重樓提取物的抗麴黴菌新用途的製作方法

2023-05-03 15:49:36 1

專利名稱：：重樓提取物的抗麴黴菌新用途的製作方法
技術領域：
：本發明涉及重樓提取物的新用途。
背景技術：
：科技的進步和醫學的發展引導人類社會進入了老齡化階段,老年人因為免疫力的降低，發生嚴重基礎性疾病、惡性腫瘤及慢性消耗性疾病的機率較高，同時對真菌感染的抵抗力也下降。由於臨床上大-劑量使用多種抗生素，尤其是高效廣譜抗生素，導致體內菌群失調，細菌被抑帶h殺死，真菌活動加強，誘發真菌感染。器官移植的成功和在臨床上的推廣，使免疫抑制劑的應用日益增加；另外，皮質類固醇等激素類藥物的廣泛應用，也抑制了機體的炎症反應，不但使吞噬細胞功能減弱，也影響B淋巴細胞的結構和功能，使抗體的形成減少，抑制了幹擾素的形成和活性，容易發生真菌感染。目前，外科靜脈營養和其他導管介入性治療等已成為常規治療手段，治療中的侵襲性操作如長期體內置留導管、心血管手術、氣管鏡檢査、胸穿等對人體造成腔孔，使真菌攜帶率大為增加，大大增加了真菌感染的機會。嚴重免疫缺陷患者如AIDS患者、惡性腫瘤和血液病患者等都易發生深部真菌感染。現在，深部真菌感染己成為這類患者致死的主要原因之一。麴黴菌是導致深部真菌感染的一類很重要的病原真菌，主要誘發深部感染，它們可感染耳鼻咽喉形成囊腫、潰瘍等，還可導致麴黴菌角膜炎，麴黴菌肺炎，肝囊腫等，而且治療困難，預後不佳。目前臨床應用的麴黴菌病治療藥物不但數量少,效果也差,而且不良反應多且嚴重。所以，臨床上急需新的高效低毒的抗麴黴菌藥物。重樓(RhizomaParidis)是百合科重樓屬(Pairs)植物七葉一枝花(parispolyphyllaSmith.Var.chinensis(Franch.)Hara)、雲南重樓(parispolyphyllaSmith.Var.yunnanensis(Franch.)Hand.-Mazz.)、闊瓣蚤休(parispolyphyllaSmith.Var.platypetala(Franch.)Franch.)、毛脈聖休(parispolyphyllaSmith.Var.pubescebs(Franch.)Hand.-Mazz.)、狹葉蚤休(parispolyphyllaSmith.Var.stenophylla(Franch.).)、滇王孫(parisdelavayi)輪葉王孫(ParisquadrifoliaL.)和具柄王孫(ParispetiolataBak.exForb.)的根莖。典籍記載，該藥味苦辛，性寒，有毒；有清熱解毒，平喘止咳，熄風定驚的功用；主治癰腫，疔瘡，瘰癧，喉痺，慢性氣管炎，小兒驚風抽搐，蛇蟲咬傷。現代藥理學研究證明，該藥提取物顯示出止血、平喘止咳、抗多種細菌、抑制多種病毒、殺滅鉤端螺旋體、鎮痛鎮靜、抗早孕殺滅精子、細胞毒等作用，臨床用於治療外傷出血、外傷炎症、功能性子宮出血、神經性皮炎以及腫瘤等，均有顯著療效。但重樓的抗麴黴菌活性從未見報導。
發明內容本發明的目的是提供重樓提取物在抗麴黴菌方面的新用途，用於治療麴黴菌感染疾病。本發明的目的通過下述技術方案予以實現。本發明提出了重樓提取物在製備治療或預防煙麴黴(Aspergillusfomigatus)、預防黑麴黴(Aspergillusniger)、黃麴黴(Aspergillusflavus)或土麴黴(Aspergillusterreus)引起的疾病的藥物中的應用。本發明提供了六種重樓提取物，製備提取方法如下-以重樓屬植物的根莖及根粉末為原料，用30%100%乙醇提取，提取液回收乙醇，製得重樓的乙醇提取物。將乙醇提取物先後用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇和水提取，各部分提取液分別回收溶劑，分別製得重樓的石油醚提取物、氯仿提取物、乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物和水提取物。該六種提取物即為本發明提供的重樓提取物。本發明的重樓六種提取物應用於製備治療或預防麴黴菌(包括煙麴黴、黑麴黴、黃麴黴、土麴黴)引起的疾病的藥物，是將提取物與一種或多種醫藥上可接受的載體和/或賦形劑組合，製備為適用於臨床使用的不同劑型的藥物，例如，可供靜脈內、肌肉內、腹腔內、皮下、腦脊髓腔注射給藥的注射劑，或適於口服給藥的片劑、膠囊劑、顆粒劑、混懸劑、溶液劑等，以及適於局部給藥的噴霧劑、氣霧劑、霜劑、軟膏和栓劑。其中，重樓各提取物佔藥物原料的重量比為10100%，載體和/或賦形劑佔重量比卯0%;優選的重量比為重樓提取物佔3090%，載體和/或賦形劑佔7010%。重樓的六種提取物還可與一種或多種天然或合成的其他與重樓提取物具有協同或輔助作用的活性成分混合，與載體和/或賦形劑組合，製備治療或預防麴黴菌引起的疾病的藥物。這些輔助性的天然或合成的活性出成分是本領域人員已知的和可以想像的。這些藥物的單位劑量一般包含重樓提取物的量為乙醇提取物50300mg，或石油醚提取物90900mg，或氯仿提取物60600mg，或乙酸乙酯提取物30300mg,或正丁醇提取物10300mg，或水提取物20300mg。這些藥物的口服給藥劑量(以提取物純量計)乙醇提取物，300mgX2/日；或石油醚提取物，300mgX2/日；或氯仿提取物，100mgX2/日；或乙酸乙酯提取物，50mgX2/日；或正丁醇提取物，30mgX2/日；或水提取物，50mgX2/日。注射給藥劑量(以提取物純量計)乙醇提取物，20Qmg/日；或石油醚提取物，150mg/日；或氯仿提取物，100mg/日；或乙酸乙酯提取物，50mg/日；或正丁醇提取物，30mg/日；或水提取物，50mg/日。本發明的優點在於中藥重樓的來源廣泛，提取物製備方法簡單，成本低廉，抗麴黴菌活性顯著，毒副作用較低，藥用前景良好。具體實施例方式下面提供的具體實施例，有助於更清楚地了解本發明，但不是對本發明的限定。實施例l(重樓提取物的製備)取乾燥的重樓根及根莖1000克，碎為粗粉，加入70%乙醇，加熱回流提取三次，每次用乙醇10000ml，回流1.5h，合併提取液，減壓回收乙醇，得乙醇提取物浸膏。將乙醇提取物浸膏用水1000ml分散，先後用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取，每種萃取溶劑萃取四次，每次用溶劑500ml。合併各部分萃取液，分別回收溶劑，得石油醚提取物、氯仿提取物、乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物；萃取所餘水液減壓蒸乾，得水提取物。實施例2(重樓提取物的製備)取乾燥的重樓根及根莖1000克，碎為粗粉，加入50000ml95W乙醇滲漉，滲漉液減壓回收乙醇，得乙醇提取物。乙醇提取物按1:1的重量比拌上硅藻土，減壓乾燥成粉，再先後用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇和水依次提取，每種提取溶劑提取三次，每次用溶劑1500ml回流1h。合併各部分提取液，分別回收溶劑，即得石油醚提取物、氯仿提取物、乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物和水提取物。實施例3(重樓提取物的製備)取乾燥的重樓根及根莖1000克，粉碎，先後用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、95%乙醇和水依次滲漉(每種溶劑用量50000ml)或回流提取(每種溶劑提取三次，每次用溶劑10000ml,回流1.5h，合併三次提取液。)，各種提取液分別蒸去溶劑至幹，即得石油醚提取物、氯仿提取物、乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物、乙醇提取物和水提物。實施例4(重樓提取物片劑製備)取重樓的乙醇提取物或正丁醇提取物或水提取物，按提取物:藥用澱粉:糊精=1:0.5:0.5的重量比混合，加入70%乙醇溼法制粒，乾燥，整粒，加入適量潤滑劑，壓片，每片0.3g。其他項目應符合中華人民共和國藥典2005年版片劑項下。實施例5(重樓提取物膠囊網備)取重樓的乙醇提取物或正丁醇提取物或水提取物，按提取物:藥用澱粉=7:3的重量比混合，用50%乙醇溼法制粒，乾燥，整粒，裝2#膠囊，每粒0,2g。其他項目應符合中華人民共和國藥典2005年版膠囊項下。實施例6(重樓提取物注射液製備)取重樓的正丁醇提取物，加注射用水配製成每ml含重樓提取物15mg的溶液，用微孔濾膜(00.22拜)過濾至澄明，高壓滅菌，無菌分裝於安瓿中，每瓶2ml，即得。實施例7(重樓提取物眼膏製備)取重樓的石油醚提取物或乙酸乙酯提取物，按提取物:眼膏基質=1:9的重量比混合研勻；或重樓的正丁醇提取物1份，加5份無菌注射用水研勻，加入眼膏基質補足至50份，研勻。滅菌，分裝入軟膏管中，每支2,5g。其餘項目應符合中華人民共和國藥典2005年版眼膏劑項下。實施例8:重樓提取物的抗麴黴菌活性試驗將所得的六種重樓提取物進行抗麴黴菌活性試驗，方法和結果如下試驗菌株煙麴黴(NO.33772)、黑麴黴(NO.33928)、黃麴黴(NO.33950)、土麴黴(NO.33935)試驗菌準備將各試驗菌株的孢子分別接種在土豆培養基斜面上，36.5土0.5'C培養48h後，傳代。連續培養三代，第四代4'C保存備用。臨用前每支斜面用10ml無菌生理鹽水洗下孢子，用玻璃珠震蕩IOmin打散孢子，無菌脫脂棉濾除菌絲，得各種麴黴菌的孢子母液。一、杯管擴散法測定抗麴黴菌活性1.試驗方法精密稱取重樓的乙醇提取物、石油醚提取物、氯仿提取物、乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物和水提物各4mg，分別溶於5ml二甲亞碸中，再分別加入5ml無菌蒸餾水，配製成濃度均為400μg/ml的六種提取物溶液。再分別用50%的二甲亞碸水溶液作稀釋劑，按對倍稀釋法，將上述六種提取物的400μg/ml溶液分別稀釋成濃度分別為200μg/ml、100μg/ml、50μg/ml、25μg/ml、12.5μg/ml、6.25μg/ml、3.13μg/ml的系列受試樣品溶液。將各種麴黴菌孢子母液按l:100的比例加入50'C左右的土豆固體培養基中，混勻，倒平板，冷卻，放置鋼圈在平板上，分別往鋼圈中加入八種不同濃度的受試樣品溶液各80以50%二甲亞碸水溶液為陰性對照，5ng/ml的兩性黴素B(AmB)的50%二甲亞碸溶液為陽性對照。平板於37r培養箱中培養24h，測定抑菌圈直徑。2.試驗結果陰性對照無抑菌圈，陽性對照抑菌圈直徑為7.88土1.15mm。表l受試樣品溶液抗煙麴黴活性試驗抑菌圈直徑(mm)樣品溶液濃度(ng/ml)400200100502512.56.253.13乙醇提取物13.812.310.78.66.5///石油醚提取物8.97.76.6/////氯仿提取物9.88.77.56.3////乙酸乙酷提取物14.514.112.710.88.16.5//正丁醇提取物14.514.213.111.810.58.66.2/水提取物14.312.910.78.66.5///表2受試樣品溶液抗黑麴黴活性試驗抑菌圈直徑(mm)樣品溶液濃度(pg/ml)400200100502512.56.253.13乙醇提取物13.612.210.68.76.7///石油醚提取物9.07.96.7/////氯仿提取物9.98.97.86.6////乙酸乙酯提取物14.514.412.811.09.17.1//正丁醇提取物14.514.413.512.110.48.66.7/水提取物14.012.610.99.07.1///表3受試樣品溶液抗黃麴黴活性試驗結果樣品溶液濃度(ng/ml)400200100502512,56.253.13乙醇提取物9.28.37.46.4////石油醚提取物7.66.76.0/////氯仿提取物8.47.46.3////乙酸乙酯提取物11.39.98.46.8////正丁醇提取物13.712.110.48,56.7///水提取物8.57.46.2./////表4受試樣品溶液抗土麴黴活性試驗結果樣品溶液濃度(pg/ml)400200100502512.56.253.13乙醇提取物14.514.012.310.18.36.3//石油醚提取物9.38.27.06.0////氯仿提取物11.910.79.27.76.3///乙酸乙酯提取物14.514.312.710.99.27.4//正丁醇提取物14.514.513.111.710.28.66.9/水提取物14.313.111.59.88.06.1//根據上述試驗結果,採用標準曲線法推算各提取物對四種試驗菌株的最小抑菌濃度(MIC)。表5杯管擴散法測定六種重樓提取物對四種試驗菌株的MICMICOg/ml)乙醇提取物石油醚提取物氯仿提取物乙酸乙酯提取物正丁醇提取物水提取物煙麴黴20.6374.9540.539.745.2919.68黑麴黴18.2266.1834.267.924.7715.34黃麴黴35.42119.4673.4832.8418.2583.32土曲霄10.8752.8321.057.064.1311.70二、試管法測定抗麴黴菌活性1.試驗方法以沙氏肉湯為稀釋劑，採用對倍稀釋法，分別將各提取物配製成濃度依次為400jxg/ml、200pg/ml、100pg/mJ、50pg/ml、25pg/ml、12.5jag/ml、6.25|_ig/ml、3.13|_ig/ml的混合藥液。分別取各受試混合藥液0.9ml，分別加入各受試真菌的孢子液0.1ml(各提取物系列溶液的終濃度分別為360pg/ml、180ng/ml、90pg/ml、45pg/ml、22.5pg/ml、11.25tig/ml、5.62ng/ml、2.81pg/ml)，35。C培養48h,肉眼觀察結果。結果記錄，以培養液出現膜狀物或渾濁為"+"，以培養液沒有膜狀物或澄清透明為"一"，以出現"一"結果的最低藥液濃度為該提取物對該菌的MIC值。2.試驗結果-表6試管法測定六種重樓提取物對四種試驗菌株的MICcomplextableseeoriginaldocumentpage7三、結論以上實驗表明，重樓的乙醇提取物、石油醚提取物、氯仿提取物、乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物和水提取物均具有明確的抗麴黴菌活性，它們對煙麴黴、黑麴黴、黃麴黴、土麴黴四種菌株的MIC為4.13119.46ng/ml，均有顯著的抑制生長或殺滅作用。權利要求1.重樓提取物在製備治療或預防煙麴黴引起的疾病的藥物中的應用，重樓提取物佔藥物原料的重量比為10％～100％，藥用載體和/或賦形劑佔藥物原料的重量比為90％～0％。2.重樓提取物在製備治療或預防黑麴黴引起的疾病的藥物中的應用。3.重樓提取物在製備治療或預防黃麴黴引起的疾病的藥物中的應用。4.重樓提取物在製備治療或預防土麴黴引起的疾病的藥物中的應用。全文摘要本發明公開了重樓的六種提取物乙醇提取物、石油醚提取物、氯仿提取物、乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物、水提取物的抗麴黴菌新用途，該六種提取物經杯管擴散法和試管法測定抗麴黴菌活性，結果顯示，該六種提取物對煙麴黴(Aspergillusfumigatus，NO.33772)、黑麴黴(Aspergillusniger，NO.33928)、黃麴黴(Aspergillusflavus，NO.33950)、土麴黴(Aspergillusterreus，NO.33935)有顯著的抑制生長或殺滅作用。文檔編號A61K36/88GK101204498SQ20061009532公開日2008年6月25日申請日期2006年12月22日優先權日2006年12月22日發明者君鄧申請人:西南大學