一種提高犬免疫力降低腹瀉發病率的複合益生菌劑及其製備和應用的製作方法
2023-05-04 04:47:26 2
本發明屬於複合益生菌劑領域，具體涉及一種提高犬免疫力降低腹瀉發病率的複合益生菌劑及其製備和應用。
背景技術：
犬的腹瀉病是犬臨床疾病中常見的一種，其發病原因較多且複雜，診斷、治療難，該病可致使幼犬營養不良、生長發育緩慢、存活率低，成年犬和老年犬消化不良、精神不振、體質羸弱。目前，預防和治療犬腹瀉病主要依靠抗生素和化學藥物，此類方法在臨床上耗資低、見效快，但長期使用必然給公共安全帶來嚴重的威脅，包括耐藥菌株種類和數量的日益增多，甚至發生細菌變異或耐藥基因水平轉移，破壞機體腸道微生態系統，致使機體對新的病原體更加敏感，從而使得腹瀉病的治療難度進一步加大、治療效果不斷降低。因此，找到有效預防和治療犬腹瀉病的方法迫在眉睫。大量研究表明乳酸菌對動物腸道微生態系統具有極其重要的作用，它們通過定植在腸道中成為腸道生理屏障的重要組成部分，維持腸道微生態系統的菌群平衡。並且，這些乳酸菌能夠刺激巨噬細胞、誘導產生幹擾素、促進細胞分裂、產生抗體，調節機體細胞免疫、體液免疫和腸黏膜局部免疫等，最終提高機體免疫能力。可見，益生乳酸菌製備的微生物製劑是目前世界公認的理想替代品。因此，可以研究開發一種複合益生菌劑，在提高犬免疫力、降低腹瀉發病率的前提下也能夠實現無毒無副作用、無藥物殘留、降低環境汙染的目標，對犬訓練和繁育具有重要的意義。
乳酸桿菌是人和動物腸道內最常見的正常定居者,也是犬源益生菌研究最廣泛的一種微生物。乳酸桿菌作為犬的正常菌群,在其生長過程中產生乳酸,使腸道ph值降低,能阻止致病菌在腸道的生長和繁殖,同時乳酸桿菌還可產生天然的抗菌物質,對腸道致病菌有明顯的抑制和殺滅作用。乳酸桿菌不僅對致病菌有拮抗作用,而且能粘附於腸道上皮細胞上,起到佔位性保護作用。同時乳酸桿菌還可產生非特異性免疫調節因子,刺激腸道局部免疫反應,提高犬的非特異性免疫功能,增強巨噬細胞的活力,提高自然殺傷細胞的活力。
乳酸桿菌作為犬用益生菌製劑菌種的研究最多。自2001年起,犬源乳酸桿菌的分離、篩選和動物試驗在國外被陸續報導。從犬腸道和糞便中分離出乳酸菌株,經過篩選、發酵、乾燥後,混入犬糧中飼餵幼犬,觀察動物的生長狀況和對疾病的預防作用。結果顯示犬源乳酸桿菌對犬的有益作用,無任何不良反應,能夠作為犬用益生菌製劑菌種。據文獻報導,給犬飼餵乳酸桿菌後,大腸桿菌的數量顯著下降,而有益菌的數量有所上升,犬對食物的消化率也大大提高。文獻有報導,給患有胃腸疾病的犬口服分離的乳酸桿菌adi,能降低血液中高濃度的膽固醇和丙氨酸轉氨酶。另據文獻報導,給健康犬飼餵嗜酸乳桿菌dsm13241,能改善犬的腸道菌群組成,加強消化道健康,提高免疫功能。
目前申請公開的專利中，有針對不同類型犬類提高其免疫力或提高其消化吸收率。
申請號為201110253876.3的專利申請公開了「可改善小型犬腸道微生態的複合益生菌微膠囊」，其製作方法包括以下步驟：a1，將嗜酸乳桿菌、植物乳桿菌和鼠李糖乳桿菌製備複合菌劑；a2，製備複合益生菌液；a3，將2-5％的多孔澱粉與複合益生菌液混合，ph值調至6.0，控溫25-35℃振蕩30min。待充分吸附後，按照重量百分比依次加入以下外層包埋材料：1-3％海藻酸鈉、1-5％明膠、1-5％糊精，攪拌均勻，滴入氯化鈣溶液固化，冷凍乾燥，製得複合益生菌微膠囊。本發明以多孔澱粉為芯材，吸附複合益生菌液，再以海藻酸鈉、糊精和明膠為壁材，加工製得複合益生菌微膠囊。
申請號為201610162021.2的專利申請公開了「一種促進貴賓犬消化吸收的益生菌添加劑及其製備方法」，其特徵在於該添加劑由嗜酸乳桿菌粉、丁酸梭菌粉、凝結芽孢桿菌粉、水蘇糖、靈芝多糖、雞肝酶解發酵物構成，通過給貴賓犬添加一定比例的益生菌、益生元、雞肝酶解發酵物，能夠幫助貴賓犬提高消化吸收能力。該發明由益生菌、益生素、雞肝酶三者搭配協調作用，益生菌調理腸道，益生素幫助益生菌定植，發酵酶解雞肝的主成分之一的功能性小肽可以提高機體免疫能力。
申請號為201510728812.2的專利申請公開了「一種老年犬用保健劑」，其特徵在於該老年犬用保健劑由以下質量份數的組分組成：雞蛋微膠囊粉5-10份，絲蘭提取物0.3-1份，小麥水解蛋白5-15份，黃芪多糖0.5-1.5份，益生菌1-2份，膨化燕麥粉15-25份，膨化玉米粉10-20份，維生素c0.5-1.5份，脫脂奶粉30-40份，雞肝粉2-5份，葡萄糖3-5份，低聚木糖2-4份，丁酸鈉3-5份；本發明的保健產品可改善老年犬腸道消化機能、提高營養物質利用，預防和治療腸道疾病，提高機體免疫力，減少口臭及排洩物臭味，效果顯著，安全、無毒副作用。
但綜上專利，並未提供可以廣泛應用於對不同類型，不同生長階段的犬類的複合益生菌劑，在有效提高其免疫力的同時，有效降低其腹瀉發病率。
技術實現要素：
本發明目的是提供一種由植物乳桿菌kt-lp9、乾酪乳桿菌zhang、植物乳桿菌p-8、動物雙歧桿菌乳亞種v9復配而成的複合益生菌劑，四鍾菌劑均具有良好的耐酸性、人工胃液、人工消化液耐受性、膽鹽耐受性、在腸道有凝集作用(自凝集和它凝集)及抑制常見腸道致病菌生長特性，能夠在人和動物腸道中定植並繁殖，可改善機體內的微生態環境，其中植物乳桿菌kt-lp9還可預防和治療高脂血症。複合益生菌劑針對犬類，能夠有效提高採食量和生長率，控制血液中白細胞數、淋巴細胞數和中性粒細胞數，不僅有效提升犬類機體內四鍾免疫因子：血液中免疫球蛋白g、白細胞介素6、幹擾素α和腫瘤壞死因子α的含量，而且有效提高了犬類糞便中分泌型免疫球蛋白a(siga)的含量，從而最終提高試驗犬免疫力，降低腹瀉發病率和發病程度。
本發明的目的是通過以下技術方案實現的：
一種提高犬免疫力降低腹瀉發病率的複合益生菌劑，是由植物乳桿菌kt-lp9菌劑、乾酪乳桿菌zhang菌劑、植物乳桿菌p-8菌劑、動物雙歧桿菌乳亞種v9菌劑以及稀釋載體混合復配，其中，植物乳桿菌kt-lp9菌劑活菌數量≥2×1011cfu/g，乾酪乳桿菌zhang菌劑活菌數量≥2×1011cfu/g，植物乳桿菌p-8菌劑活菌數量≥2×1011cfu/g，動物雙歧桿菌乳亞種v9菌劑活菌數量≥2×1011cfu/g
進一步地，所述植物乳桿菌kt-lp9菌劑、乾酪乳桿菌zhang菌劑、植物乳桿菌p-8菌劑、動物雙歧桿菌乳亞種v9菌劑的質量比分別為1-4：1-4：1-4：2-7。
優先選地，所述植物乳桿菌kt-lp9菌劑、乾酪乳桿菌zhang菌劑、植物乳桿菌p-8菌劑、動物雙歧桿菌乳亞種v9菌劑的質量比分別為1：1：1：2。
本發明的另一目的在於提供上述提高犬免疫力降低腹瀉發病率的複合益生菌劑的製備方法，包括如下步驟：
(1)所述植物乳桿菌kt-lp9菌劑、乾酪乳桿菌zhang菌劑、植物乳桿菌p-8菌劑、動物雙歧桿菌乳亞種v9菌劑的製備：
分別將4株發酵菌種單獨進行高密度發酵：分別取一環活化後的植物乳桿菌kt-lp9、乾酪乳桿菌zhang、植物乳桿菌p-8、動物雙歧桿菌乳亞種v9的斜面菌體，各自分別接種至mrs培養基中，在相同溫度33～37℃，相同轉速50～100rpm條件下培養18～24h，分別得到一級種子液；將培養好的一級種子液按接種量3％～10％(v/v)再次轉接入mrs培養基進行二次活化，活化時間18～24h後得二級種子液；將二級種子液分別按照相同接種量3％～10％(v/v)分別各自接入到不同的發酵罐培養基中，溫度均為33～37℃，轉速均為50～100rpm，通風量均為0.3～1l/min，發酵全程調節發酵液相同ph值為5.6～6.2條件下培養8～12小時，分別得到植物乳桿菌kt-lp9最終發酵液、乾酪乳桿菌zhang最終發酵液、植物乳桿菌p-8最終發酵液、動物雙歧桿菌乳亞種v9最終發酵液，將得到的上述最終發酵液分別經5000～12000rpm，5～15min離心收集菌體；
所述發酵罐培養基(g/l)：蔗糖50～80，酵母粉20～40，大豆蛋白腖8～20，mgso4.7h2o1.5～2.0，mnso4.5h2o0.08～0.12，吐溫-800.8～1.0，餘量為水，ph7.0。
向經離心後的植物乳桿菌kt-lp9、乾酪乳桿菌zhang、植物乳桿菌p-8、動物雙歧桿菌乳亞種v9菌的菌體中分別按照各自菌體與保護劑溶液質量比1：(5～10)的比例添加保護劑溶液，混勻獲得菌懸液，將所述菌懸液經冷凍乾燥，分別得到植物乳桿菌kt-lp9菌劑、乾酪乳桿菌zhang菌劑、植物乳桿菌p-8菌劑、動物雙歧桿菌乳亞種v9菌劑；
(2)復配混合：
將所述植物乳桿菌kt-lp9菌劑、乾酪乳桿菌zhang菌劑、植物乳桿菌p-8菌劑、動物雙歧桿菌乳亞種v9菌劑按比例進行混合，並加入稀釋載體進行復配，製備活菌總數分別為2×109cfu/g、4×109cfu/g和1×1010cfu/g三種規格的複合益生菌劑；
經粉末包裝機充氮氣填充將所述複合益生菌劑進行分裝，2g/袋。
進一步地，所述植物乳桿菌kt-lp9最終發酵液、乾酪乳桿菌zhang最終發酵液、植物乳桿菌p-8最終發酵液以及動物雙歧桿菌乳亞種v9最終發酵液的各自活菌數均達到1010cfu/ml以上。
進一步地，所述保護劑溶液的配方如下(g/l)：脫脂乳粉30～35，脫鹽乳清粉15～20，工業海藻糖15～20，維生素c3～4，卵磷脂0.05～0.08，餘量為蒸餾水。
進一步地，所述稀釋載體為脫脂乳粉。
進一步地，所述一種提高犬免疫力降低腹瀉發病率的複合益生菌劑的用途，在每隻犬的基礎日糧中添加所述提高犬免疫力降低腹瀉發病率的複合益生菌劑，選擇活菌總數為2×109cfu/g或4×109cfu/g或1×1010cfu/g複合益生菌劑的三種規格中的任意一種，添加量為2g/天，所述提高犬免疫力降低腹瀉發病率的複合益生菌劑添加溫度低於40℃。
優選地，一種提高犬免疫力降低腹瀉發病率的複合益生菌劑的用途，在每隻幼犬、訓練犬、老年犬的基礎日糧中分別對應添加活菌含量為2×109cfu/g、4×109cfu/g和1×1010cfu/g的所述提高犬免疫力降低腹瀉發病率的複合益生菌劑。
進一步地，所述的一種提高犬免疫力降低腹瀉發病率的複合益生菌劑的用途，在所述幼犬、訓練犬、老年犬中，所述提高犬免疫力降低腹瀉發病率的複合益生菌劑的添加量為2g/天，添加溫度低於40℃。
所述植物乳桿菌kt-lp9，已於2016年9月8日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱cgmcc)，保藏號為cgmccno.12950，保藏地址為：中國北京市朝陽區北辰西路1號院3號,中國科學院微生物研究所，郵編：100101，分類命名為植物乳桿菌(lactobacillusplantarum)，該菌株分離自傳統自然發酵酸牛奶乳中。具備優良的益生特性，研究表明該菌株具有良好的耐酸性、人工胃液、人工消化液耐受性、膽鹽耐受性、在腸道有凝集作用(自凝集和它凝集)及抑制常見腸道致病菌生長特性，能夠在人和動物腸道中定植並繁殖，可改善機體內的微生態環境、預防和治療高脂血症。。
所述乾酪乳桿菌zhang，已於2011年11月18日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱cgmcc)，保藏號為cgmccno.5469，保藏地址為：中國北京市朝陽區北辰西路1號院3號,中國科學院微生物研究所，郵編：100101，分類命名為乾酪乳桿菌(lactobacilluscasei)。該菌株是2001年分離自內蒙古錫林郭勒盟正藍旗草原上自然發酵酸馬奶(komiss)中的一株具有優良益生特性的乾酪乳桿菌。研究人員採用體外實驗、動物模型和人體試驗對菌株的益生功能進行了系統評價，並利用基因組學、蛋白質組學和轉錄組學的手段對菌株的益生機制進行了深入剖析。目前已經證實菌株具有優異的抗胃腸道消化液耐受能力，能夠在人和動物腸道中定植並繁殖，改善腸道菌群，從而預防腸道致病菌感染，提高機體細胞免疫、體液免疫和腸黏膜局部免疫，調節血脂代謝、保護修復肝臟，增強機體抗氧化能力，抑制腫瘤細胞的生長，預防糖尿病。
所述植物乳桿菌p-8，已於2012年06月28日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱cgmcc)，保藏號為cgmccno.6312，保藏地址為：中國北京市朝陽區北辰西路1號院3號,中國科學院微生物研究所，郵編：100101，分類命名為植物乳桿菌(lactobacillusplantarum)。該菌株是2003年從內蒙古自治區牧民家庭中的自然發酵酸牛奶中分離並篩選出的一株具有優良益生特性的乳酸菌株。研究採用體外實驗、動物模型和人體試驗對菌株的益生功能進行了系統評價，並利用基因組學的手段對菌株的益生機制進行了深入剖析。目前已經證實菌株具有優異的抗胃腸道消化液耐受能力，能夠在人和動物腸道中定植並繁殖，改善腸道菌群，調節血脂代謝，對肝臟具有保護修復作用，提高機體免疫能力。
所述動物雙歧桿菌乳亞種v9，已於2011年11月18日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱cgmcc)，保藏號為cgmccno.5470，保藏地址為：中國北京市朝陽區北辰西路1號院3號,中國科學院微生物研究所，郵編：100101，分類命名為雙歧桿菌乳亞種(bifidobacteriumlactis。bifidobacteriumlactis)。該菌株是2005年分離自內蒙古草原上健康蒙古族兒童腸道中的一株具有優良益生特性的動物雙歧桿菌乳亞種。研究人員採用體外實驗、動物模型和臨床試驗對菌株的益生功能進行了系統評價，並利用基因組學的手段對菌株的益生機制進行了深入剖析。目前已經證實對菌株具有優異的抗胃腸道消化液耐受能力，能夠在人和動物腸道中定植並繁殖，改善腸道菌群，拮抗腸道致病菌，提高腸道抗致病菌感染能力，預防和緩減腹瀉、便秘、腹痛、腹脹等腸易激綜合症。
有益效果：
本發明提供的一種複合益生菌劑針對犬類，能夠有效提高採食量和生長率，控制血液中白細胞數、淋巴細胞數和中性粒細胞數，不僅有效提升犬類機體內四鍾免疫因子：血液中免疫球蛋白g、白細胞介素6、幹擾素α和腫瘤壞死因子α的含量，而且有效提高了犬類糞便中分泌型免疫球蛋白a(siga)的含量，從而最終提高試驗犬免疫力，降低腹瀉發病率和發病程度。
經實驗驗證，實驗組(在原飼料配方的基礎上添加一定比例的複合益生菌劑)體溫、脈搏、呼吸次數等基礎指標均能與對照組保持一致，表明試驗期間實驗組表觀上無副作用；血液中白細胞、淋巴細胞、中性粒細胞含量均呈現低於對照組的趨勢，停用一段時間後仍能保持該水平，表明實驗組機體炎性感染的程度有所降低；實驗組中血液中免疫球蛋白g和幹擾素α含量均顯著高於對照組，白細胞介素6含量也高於對照組，停用一段時間後上述免疫因子含量仍能保持前述水平，表明實驗組機的體液免疫和細胞免疫水平均得到明顯提升；糞便中分泌型免疫球蛋白a含量顯著高於對照組，該水平在停用一段時間後同樣能得到保持，表明腸黏膜局部免疫水平得到明顯提升。腹瀉發病率及患病程度也均呈現實驗組低於對照組。
由植物乳桿菌kt-lp9、乾酪乳桿菌zhang、植物乳桿菌p-8、動物雙歧桿菌乳亞種v9復配而成的複合益生菌劑，四鍾菌劑均具有良好的耐酸性、人工胃液、人工消化液耐受性、膽鹽耐受性、在腸道有凝集作用(自凝集和它凝集)及抑制常見腸道致病菌生長特性，能夠在人和動物腸道中定植並繁殖，可改善機體內的微生態環境，其中植物乳桿菌kt-lp9具有較好的耐酸以及耐膽鹽特性，其在ph2.5的人工模擬胃液中消化3h後繼續在ph8.0的人工腸液中消化8h，其存活率高達81.57％。同時菌株kt-lp9具有廣譜抑制致病菌的優良特性，且抑菌效果十分顯著，可預防和治療高脂血症，由於植物乳桿菌kt-lp9的加入，使得複合益生菌劑在高犬免疫力、降低腹瀉發病率方面更具有顯著性。
需要說明的是本發明的一種提高犬免疫力降低腹瀉發病率的複合益生菌劑及其製備和應用的技術效果是各組分相互協同、相互作用的結果，並非簡單的原料功能的疊加，各原料組分的科學復配和提取，產生的效果遠遠超過各單一組份功能和效果的疊加，具有較好的先進性和實用性。
附圖說明
圖1：脈搏測定結果；
圖2：呼吸次數測定結果；
圖3：體溫測定結果；
圖4：採食量測定結果；
圖5：體重測定結果；
圖6：血常規測定結果(白細胞數、淋巴細胞數、中性粒細胞數)，其中圖6-1：白細胞數量、6-2淋巴細胞數量、6-3中性粒細胞數量；
圖7：血液中免疫球蛋白g檢測結果(*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001)，其中7d為免疫球蛋白g標品濃度；
圖8：血液中幹擾素α檢測結果(*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001)，其中8d為血液中幹擾素α標品濃度；
圖9：血液中白細胞介素6檢測結果(*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001)，其中9d為血液中白細胞介素6的標品濃度；
圖10：血液中腫瘤壞死因子α檢測結果(*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001)，其中10d為血液中腫瘤壞死因子α的標品濃度；
圖11：糞便中分泌型免疫球蛋白a檢測結果(*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001)，其中11d為免疫球蛋白a的標品濃度；
圖12：腹瀉病發病率；
圖13：腹瀉病患病程度指數；
其中圖1至圖13中的a、b、c分別代表幼犬、訓練犬、老年犬的數據檢測結果。
具體實施方式
下面通過具體的實施方案敘述本發明。除非特別說明，本發明中所用的技術手段均為本領域技術人員所公知的方法。另外，實施方案應理解為說明性的，而非限制本發明的範圍，本發明的實質和範圍僅由權利要求書所限定。對於本領域技術人員而言，在不背離本發明實質和範圍的前提下，對這些實施方案中的物料成分和用量進行的各種改變或改動也屬於本發明的保護範圍。
實施例1四種益生菌的製備
植物乳桿菌kt-lp9菌劑、乾酪乳桿菌zhang菌劑、植物乳桿菌p-8菌劑、動物雙歧桿菌乳亞種v9菌劑的製備：
分別將4株發酵菌種單獨進行高密度發酵：分別取一環活化後的植物乳桿菌kt-lp9、乾酪乳桿菌zhang、植物乳桿菌p-8、動物雙歧桿菌乳亞種v9的斜面菌體，各自分別接種至mrs培養基中，在相同溫度33～37℃，相同轉速50～100rpm條件下培養18～24h，分別得到一級種子液；將培養好的一級種子液按接種量3％～10％(v/v)再次轉接入mrs培養基進行二次活化，活化時間18～24h後得二級種子液；將二級種子液分別按照相同接種量3％～10％(v/v)分別各自接入到不同的發酵罐培養基中，溫度均為33～37℃，轉速均為50～100rpm，通風量均為0.3～1l/min，發酵全程調節發酵液相同ph值為5.6～6.2條件下培養8～12小時，分別得到植物乳桿菌kt-lp9最終發酵液、乾酪乳桿菌zhang最終發酵液、植物乳桿菌p-8最終發酵液、動物雙歧桿菌乳亞種v9最終發酵液，將得到的上述最終發酵液分別經5000～12000rpm，5～15min離心收集菌體；
發酵罐培養基(g/l)：蔗糖50～80，酵母粉20～40，大豆蛋白腖8～20，mgso4.7h2o1.5～2.0，mnso4.5h2o0.08～0.12，吐溫-800.8～1.0，餘量為水，ph7.0。
向經離心後的植物乳桿菌kt-lp9、乾酪乳桿菌zhang、植物乳桿菌p-8、動物雙歧桿菌乳亞種v9菌的菌體中分別按照各自菌體與保護劑溶液質量比1：(5～10)的比例添加保護劑溶液，混勻獲得菌懸液，將菌懸液經冷凍乾燥，分別得到植物乳桿菌kt-lp9菌劑、乾酪乳桿菌zhang菌劑、植物乳桿菌p-8菌劑、動物雙歧桿菌乳亞種v9菌劑。
保護劑溶液的配方如下(g/l)：脫脂乳粉30～35，脫鹽乳清粉15～20，工業海藻糖15～20，維生素c3～4，卵磷脂0.05～0.08，餘量為蒸餾水。
植物乳桿菌kt-lp9最終發酵液、乾酪乳桿菌zhang最終發酵液、植物乳桿菌p-8最終發酵液以及動物雙歧桿菌乳亞種v9最終發酵液的各自活菌數均達到1010cfu/ml以上。
植物乳桿菌kt-lp9菌劑活菌數量≥2×1011cfu/g，乾酪乳桿菌zhang菌劑活菌數量≥2×1011cfu/g，植物乳桿菌p-8菌劑活菌數量≥2×1011cfu/g，動物雙歧桿菌乳亞種v9菌劑活菌數量≥2×1011cfu/g
實施例2一種提高犬免疫力降低腹瀉發病率的複合益生菌劑的製備
復配混合：將由實施例1製備的植物乳桿菌kt-lp9菌劑、乾酪乳桿菌zhang菌劑、植物乳桿菌p-8菌劑、動物雙歧桿菌乳亞種v9菌劑按質量比1：1：1：2進行混合，並加入稀釋載體脫脂乳粉進行復配，製備活菌總數分別為2×109cfu/g、4×109cfu/g和1×1010cfu/g三種規格的複合益生菌劑；
經粉末包裝機充氮氣填充將複合益生菌劑進行分裝，2g/袋。
實施例3一種提高犬免疫力降低腹瀉發病率的複合益生菌劑的製備
復配混合：將由實施例1製備的植物乳桿菌kt-lp9菌劑、乾酪乳桿菌zhang菌劑、植物乳桿菌p-8菌劑、動物雙歧桿菌乳亞種v9菌劑按質量比4：4：4：7進行混合，並加入稀釋載體脫脂乳粉進行復配，製備活菌總數分別為2×109cfu/g、4×109cfu/g和1×1010cfu/g三種規格的複合益生菌劑；
經粉末包裝機充氮氣填充將複合益生菌劑進行分裝，2g/袋。
實施例4一種提高犬免疫力降低腹瀉發病率的複合益生菌劑的製備
復配混合：將由實施例1製備的植物乳桿菌kt-lp9菌劑、乾酪乳桿菌zhang菌劑、植物乳桿菌p-8菌劑、動物雙歧桿菌乳亞種v9菌劑按質量比2.5：2.5：2.5：4進行混合，並加入稀釋載體脫脂乳粉進行復配，製備活菌總數分別為2×109cfu/g、4×109cfu/g和1×1010cfu/g三種規格的複合益生菌劑；
經粉末包裝機充氮氣填充將複合益生菌劑進行分裝，2g/袋。
實施例5一種提高犬免疫力降低腹瀉發病率的複合益生菌劑的應用
利用實施例2製備的複合益生菌劑，在犬繁殖基地中，在每隻犬的基礎日糧中添加所述提高犬免疫力降低腹瀉發病率的複合益生菌劑，選擇活菌總數為2×109cfu/g複合益生菌劑，按照添加量為2g/只/天的劑量添加到犬的日糧中，每日中午餵食。拌料前從冰櫃中取出複合益生菌劑，按照上述劑量直接添加到犬飼料中，充分攪拌後進行飼喂。複合益生菌劑加入時犬飼料溫度低於40℃。
實施例6一種提高犬免疫力降低腹瀉發病率的複合益生菌劑的應用
由犬訓練和繁育基地選取不同年齡段犬96隻，其中幼犬實驗組和對照組各13隻，訓練犬兩組各15隻，老年犬兩組各20隻，所有試驗犬均分組編號單籠飼養。對照組仍按照原飼料配方飼喂，實驗組在原飼料配方中添加由實施例2製備的複合益生菌劑，其添加量為2g/只/天，其中幼犬選擇活菌含量為2×109cfu/g規格的複合益生菌劑，訓練犬為4×109cfu/g，老年犬為1×1010cfu/g，具體添加方法為每日早晨餵食時進行添加，拌料前從冰櫃中取出複合益生菌劑，按照上述劑量直接添加到犬飼料中，充分攪拌後進行飼喂。複合益生菌劑加入時犬飼料溫度低於40℃。
實施例7一種提高犬免疫力降低腹瀉發病率的複合益生菌劑的應用效果實驗例
1實驗方法：
(1)試驗犬腹瀉病患病狀況統計：使用前、試用期間和停用後一段時間對所有試驗犬腹瀉病患病情況進行統計記錄。
(2)試驗犬採食量變化統計：試驗犬的實際餵量，即飼餵前飼料的重量減去攝食後剩料的重量。每次統計為試驗犬全天2次採食的總量。
(3)試驗犬體重變化統計：檢測時，由訓練員和飼養員配合將犬固定在體重稱中央，記錄犬體重。
(4)試驗犬體溫檢測：在犬安靜的狀態下使用電子檢溫器檢測犬的體溫，檢測部位為犬的耳蝸或後肢根部，檢測員將電子檢溫器固定在檢測部位約10秒，按下檢測按鈕進行檢測並記錄。
(5)試驗犬脈搏檢測：在犬安靜的狀態下進行檢測，檢測時，將犬適當的固定後，檢測員位於犬的後側方，一手握住後肢，一手伸入股內側，用手指輕壓股動脈檢測，記錄犬脈搏。
(6)試驗犬呼吸次數檢測：在犬安靜的狀態下進行檢測，檢測時，檢測員站在犬胸部的前側方觀察犬胸部的起伏動作，一起一伏為一次呼吸，記錄犬呼吸次數。
(7)試驗犬血常規及血液中免疫因子檢測：利用全自動流式血細胞計數儀進行血常規檢測。離心，轉速3000rpm，10min，獲取血清，並採用雙抗體一步夾心法酶聯免疫吸附試驗(elisa)對血清樣品中的免疫球蛋白g、白細胞介素6、幹擾素α和腫瘤壞死因子α，共4種免疫因子的含量進行檢測。
(8)試驗犬糞便樣品採集及研究：採用雙抗體一步夾心法酶聯免疫吸附試驗(elisa)對糞便樣品中的分泌型免疫球蛋白a(siga)含量進行檢測。
2試驗樣品採集：
試驗前對參加試驗的96隻犬進行採樣，並統計上述指標。採樣後實驗組在原飼料配方的基礎上按照上述方法添加本發明複合益生菌劑進行飼喂，對照組仍採用基地一直使用的飼料配方進行飼喂，持續食用30天後進行第二次採樣，持續食用60天後進行第三次採樣，停止添加使用複合益生菌劑，停用後10天後對訓練犬實驗組和對照組進行採樣，停用後15天對幼犬和老年犬實驗組和對照組進行採樣。血液樣品採集前試驗犬禁食一夜，採血前，採樣員佩戴醫用手套和口罩將犬採血部位的毛剪掉，清除入針處皮上汙物。用酒精進行消毒，並用潔淨紙巾擦拭乾淨。採用抗凝採血管採集血液2-3毫升，迅速拔下抗凝採血管，保留採血針，插入普通採血管繼續採集血液約2毫升，拔下普通採血管靜置。將抗凝採血管交予另一個實驗員上下顛倒血樣管8-10次，使血液與抗凝劑充分混合，注意不能振動或用手指彈抗凝管。使用止血帶進行止血並對2份血液樣品進行編號。採血後立刻對抗凝採血管中的血樣進行血常規檢測，普通採血管血樣進行離心獲取血清，並進行上述免疫因子含量檢測。糞便樣品採樣前，採樣人員佩戴醫用手套和口罩，在試驗犬排便後立刻用一次性塑料小勺進行採集，採集時均勻採集糞便表面和內部部分，用力將糞便甩到採樣管底部，共採集糞便樣品20-25ml，加入適量保護劑後充分搖晃混勻，並對樣品進行編號，置於液氮中速凍後暫存於-20℃冷櫃，儘快送回實驗室進行免疫因子檢測。
3試驗結果：
(1)脈搏測定
結果顯示(圖1)在試驗過程中，訓練犬和老年犬脈搏實驗組和對照組並無明顯差異，幼犬實驗組脈搏數向成年犬水平靠近的趨勢較快於對照組。並且，隨著試驗的推進，幼犬和訓練犬脈搏均呈現降低的趨勢，老年犬無明顯變化。
(2)呼吸次數測定
結果顯示(圖2)在試驗過程中，幼犬、訓練犬和老年犬呼吸次數實驗組和對照組均無明顯差異。並且，隨著試驗的推進，幼犬和訓練犬呼吸次數均呈現降低的趨勢，老年犬無明顯變化。
(3)體溫測定
結果顯示(圖3)在試驗過程中，幼犬、訓練犬和老年犬組和對照組均無明顯差異，並且隨著試驗的推進，犬體溫較試驗前也無明顯變化。
(4)採食量測定
結果顯示(圖4)試驗前幼犬、訓練犬、老年犬的實驗組和對照組平均採食量分別為1.51和1.22kg/只/天；1.45和1.78kg/只/天；1.31和1.25kg/只/天。隨著試驗的推進，幼犬、訓練犬和老年犬的平均採食量一直保持實驗組高於對照組的趨勢(試驗30天，訓練犬實驗組低於對照組)。自實驗前至複合微生物菌劑停用後15天的整個過程，實驗組中，幼犬、訓練犬的整體採食量均呈現上升趨勢，而對照組則呈現出先上升後下降的不穩定趨勢。說明複合微生物菌劑不僅顯著提高幼犬、訓練犬的採食量，而且使犬的採食量呈現穩定增長的趨勢。
(5)體重測定
結果顯示(圖5)試驗前幼犬、訓練犬、老年犬的實驗組和對照組平均體重分別為16.8和16.6kg；25.3和26.0kg；36.8和34.9kg。隨著試驗的推進，幼犬和訓練犬的平均體重一直呈現實驗組高於對照組，幼犬更為明顯；老年犬實驗組和對照組平均體重變化較小。
(6)血常規測定
利用全自動流式血細胞計數儀對其血常規進行測定。臨床上認為白細胞數、淋巴細胞數和中性粒細胞數與機體的免疫系統密切相關，能夠反映機體炎性感染的情況。測定結果顯示(圖6)，隨著試驗的推進，幼犬、訓練犬和老年犬實驗組血液中白細胞數、淋巴細胞數和中性粒細胞數均低於對照組的趨勢，說明實驗組犬的炎性感染程度較弱於對照組。
(7)免疫因子的含量測定
採用雙抗體一步夾心法酶聯免疫吸附試驗(elisa)對試驗犬血液樣品中的免疫球蛋白g、白細胞介素6、幹擾素α和腫瘤壞死因子α，糞便樣品中的分泌型免疫球蛋白a共5種免疫因子的含量進行檢測。
血液中免疫球蛋白g含量檢測結果顯示(圖7)，試驗前幼犬、訓練犬、老年犬的實驗組和對照組中免疫球蛋白g的含量分別為10.80mg/ml和10.76mg/ml；12.53mg/ml和12.45mg/ml；11.22mg/ml和11.56mg/ml。試驗30天後，幼犬的實驗組和對照組分別變為12.81mg/ml和11.04mg/ml；訓練犬變為13.95mg/ml和12.45mg/ml；老年犬變為12.58mg/ml和11.71mg/ml。試驗60天後，幼犬的實驗組和對照組分別變為16.56mg/ml和11.10mg/ml，組間差異極顯著(***p<0.001)；訓練犬變為17.3mg/ml6和13.41mg/ml，組間差異極顯著(***p<0.001)；老年犬變為15.36mg/ml和12.65mg/ml，組間差異極顯著(**p<0.01)。停止使用複合益生菌劑後n天后(訓練犬n＝10；幼犬、老年犬n＝15)，幼犬的實驗組和對照組分別變為16.62mg/ml和13.11mg/ml，組間差異極顯著(**p<0.01)；訓練犬變為16.74mg/ml和13.23mg/ml，組間差異極顯著(***p<0.001)；老年犬變為14.62mg/ml和12.42mg/ml，組間差異顯著(*p<0.05)。
幹擾素α含量檢測結果顯示(圖8)，試驗前幼犬、訓練犬、老年犬的實驗組和對照組中幹擾素α的含量分別為132.58mg/ml和133.09pg/ml；207.60mg/ml和210.11pg/ml；164.62mg/ml和163.27pg/ml。試驗30天後，幼犬的實驗組和對照組分別變為156.19mg/ml和141.62pg/ml；訓練犬變為228.23mg/ml和212.46pg/ml；老年犬變為169.85mg/ml和164.41pg/ml。試驗60天後，幼犬的實驗組和對照組分別變為180.57mg/ml和154.59pg/ml；訓練犬變為237.92mg/ml和193.32pg/ml，組間差異極顯著(**p<0.01)；老年犬變為171.66mg/ml和159.91pg/ml。停止使用複合益生菌劑後n天后(訓練犬n＝10；幼犬、老年犬n＝15)，幼犬的實驗組和對照組分別變為195.72mg/ml和170.69pg/ml；訓練犬變為228.20mg/ml和191.42pg/ml，組間差異顯著(*p<0.05)；老年犬變為166.85mg/ml和156.91pg/ml。
白細胞介素6含量檢測結果顯示(圖9)，試驗前幼犬、訓練犬、老年犬的實驗組和對照組中白細胞介素6的含量分別為242.25mg/ml和247.02pg/ml；279.58mg/ml和292.04pg/ml；272.05mg/ml和270.78pg/ml。試驗30天後，幼犬的實驗組和對照組分別變為244.20mg/ml和253.48pg/ml；訓練犬變為279.58mg/ml和292.04pg/ml；老年犬變為259.01mg/ml和265.91pg/ml。試驗60天後，幼犬的實驗組和對照組分別變為269.45mg/ml和259.62pg/ml；訓練犬變為304.29和284.28pg/ml，組間差異顯著(*p<0.05)；老年犬變為274.01mg/ml和262.62pg/ml。停止使用複合益生菌劑後n天后(訓練犬n＝10；幼犬、老年犬n＝15)，幼犬的實驗組和對照組分別變為264.91mg/ml和258.35pg/ml；訓練犬變為292.33mg/ml和280.60pg/ml；老年犬變為269.09mg/ml和263.96pg/ml。
腫瘤壞死因子α含量檢測結果顯示(圖10)，試驗前幼犬、訓練犬、老年犬的實驗組和對照組中腫瘤壞死因子α的含量分別為28.39mg/ml和28.53pg/ml；34.45mg/ml和34.93pg/ml；33.12mg/ml和33.18pg/ml。試驗30天後，幼犬的實驗組和對照組分別變為29.07mg/ml和29.54pg/ml；訓練犬變為35.33mg/ml和34.69pg/ml；老年犬變為32.23mg/ml和32.30pg/ml。試驗60天後，幼犬的實驗組和對照組分別變為33.84mg/ml和30.32pg/ml；訓練犬變為33.29mg/ml和33.87pg/ml；老年犬變為28.94mg/ml和29.42pg/ml。停止使用複合益生菌劑後n天后(訓練犬n＝10；幼犬、老年犬n＝15)，幼犬的實驗組和對照組分別變為32.83mg/ml和30.02pg/ml；訓練犬變為33.68mg/ml和33.23pg/ml；老年犬變為29.04mg/ml和29.00pg/ml。
糞便中分泌型免疫球蛋白a含量檢測結果顯示(圖11)，試驗前幼犬、訓練犬、老年犬的實驗組和對照組中免疫球蛋白g的含量分別為15.56mg/ml和15.00mg/ml；25.19mg/ml和24.58mg/ml；22.23mg/ml和22.16mg/ml。試驗30天後，幼犬的實驗組和對照組分別變為21.27mg/ml和19.78mg/ml，組間差異極顯著(**p<0.01)；訓練犬變為28.74mg/ml和27.52mg/ml，組間差異顯著(*p<0.05)；老年犬變為24.14mg/ml和22.27mg/ml，組間差異極顯著(**p<0.01)。試驗60天後，幼犬的實驗組和對照組分別變為32.82mg/ml和23.93mg/ml，組間差異極顯著(***p<0.001)；訓練犬變為47.65mg/ml和35.08mg/ml，組間差異極顯著(***p<0.001)；老年犬變為24.71mg/ml和21.05mg/ml，組間差異極顯著(***p<0.001)。停止使用複合益生菌劑後n天后(訓練犬n＝10；幼犬、老年犬n＝15)，幼犬的實驗組和對照組分別變為33.69mg/ml和25.14mg/ml，組間差異極顯著(***p<0.001)；訓練犬變為48.58mg/ml和35.13mg/ml，組間差異極顯著(***p<0.001)；老年犬變為23.52mg/ml和21.10mg/ml，組間差異極顯著(***p<0.001)。可見，隨著試驗的推進，幼犬、訓練犬和老年犬實驗組犬糞便中分泌型免疫球蛋白a的含量均顯著高於對照組。
(8)犬腹瀉發病情況統計
犬腹瀉發病情況統計結果顯示(圖12)，試驗前幼犬、訓練犬、老年犬的實驗組和對照組腹瀉發病率分別為58％和58％；73％和26％；40％和40％。試驗30天後，幼犬的實驗組和對照組分別變為17％和50％；訓練犬變為20％和32％；老年犬變為0％和40％，即實驗組腹瀉患病老年犬已全部康復。試驗60天後，幼犬的實驗組和對照組仍保持試驗30天的腹瀉發病率；訓練犬變為7％和16％；老年犬的實驗組和對照組仍保持試驗30天的腹瀉發病率。停止使用複合益生菌劑後n天后(訓練犬n＝10；幼犬、老年犬n＝15)，實驗組和對照組仍保持試驗60天的腹瀉發病率。此外，對照組55號幼犬患習慣性腹瀉、104號訓練犬患急性腸道痙攣，均在試驗中期死亡；實驗組犬無死亡情況。為了對實驗組和對照組犬整體患病程度進行進一步比較，我們將每隻犬的患病程度轉化為數字(即：無腹瀉0；輕度腹瀉1；中度腹瀉2；重度腹瀉3)，並進行組內累加，將得出的值暫稱為腹瀉患病指數，結果顯示(圖13)：試驗前幼犬、訓練犬、老年犬的實驗組和對照組腹瀉患病指數分別為13和9；16和9；10和9。試驗30天後，幼犬的實驗組和對照組分別變為2和8；訓練犬變為4和10；老年犬變為0和7。試驗60天後，幼犬的實驗組和對照組仍為2和8；訓練犬變為1和5；老年犬變為0和3。停止使用複合益生菌劑後n天后(訓練犬n＝10；幼犬、老年犬n＝15)，幼犬的實驗組和對照組仍為2和7；訓練犬仍為1和5；老年犬仍為0和3。
綜上所述，實驗組(在原飼料配方的基礎上添加一定比例的複合益生菌劑)體溫、脈搏、呼吸次數等基礎指標均能與對照組保持一致，表明試驗期間實驗組表觀上無副作用；血液中白細胞、淋巴細胞、中性粒細胞含量均呈現低於對照組的趨勢，停用一段時間後仍能保持該水平，表明實驗組機體炎性感染的程度有所降低；血液中免疫球蛋白g和幹擾素α含量均顯著高於對照組，白細胞介素6含量也高於對照組，停用一段時間後上述免疫因子含量仍能保持前述水平，表明實驗組機的體液免疫和細胞免疫水平均得到明顯提升；糞便中分泌型免疫球蛋白a含量顯著高於對照組，該水平在停用一段時間後同樣能得到保持，表明腸黏膜局部免疫水平得到明顯提升。腹瀉發病率及患病程度也均呈現實驗組低於對照組。
需要說明的是：本發明實施例3-4製備的一種提高犬免疫力降低腹瀉發病率的複合益生菌劑同樣具有上述實驗效果，各實施例之間及與上述實驗效果差異性不大。
實施例8植物乳桿菌kt-lp9耐酸、耐膽鹽特性及其抑菌特性實驗
將冷凍保存的植物乳桿菌kt-lp9接種於mrs液體培養基中，在溫度37℃下靜態培養18h，如此傳代培養2次得到活化發酵液；
所述的mrs液體培養基組成如下：10g蛋白腖、5g牛肉膏、4g酵母浸粉、20g葡萄糖、2g磷酸氫二鉀、5g乙酸鈉、2g檸檬酸三鈉、1ml吐溫80、0.2g硫酸鎂、0.05g硫酸錳加入1000ml蒸餾水，調節ph至6.5，121℃滅菌15min。
耐酸、耐膽鹽特性：
在ph2.5(用1mol/lhcl調整)滅菌pbs緩衝液中，加入3.5g/l胃蛋白酶，用0.22μm的微孔濾膜過濾除菌，製成模擬胃液；將活化好的菌株離心收集菌體，加入與培養基等量的ph2.5模擬胃液，37℃培養3h，於0h、3h用mrs瓊脂培養基傾注法測定其活菌數。
在ph8.0(用0.1mol/lnaoh調整)滅菌pbs中，加入0.1％胰蛋白酶和1.8％牛膽鹽用0.22μm的微孔濾膜過濾除菌，製成模擬腸液；將模擬胃液中處理3h後的菌液，離心洗菌兩次收集菌體後，加入與之前模擬胃液等量的模擬腸液繼續37℃培養，於4h、8h用mrs瓊脂培養基傾注法測活菌數，試驗結果見表1：
存活率＝[n1/n0]×100％(n0－0h活菌數；n1－經模擬腸、胃液消化後的活菌數)
表1kt-lp9人工模擬胃液和腸液的存活率
抑菌特性：
用瓊脂孔擴散法(well-diffusionagarassay)測定植物乳桿菌kt-lp9發酵液的抑菌效果：將滅菌後冷卻至50℃左右的mrs瓊脂培養基(20ml)與200μl腸道致病菌液(106cfu/ml)一起倒入平板混勻。待加有腸道致病菌的mrs瓊脂培養基冷卻凝固結實後，使用打孔器在平板上打出直徑8mm左右的孔。
每孔加入100μl植物乳桿菌kt-lp9發酵液，於4℃冰箱中擴散12h後37℃培養恆溫48h，觀測抑菌圈的大小。抑菌圈直徑大小使用遊標卡尺進行測量(保留兩位有效數字)，實驗結果見表2：
表2kt-lp9發酵液中苯乳酸、4-羥基苯乳酸含量和抑菌特性
註：打孔器直徑為8mm
由表1、表2試驗結果可知，kt-lp9菌株具有較好的耐酸以及耐膽鹽特性，其在ph2.5的人工模擬胃液中消化3h後繼續在ph8.0的人工腸液中消化8h，其存活率高達81.57％。同時菌株kt-lp9具有廣譜抑制致病菌的優良特性，且抑菌效果十分顯著。