Ⅰ型糖尿病疫苗及其構建方法
2023-05-03 21:37:46 1
專利名稱：Ⅰ型糖尿病疫苗及其構建方法
技術領域：
本發明涉及一種質粒DNA的構建方法，尤其是表達I型糖尿病早期自身抗原分子特異性T表位、B表位和CTL表位反義肽的質粒DNA的構建方法，並進一步涉及呈遞反義肽的噬菌體疫苗的構建和製備方法。
背景技術：
糖尿病已成為全球範圍內危害公眾健康的主要疾病之一。糖尿病主要分為I型和II型。I型以自身免疫系統攻擊胰島β細胞，使β細胞受損，導致胰島素分泌絕對減少為特徵；II型則以胰島素抵抗和胰島細胞功能缺陷為特徵。目前，對I型糖尿病病因及其治療的研究主要是使用非肥胖糖尿病(NOD)小鼠作為動物模型，NOD小鼠會自然發展成與人類I型糖尿病很相似的糖尿病症狀。
生物體的主要遺傳物質是雙鏈DNA，DNA大分子以反向互補的兩條鏈形成雙螺旋結構。因此，在一個順反子中，一條鏈編碼多肽結構的信息，謂之有意義鏈，而與之互補的、不編碼多肽結構的、也無轉錄能力而只起到模板作用的一條鏈，謂之無意義鏈。按照一般將與mRNA互補的RNA稱為反義RNA的習慣，簡稱由反義RNA翻譯的多肽為反義肽。
大量實驗證明，反義肽與天然肽之間有相互識別的特性。研究發現，編碼互補的胺基酸的「水合指數」的符號通常是相反的，即一個是親水性的，而另一個則是疏水性的。因此，Bost(Proc Natl Acad Sci USA.，1985，82(5)1372-1375)認為，在水環境下，編碼互補的兩條鏈由於相應的胺基酸的水合指數不同，可能通過它們親水或疏水的表面，沿著整條肽鏈相互結合，這可能就是反義肽與天然肽選擇性識別的作用機理。
Blalock等(Biochem Biophys Res Commun，1984，121(1)203-207)提出「分子識別理論」，認為相互作用的蛋白質和多肽是由互補的DNA片段編碼的。新的研究證明編碼兩個高親和力相互作用的蛋白的DNA不一定是嚴格互補的，但是，其胺基酸序列具有明顯的疏水-親水特性，即一個疏水性胺基酸對應著一個親水性胺基酸，胺基酸的疏水-親水相互作用使兩個高度親和的蛋白呈現互補形態，即「鎖—鑰匙」識別模式，產生特異性的親和作用。
目前，I型糖尿病的治療主要是注射胰島素，尚無有效的預防措施。近年來，國際上利用Th1類轉換為Th2類免疫治療策略預防I型糖尿病的發生。然而，許多研究對Th1-Th2免疫應答轉換策略提出了質疑。說明利用Th1-Th2免疫應答轉換的方式抑制I型糖尿病的發生不一定是一條有效的途徑，意味著可能存在更複雜的免疫調控機制。因此，有必要研究新的技術方案，更有效地預防I型糖尿病。
發明內容
本發明的目的正是為解決現有技術存在的上述不足而提出了I型糖尿病反義肽疫苗及其構建方法，構建的反義DNA疫苗以及呈遞反義肽的噬菌體疫苗在早期免疫能夠抑制NOD小鼠發生糖尿病。
本發明通過下列技術方案完成一種I型糖尿病疫苗，其特徵在於由胰島素CTL表位的反義DNA序列catcaagttcaagttttcgatcaagtc、前胰島素T表位的反義DNA序列gctccttccgctgtccatcaagtccaaggtttccatcaagtcgct、受體型蛋白酪氨酸磷酸酶樣蛋白IA-2β兩個T表位的反義DNA序列caattccttgtcggtggtggtggtgtcggtgctggtgtcgctgct和catcctgctgtcgtcgtcggtcaacatggtcaagccctgtcttc及B表位的反義DNA序列gtccacaagctcctgctgctgctggtcatgctcctgtcgtccctgctcaaaaatgaaacttggtcatggtcctggtttcgtcggtcttcaagtcttccaagtcaaagctcctcatcaaaaagtcttcgctcctgatgtcttcgctgatcaagtccatttcgtccatgtcgtccaagtcgctgctttcgtcggtcctgtcgtcgtcgtccttcctcatgctgtcttcggtcaaggtggtcaatcatgatcatcatgctgctgctttccctcatcatctt、胰島葡萄糖-6-磷酸酶催化亞單位相關蛋白IGRP T表位的反義DNA序列caaaaacaagtcggtttccaagtcggt、穀氨酸脫羧酶GAD65T表位的反義DNA序列ggtggtggtggtgtcgctgatcatcatcctaaaaaagtc及B表位的反義DNA序列gtctctgtccaacaaggtgctcaattcgtcgctgatgctgctggtaaattccttggtcatcttg ctcctggtcctggtggtgctggtgtcttcgctgtcgctgct和CTL表位的反義DNA序列catcatgtccttcaacaagatgtccatcat，以及連接於各反義DNA序列之間的間隔子編碼基因和表達載體。
所述間隔子編碼基因為GPGPG或者AAY的編碼基因。
所述表達載體為真核pCDNA3.1或者T7噬菌體，為市購產品。
所述I型糖尿病疫苗通過下列方法構建在胰島素CTL表位的反義DNA序列catcaagttcaagttttcgatcaagtc、前胰島素T表位的反義DNA序列gctccttccgctgtccatcaagtccaaggtttccatcaagtcgct、受體型蛋白酪氨酸磷酸酶樣蛋白IA-2β兩個T表位的反義DNA序列caattccttgtcggtggtggtggtgtcggtgctggtgtcgctgct和catcctgctgtcgtcgtcggtcaacatggtcaagccctgtcttc及B表位的反義DNA序列gtccaacaagctcctgctgctgctggtcatgctcctgtcgtccctgctcaaaaatgaaacttggtcatggtcctggtttcgtcggtcttcaagtcttccaagtcaaagctcctcatcaaaaagtcttcgctcctgatgtcttcgctgatcaagtccatttcgtccatgtcgtccaagtcgctgctttcgtcggtcctgtcgtcgtcgtccttcctcatgctgtcttcggtcaaggtggtcaatcatgatcatcatgctgctgctttccctcatcatctt、胰島葡萄糖-6-磷酸酶催化亞單位相關蛋白IGRP T表位的反義DNA序列caaaaacaagtcg gtttccaagtcggt、穀氨酸脫羧酶GAD65 T表位的反義DNA序列ggtggtg gtggtgtcgctgatcatcatcctaaaaaagtc及B表位的反義DNA序列gtctctgtc caacaaggtgctcaattcgtcgctgatgctgctggtaaattccttggtcatcttgctcctggtc ctggtggtgctggtgtcttcgctgtcgctgct和CTL表位的反義DNA序列catcatg tccttcaacaagatgtccatcat之間，用間隔子編碼基因相連，進行合成後，插入真核表達載體，得到I型糖尿病反義DNA，或者插入T7噬菌體DNA衣殼蛋白B10編碼基因的3』端，得到呈遞反義肽的重組T7噬菌體。
所述反義肽的胺基酸序列是HQVQGFDQVGPGPGAPFAAHQVQGFHQVAGPGPGQFLVGGGGVGAGVAAGPGPGHPAVVVGQHGQAPVFGPGPGVQQAPAAAGHAPVVPAQKMKLGHGPGFVGLQVFQVKAPHQKVFAPDVFADQVHFVHVVQVAAFVGPVVVALPHAVFGQGGQHHDHHAAAFPHHLGPGPGQKQVGFQVGGPGPGGGGGVADHHPKKVGPGPGVSVQQGAQFVADAAGKFLGHLAPGPGGAGVFAVAAGPGPGHHVLQQDVHH。
所述的胰島素CTL表位(Gabrielle GM Pinkse，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2005，102(51)18425-18430)；所述的前胰島素T表位(Kent.Nature，2005，435224)；所述的受體型蛋白酪氨酸磷酸酶樣蛋白IA-2β(receptor-type protein tyrosine phosphatase-like protein)T表位(KatalinKelemen，J Immunol，2004，172(6)3955-3962.)，以及B表位(Hoppu S，JAutoimmun.2004，23(4)361-370.)；所述的胰島葡萄糖-6-磷酸酶催化亞單位相關蛋白IGRP(islet glucose-6-phosphatase catalytic subunit-related protein)T表位(Scott M.Lieberman，Proc Natl Acad Sci U S A.2003，100(14)8384-8388)；所述的穀氨酸脫羧酶GAD65(glutamic acid decarboxylase)T表位、B表位(HelenaReijonen，Diabetes.2004，53(8)1987-1994.)，以及CTL表位(ConstadinaPanagiotopoulos，Current Diabetes Reports，2004，487-94.)。
所述的間隔子編碼基因GPGPG(Livingston BD.J Immunol，2002，168(11)5499-506)，間隔子編碼基因AAY(Velders MP.J Immunol，2001，166(9)5366-5373)。
所述I型糖尿病疫苗的製備方法，取I型糖尿病反義DNA並用現有的工藝將其在大腸桿菌中擴增後，經現有的鹼裂解法提取、純化，按所需濃度用無菌的蒸餾水溶解DNA，得到I型糖尿病反義DNA疫苗。
所述I型糖尿病疫苗的製備方法，其特徵在於將呈遞反義肽的重組T7噬菌體在大腸桿菌菌株BL5403(購自Novagen公司)中擴增後，按常規方法收穫噬菌體，測定噬菌體的滴度，滴度按pfu/ml計數，數值上等於「噬斑數×稀釋倍數×10」。調整噬菌體濃度為1014pfu/ml，按1∶4000體積比加入甲醛，常規方法滅活，得I型糖尿病反義肽疫苗。
所述反義DNA全長765個核苷酸。所述反義肽全長255個胺基酸殘基。
所述的反義肽展示在T7噬菌體的表面。
本發明經過下列試驗1、反義DNA疫苗免疫NOD小鼠4周齡雌性NOD小鼠隨機分成3組，即反義DNA疫苗組、空質粒組和陽性對照組，每組20隻。於第0周、1周、3周和8周免疫，疫苗組肌肉注射反義DNA疫苗，免疫劑量為100ug/只；空質粒組肌肉注射空質粒PcDNA3.1，100ug/只；陽性對照組僅注射生理鹽水，0.1ml/只。
2、反義肽疫苗免疫NOD小鼠4周齡雌性NOD小鼠隨機分成3組，即反義肽疫苗組、空噬菌體組和陽性對照組，每組20隻。於第0周、1周、3周和8周免疫，疫苗組皮下注射反義肽疫苗，免疫劑量為1012pfu/只；空噬菌體組皮下注射T7噬菌體，1012pfu/只；陽性對照組僅注射生理鹽水，0.1ml/只。
3、ELISA方法檢測反義DNA疫苗、反義肽疫苗誘導的抗體在反義DNA疫苗、反義肽疫苗免疫後的不同時間，採集免疫小鼠尾靜脈血，分離血清，間接ELISA法檢測反義肽特異的血清IgG水平。其方法是用合成的反義肽約1μg包被96孔酶標板，加入系列稀釋後的待測血清，加入過氧化物酶羊抗鼠抗體，反應後洗板3次，隨後加入TMB底物顯色液，終止反應，450nm波長讀數。
4、血糖、尿糖、體重的檢測在反義DNA疫苗、反義肽疫苗免疫後的不同時間，檢測NOD小鼠的血糖、尿糖、體重水平。
本發明與現有技術相比具有下列優點和效果經過試驗證明1)反義DNA疫苗對NOD小鼠起了明顯的保護作用，免疫小鼠的血糖、尿糖和體重都處於正常範圍，而陽性對照組、空質粒組的NOD小鼠均表現出血糖、尿糖升高，體重減輕的症狀。2)反義肽疫苗對NOD小鼠起了明顯的保護作用，免疫小鼠的血糖、尿糖和體重都處於正常範圍，而陽性對照組、空噬菌體組的NOD小鼠均表現出血糖、尿糖升高，體重減輕的症狀。
本發明解決了下列技術難點I型糖尿病是一種自身免疫疾病，免疫T細胞以β胰島細胞為靶點，引起β胰島細胞凋亡。抗原特異性的免疫治療是一種選擇性抑制與自免疾病相關的抗自身T細胞應答，其特點是誘導抗原特異性的調控Th細胞，抑制自免疾病的發生。然而，Th1-Th2免疫應答轉換的方式並不一定抑制I型糖尿病的發生，有研究表明該方法甚至會加速I型糖尿病的發生。所以，本專利的發明人在「分子識別理論」和反義肽概念的基礎上創新性率先提出「I型糖尿病反義DNA疫苗」、「I型糖尿病反義肽疫苗」的研究思路，經過多年的潛心研究與實驗，並付出了創造性的勞動，成功構建了I型糖尿病反義DNA疫苗，並進一步構建反義肽疫苗，免疫NOD小鼠後，對免疫動物起了明顯的保護作用，免疫動物的血糖、尿糖和體重都處於正常範圍，而陽性對照組動物表現出血糖、尿糖升高，體重減輕的症狀。其結果如下(一)I型糖尿病反義DNA疫苗對免疫NOD小鼠的保護作用(1)NOD小鼠抗反義肽抗體檢測分別於0、4、8、12、16、20、24、28周採集小鼠尾靜脈血，分離血清，用合成的反義肽作為抗原包被板子，用間接ELISA法檢測抗反義肽抗體。
表1 抗反義肽抗體滴度(X±S)
測結果表明，反義DNA疫苗免疫NOD小鼠後，誘導了抗反義肽抗體的產生，並且抗體水平在16周時升至最高，達到201±23，與其它組相比，差異顯著(P＜0.01)，之後開始逐漸下降，而空質粒組與陽性對照組的抗體水平相比，差異沒有顯著性(P＞0.05)。
(2)NOD小鼠血糖、尿糖、體重檢測表2 NOD小鼠血糖水平變化(X±S mmol/L)
從表2中可以看出，陽性對照組和空質粒組的血糖水平在16周時超過正常值，並且在24周時升至最高，分別為28.5±8.4、25.0±7.1，在28周時，分別有17隻、18隻NOD小鼠死亡。而疫苗組血糖水平基本處於正常值範圍，除了有3隻在第28周時血糖升至14.3±6.5。說明反義DNA疫苗有效地保護了免疫小鼠，避免了NOD小鼠血糖水平的升高，反義DNA疫苗保護NOD小鼠預防糖尿病的有效率達85％。
表3 NOD小鼠尿糖水平變化
從表3中可以看出，陽性對照組和空質粒組的尿糖水平在8周時升高，之後持續上升，並且在24周時達到最高++++，在28周時，分別有17、18隻NOD小鼠死亡。而疫苗組的尿糖水平基本處於陰性，除了有3隻在28周時尿糖++。說明反義DNA疫苗有效地保護了免疫小鼠，避免了NOD小鼠尿糖水平的升高。
表4 NOD小鼠體重變化(X±S g)
從表4中可以看出，在12周以前，各組小鼠體重均逐漸增加，到12周以後，陽性對照組和空質粒組小鼠體重開始下降，並且在28周時，降為最低，分別為10.7±4.3、11.2±3.5，而疫苗組的體重沒有明顯下降。說明反義DNA疫苗有效地保護了免疫小鼠，避免了NOD小鼠體重的顯著下降。(3)NOD小鼠Th1、Th2類細胞因子的檢測分別於6、12、18、24周採集尾靜脈血，分離血清，用試劑盒檢測Th1細胞分泌的細胞因子IL-1、IFN-γ，以及Th2細胞分泌的細胞因子IL-4、IL-10。
表5.IL-1水平變化(X±S pg/ml)
表6 IFN-γ水平變化(X±S pg/ml)
從表6可以看出，陽性對照組和空質粒組分泌的IFN-γ水平在18周時達到最高，並且與疫苗組相比，差異顯著，P＜0.05；而陽性對照組和空質粒組的分泌水平沒有顯著差異，P＞0.05。
表7 IL-4水平變化(X±S pg/ml)
從表7可以看出，疫苗組分泌的IL-4水平在18周時達到最高，並且顯著高於空質粒組和陽性對照組，P＜0.05；而陽性對照組和空質粒組的分泌水平沒有顯著差異，P＞0.05。
表8 IL-10水平變化(X±S pg/ml)
從表8可以看出，疫苗組分泌的IL-10水平在18周時達到最高，並且顯著高於空質粒組和陽性對照組，P＜0.05；而陽性對照組和空質粒組的分泌水平沒有顯著差異，P＞0.05。
從以上細胞因子的檢測結果可以看出，疫苗組分泌的Th2型細胞因子水平顯著高於陽性對照組，而分泌的Th1型細胞因子水平顯著低於陽性對照組，表明疫苗的作用使免疫反應從Th1型向Th2型轉化。
(4)致敏T細胞增殖抑制實驗①致敏T細胞的製備取26周時的陽性對照組小鼠，斷頸處死，無菌條件下分離淋巴結。過不鏽鋼篩網收集淋巴細胞。通過Ficoll-Hypaque離心除去組織碎片和死細胞，淋巴細胞重懸於完全培養液(RPMI 1640，10％FCS、100U/ml青黴素、100mg/ml鏈黴素，1％NaHCO3，10mM非必需胺基酸，20mM L-穀氨醯胺)。通過塑料板貼壁方法除去巨噬細胞。
②輻射脾細胞的製備處死血糖正常的NOD小鼠，無菌條件下取出脾臟。通過Ficoll-Hypaque離心收集脾細胞，將脾細胞懸於上述培養液。脾細胞用3000rad輻射。將10ug/ml合成的正義肽加入輻照後的脾細胞，在5％CO2孵箱中溫育1天。這些輻照細胞用作APC。
③致敏T細胞的增殖抑制將致敏的T細胞(2×105/孔)、結合有正義肽的APC(5×105/孔)與不同濃度的抗反義肽血清或正常NOD小鼠血清在37℃、5％CO2共孵育4天，每個樣做3個復孔。培養結束前16小時用0.5μCi的[3H]TdR標記，培養結束後收集細胞用液閃儀測定cpm值。
表9 抗反義肽抗體對致敏T細胞的增殖抑制(cpm)
從表9可以看出，抗反義肽抗體能夠抑制致敏T細胞的增殖，並且抑制作用與抗反義肽血清的濃度呈劑量依賴性，濃度越高，抑制作用越明顯；而正常NOD小鼠的血清對致敏T的增殖則沒有抑制作用。
以上結果說明，反義DNA疫苗對免疫小鼠起了明顯的保護作用，免疫小鼠的血糖、尿糖和體重都處於正常範圍，而陽性對照組和空質粒組的NOD小鼠均表現出血糖、尿糖升高，體重減輕的症狀。反義DNA疫苗保護作用的機理在於疫苗免疫NOD小鼠後，誘導了抗反義肽抗體的產生，並通過抗體抑制了病理性T細胞的增殖，從而減少了胰島β細胞的損傷。
(二)反義肽疫苗對免疫NOD小鼠的保護作用(1)NOD小鼠抗反義肽抗體檢測分別於0、4、8、12、16、20、24、28周採集尾靜脈血，分離血清，用合成的反義肽作為抗原包被板子，用間接ELISA法檢測抗反義肽抗體。
表10 抗反義肽抗體水平變化(X±S)
檢測結果表明，反義肽疫苗免疫NOD小鼠後誘導了抗反義肽抗體的產生，並且在第16周時，疫苗組的抗體水平升至最高，300±34，與其它組相比，差異顯著，P＜0.01，之後有所下降；而空噬菌體組與陽性對照組的差異無顯著性(P＞0.05)。
(2)NOD小鼠血糖、尿糖和體重檢測表11 NOD小鼠血糖水平變化(X±S mmol/L)
從表11中可以看出，陽性對照組和空噬菌體組的血糖水平在16周時超過正常值，在24周時升至最高，分別為25.5±7.4、24.7±6.1，在28周時，分別有17隻、16隻NOD小鼠死亡。而疫苗組血糖水平基本處於正常值範圍，除了有3隻在第24周時血糖升至13.1±4.5、在第28周時升至17.6±5.8。說明反義肽疫苗有效地保護了免疫小鼠，避免了NOD小鼠血糖水平的升高，保護效率達85％。
表12 NOD小鼠尿糖水平變化
從表12中可以看出，陽性對照組和空噬菌體組的尿糖水平在8周時升高，之後持續上升，並且在24周時達到最高，++++，在28周時，分別有17、16隻NOD小鼠死亡。而疫苗組的尿糖水平基本處於陰性，除了有3隻NOD小鼠在28周時尿糖++。說明反義肽疫苗有效地保護了免疫小鼠，避免了NOD小鼠尿糖水平的升高。
表13 NOD小鼠體重變化(X±S g)
從表13中可以看出，在12周以前，各組小鼠體重均逐漸增加，到12周以後，陽性對照組和空噬菌體組小鼠體重開始下降，並且在28周時，降為最低，分別為15.2±3.5、16.5±4.1，而疫苗組的體重沒有明顯下降。說明反義肽疫苗有效地保護了免疫小鼠，避免了NOD小鼠體重的顯著下降。
(3)NOD小鼠Th1、Th2類細胞因子的檢測分別於6、12、18、24周採集尾靜脈血，分離血清，用試劑盒檢測Th1細胞分泌的細胞因子IL-1、IFN-γ，以及Th2細胞分泌的細胞因子IL-4、IL-10。
表14 1L-1水平變化(X±S pg/ml)
從表14可以看出，陽性對照組和空噬菌體組分泌的IL-1水平在18周時達到最高，並且與疫苗組相比，差異顯著，P＜0.05；而陽性對照組和空噬菌體組的分泌水平沒有顯著差異，P＞0.05。
表15 IFN-γ水平變化(X±S pg/ml)
從表15可以看出，陽性對照組和空噬菌體組分泌的IFN-γ水平在18周時達到最高，並且與疫苗組相比，差異顯著，P＜0.05；而陽性對照組和空噬菌體組的分泌水平沒有顯著差異，P＞0.05。
表16 IL-4水平變化(X±S pg/ml)
從表16可以看出，疫苗組分泌的IL-4水平在18周時達到最高，並且顯著高於空噬菌體組和陽性對照組，P＜0.05；而陽性對照組和空噬菌體組的分泌水平沒有顯著差異，P＞0.05。
表17 IL-10水平變化(X±S pg/ml)
從表17可以看出，疫苗組分泌的IL-10水平在18周時達到最高，並且顯著高於空噬菌體組和陽性對照組，P＜0.05；而陽性對照組和空噬菌體組的分泌水平沒有顯著差異，P＞0.05。
以上細胞因子檢測結果表明，反義肽疫苗免疫組分泌的Th2型細胞因子水平顯著高於陽性對照組，而分泌的Th1型細胞因子水平顯著低於陽性對照組，表明反義肽疫苗的作用使免疫反應從Th1型向Th2型轉化。
(4)致敏T細胞增殖抑制實驗①致敏T細胞的製備取26周時的陽性對照組小鼠，斷頸處死，無菌條件下分離淋巴結。過不鏽鋼篩網收集淋巴細胞。通過Ficoll-Hypaque離心除去組織碎片和死細胞，淋巴細胞重懸於完全培養液(RPMI 1640，10％FCS、100U/ml青黴素、100mg/ml鏈黴素，1％NaHCO3，10mM非必需胺基酸，20mM L-穀氨醯胺)。通過塑料板貼壁方法除去巨噬細胞。
②輻射脾細胞的製備處死血糖正常的NOD小鼠，無菌條件下取出脾臟。通過Ficoll-Hypaque離心收集脾細胞，將脾細胞懸於上述培養液。脾細胞用3000rad輻射。將10ug/ml合成的正義肽加入輻照後的脾細胞，在5％CO2孵箱中溫育1天。這些輻照細胞用作APC。
③致敏T細胞的增殖抑制將致敏的T細胞(2×105/孔)、結合有正義肽的APC(5×105/孔)與不同濃度的抗反義肽血清或正常未免疫NOD小鼠的血清在37℃、5％CO2共孵育4天，每個樣做3個復孔。培養結束前16小時用0.5μCi的[3H]TdR標記，培養結束後收穫細胞用液閃儀測定[3H]TdR的摻入率cpm。
表18 抗反義肽抗體對致敏T細胞的增殖抑制(cpm)
從表18可以看出，抗反義肽血清能夠抑制致敏T細胞的增殖，並且抑制作用與抗反義肽血清的濃度呈劑量依賴性，濃度越高，抑制作用越明顯；而正常NOD小鼠的血清對致敏T的增殖則沒有抑制作用。
以上結果說明，反義肽疫苗對免疫小鼠起了明顯的保護作用，免疫小鼠的血糖、尿糖和體重基本都處於正常範圍，而陽性對照組和空噬菌體組的NOD小鼠均表現出血糖、尿糖升高，體重減輕的症狀。反義肽疫苗保護作用的機理在於疫苗免疫NOD小鼠後，誘導了抗反義肽抗體的產生，並通過抗體抑制了病理性T細胞的增殖，從而減少了胰島β細胞的損傷。
具體實施例方式
下面結合實施對本發明做進一步描述，但本發明之內容並不局限於此。
實施例1A、I型糖尿病反義DNA的構建選擇已明確與I型糖尿病早期發病相關的表位，並通過互補特性推定出其反義肽及編碼反義肽的DNA序列，具體是在胰島素CTL表位的反義DNA序列catcaagttcaagttttcgatcaagtc、前胰島素T表位的反義DNA序列gctccttccgctgtccatcaagtccaaggtttccatcaagtcgct、受體型蛋白酪氨酸磷酸酶樣蛋白IA-2β兩個T表位的反義DNA序列caattccttgtcggtggtggtggtgtcggtgctggtgtcgctgct和catcctgctgtcgtcgtcggtcaacatggtcaagcccctgtcttc及B表位的反義DNA序列gtccaacaagctcctgctgctgctggtcatgctcctgtcgtccctgctcaaaaatgaaacttggtcatggtcctggtttcgtcggtcttcaagtcttccaagtcaaagctcctcatcaaaaagtcttcgctcctgatgtcttcgctgatcaagtccatttcgtccatgtcgtccaagtcgctgctttcgtcggtcctgtcgtcgtcgtccttcctcatgctgtcttcggtcaaggtggtcaatcatgatcatcatgctgctgctttccctcatcatctt、胰島葡萄糖-6-磷酸酶催化亞單位相關蛋白IGRP T表位的反義DNA序列caaaaacaagtcggt ttccaagtcggt、穀氨酸脫羧酶GAD65T表位的反義DNA序列ggtggtggtggtgt cgctgatcatcatcctaaaaaagtc及B表位的反義DNA序列gtctctgtccaacaaggtgctcaattcgtcgctgatgctgctggtaaattccttggtcatcttgctcctggtcctggtggtgctggtgtcttcgctgtcgctgct和CTL表位的反義DNA序列catcatgtccttcaac aagatgtccatcat之間，用間隔子GPGPG的編碼基因相連，並且第一個表位的反義DNA序列前加一個起始密碼子，最後一個表位的反義DNA序列3『端加一個終止密碼子，進行合成後，插入PcDNA3.1載體，最終構建成I型糖尿病反義DNA。
B、I型糖尿病反義DNA疫苗的製備取A過程構建的I型糖尿病反義DNA，並用現有的工藝進行擴增、純化，即將I型糖尿病反義DNA轉化大腸桿菌，37℃過夜培養，挑取單菌落，接種於5ml LB液體培養基，在37℃搖床培養至對數生長期，轉至600ml LB液體培養基，繼續培養至菌液渾濁，離心收穫細菌沉澱，按美國薩姆布魯克《分子克隆實驗指南》(第三版)鹼裂解法進行質粒DNA的大量提取、純化，按所需濃度用無菌的蒸餾水溶解DNA，得到I型糖尿病反義DNA疫苗。
實施例2A、I型糖尿病反義肽的構建選擇已明確與I型糖尿病早期發病相關的表位，並通過互補特性推定出其反義肽及編碼反義肽的DNA序列，具體是在胰島素CTL表位的反義DNA序列catcaagttcaagttttcgatcaagtc、前胰島素T表位的反義DNA序列gctccttccgctgtccatcaagtccaaggtttccatcaagtcgct、受體型蛋白酪氨酸磷酸酶樣蛋白IA-2β兩個T表位的反義DNA序列caattccttgtcggtggtggtggtgtcggtgctggtgtcgctgct和catcctgctgtcgtcgtcggtcaacatggtcaagcccctgtcttc及B表位的反義DNA序列gtccaacaagctcctgctgctgctggtcatgctcctgtcgtccctgctcaaaaatgaaacttggtcatggtcctggtttcgtcggtcttcaagtcttccaagtcaaagctcctcatcaaaaagtcttcgctcctgatgtcttcgctgatcaagtccatttcgtccatgtcgtccaagtcgctgctttcgtcggtcctgtcgtcgtcgtccttcctcatgctgtcttcggtcaaggtggtcaatcatgatcatcatgctgctgctttccctcatcatctt、胰島葡萄糖-6-磷酸酶催化亞單位相關蛋白IGRP T表位的反義DNA序列caaaaacaagtcggt ttccaagtcggt、穀氨酸脫羧酶GAD65T表位的反義DNA序列ggtggtggtggtgt cgctgatcatcatcctaaaaaagtc及B表位的反義DNA序列gtctctgtccaacaaggtgctcaattcgtcgctgatgctgctggtaaattccttggtcatcttgctcctggtcctggtggtgctggtgtcttcgctgtcgctgct和CTL表位的反義DNA序列catcatgtccttcaac aagatgtccatcat之間，用三個胺基酸AAY的編碼序列(間隔子)相連，並且第一個表位的反義DNA序列前加一個起始密碼子，最後一個表位的反義DNA序列3『端加一個終止密碼子，進行合成後，插入T7噬菌體DNA衣殼蛋白B10編碼基因的3『端，構建成呈遞反義肽的重組T7噬菌體，得到I型糖尿病反義肽。
B、I型糖尿病反義肽疫苗的製備用現有的工藝對呈遞反義肽的噬菌體進行大量擴增、純化，即將大腸桿菌菌株BL5403大量培養後，加入噬菌體，37℃搖床培養3小時左右至菌液清亮，可見絲狀物，離心收集上清，加入PEG沉澱噬菌體，離心收集沉澱，加入噬菌體溶解液，振搖溶解噬菌體，離心取上清，按常規方法測定噬菌體的滴度，滴度按pfu/ml計數，數值上等於「噬斑數×稀釋倍數×10」。調整噬菌體濃度為1014pfu/ml，按1∶4000體積比加入甲醛，37℃、100轉/分鐘搖床培養4天滅活，測定噬菌體的滴度，滴度為零，加入亞硫酸氫鈉中和甲醛，得I型糖尿病反義肽疫苗。
權利要求
1.一種I型糖尿病疫苗，其特徵在於由胰島素CTL表位的反義DNA序列catcaagttcaagttttcgatcaagtc、前胰島素T表位的反義DNA序列gctccttccgctgtccatcaagtccaaggtttccatcaagtcgct、受體型蛋白酪氨酸磷酸酶樣蛋白IA-2β兩個T表位的反義DNA序列caattccttgtcggtggtggtggtgtcggtgctggtgtcgctgct和catcctgctg tcgtcgtcggtcaacatggtcaagcccctgtcttc及B表位的反義DNA序列gtccaacaagctcctgctgctgctggtcatgctcctgtcgtccctgctcaaaaatgaaacttggtcatggtcctggtttcgtcggtcttcaagtcttccaagtcaaagctcctcatcaaaaagtcttcgctcctgatgtcttcgctgatcaagtccatttcgtccatgtcgtccaagtcgctgctttcgtcggtcctgtcgtcgtcgtccttcctcatgctgtcttcggtcaaggtggtcaatcatgatcatcatgctgctgctttccctcatcatctt、胰島葡萄糖-6-磷酸酶催化亞單位相關蛋白IGRP T表位的反義DNA序列caaaaacaagtcggtttccaagtcggt、穀氨酸脫羧酶GAD65T表位的反義DNA序列ggtggtggtggtgtcgctg atcatcatcctaaaaaagtc及B表位的反義DNA序列gtctctgtccaacaaggtgct caattcgtcgctgatgctgctggtaaattccttggtcatcttgctcctggtcctggtggtgctg gtgtcttcgctgtcgctgct和CTL表位的反義DNA序列catcatgtccttcaacaagatgtccatcat，以及連接於各反義DNA序列之間的間隔子編碼基因和表達載體。
2.根據權利要求1所述的I型糖尿病疫苗，其特徵在於所述間隔子編碼基因為GPGPG或者AAY的編碼基因。
3.根據權利要求1所述的I型糖尿病疫苗，其特徵在於所述表達載體為真核pCDNA3.1或者T7噬菌體。
4.一種如權利要求1所述I型糖尿病疫苗的構建方法，其特徵在於在胰島素CTL表位的反義DNA序列catcaagttcaagttttcgatcaagtc、前胰島素T表位的反義DNA序列gctccttccgctgtccatcaagtccaaggtttccatcaagtcgct、受體型蛋白酪氨酸磷酸酶樣蛋白IA-2β兩個T表位的反義DNA序列caattcc ttgtcggtggtggtggtgtcggtgctggtgtcgctgct和catcctgctgtcgtcgtcggtc aacatggtcaagcccctgtcttc及B表位的反義DNA序列gtccaacaagctcctgctgctgctggtcatgctcctgtcgtccctgctcaaaaatgaaacttggtc atggtcctggtttcgtcggtcttcaagtcttccaagtcaaagctcctcatcaaaaagtcttcgctcctgatgtcttcgctgatcaagtccatttcgtccatgtcgtccaagtcgctgctttcgtcggtcctgtcgtcgtcgtccttcctcatgctgtcttcggtcaaggtggtcaatcatgatcatcatgctgctgctttccctcatcatctt、胰島葡萄糖-6-磷酸酶催化亞單位相關蛋白IGRP T表位的反義DNA序列caaaaacaagtcggtttccaagtcggt、穀氨酸脫羧酶GAD65T表位的反義DNA序列ggtggtggtggtgtcgctgatcatcatcctaaaaaagtc及B表位的反義DNA序列gtctctgtccaacaaggtgctcaattcgtcgctgatgctgctggtaaattccttggtcatct tgctcctggtcctggtggtgctggtgtcttcgctgtcgctgct和CTL表位的反義DNA序列catcatgtccttcaacaagatgtccatcat之間，用間隔子編碼基因相連，進行合成後，插入真核pCDNA3.1質粒，得到I型糖尿病反義DNA，或者插入T7噬菌體DNA衣殼蛋白B10編碼基因的3』端，得到呈遞反義肽的重組T7噬菌體。
5.根據權利要求1所述的I型糖尿病疫苗的構建方法，其特徵在於所述間隔子編碼基因為GPGPG或者AAY的編碼基因。
6.根據權利要求1所述的I型糖尿病疫苗的構建方法，其特徵在於所述反義肽的胺基酸序列是HQVQGFDQVGPGPGAPFAAHQVQGFHQVAGPGPGQFLVGGGGVGAGVAAGPGPGHPAVVVGQHGQAPVFGPGPGVQQAPAAAGHAPVVPAQKMKLGHGPGFVGLQVFQVKAPHQKVFAPDVFADQVHFVHVVQVAAFVGPVVVALPHAVFGQGGQHHDHHAAAFPHHLGPGPGQKQVGFQVGGPGPGGGGGVADHHPKKVGPGPGVSVQQGAQFVADAAGKFLGHLAPGPGGAGVFAVAAGPGPGHHVLQQDVHH。
7.一種製備權利要求1所述I型糖尿病疫苗的方法，其特徵在於將I型糖尿病反義DNA用現有的工藝將其在大腸桿菌中擴增後，經現有的鹼裂解法提取、純化，按所需濃度用無菌的蒸餾水溶解DNA，得到I型糖尿病反義DNA疫苗。
8.一種製備權利要求1所述I型糖尿病疫苗的方法，其特徵在於將呈遞反義肽的重組T7噬菌體在大腸桿菌菌株BL5403中擴增後，按常規方法收穫噬菌體，測定噬菌體的滴度，滴度按pfu/ml計數，數值上等於「噬斑數×稀釋倍數×10」，調整噬菌體濃度為1014pfu/ml，按1∶4000體積比加入甲醛，用常規方法滅活，得I型糖尿病反義肽疫苗。
全文摘要
本發明構建並製備了表達I型糖尿病反義肽的DNA疫苗，構建方法是將I型糖尿病早期抗原(胰島素、前胰島素、IA－2β、IGRP和GAD65)特異性T表位、B表位和CTL表位反義肽的編碼基因插入真核表達質粒或T7噬菌體DNA衣殼蛋白B10編碼基因的3』端，使之表達反義肽，並進一步製備了I型糖尿病反義肽疫苗，結果發現，該疫苗在早期免疫能夠預防糖尿病的發生。
文檔編號A61P3/00GK1872346SQ20061001092
公開日2006年12月6日 申請日期2006年5月26日 優先權日2006年5月26日
發明者胡云章, 胡凝珠, 翟素, 劉國棟 申請人:中國醫學科學院醫學生物學研究所