb片段和順時針排列的來自pUC4K的細菌卡那黴素抗性基因、以順時針方向定位的mas5′區核苷酸21476到20128、包含來自pPMG34片段的BamHⅠ-SalⅠaro A、從核苷酸11207到9062的tml3′區、一個來自pACYC184的四環素抗性基因的BamHⅠ-SalⅠ片段、來自pCGN552的npt基因、一個來自pACYC184的2.5Kb SalⅠ-EcoRⅠ片段和來自在BglⅡ-HindⅢ-17片段(Huffman et al.，J.Bacteriol(1984)157269-276)上的pRIA4的2Kb EcoRⅠ片段。
實施例2蕃茄子葉組織的轉化從幼苗得到完全無菌的蕃茄子葉組織，幼苗是於24℃下在含有Murashige-Skoog鹽培養基和0.8%瓊脂(pH6.0)的100×25毫米培養皿中生長發育16小時/8小時日/夜周期時間。各蕃茄種均可使用，但本發明是用UC82B近交繁殖系，它可從戴維斯站(澳)加利福利亞大學蔬菜作物系CA 95616得到。將子葉切成三片並將中間一片子葉置於飼養平板上預培育24小時。用滴管將0.5毫升的菸草懸浮培養物(106細胞/毫升)移到含有Murashige基本有機培養基(K.C.生物製品)、2、4-d(0.1毫克/升)激動素(1毫克/升)、硫胺素(0.9毫克/升)和磷酸氫鉀(200毫克/升、pH5.5)的0.8%瓊脂培養基上，以製備飼養平板，該飼養平板在使用前兩天製備。菸草懸浮細胞生長兩天後，將一張含有飼養培養基的3毫米無菌濾紙圓片放在菸草細胞的上部。
將子葉切片中三分之一的中間那些子葉切片預保溫後，置於根癌土壤桿菌2760/587/85菌株(1×107-1×108細菌/毫升)的液體MG/L肉湯液體培養物(1-5毫升)中。(將質粒pCGN87和pPMG85轉化到大腸桿菌C2110(polA)利用卡那黴素和草甘膦抗性選出共合體，引自Fromard et al.，Bio Technology，May1983，PP.262-267)。用兩個菌株大腸桿菌和一個菌株的土壤桿菌進行細菌接合，其中一株大腸桿菌(MM294)具有提供遷移功能的pRK2073，而另一株大腸桿菌(C2110)帶有卡那黴素抗性標記的質粒將被轉移到土壤桿菌中去。兩株大腸桿菌均於37℃在LB肉湯液體培養基中震蕩培養過夜，土壤桿菌株則於28℃在MG/L肉湯液體培養基中培養過夜。三種菌株各取50微升置於MG/L平板的硝化纖維濾紙上混合，該平板於28℃保溫3天，混合液在補加100微克/毫升卡那黴素和100微克/毫升鏈黴素的AB基本培養基上劃線後，於28℃保溫兩天，所加的鏈黴素使兩株大腸桿菌致死。通過在上述培養基上兩次以上的劃線培養以純化和挑取單個菌落。將子葉切片與細菌在飼養平板上共培養48小時，隨後將其轉移到含有500毫克/升羧苄青黴素和100毫克/升卡那黴素的再生培養基中。再生培養基是含有玉米素(2毫克/升)、肌醇(100毫克/升)、蔗糖(20克/升)、Nitsch維生素及0.8%瓊脂(pH6.0)的一種K.C.生物製品Murashige-Skoog鹽培養基。發育2-3周後即可觀察到帶葉枝條的生長，當帶葉枝條長至約1.25釐米長時，將其切下斷並轉移到含有羧苄青黴素(500毫克/升)和卡那黴素(500毫克/升)的Murashige和Skoog培養基中以便生根，10-12天內發育出根。
將在含有卡那黴素培養基上發育並隨後生根的帶葉枝條進行APH酶活性和是否存在aro A蛋白質的檢測。西方印跡法蕃茄植株的提取液在西方印跡法中(Comai et al.，Nature(1985)37341-344)顯出aro A蛋白質的一條正常。用誘變的草甘膦抗性aro A基因表達產物，按常規方法使兔子產生免疫即可獲得抗體用於西方印跡法。美國專利4，535，060的有關介紹已為本發明列入參考。在有標準條帶的凝膠中證實草苷膦抗性酶確實生成並且在寄主細胞中也是穩定的。
在假定已轉化的蕃茄植株和枝條上也進行了氨基糖苷磷酸轉移酶(APH 3′Ⅱ)的分析，發育成帶葉分枝條並隨後在含有卡那黴素的培養基上生根的約90%的蕃茄植株已檢驗出對APH3′Ⅱ酶活性為正帶，APH 3′Ⅱ提供對卡那黴素和新黴素的抗性。用電泳法將酶與其它幹擾的蛋白質分離，分析APH 3′Ⅱ的活性(Reiss et al.，Gene(1984)30211-218)。亦可通過在原位卡那黴素的磷酸化作用檢測出APH 3′Ⅱ的酶促活性。卡那黴素和〔γ-32P〕ATP都可作為底物用，並包埋在瓊脂糖凝膠裡，該瓊脂糖凝膠被置於含有蛋白質的聚丙烯醯胺凝膠的上面。酶促反應後，磷酸化的卡那黴素被轉移到P-81二氧磷基纖維素離子交換紙上，用放射自顯影法最後可見使放射性標記的卡那黴素顯影。用0.1毫克/毫升的蛋白質酶K洗P-81離子交換紙，以改進Reiss等人的方法。
在子葉細菌共培養後，放在「2Z」再生培養基平板上的約90-100%子葉都再生出帶葉枝條。放在含有羧苄青黴素和卡那黴素「2Z」培養基平板上約60-90%子葉也都形成了帶葉枝條。在選擇培養基上開始培養的約80%的帶葉枝條隨後都在含有卡那黴素(50毫克/毫升)的生根培養基上生出了根。通過蛋白質的西方印跡法分析，有90%以上的這些帶葉枝條在產生了aro A蛋白質的卡那黴素上生出了根，表1列出了蕃茄轉化的結果。
表1通過與農業土壤桿菌共培養的蕃茄轉化處理 子葉數 總數不飼養物 13/19 68% 27/41 66%KCMS+培養基 14/22 64%玉米飼養物 10/14 71% 24/37 64.3%KCMS+培養基 6/11 55%8/12 67%菸草飼養物 12/12 100% 33/37 89.3%KCMS+培養基 10/12 83%11/13 85%無飼養物 4/18 22% 11/35 31/5%N6培養基 7/17 41%玉米飼養物 6/22 27% 11/32 29.0%N6培養基 5/10 31%對照數KCMS+培養基是菸草培養基，N6培養基是玉米培養基。
通過肉眼檢查子葉在含有100毫克/升卡那黴素的2Z培養基上開始生長的綠色帶葉分枝可測定出轉化反應。
因此，以上介紹的蕃茄轉化/再生系統是快速而有效的，85%以上的共培養的外植體隨後都在選擇的卡那黴素培養基上發育成帶葉分枝並表達了aro A蛋白質。每個外植體長出了2-10個帶葉分枝，6周後，每個外植體長出了10、20或甚至更多個的帶葉的分枝。草甘膦噴黴試驗證實得到的蕃茄植株對0.75磅/英畝的草甘膦具有抗性。
上述結果證明能夠有效地轉化植物種，利用此種方法外源基因可以整合進入植物基因組而且能夠表述。並提供新的表型性狀。根據高效的轉化，在適當的期限內，又沒有過多的重複步驟就可實現成功的轉化。如上述介紹所證實的，所提供的植物種能保護植物免受除草劑的傷害，從而可以實現農作物的快速生長和高產。
為清楚理解起見，雖已通過說明和舉例的方法，詳細介紹了本發明，但顯然可在申請的專利範圍內實行某些變動和修改。
權利要求
1.一種高效轉化植物細胞的方法，將DNA引入上述的植物細胞，該DNA能在上述細胞中複製和轉錄，該方法包括在植物細胞所限定的培養基中培育子葉細胞，並與含有一種構建體、並被改裝和轉化的農業土壤桿菌(Agrobacterium)細胞共培養。這種構建體包括一個T-DNA的邊界和能夠在植物細胞內轉錄的一個有價值的基因，此構建體還能夠被轉移至植物細胞內，以後整合進入該植物細胞的基因組。利用上述構建體能夠被整合進入該植物細胞基因組，以便提供被轉化的植物細胞。除去上述轉化植物細胞的細菌，在再生培養基中培育該轉化的植物細胞，以產生帶葉的分枝，以及轉移帶葉分枝到生根培養基中以產生小植物。
2.根據權利要求
1的方法，其中上述子葉細胞是通過完全無菌的條件下，得到萌發的無菌種子，形成伸出的子葉;以及將上述子葉至少切成兩片，除去該種子的其他部分並挑選更靠近種子的那片子葉切片。
3.根據權利要求
1的一種方法，其中所說的限定培養基是指含有激素和維生素的軟的瓊脂培養基中，有每毫升104-1010細胞生長，這種培養基在培育上述子葉細胞時，至少前一天製備出來。
4.根據權利要求
1的一種方法，其中所說的植物細胞首先與細菌肉湯液體培養基中的上述土壤桿菌接觸，隨後將與土壤桿菌接觸過的細胞轉移到條件培養基中。
5.一種有效地轉化蕃茄植物細胞的方法，將DNA引進該蕃茄植物細胞，其中DNA能在該細胞中複製和轉錄，上述方法包括將子葉細胞置於植物細胞所限定的培養基中培育，與含有一種構建體、並經過改裝和轉化的土壤桿菌細胞共培養，這種構建體包括一個T-DNA邊界和在蕃茄植物細胞內能夠轉錄的有價值的基因，這種構建體能夠被轉移到蕃茄植物細胞內並且能夠整合進入該細胞的基因組，根據上述構建體整合進入該蕃茄植物細胞的基因組，以便提供轉化的蕃茄植株細胞;除去上述轉化植物細胞的細菌，與再生培養基中該轉化的植物細胞在再生培養基中培育，以產生帶葉分枝，以及將上述的帶葉分枝轉移到生根培養基中，以產生小植物。
6.根據權利要求
5的一種方法，其中所說的子葉細胞是通過實質上在無菌條件下，使無菌種子萌發來獲得，形成伸出的子葉;以及將上述子葉至少切成兩片，除去該種子的剩餘部分並挑選靠近種子一片子葉切片。
7.一種蕃茄細胞具有編碼外源的草甘膦抗性的3-烯醇丙酮基二氧膦基莽草酸鹽合成酶的構建物。
8.一種具有外源的草甘膦抗性的3-烯醇丙酮基二氧膦基莽草酸鹽合成酶的蕃茄細胞。
9.根據權利要求
7的一種蕃茄細胞，其中所說的蕃茄細胞是蕃茄(Lycopersicon esculentum)。
10.根據權利要求
8，由蕃茄細胞組成的蕃茄苗。
專利摘要
本發明涉及通過將子葉的帶葉分枝培養物與外源基因共培養轉化，隨後由轉化細胞再生出植物體，從而產生能表達外源基因的植物體以產生植物種，特別是利用一種受到控制的農業土壤桿菌(Agrobacte-rium)轉化系統來轉化蕃茄帶葉分枝培養物，而後使轉化的蕃茄組織再生成植物體。
文檔編號C12N15/82GK87104202SQ87104202
公開日1988年3月9日 申請日期1987年6月10日
發明者喬安·菲拉蒂, 布魯斯·R·託馬斯 申請人:加利福尼亞基因公司導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan