用於生產具有高活性脂肪酶的基因的製作方法
2023-05-04 04:54:45
本發明屬於生物
技術領域：
，具體涉及一種用於生產具有高活性脂肪酶的基因。
背景技術：
：aprol(rhizopusoryzaelipase)，源於rhizopusoryzae，amazon有商品化的脂肪酶基因。minningetal.(2001)採用ppicαa/p.pastorisx-33表達系統對rhizopusoryzae來源的基因並對其進行表達，發酵103h後酶活為12888u/l·h(oliveoil，在30℃ph8.1下反應)，用ppiczac/p.pastoris表達系統對其進行表達,發酵48h後酶活為110u/ml,8571u/mg(triolein，30℃ph8.1)，nativeenzyme(10000u/mg,oliveoil,ph8.5,37℃)。但該酶活性不高，影響了其商業化推廣或應用。技術實現要素：為了解決上述問題，本發明的目的之一在於提供了一種用於生產具有高活性脂肪酶的基因；本發明的目的之二在於提供一種由所述基因所表達的高活性脂肪酶。本發明是通過以下技術方案來實現的：一種用於生產具有高活性脂肪酶的基因，所述基因的序列如下：一種由上述基因所表達的高活性脂肪酶，所述高活性脂肪酶的比酶活為380～430u/mg。較佳地，所述高活性脂肪酶的比酶活為409u/mg。應用上，所述高活性脂肪酶可用於增白麵製品與烘焙製品，如麵條、饅頭等。與現有技術相比，本發明具有以下有益效果：本發明的基因所表達的脂肪酶活性高、具有開發潛力，具有廣泛和實際的應用價值，如可用於麵製品與烘焙製品的增白。附圖說明圖1是本發明線性化質粒aprol-ppiczαa的瓊脂糖電泳檢測，其中，線m，dl15000bpmarker；線1，線性化aprol-ppiczαa。圖2是bmmy-羅丹明b平板法篩選重組子的示意圖。具體的實施方式下面結合具體實施方式對本發明作進一步的詳細說明，以助於本領域技術人員理解本發明。本發明用於生產具有高活性脂肪酶的基因(用aprol-ppiczαa表示)的序列如下：一、基因的表達寄主：畢赤酵母菌株x-33和gs115。當然，可表達脂肪酶基因的其他寄主都可應用至本發明。基因合成：本發明用於生產具有高活性脂肪酶的基因由上海捷瑞公司合成。1.1表達菌株構建1.1.1質粒提取參照廣州東盛質粒小提試劑盒使用說明書。1.1.2重組質粒aprol-ppiczαa的線性化和回收將所得的重組質粒aprol-ppiczαa用saci進行線性化處理，37℃下酶切反應1h，反應體系如下：將酶切反應溶液混勻後放置於37℃水浴，1h後取出，用凝膠純化回收試劑盒進行回收(參見天根膠回收試劑盒使用說明書)。1.1.3畢赤酵母菌株感受態的製備及電轉化參見invitrogen的ppiczαa,b,andc用戶操作手冊。1.1.4結果將經酶切驗證和測序驗證後正確的重組質粒aprol-ppiczαa用saci進行線性化處理，酶切產物回收後用1％瓊脂糖凝聚電泳進行鑑定，結果如圖1所示。1.2具脂肪酶活性的轉化子的篩選1.2.1初篩挑取ypds平板上生長最快的單克隆子分別點接於ypd(用於保種)和bmmy-羅丹明b平板(用於誘導)平板上，30℃倒置恆溫培養3～5d；每隔24h在bmmy-羅丹明b平板的蓋子上添加100μl甲醇對重組子進行誘導表達，在培養過程中，根據水解圈的相對大小選出脂肪酶酶活性最強的10個轉化子，依次編號為1#，2#，3#～10#，平板篩選結果如圖2所示。1.2.2復篩將選定的10個轉化子分別接種含10mlbmgy液體培養基中(100ml規格搖瓶)，30℃250rpm培養至od600＝6.0；3,000g離心5min收集菌體，用2mlbmmy液體培養基重懸細胞後轉移至50mlbmmy液體培養基中，使其od600＝1.0；30℃250rpm繼續誘導培養，每隔24h添加一次甲醇使其終濃度為0.5％，48h後開始取樣測酶活性，取樣時間點為48h、72h、96h、120h，所取樣品在3,000g離心3min後收集上清，採用滴定法測脂肪酶酶活性，確定活性最高的轉化子及其誘導條件。1.2.3結果選取初篩獲得的脂肪酶活性較高的10個轉化子進一步進行篩選，觀察其三角瓶水平的表達情況，採用鹼性滴定法測定發酵液上清中的脂肪酶活性，aprol-ppiczαa的酶活測定結果見表1。表1搖床水平三角瓶中各轉化子的脂肪酶酶活性誘導時間(h)aprol-ppiczαa酶活性(u/ml)487072759685120851.3脂肪酶活力測定本實驗採用鹼式滴定法測定脂肪酶活力。1.3.1原理脂肪酶在一定條件下，能使甘油三脂水解成脂肪酸、甘油二酯、甘油單脂和甘油，所釋放的脂肪酸可用標準鹼溶液進行中和滴定，用ph計或酚肽指示液指示反應終點，根據消耗的鹼量，計算其酶活力。反應式為：rcooh+naoh→rcoona+h2o1.3.2操作步驟1)取兩個50ml三角瓶，分別於空白管(a)和樣品管(b)中各加入底物溶液4.00ml橄欖油乳化液(橄欖油：pva＝1:3，v/v)和5.00ml磷酸緩衝液(100mm,ph7.0),再於a管中加入95％乙醇15.00ml，於40℃水浴中預熱5min，然後於a、b管中各加待測酶液1.00ml，立即混勻計時，於40℃水浴中準確反應10min，於b管中立即補加95％乙醇15.0ml終止反應，取出；2)於空白和樣品溶液中各加酚肽指示液2滴，用50mmnaoh標準溶液滴定，直至微紅色並保持30s不褪色為滴定終點，記錄消耗50mmnaoh標準溶液的體積。1.3.3酶活計算酶活定義:1g固體酶粉(或1ml液體酶)，在40℃溫度和ph7.0條件下，1min水解橄欖油(oliveoil)產生1μmol的可滴定的脂肪酸，即為1個酶活力單位，以u/g(u/ml)表示。計算方法：脂肪酶製劑的酶活力按下式計算x1＝(v1-v2)*c*50*n1/0.05*1/10式中：x1-----樣品的酶活力，u/g(u/ml)v1----滴定樣品時消耗氫氧化鈉標準溶液的體積,單位為毫升(ml)；v2----滴定空白時消耗氫氧化鈉標準溶液的體積,單位為毫升(ml)c----氫氧化鈉標準溶液濃度，單位為摩爾每升(mol/l)；50---0.05mol/l氫氧化鈉溶液1.00ml相當於脂肪酸50μmol；n1----樣品的稀釋倍數；0.05----氫氧化鈉標準溶液濃度換算係數；1/10----反應時間10min,以1min計。所得結果表示至整數。1.3.4結果對比例：lbk-b4000(饅頭專用脂肪酶，綠微康)：46.5mg蛋白/g粉末(蛋白含量4.65％)；cal-b(用於有機合成，novozymes)：9.24mg蛋白/ml原酶液(蛋白含量0.924％)。各脂肪酶酶學特性的比較如表2所示名稱特性比酶活(u/mg)(oliveoil)lbk-b4000282.61cal-b1.84aprol-ppiczαa409由表2可知：aprol-ppiczαa的比酶活要高於lbk-b4000的1.7倍；cal-b的水解活力最低，只有1.84u/mg，主要用於有機合成反應。在比酶活方面，我們在研究的脂肪酶aprol-ppiczαa具有開發潛力。製得注意的是，脂肪酶的酶活測定採用的是naoh滴定法，不同的人對顯色反應評判的尺度不一樣，進行酶活測定時得到的結果會有一定的差別。如：饅頭專用脂肪酶lbk-b4000，化驗室所測酶活16346u/g粉末(比活為355.35u/mg蛋白)，本實驗所測酶活為13000u/g粉末(比活為282.61u/mg蛋白)。二、應用通過將本發明的基因aprol-ppiczαa在酵母上高效表達後獲得高活性的脂肪酶，再通過現有的配方優化獲得了兩個樣品fnl-25000與fsl-20000，能分別被應用於麵製品與烘焙製品的增白。其中，將脂肪酶優化以適用於麵製品或烘焙製品中屬於現有技術，在此不再贅述。2.1脂肪酶fnl-25000麵條增白效果實驗2.1.1、實驗目的測試脂肪酶fnl-25000在白鹽麵條中的增白效果2.1.2實驗主要原料麵粉：山東中筋基礎粉脂肪酶：fnl-250002.1.3實驗配方及工藝表3、麵條配方原料用量/g麵粉100食鹽1水33麵條工藝：加水和面；鬆弛；壓面機壓面；整型，製成麵條和面片。2.1.4實驗結果表4、fnl-25000測試結果從上表可知，隨著fnl-25000濃度的增加，麵條和面片白度依次遞增。2.1.5實驗結論以山東中筋基礎粉為麵粉原料，添加脂肪酶fnl-25000，麵條白度明顯增加，添加量越大，麵條白度越大。2.2脂肪酶fsl-20000饅頭增白效果實驗2.2.1、實驗目的測試脂肪酶fsl-20000在北方饅頭中增白效果2.2.2實驗主要原料麵粉：山東中筋基礎粉；河北中筋基礎粉脂肪酶：fsl-200002.2.3實驗配方及工藝表5、饅頭配方原料用量/g麵粉100酵母0.8水462.2.4饅頭工藝加水和面→壓面機壓面→手工搓圓→醒發→蒸煮2.2.5實驗結果表6、fsl-20000測試結果山東中筋基礎粉及河北中筋基礎粉隨著fsl-20000添加濃度的增加，饅頭表皮白度依次增加。2.2.6結論以山東中筋基礎粉和河北中筋基礎粉為麵粉原料，添加了脂肪酶fsl-20000，饅頭表皮白度明顯增加，隨著添加量的增加，饅頭表皮白度呈上升趨勢。申請人：東莞泛亞太生物科技有限公司發明名稱：用於生產具有高活性脂肪酶的基因序列特徵：用於生產具有高活性脂肪酶的基因的基因全序列序列描述：gaattcgacgacaatttggtcggtggaatgaccttggacttgccttctgatgcccctcctatttctttgtctggttctacaaattctgcttctgacggaggaaaggttgttgctgctactactgcccagatccaggagttcactaaatacgctggtattgcagccacagcctattgtagatctgttgtcccaggaaataagtgggactgcgtccagtgccagaagtgggttccagacggtaagatcattaccacattcacctctttgttgtctgacaccaatggatacgtcttgagatctgacaagcaaaaaactatttacttggtcttcagaggaactaactcttttagatctgcaatcaccgacatcgttttcaacttttctgactataagccagtcaaaggagccaaggttcatgctggattcttgtcttcttacgaacaagtcgtcaacgactactttccagtcgttcaggagcagttgaccgcaaacccaacatacaaggttattgtcaccggacactctttgggaggtgctcaggcattgttggcaggtatggatttgtatcaaagagagcctagattgtctcctaagaacttgtctatcttcaccgttggaggtcctagagtcggaaaccctaccttcgcatactatgttgagtctacaggaatcccattccagagaaccgtccacaaaagagacattgttccacacgttcctccacagtctttcggatttttgcacccaggtgtcgaatcttggatcaagtctggtacttctaacgtccaaatctgcacctctgagatcgaaaccaaggattgctctaattctatcgttcctttcacatctttgttggaccatttgtcttactttgacatcaacgaaggttcttgcttgtaagcggccgc。當前第1頁12