一種將單核細胞分化培養為成熟的樹突狀細胞的方法

2023-05-03 14:23:16

專利名稱：一種將單核細胞分化培養為成熟的樹突狀細胞的方法
技術領域：
本發明涉及一種將CD 14+單核細胞分化培養為成熟的樹突狀細胞的方法，屬於細胞生物學領域。
背景技術：
樹突狀細胞(Dendritic cell, DC)於1973年由Meinman和Cohn首次從小鼠淋巴器官分離獲得。是目前所知功能最強的、也是唯一能激活初始性T細胞(NT cell)的專職抗原提呈細胞(Antigen-presenting cell，APC)，在免疫應答中處於中心地位。近年來基於DC的免疫治療已經成為研究熱點，尤其是體外大量擴增培養DC用於病毒感染和腫瘤治療已經進入臨床實驗階段。DC起源於骨髓CD34+細胞，除大腦以外廣泛分布於全身各臟器，但數量極微，僅佔外周斑單核細胞的0. 5-1%以下。目前研究表明，經細胞因子作用可在體外誘導分化獲得大量DC。具體方法包括有(1)用細胞因子混合劑如幹細胞因子(SCF)、IL-3、IL-4、IL-6等培養⑶34+幹細胞來源J2)IL-4、GM-CSF培養單核細胞來源；(3)從外周血中分離獲得DC。近年來的一個重要進展就是把骨髓和血中的CD34+前體細胞誘導成有免疫刺激活性的DC。具體來源和方法為①臍帶血臍帶血中含有豐富的細胞因子，具有組織相容性好等特點，用臍帶血體外誘導擴增DC成為目前研究的熱點。但是從臍帶血中純化出CD34+幹細胞費用昂貴。②骨髓骨髓中含有大量的CD34+造血幹細胞，在合適的細胞因子刺激下可以誘導高質大量的DC。其主要缺點是骨髓採集不易，而且容易汙染，患者比較痛苦，擴增費用昂貴。③ 脾臟脾臟是免疫器官和造血器官，從脾臟分離出來的貼壁單核細胞可以誘導分化為典型 DC ；但脾臟來源受限。由於DC存在異質性，不同組織來源，不同的培養擴增條件可以得到不同分化成熟階段的DC。由於外周血採集方法簡單易行，並且較骨髓而言不易汙染。目前很多人主張用外周血來源的DC做免疫治療。常用的方法是從正常人外周血分離獲得單核細胞，加入GM-CSF、IL-4，進一步地成熟需要腫瘤壞死因子-α (TNF- α )、⑶40或其他試劑如細菌脂多糖(LPQ的刺激。體外培養1周後，可獲得大量高純度的DC。但是此種方法細胞誘導周期較長，細胞因子價格昂貴。2008年Brian C. Schanen利用transwell技術(一類有通透性的杯狀的裝置，常用於腫瘤侵襲實驗，共培養實驗等)將外周血單核細胞(PBMC)和人臍靜脈血內皮細胞(HUVEC)進行共培養，在PBMC通過上層的HUVEC後，在下層分化為未成熟的DC，整個分化過程不需要外源細胞因子，並且更接近體內DC分化的過程，但是這種培養方法transwell價格比較昂貴並且只適用於小量培養(Brian C. Schanen and Donald R.Drake III. A novel approach for the generation of human dendritic cells from blood. Journal of Immunological Methods2008,335,53-64)。基於現有技術存在的問題，本發明欲使用人臍靜脈內皮細胞株作為飼養層細胞， 並提供相應的細胞因子，以誘導單核細胞的成熟和分化，旨在提供一種經濟、方便、高效的 DC培養分化技術，解決現有技術存在的問題。

發明內容
本發明提供了一種將CD 14+單核細胞分化培養為成熟的樹突狀細胞的方法，所述方法包括以下步驟(1)以能分泌促進細胞成熟的細胞因子的人臍靜脈內皮細胞作為飼養層細胞，培
養至貼壁；(2)接種CD 14+細胞，與(1)所述飼養層細胞進行共培養36_60小時；(3)收集步驟(2)獲得的懸浮細胞；(4)將步驟( 獲得的細胞與能分泌促進細胞分化的細胞因子且已經貼壁生長的飼養層細胞人臍靜脈內皮細胞共培養12-36小時；(5)收集步驟(4)獲得的懸浮細胞，即為成熟的樹突狀細胞。在一個優選技術方案中，所述人臍靜脈內皮細胞為Ea. hy926細胞。在另一個優選技術方案中，所述步驟O)中所述的能分泌促進細胞成熟的細胞因子為GM-CSF和/或IL-4。在又一個優選技術方案中，所述GM-CSF和IL-4為融合表達蛋白。為獲得更好的技術效果，所述步驟O)中所述的培養時間可以為48小時。在一個優選技術方案中，所述步驟中所述的能分泌促進細胞分化的細胞因子為 TNF- α。為獲得更好的技術效果，所述步驟⑷中所述的培養時間為M小時。在另一個優選技術方案中，所述⑶14+單核細胞分離於人外周血。在另一個優選技術方案中，所述細胞因子的表達載體為慢病毒載體pBPLV。為獲得更好的技術效果，所述Ea. hy926細胞在共培養之前需要經過的劑量為 40Gy的γ射線照射。本發明利用能分泌促進細胞成熟和分化的細胞因子的人臍靜脈內皮細胞株用作 DC培養的飼養層細胞，不僅模擬了體內DC分化時在體內的微環境和細胞因子催化的過程， 避免了用人臍靜脈血內皮細胞HUVEC作為飼養層時，原代細胞來源受限，每次提取都必須從臍帶中分離得到，而且培養時需要加入細胞因子的問題。本發明所具體使用的人臍靜脈內皮細胞株Ea. hy^6細胞，是HUVEC和肺癌細胞A549的融合細胞，可以增殖100代以上， 並且培養時不需要加入細胞因子，克服了培養複雜以及不穩定等因素，優化了 DC的培養系統。與傳統方法相比具有經濟、快速、可以大量培養的特點及優勢。


圖IGM-CSF和IL-4、以及TNF- α PCR擴增產物鑑定圖；圖2重組慢病毒載體pBPLV (GFP)構建示意圖；圖3重組質粒pBPLV-GMCSF-2A-IL4酶切圖譜；圖4重組質粒PBPLV-IL2信號肽-STNF- α酶切圖譜；圖5慢病毒載體包裝電鏡圖；圖6Ea. hy926細胞感染電鏡圖；圖7DC體外培養倒置顯微鏡觀察形態圖；圖8DC的表型變化的流式細胞分析圖。
具體實施例方式以下結合具體實施例對本發明進行更為詳細的說明，但是這些實施例用於更好地理解本發明，但並不限定本發明。本發明的保護範圍以權利要求書為準，在本發明的發明構思範圍內，以本領域普通技術人員的技術水平和本領域公知常識水平作出的任何改變均處於本發明的保護範圍內。實施例1分泌GM-CSF和IL-4、以及TNF- α的Ea. hy926細胞的構建1.慢病毒多基因共表達載體的建立1)分別擴增 GM-CSF-2A，以及 2A-IL4 序列。2A序列正向引物5，-3，GAGGGCAGAGGAAGTCTTCTAACATGCGGTGACGTGGAGGAGAATCCCGGCCCT2A序列反向引物5，-3，AGGGCCGGGATTCTCCTCCACGTCACCGCATGTTAGAAGACTTCCTCTGCC CTC2)擴增融合基因 GM-CSF-2A-IL4。3)擴增 IL2 信號肽-sTNF- α。2)與3)的PCR擴增的結果見圖1，在圖1中，各泳道依次為(1). GM-CSF_2A_IL4 重疊PCR結果；(2) IL2信號肽-sTNF- α ； (3)分子量標記DL. marker2000。通過聚合酶鏈式反應(PCR)分別獲得了 GM-CSF、IL4共表達基因948bp，以及目的基因IL2信號肽-sTNF-α 530bp左右。測序結果經過序列比對與Genebank公布序列一致(IL4Gene ID 3565，GM-CSF Gene ID 1437，TNF-α Gene ID 7124，IL2 信號肽序列參考文獻單純分泌性TNF-α真核表達質粒的構建及表達細胞株的建立，細胞與分子免疫學雜誌(J Cell Mol Imumuno 1)2000 ； 16(1))。4)目的基因連接pEASY-Tl載體(購自"TransGen Biotech公司)測序(按產品說明書進行操作)。 5)慢病毒載體pBPLV (pBPLV是通過將pMAl載體(該載體是將原始質粒pRRLSIN. cPPT. PGK-GFP. WPRE (購自 ADDGENE 公司)參考 Amedola M, et al. Coordinate dual-gene transgenesis by lentiviral vectors carrying synthetic bidirectional promoters. Nat Biotechol, 2005, 23(1) :108-116文獻進行改造而得)用限制性內切酶PstI、Mil進行雙酶切後與正義鏈為5，-ggctagcatgctctagagcgctg-3，，反義鏈為 3，-acgtccgatcgtac gagatctcgcgacagct-5』多克隆位點序列連結得到的)與目的基因37°C分別雙酶切汕後，T4 連接酶的作用下16°C過夜(所用的酶均來自TaKaRa公司，按照說明書進行操作)。載體構建示意圖見圖2，在圖2中，通過雙酶切、連接過程獲得重組質粒 PBPLV-GM-CSF-2A-IL4 (xba I，sail)、pBPLV_IL2 信號肽-TNF-α (pst I，sall)。6)構建後的質粒鑑定圖3為重組質粒pBPLV-GMCSF-2A-IL4酶切圖譜。其中(1) sail單酶切；(2)xbal 單酶切；(3)雙酶切；(4)分子量標記maker 15000。圖4為重組質粒PBPLV-IL2信號肽-STNF- α酶切圖譜。其中(1) DLmarker2000 ； (2)pst I 單酶切；(3)sal I 單酶切 J4)pst I、sail 雙酶切；(5)DLmarker 15000。通過雙酶切鑑定，兩個重組質粒都可以切除目的基因的條帶，該結果表明構建質粒成功。
2.慢病毒載體的包裝以293FT細胞系(是經人工改造過的人胚腎細胞系，購自invitrogen公司cat no :R700-07)為包裝細胞，利用invitrogen慢病毒三質粒包裝系統(pLPl、pLP2、pLP/VSVG 均購自invitrogen公司)，包裝慢病毒。步驟1)準備質粒。第三代慢病毒包裝系統，包含慢病毒載體、包裝質粒pLPl和pLP2、 包膜質粒pLP/VSVG四個質粒，要求質粒DNA的0擬60Λ80的比值為1. 80左右，濃度在 0.l_3ug/ul02)培養細胞，注意不要讓其生長過度，長至90 %匯合即傳代，傳代超過20 代則不應使用。3)製備DNA-Lipofectamin2000複合物。在一個無菌的5ml管中，加入1. 5ml無血 ^raOpti-MEM 1 (invitrogen cat no :31985-062),依次加入4. 2ug pLPl、2ug pLP2、2. 8ug pLP/VSVG和5ug慢病毒表達質粒，輕輕混勻。在另一個無菌的 5ml 管中，將 42ulLipofectamine (invitrogen，cat no :11668-027)稀釋於1. 5ml無血清Opti-MEM I無血清培養基中，輕輕混勻，室溫放置5min，混合以上兩管液體，輕輕混勻，室溫孵育20min，形成DNA-Lipofectamin2000複合物。4)在DNA-Iipid複合物形成過程中，胰蛋白酶消化細胞，計數，將細胞重懸於含血清的生長培養基中，使其密度達到1. MlO6個/ml。注意培養基中不能含抗生素。5)將DNA-Lipofectamin2000複合物加入到含有5ml生長培養基的IOcm細胞培養皿中。培養基中不含抗生素。6)將5ml 293FT細胞細胞懸液加入到含有DNA-Lipofectamin2000複合物和生長培養基的IOcm細胞培養皿中，輕輕前後搖晃移動培養皿混勻。將細胞置於37°C、5% CO2細胞培養箱中培養過夜。7)次日，用IOml包含丙酮酸鈉的的完全培養基(高糖DMEM，10 %胎牛血清，0. ImM非必需胺基酸，2mM-L-穀氨醯胺，青-鏈黴素，ImM丙酮酸鈉)更換含有 DNA-Lipofectamin2000複合物的培養基。8)轉染48_72h後收集上清於15ml無菌離心管中。9)4°C，3000rpm離心15min去除細胞碎片，或用0. 45um濾膜過濾。如果需要濃縮，則需要50000g超速離心池收集病毒沉澱。293FT細胞包裝慢病毒，在慢病毒載體構建成功後，利用invitrigen慢病毒三質粒包裝系統在細胞中進行慢病毒的包裝。包裝細胞24h後，通過電鏡觀察，既可以看到細胞內有GFP表達，陽性細胞比列超過95% (圖幻，包裝效率很高。包裝7 後，培養上清為淡黃色，收集毒液， 用0. 45um濾膜過濾除去細胞碎片，置於-70°C備用。3.慢病毒感染EA.hy^6細胞(購自中科院上海生命科學研究所細胞資源中心，中科院典型培養物保藏委員會細胞庫)去除EA. hy926細胞培養基，加入慢病毒毒液及中濃度 8ug/ml 的 polybrene(sigama cat no :h9268)，置於 37°C>5% CO2 細胞培養箱中培養過夜。次日，去除毒液，添加完全培養基，待細胞生長至80% -90%匯合時，按1 3傳代。圖6為電鏡觀察的Ea. hy926細胞感染結果，可見利用上述慢病毒感染內皮細胞株 EA. hy926,感染效率達90%。獲得GM-CSF、IL4共表達株，以及TNF- α表達株。實施例2製備飼養層細胞1)上述慢病毒感染Ea. hy926細胞，獲得IL4、GM-CSF-Ea. hy926飼養層細胞和 TNF- α -Ea. hy926飼養層細胞；感染步驟同實施例1中慢病毒感染EA. hy926細胞；2)利用螢光細胞分選技術，根據GFP螢光強弱分選出GFP強表達株和弱表達株；3) IL4、GM-CSF-Ea. hy926 和 TNF- α -Ea. hy926 細胞以劑量 40Gy 的 γ 射線照射抑制其增殖，照射後的細胞更換培養基，於細胞培養箱孵育2-3h，PBS液衝洗，製備成飼養層細胞。實施例3PBMC和飼養層細胞共培養1)正常人外周血PBMC的製備(按照淋巴細胞分離液試劑盒說明書進行操作，人淋巴細胞分離液ftOduct Number =LTS 1077，購自中國醫學科學院生物工程研究所灝洋生物公司)；幻免疫磁珠法分選外周血⑶14+單核細胞(使用德國美天旎公司Monocyte Isolation Kit II Order no. 130-091-153，按說明書進行分離)；3)待GM-CSF、IL4_Ea. hy926飼養層細胞貼壁後，接種PBMC細胞，48h收集懸浮的細胞接種於TNF- α -Ea. hy926飼養層細胞，24h後收集懸浮細胞即為成熟的DC。圖7為DC體外培養倒置顯微鏡觀察形態學，通過圖7可見誘導成熟後，顯微鏡下 DC的表形，加入TNF- α後，細胞大部分懸浮，胞漿透明，胞體大，細胞膜伸出的樹突更加明顯，細胞分布於培養板中，數量明顯增加，呈典型的DC形態。圖8是DC的表型變化的流式細胞分析圖，DC細胞與螢光標記的單克隆抗體孵育後，流式分析其表面標誌的表達，其中虛線代表同型對照組，細實線代表為刺激成熟的樹突狀細胞，粗實線表示刺激成熟的樹突狀細胞。刺激成熟後，DC表面CD32的表達減少，而 ⑶80、⑶86、⑶40這些在適應性免疫中起到共刺激作用的分子表達增加。HLA-DR表達稍有增加，⑶14的表達變化不大。
權利要求
1.一種將CD 14+單核細胞分化培養為成熟的樹突狀細胞的方法，所述方法包括以下步驟(1)以能分泌促進細胞成熟的細胞因子的人臍靜脈內皮細胞作為飼養層細胞，培養至貼壁；(2)接種CD14+細胞，與(1)所述飼養層細胞進行共培養36-60小時；(3)收集步驟( 獲得的懸浮細胞；(4)將步驟C3)獲得的細胞與能分泌促進細胞分化的細胞因子並已經貼壁生長的飼養層細胞人臍靜脈內皮細胞共培養12-36小時；(5)收集步驟(4)獲得的懸浮細胞，即為成熟的樹突狀細胞。
2.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述人臍靜脈內皮細胞為Ea.hy926細胞。
3.根據權利要求2所述的方法，其特徵在於，所述步驟( 中所述的能分泌促進細胞成熟的細胞因子為GM-CSF和/或IL-4。
4.根據權利要求3所述的方法，其特徵在於，所述GM-CSF和IL-4為融合表達蛋白。
5.根據權利要求4所述的方法，其特徵在於，所述步驟(2)中所述的培養時間為48小時。
6.根據權利要求2所述的方法，其特徵在於，所述步驟(4)中所述的能分泌促進細胞分化的細胞因子為TNF-α。
7.根據權利要求6所述的方法，其特徵在於，所述步驟(4)中所述的培養時間為24小時。
8.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述CD14+單核細胞分離於人外周血。
9.根據權利要求4或6所述的方法，其特徵在於，所述細胞因子的表達載體為慢病毒載體pBPLV。
10.根據權利要求4或6所述的方法，其特徵在於，所述Ea.hy926細胞在共培養之前需要經過劑量為40Gy的γ射線照射。
全文摘要
本發明提供了一種將CD 14+單核細胞分化培養為成熟的樹突狀細胞的方法，所述方法將CD 14+細胞分別與能分泌促進細胞成熟和分化的細胞因子的人臍靜脈內皮細胞共培養，使CD 14+細胞成為成熟的樹突狀細胞，與傳統方法相比，本發明具有經濟、快速、可以大量培養的特點及優勢。
文檔編號C12N5/0786GK102443568SQ20101050831
公開日2012年5月9日 申請日期2010年10月15日 優先權日2010年10月15日
發明者喬志新, 於群, 馮秋月, 張公慶, 李偉靜, 楊曉琮, 王婧, 王璇琳, 石曉月, 程宏, 賀敏 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院野戰輸血研究所