編碼番茄β－半乳糖苷酶多肽的基因的製作方法

2023-05-03 15:26:16

專利名稱：：編碼番茄β－半乳糖苷酶多肽的基因的製作方法
技術領域：
：本發明涉及編碼多肽的新植物基因家族，所述多肽的特徵在於其水解β-D-半乳糖苷的末端非還原性3-D-半乳糖基殘基的能力。更具體地說，提供得自稱為pZBG2-1-4(在美國臨時申請第60/088,805中稱為pTomβgal4)的cDNA克隆的多核苷酸序列，它編碼稱為β-半乳糖苷酶Ⅱ的特有植物多肽。還提供編碼六種其它同源多肽的cDNA克隆、使用這些cDNA克隆生產本發明β-D-半乳糖苷多肽的方法以及通過使用本發明的多核苷酸或多肽改進果實品質的方法。
背景技術：
：涉及呼吸高峰果實採集後品質的最顯著和最重要的處理是在成熟期間發生的結構、顏色、味道和芳香味的改變。因為結構方面的有害變化對品質和採集後保存期限具有重要影響，所以已經著重研究了與在番茄果實成熟期間發生的硬度損失有關的機制。儘管果實軟化可能與膨壓、解剖學特性和細胞壁完整性的變化有關，但一般認為導致細胞壁完整性喪失的細胞壁分解是關鍵因素。在組成成分和大小方面最明顯的變化發生在細胞壁的果膠部分(參見在Seymour和Gross,1996中的參考文獻)。已知在果實成熟期間發生在細胞壁果膠部分的變化包括可溶性、解聚作用、脫酯化作用增加以及含有側鏈的中性糖的顯著淨損失(Huber,1983；Fischer和Bennett,1991；Seymour和Gross,1996)。最充分特徵鑑定的果膠修飾酶是多聚半乳糖醛酸酶(內切-α1→4-D-聚半乳糖醛酸水解酶；E.C.3.2.1.15；PG)和果膠甲酯酶(E.C.3.1.1.11；PME)。儘管PG和PME在番茄果實成熟期間相對充裕並具有豐富活性，但在轉基因植物中PG(Smith等1988,1990)或PME(Tieman等1992；Hall等1993)基因表達和酶活性被顯著下調的果實仍然發生軟化，儘管稍微延遲。而且，PG在非成熟突變體rin番茄果實中的過量表達沒有造成軟化，即使果膠明顯發生明顯解聚和溶解(Ginvannoni等，1989)。在其它已知的於果實發育期發生的果膠變化之中，最充分特徵鑑定的一個變化是在許多成熟果實的細胞壁中發生的半乳糖基殘基的顯著淨損失(Gross和Sams,1984；Seymour和Gross,1996)。儘管半乳糖基殘基的一些損失可能是由PG的作用間接造成，但β-半乳糖苷酶(外切-β(1→4)-D-吡喃半乳糖苷；E.C.3.2.1.23)是在高等植物中鑑定出的唯一一個能夠直接切割β(1→4)半乳聚糖鍵的酶，並可能在半乳聚糖側鏈損失中起作用(DeVeau等，1993；Carey等，1995；Carrington和Pressey,1996)。尚未在高等植物中鑑定出內切作用的半乳聚糖酶。在成熟期的番茄中，β-半乳糖苷酶活性產物游離半乳糖(Gross,1984)急劇增加，並且叫做β-半乳糖苷酶Ⅱ的特定酶的活性相應增加(Carey等，1995)，這些現象支持β-半乳糖苷酶在成熟期對由細胞壁釋放半乳糖基殘基起作用的觀點。據認為，β-半乳糖苷酶活性對細胞壁代謝重要(Carey等，1995)。通常使用人工底物，諸如對硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷(PNP)、4-甲基傘形基-β-D-吡喃半乳糖苷和5-溴-4-氯-3-吲哚酚-β-D-吡喃半乳糖苷(X-GAL)，檢測β-半乳糖苷酶。然而，顯然β-半乳糖苷酶Ⅱ也具有對天然底物即β(1→4)半乳聚糖的活性(Carey等，1995；Carrington和Pressey,1996；Pressey,1983)。在許多其它果實中已純化和特徵鑑定了β-半乳糖苷酶蛋白，所述果實包括獼猴桃(Ross等，1993)、咖啡(Golden等，1993)、柿子(Kang等，1994)和蘋果(Ross等，1994)。Carey等(1995)能夠從成熟番茄果實中純化出三種以前鑑定的β-半乳糖苷酶(Pressey,1983)，但只有一種(β-半乳糖苷酶Ⅱ)對β(1→4)半乳聚糖有活性。雖然他們能夠鑑定出推定的β-半乳糖苷酶cDNA克隆，但所述cDNA的推斷的胺基酸序列沒有一個匹配所述β-半乳糖苷酶Ⅱ蛋白的氨基末端序列。儘管已經純化了存在於成熟期番茄(LycopersiconesculentumMill.)果實中並能夠降解番茄果實半乳聚糖的β-半乳糖苷酶Ⅱ蛋白，但仍難以獲得相應基因的克隆。利用幾種方法已經實現了對植物基因表達的改進。分子生物學家可以由一系列降低或增加基因表達或改變特定基因的空間和時間表達的已知方法中選擇。例如，已經利用特異性反義RNA或部分(截短的)有義RNA的表達降低植物中不同靶基因在植物中的表達(如Bird和Ray,1991,BiotechnologyandGenetic-EngineeringReviews9:207-227所論述)。這些技術包括將用來表達反義或有義RNA的合成基因加入到植物的基因組中。它們已成功用於向下調節與番茄果實的發育和成熟有關的一系列個體基因的表達(Gray等，1992,PlantMolecularBiology,i9:69-87)。還開發了增加靶基因表達的方法。例如可以將用來表達含有所述靶基因的完全編碼區的RNA的另外的基因加入到所述植物的基因組中，以「過量表達」所述基因產物。已知各種其它改變基因表達的方法；例如使用可變調節序列。以上提及的每個參考文獻的全部公開內容都通過引用完整結合到本文中。因此存在一種需要即克隆β-半乳糖苷酶Ⅱ和相關多肽的基因，並使用已知的改變植物基因表達的方法從而提供改變果實品質的方法，尤其是通過改變細胞壁，從而直接影響所述果實成熟的方法。發明概述本發明是基於對得自編碼β-半乳糖苷酶的基因家族的cDNA克隆的新DNA序列的發現。在圖1A、B中顯示了基於對本發明DNA序列的共有胺基酸序列同一性的系統樹。在圖2中顯示了5個cDNA克隆和2個逆轉錄酶PCR(RT-PCR)克隆，本文稱為TBG1、TBG2、TBG3、TBG4、TBG5、TBG6和TBG7，它們分別具有稱為SEQIDNO1-7的核苷酸序列，經鑑定它們與其它已知β-半乳糖苷酶具有高度共有序列同一性。對應的胺基酸序列本文分別稱為SEQIDNO8-16，並示於圖2和3。SEQIDNO1-7的核苷酸序列收錄於GenBank，獲得以下相應的收錄號SEQIDNO:1TGB1AF0238471997年9月10日收錄SEQIDNO:2TGB2AF1544201999年5月19日收錄SEQIDNO:3TGB3AF1544211999年5月20日收錄SEQIDNO:4TGB4AF0203901997年8月21日收錄SEQIDNO:5TGB5AF1544231999年5月20日收錄SEQIDNO:6TGB6AF1544241999年5月20日收錄SEQIDNO:7TGB7AF1544221999年5月20日收錄在以下的整個論述中，應當理解無論在本發明說明書中何處論及TBG4,TBG1-3和5-7也包括在該敘述中，除非另有說明。還提供一種方法，該方法通過克隆編碼本發明蛋白(諸如β-半乳糖苷酶Ⅱ)的cDNA(例如pZBG2-1-4)，或通過由基因組DNA獲得所述DNA序列，或通過用所述cDNA序列作為引導序列從頭開始合成DNA序列，從而提供本發明的DNA序列。還提供改變細胞壁代謝的方法，該方法包括改變至少一種半乳糖苷酶的活性並因此改變所述果實的品質。本發明還提供DNA構建物，它包括在植物中有效的轉錄起始區控制下的部分或全部示範性β-半乳糖苷酶DNA序列，以使該構建物可以在植物細胞中產生RNA。還發現了與編碼β-半乳糖苷酶的基因的表達相關的增強子/啟動子。本發明還涉及重組載體(它包括本發明的分離的核酸分子)、包含所述重組載體的宿主細胞，以及產生這樣的載體和宿主細胞的方法和使用它們通過重組技術產生β-半乳糖苷酶多肽或肽的方法。本發明還提供包含本發明的DNA構建物的植物細胞；由其產生具有改變的β-半乳糖苷酶基因表達的植物；和由這樣的植物產生的種子。本發明的β-半乳糖苷酶Ⅱ蛋白已顯示了其在導致組織完整性喪失和果實軟化的細胞壁分解中的酶活性。所述β-半乳糖苷酶Ⅱ蛋白可能還涉及細胞壁代謝，細胞壁代謝可能與細胞延長和/或擴張有關，並因此與植物生長和發育有關。β-半乳糖苷酶可以通過水解細胞壁中的半乳糖使成熟開始和/或發展，因為半乳糖可能涉及單獨或與非結合N-聚糖一起刺激乙烯產生。本發明的β-半乳糖苷酶可能涉及在果實成熟期間通過降解葉綠體膜半乳糖脂將葉綠體(綠色-葉綠素)轉變為色質體(紅色-番茄紅素)。預期由示於圖2的核苷酸序列代表的基因家族編碼一組相似的酶，它們具有相同類型的水解活性，但具有不同的組織和/或底物特異性或細胞區室類型。本發明的β-半乳糖苷酶Ⅱ蛋白以及其它由示於圖2的核苷酸序列編碼的蛋白可用來製備果膠或其它得自細胞壁的具有降低的半乳糖基含量的聚合物，用於需要較低或較高交聯或粘度特性的生物膜和溶液(例如澄清的果汁)。本發明還提供β-半乳糖苷酶用作酶混合物組成成分，用於分離原生質體。附圖簡述圖1A和1B顯示了在番茄β-半乳糖苷酶克隆TGB1-7和其它已知植物β-半乳糖苷酶多肽之間的基於共有胺基酸序列同一性的系統樹。圖2顯示本發明的7個β-半乳糖苷酶基因(TGB1、TGB2、TGB3、TGB4、TGB5、TGB6和TGB7)的cDNA序列[分別為SEQIDNO:1-7]。圖3顯示番茄果實cDNA克隆TGB1、TGB2、TGB3、TGB4、TGB5、TGB6和TGB7的推斷胺基酸序列[分別為SEQIDNO:8-16]和各種植物β-半乳糖苷酶cDNA克隆的推斷胺基酸序列的多重序列對比。圖4顯示對在各種植物組織(花、葉、根和莖)中表達的TBG進行RNA印跡分析的放射自顯影圖。圖5顯示對在處於不同發育階段的果實組織中表達的TBG進行RNA印跡分析的放射自顯影圖。圖6顯示對在果實組織(青熟(maturegreen)或轉換期(turningstage)果實的果皮、外果皮(outerpericarp)、內果皮(innerpericarp)和子房室(locular))中表達的TBG進行RNA印跡分析的放射自顯影圖。圖7顯示對在正常和突變果實組織中表達的TBG進行RNA印跡分析的放射自顯影圖。圖8顯示對在乙烯處理的青熟果實組織中表達的TBG進行RNA印跡分析的放射自顯影圖。圖9顯示對酵母表達的TBG4的蛋白質印跡分析。圖10顯示對在大腸桿菌(E.coli)中表達的pZBG2-1-4的β-半乳糖苷酶活性的檢測。圖11A-E(1-4)顯示包含抑制TBG4mRNA的反義構建物的番茄植物果實和親代系果實的結構檢測的對比結果。圖12A-B顯示對在包含TBG4反義構建物的轉基因果實中表達的TBG4的RNA印跡分析。圖13顯示用於轉化植物和以反義方向表達TBG4(pZBG2-1-4)的雙元構建物(Binaryconstruct)。發明詳述下文的詳細描述涉及本發明的優選實施方案，並意欲說明每個本發明其它DNA序列。本發明提供含有編碼β-半乳糖苷酶多肽(尤其是具有示於圖2的胺基酸序列的β-半乳糖苷酶Ⅱ多肽)的多核苷酸的分離的核酸分子。本發明的示範性β-半乳糖苷酶ⅡcDNA克隆的DNA序列由編碼β-半乳糖苷酶Ⅱ的cDNA克隆pZBG2-1-4測定，收錄於GenBank，獲得的收錄號為AF020390。不是所有的β-半乳糖苷酶都對提取的細胞壁物質由包含β(1→4)-D-半乳聚糖的細胞壁聚合物中經釋放半乳糖具有體外活性。已經表明，由示範性β-半乳糖苷酶Ⅱ克隆pZBG2-1-4表達的多肽具有β-半乳糖苷酶活性和外切半乳聚糖酶(exogalactinase)活性。如圖2所示，本發明的示範性β-半乳糖苷酶Ⅱ蛋白和由以下cDNA克隆推斷的胺基酸序列具有序列同源性，所述cDNA克隆為β-半乳糖苷酶cDNA克隆TBG2-7和蘆筍(收錄號P45582)、蘋果(收錄號P48981)和康乃馨(收錄號Q00662)果實的cDNA克隆，本發明的示範性β-半乳糖苷酶Ⅱ蛋白還和分離自成熟『AilsaCraig』果實的番茄β-半乳糖苷酶cDNA克隆(命名為pTomβgall，獲得的收錄號為P48980)的先前公開序列的β-半乳糖苷酶cDNA克隆序列具有序列同源性(Carey等，1995)。本發明人在此公開的TBG1克隆(收錄號AF023847)的ORF與先前由Carey等描述的cDNA幾乎相同。如圖2所示，在所有公開的植物β-半乳糖苷酶的7個克隆(TBG1-7)和其它植物β-半乳糖苷酶中都具有高共有推斷序列同一性。對所述資料庫的BLAST檢索也表明，在植物β-半乳糖苷酶與哺乳動物和真菌β-半乳糖苷酶的域之間存在明顯的共有序列同一性，但用細菌β-半乳糖苷酶檢測幾乎沒有共有序列同一性。如在圖1中所示，TBG1和TBG3具有高共有胺基酸同一性。TBG4也非常類似於TBG1和3。TBG2和7的胺基酸序列是獨特的，因為胺基酸插入的幾個區似乎遍及其序列(圖3)。核酸分子除非另有說明，否則通過測序本文的DNA分子確定的所有核苷酸序列都使用基於PCR的雙脫氧核苷酸終止法和ABI自動DNA測序儀(諸如AppliedBiosytems,Inc.,FosterCity,CA的373型測序儀)測定，而所有的由本文測定的DNA分子編碼的多肽的胺基酸序列都通過翻譯如上測定的DNA序列推算。因此，如本領域對通過此自動方法測定任何DNA序列的了解，本文測定的任何核苷酸序列可能包含一些錯誤。通過自動裝置測定的核苷酸序列與所測序的DNA分子的實際核苷酸序列通常具有至少約90％同一性，更通常至少約95％至至少約99.9％同一性。通過其它方法可以更精確的測定實際序列，包括在本領域廣為人知的手工DNA測序法。本領域還知道，與實際序列相比，在所測定的核苷酸序列中單個的插入或缺失將在翻譯所述核苷酸序列時產生移碼，使得推算的由所測定的核苷酸序列編碼的胺基酸序列與由所測序的DNA分子實際編碼的胺基酸序列從此插入或缺失點開始完全不同。所述核酸分子或多核苷酸的「核苷酸序列」對於DNA分子或多核苷酸而言意指脫氧核糖核苷酸序列，而對於RNA分子或多核苷酸而言意指相對應的核糖核苷酸序列(A、G、C和U)，其中在特定脫氧核糖核苷酸序列中的每個胸腺嘧啶脫氧核糖核苷酸(T)都置替換為尿嘧啶核糖核苷酸(U)。可以使用本文提供的信息，諸如示於圖2的示範性核苷酸序列[SEQIDNO:4]，使用標準克隆和篩選方法，諸如那些使用mRNA作為原料克隆cDNA的方法，獲得編碼β-半乳糖苷酶Ⅱ多肽的本發明核酸分子。在圖2[SEQIDNO:4]中描述的作為本發明實例的核酸分子發現於得自『Rutgers』番茄植物的花端著色(breaker)、轉換和粉紅色果實的果皮的cDNA文庫。pZBG2-1-4的cDNA插入片段的全序列可由GenBank(AF020390)獲得並示於圖2[SEQIDNO:4]。該cDNA插入片段為2532個核苷酸(nt)長，並包含單一的長可讀框(ORF)，估計它在位於核苷酸64的框內的第一個ATG開始，並在核苷酸2238的TAA終止。此ORF編碼724個胺基酸長的79kD的蛋白。推斷的pZBG2-1-4的胺基酸序列和在資料庫中所有公開的植物β-半乳糖苷酶序列(圖1A、B)具有明顯的胺基酸同一性。當將每個β-半乳糖苷酶基因的完整ORF與pZBG2-1-4對比時，共有序列同一性就番茄pTomβgal1(P48980)而言約為64％，就蘋果(P48981)而言約為67.6％，就蘆筍(P45582)而言約為63％，而就康乃馨(Q00662)而言約為55％。一般技術人員應當意識到，由於上文論述的可能出現的測序錯誤，包含約724個胺基酸並由所收錄的cDNA編碼的實際的完全β-半乳糖苷酶Ⅱ多肽可能略短或略長。更一般地說，實際的可讀框可能在±20個胺基酸的範圍內的任何位置，更可能是在±10個胺基酸的範圍內，由這二者中的任一個預測它為示於圖2[SEQIDNO:4]的N端的第一個蛋氨酸密碼子。在任何情況下，如下文的進一步論述，本發明進一步提供在完全多肽的N端缺失各種殘基的多肽，包括在本文所述的β-半乳糖苷酶Ⅱ多肽的N端缺少一個或幾個胺基酸的多肽。前導序列和成熟序列對pZBG2-1-4的推斷胺基酸序列的分析表明，基於疏水性前導序列、前導序列切割位點和三個可能的N-糖基化位點分泌的可能性很高。使用PSORT(版本6.4,Nakai和Kanehisa,1992，通過引用結合到本文中)和SignalP(版本1.1,Nielsen等，1997，通過引用結合到本文中)程序推算，所述ORF包含應在分別於位置23和24的丙氨酸和絲氨酸殘基之間被切割的疏水性前導序列，而所述成熟多肽具有胞外定位。所述成熟多肽在編號282、459和713的天冬醯胺處包含三個可能的N-糖基化位點，然而在位置713的天冬醯胺由於在位置714的脯氨酸而不大可能被糖基化。估測未糖基化成熟多肽的分子量為75kD,pⅠ為8.9。因此，本發明的完全β-半乳糖苷酶Ⅱ蛋白的胺基酸序列包括前導序列和成熟蛋白，如圖3[SEQIDNO:4]所示。更具體地說，本發明提供編碼成熟形式的β-半乳糖苷酶Ⅱ蛋白的核酸分子。因此，按照信號假說，分泌性蛋白具有由所述完全多肽切下的信號或分泌前導序列，以產生分泌性「成熟」形式的蛋白。在某些情況下，對分泌性蛋白的切割不完全一致，這產生了兩種或兩種以上的成熟蛋白。此外，很早就知道分泌性蛋白的切割特異性最終通過完全蛋白的一級結構測定，即它是在多肽的胺基酸序列中固有的。所以，本發明提供編碼成熟β-半乳糖苷酶Ⅱ多肽的核苷酸序列，所述多肽具有由示於圖2[SEQIDNO:4]並收錄於GenBank(收錄號AF20390)的cDNA編碼的胺基酸序列。所述「具有由示於圖2[SEQIDNO:4]的cDNA克隆編碼的胺基酸序列的成熟β-半乳糖苷酶Ⅱ多肽」是指通過在植物細胞中表達由示於圖2[SEQIDNO:4]並收錄於GenBank(收錄號AF20390)的克隆的cDNA序列編碼的完全可讀框生產的成熟形式的β-半乳糖苷酶Ⅱ蛋白。本發明的示範性β-半乳糖苷酶ⅡcDNA(TBG4)已經在大腸桿菌菌株XLIblueMR(1acZ)(Stratagene,LaJolla,CA)中表達，如下文所述(參見實施例)。對表示本發明其它β-半乳糖苷酶基因的cDNA克隆的推斷胺基酸序列的分析也揭示了可讀框，並在某些情況下顯示分泌所編碼蛋白的可能性很高。推測所有的全長cDNA克隆都具有信號序列(圖2)。使用兩個預測程序SignalP和PSORT，由兩個程序預測都顯示TBG4是分泌性的。用SignalP預測顯示TBG1、2和3具有可切割的信號序列，但PSORT預測TBG1、2和3具有不可切割的信號序列。利用PSORT顯示TBG7靶向葉綠體。基於利用所述程序PSORT(版本6.4)和SingalP(版本1.1)預測的疏水性前導序列的存在，對所述7個克隆中的每一個的具體觀察如下TBG1起始密碼子位於306[SEQIDNO:1],ORF=835個胺基酸[SEQIDNO:8]，信號序列位於1-24；TBG2起始密碼子未確定[SEQIDNO:2],ORF=888個胺基酸[SEQIDNO:9]，信號序列位於1-25；TBG3起始密碼子位於32[SEQIDNO:3],ORF=838個胺基酸[SEQIDNO:10]，信號序列位於1-22；TBG5起始密碼子未確定[SEQIDNO:5],ORF=251個胺基酸[SEQIDNO:12]，信號序列未確定；TBG6起始密碼子未確定[SEQIDNO:6],ORF=248個胺基酸[SEQIDNO:13]，信號序列未確定；TBG7起始密碼子位於104[SEQIDNO:7],ORF=870個胺基酸[SEQIDNO:14]，信號序列位於1-35。還使用程序DNAsis對所述7個克隆的推斷的胺基酸序列進行分析，在表Ⅰ中概述了預測的分子量、細胞尋靶、pⅠ和潛在的N聯糖基化位點。表1．番茄β-半乳糖苷酶(TBG)cDNA序列數據。克隆5個全長和2個部分長度的cDNA並測序。所述DNA和推定的胺基酸序列數據如下克隆mRNA(kb)kDpⅠN聯靶TBG13.290.86.22ER/OUTTBG23.097.06.26PMTBG32.890.58.21ER/OUTTBG42.677.98.93OUTTBG5～3TBG6～3TBG73.093.38.06CHLORN聯=可能的N聯糖基化位點；ER=內質網；OUT=分泌的；PM=限於質膜；CHLOR=葉綠體正如所示，本發明的核酸分子可以是RNA形式，諸如mRNA,或是DNA形式，包括例如通過克隆獲得的或合成產生的cDNA和基因組DNA。所述DNA可以是雙鏈或單鏈。單鏈DNA或RNA可以是編碼鏈，也叫做有義鏈，或者可以是非編碼鏈，也叫做反義鏈。所述「分離的」核酸分子是指已經脫離其天然環境的核酸分子DNA或RNA。例如對於本發明來說，包含於載體中的重組DNA分子被認為是分離的。更多分離的DNA分子的實例包括保持在異源宿主細胞中的重組DNA分子或在溶液中的(部分或大致)純化的DNA分子。分離的RNA分子包括本發明的DNA分子的體內或體外RNA轉錄本。按照本發明的分離的核酸分子進一步包括所述合成產生的分子。本發明的分離的核酸分子包括包含可讀框(ORF)的DNA分子，所述ORF的起始密碼子位於示於圖2的核苷酸序列[SEQIDNO:4]的位置64。還包括包含成熟β-半乳糖苷酶Ⅱ蛋白的編碼序列的DNA分子，所述編碼序列示於圖2[SEQIDNO:4]的位置135-2532。另外，本發明的分離的核酸分子包括包含一種序列的DNA分子，所述序列大體上不同於以上描述的那些序列，但由於遺傳密碼的簡併性仍可編碼所述β-半乳糖苷酶Ⅱ蛋白。當然，所述遺傳密碼和種特異性適宜密碼子在本領域是眾所周知的。因此，產生上述的簡併變異體，例如最佳化密碼子表達於特定宿主(例如將植物mRNA的密碼子改變為諸如大腸桿菌的細菌宿主優選的那些密碼子)，對於本領域的技術人員而言應是常規操作。最好是，該核酸分子將編碼由上述收錄cDNA克隆編碼的成熟多肽。本發明進一步提供具有示於圖2的核苷酸序列[SEQIDNO:4]的分離的核酸分子或具有上述序列的互補序列的核酸分子。這樣的分離分子，尤其是DNA分子，通過和染色體原位雜交用作基因作圖的探針，以及例如通過RNA印跡分析用於檢測所述β-半乳糖苷酶Ⅱ基因在植物組織中的表達。本發明進一步涉及編碼本文所述的部分核苷酸序列的核酸分子以及涉及本文所述的分離的核酸分子的片段。具體而言，本發明提供具有代表圖2[SEQIDNO:4]的部分的核苷酸序列的多核苷酸，所述核苷酸序列包括圖2[SEQIDNO:4]的位置1-2538。另外，本發明提供具有涉及圖2[SEQIDNO:4]的多個部分(extensiveportions)的核苷酸序列的另外的核酸分子，所述核苷酸序列已經由以下的相關cDNA克隆確定如圖3所示的TBG1-3和TBG5-7,SEQNO1-3和5-7。另一方面，本發明提供包含一種多核苷酸的分離的核酸分子，所述多核苷酸在嚴格雜交條件下與上述的本發明核酸分子(例如示於圖2[SEQIDNO:4]的cDNA克隆)中的一部分多核苷酸雜交。所述「嚴格雜交條件」是指在溶液中(包含50％甲醯胺、5×SSC(150mMNaCl,15mM檸檬酸三鈉)、50mM磷酸鈉(pH7.6)、5×Denhardt氏溶液、10％硫酸葡聚糖和20μg/ml剪切變性的鮭精DNA)於42℃過夜溫育，接著在約65℃以0.1×SSC漂洗濾膜。正如所述，編碼β-半乳糖苷酶Ⅱ多肽的本發明核酸分子包括但不限於，單獨編碼所述成熟多肽的胺基酸序列的核酸分子；所述成熟多肽的編碼序列和另外的序列(諸如編碼約1-23胺基酸的前導序列的序列)，如前蛋白或蛋白原或前蛋白原序列；所述成熟多肽的編碼序列有或沒有上述另外的編碼序列。還發現了與編碼β-半乳糖苷酶的基因表達相關的增強子/啟動子。本發明人已特徵鑑定了TBG2mRNA的表達形式，並已克隆了λ基因組cDNA。TBG2在果實成熟開始之前表達並在整個成熟期中保持在同一水平上。已經發現TBG2在所有的果實組織中表達，並已經發現其是果實特異性的。試驗已經顯示TBG2不受乙烯的影響。在開花期後正常時序時間TBG2表達於成熟突變體rin、nor和Nr。所發現的啟動子對在有義或反義方向表達任何基因均有用，尤其是在番茄果實中，在所有的番茄果實組織中表達都在成熟過程之前開始並持續整個成熟過程。所述啟動子還可以用於在成熟突變體rin、nor和Nr中表達任何基因，而不需要用外來的乙烯氣體處理所述果實。變異體和突變體多核苷酸本發明進一步涉及本發明核酸分子的變異體，它編碼所述β-半乳糖苷酶Ⅱ蛋白的部分、類似物或衍生物。變異體可以天然產生，諸如天然等位基因變異體。所述「等位基因變異體」是指在生物體的染色體上佔據特定基因座的基因的幾種可選形式之一。GenesⅡ,Lewin,B.編輯，JohnWileySons，紐約(1985)。可以使用本領域已知的誘變技術產生非天然產生的變異體。這樣的變異體包括通過核苷酸置換、缺失或添加產生的變異體。所述置換、缺失或添加可以包括一個或幾個核苷酸。所述變異體可以在編碼區、非編碼區或這二者中改變。在所述編碼區的改變可以產生保守或非保守的胺基酸置換、缺失或添加。在這其中特別優選的是沉默置換、添加和缺失，它們不改變所述β-半乳糖苷酶Ⅱ蛋白或其部分的特性和活性。在這點上還特別優選保守置換。最高度優選的是編碼具有示於圖2的胺基酸序列的成熟蛋白核酸分子(如pZBG2-l-4)或由所收錄的cDNA克隆編碼的成熟β-半乳糖苷酶Ⅱ胺基酸序列的核酸分子。進一步的實施方案包括含有一種多核苷酸的分離的核酸分子，所述多核苷酸和選自以下的多核苷酸具有至少90％、更優選至少95％、96％、97％、98％或99％核苷酸序列同一性(a)編碼具有示於圖2[SEQIDNO:4]的完全胺基酸序列的β-半乳糖苷酶Ⅱ多肽的核苷酸序列；(b)編碼具有示於圖2[SEQIDNO:4]的成熟β-半乳糖苷酶Ⅱ多肽的核苷酸序列；(c)與以上(a)或(b)中的任一核苷酸序列互補的核苷酸序列。載體和宿主細胞本發明還涉及包括本發明的分離的DNA分子的載體、用所述重組載體進行基因工程操作的宿主細胞以及通過重組技術產生β-半乳糖苷酶Ⅱ多肽或其片段。所述載體可以是例如噬菌體、質粒、病毒或反轉錄病毒載體。反轉錄病毒載體可以是複製型或複製缺陷型。在後一種情況下，病毒繁殖通常只在互補型宿主細胞中發生。所述多核苷酸可以連接至包含選擇標記的載體，用於在宿主中繁殖。一般來說，在沉澱(諸如磷酸鈣沉澱)中或在具有帶電脂質的複合物中引入質粒載體。如果所述載體是病毒，則可以使用合適的包裝細胞系將其體外包裝，然後轉導入宿主細胞中。所述DNA插入片段應當操作性連接至合適的啟動子，諸如噬菌體λPL啟動子、大腸桿菌lac、trp、phoA和tac啟動子、SV40早期和晚期啟動子和反轉錄病毒LTR啟動子，在此僅舉幾個例子。其它適合的啟動子是熟練技術人員已知的。所述表達構建物將進一步包含轉錄起始位點、終止位點以及在轉錄區中的用於翻譯的核糖體結合位點。由所述構建物表達的轉錄本的編碼部分最好包括位於要翻譯的多肽的開始部分的翻譯起始密碼子和在該多肽末端的合適位置的終止密碼子(UAA、UGA或UAG)。正如所述，所述表達載體最好包括至少一個選擇標記。這樣的標記包括用於真核生物細胞培養的二氫葉酸還原酶、G418或新黴素抗性基因和用於在大腸桿菌和其它細菌中培養的四環素、卡那黴素或氨苄青黴素抗性基因。合適宿主的代表性實例包括但不限於，細菌細胞，諸如大腸桿菌、StrepZBG2-1-4yces和鼠傷寒沙門氏桿菌(Salmonellatyphimurium)細胞；真菌細胞，諸如酵母細胞；昆蟲細胞，諸如果蠅屬S2細胞和草地夜蛾Sf9細胞；動物細胞，諸如CHO、COS、293和Bowes黑素瘤細胞；和植物細胞。適於上述宿主細胞的培養基和培養條件是本領域已知的。優選用於細菌的載體包括由QIAGEN,Inc.，同上，獲得的pQE70、pQE60和pQE-9；可由Stratagene獲得的pBS載體、Phagescript載體、Bluescript載體、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A；以及可由Pharmacia獲得的ptrc99a、pKK233-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5。優選的真核生物載體是可由Stratagene獲得的pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1和pSG；以及可由Pharmacia獲得的pSVK3、pBVP、pMSG和pSVL。其它合適的載體對技術熟練人員而言將是顯而易見的。可以通過磷酸鈣轉染、DEAE-葡聚糖介導的轉染、陽離子脂質介導的轉染、電穿孔、轉導、感染或其它方法實現將所述構建物引入到所述宿主細胞中。在許多標準實驗室手冊中都描述了這些方法，諸如Davis等，BasicMethodsInMolecularBiology(1986)。實施例使用標準培養方法在溫室中培育番茄載培品種Rutgers(LycopersiconesculentumMill.,cv.『Rutgers')植株。所述成熟突變體成熟抑制劑(rin)、非成熟(nor)和永不成熟(Nr)(Tigchelaar等，1978)都出自所述『Rutgers』。在開花時對花做標記，而果實就按照開花後的天數(dpa)或基於如前所述的其成熟期的表面顏色採集(Mitcham等，1989)，該文獻的全部公開內容在此通過引用完整結合到本文中。關於基因表達研究，由溫室培育的植物採集各種葉、花和莖組織，並由基礎組織培養基中培育的幼苗採集根，該幼苗在種子萌芽後培育4周。RNA提取於溫室採集果實後立即對其進行以下加工在冰上冷卻、切除各種組織並使它們在液氮中凍結。使用臼和杵磨碎組織樣品，並儲存在-80℃。使用在Verwoerd等(1989)中描述的方法提取RNA。使用寡聚物(dT)柱(Pharmacia,Piscataway,NJ)由總的RNA中純化聚腺苷酸化RNA。通過使用雙光束分光光度計檢測A260定量RNA。RT-PCR基於我們在蘋果(收錄號P48980)、蘆筍(P445582)和康乃馨(Q00662)的β-半乳糖苷酶cDNA克隆之間發現的最高共有推斷胺基酸序列同一性，設計簡併引物。用於第一個反應的兩個引物是BG5＇E1(WSNGGNWSNATHCAYTAYCC)和BG3＇E(CCRTAYTCRTCNADNGGNGG)。使用BG5＇Ⅰ1(ATHCARACNTAYGTNTTYTGG)和BG3＇E對第一個反應的產物進行第二個反應。所述引物序列的簡併密碼是N=a+t+c+g；H=a+t+c；B=t+c+g；D=a+t+g；V=a+c+g；R=a+g；Y=c+t；M=a+c；K=t+g；S=c+g；和W=a+t。所述5＇和3＇引物分別對應於所述蘋果克隆的胺基酸72-78和321-315。使用AmpliTaqDNA聚合酶(PerkinElmer,Norwalk,CT)和標準PCR條件，使用由以下所述的第一個cDNA文庫(Ausubel等，1987)製得的cDNA作為模板，進行擴增。在瓊脂糖凝膠中分離PCR產物，純化預期大小(約750bp)的片段，將其克隆入pCRscript(Stratagene,LaJolla,CA)中並測序。cDNA文庫構建兩個cDNA文庫。第一個包含分離自『Rutgers'植物的花端著色、轉換和粉紅色的果實果皮的聚腺苷酸化(poly(A))RNA。根據生產商的ZAP-cDNAGigapackⅡGold克隆試劑盒(Stratagene)的說明書精確地進行cDNA合成和文庫構建，該說明書的全部公開內容通過引用完整結合到本文中。使用多脫氧胸苷酸(poly(dT))引物引發cDNA第一鏈的合成，並使用EcoRⅠ和XhoⅠ限制位點將插入片段直接克隆到Uni-ZapXR載體中。第二個文庫包含分離自『Rutgers』植物的生綠色(immaturegreen)、青熟、花端著色、轉換、粉紅色、紅色-成熟和過熟果實的所有果實組織(種子除外)的聚腺苷酸化RNA。根據生產商對用於cDNA合成和·克隆的SuperScriptλ系統(GibcoBRL,Gaithersburg,MD)的說明書精確地進行cDNA合成和文庫構建。使用寡脫氧胸苷酸引物引發cDNA第一鏈的合成，並使用SalⅠ和NotⅠ限制位點將cDNA插入片段直接克隆到·ZipLox克隆載體中。擴增兩個文庫並使用生產商提供的宿主菌株按照其說明書保持。使用一種所述克隆(RT-PCR2-1)以低嚴格性(在無甲醯胺的情況下於45℃雜交，並用0.2×SSC於42℃最後漂洗)由番茄果實cDNA文庫中篩選106噬菌斑。鑑定30個陽性cDNA克隆並部分測序。對所述RT-PCR和cDNA克隆的完全測序和特徵鑑定揭示了7種可能的獨特的β-半乳糖苷酶基因。DNA和RNA凝膠印跡分析使用每個全長克隆的3＇UTR和RT-PCR克隆作為探針對限制酶消化的基因組DNA進行DNA分析。基本上如在Smith和Fedoroff(1995)中的描述進行DNA凝膠印跡分析，除了用於每次消化的是3μg基因組DNA。對應於所述克隆的基因似乎作為單一拷貝存在(未提供數據)。上述探針使用重組近交系的RFLP用於所述7個基因中的6個的作圖，基因座名稱和圖位示於表Ⅱ(JamesGioviannone,TexasAMUniversity，個人通信)。表Ⅱ．TBG基因座圖位。使用重組近交系的RFLP通過DNA分析對基因作圖基因染色體圖位TBG112★IL12-2、IL12-3的重疊TBG29IL9-3TBG33IL3-5TBG412★IL12-2、IL12-3的重疊TBG511IL11-3TBG62IL2-4、IL2-5的重疊TBG7無RFLP★TBG1和4是鬆散連鎖在甲醛/Mops瓊脂糖凝膠中分離總的RNA(20μg/泳道)，轉移到Hybond-N+尼龍膜(Amersham,ArlingtonHeights,IL)，通過於80℃溫育2小時固定，在雜交培養箱(RobbinsScientific,Sunnyvale,CA)中使用Church和Gilben(1984)描述的緩衝液過夜雜交，最終的漂洗嚴格條件為含0.2％SDS的0.1×SSC、65℃，並基本按照Ausubel等(1987)所述放射自顯影。使用RNA梯標準品(GibcoBRL)測定所述RNA的長度。使用用32p-dATP作為標記的隨機引物試劑盒(BoehringerMannheim,Indianapolis,IN)合成探針。使用每個全長克隆的3＇UTR和RT-PCR克隆作為探針合成的模板進行RNA分析。至於加樣量對照，剝離RNA印跡並使用大豆26SrDNA片段(Turano等，1997)在降低雜交和漂洗嚴格條件下再探測RNA印跡。對於所有的雜交，將32p-(dATP)標記的探針稀釋至1-2×106dpm/mL。以上參考文獻的全部公開內容都通過引用完整結合到本文中。序列分析使用基於PCR的雙脫氧核苷酸終止法和ABI自動測序儀(AppliedBiosystems,Fostercity,CA)在Iowa州立大學測序中心(Ames,IA)進行測序。通過引物步移(primerwalking)對cDNA插入片段的兩條鏈進行測序。使用BLAST搜索(Altschul等，1990)對核苷酸序列和推斷的胺基酸序列與所述資料庫進行對比。使用DNAStrider1.2(Marck,1988)和MacDNAsis(Hitachi,SanBruno,CA)軟體分析序列數據並進行對比。以上參考文獻的全部公開內容都通過引用完整結合到本文中。RNA印跡分析組織特異性表達進行RNA印跡分析，以揭示所述β-半乳糖苷酶基因的RNA具有(如果有的話)果實特異性表達模式。除了TBG2以外，在非果實組織中檢測到所有克隆的轉錄本(圖4)。在所有的測試組織中都檢測到TBG1、4、5和6的轉錄本。在根和莖組織中檢測到低水平的TBG3轉錄本，而在花和莖組織中檢測到TBG7轉錄本。在果實中的時間表達模式使用提取自除種子之外的所有果實組織的RNA檢測所述7個基因在果實組織中的時間表達模式。在果實發育的幾個階段檢測所有7個基因的轉錄本(圖5)。TBG1和3具有相似的表達模式，並在花端著色至過熟階段的整個過程中都檢測到它們的轉錄本。TBG2具有獨特的表達模式，由30dpp至過熟階段檢測到其恆定水平的轉錄本。TBG4表達模式類似於TBG1和3，但不同之處在於轉錄本水平在轉換階段明顯較高。TBG5在發育的成熟階段具有和TBG4相似的表達模式，但在果實發育的所有較早期的過程中也檢測到TBG5轉錄本。TBG6的表達模式令人關注，只是在所測試的所有成熟前階段檢測到其高水平的轉錄本。TBG7也具有獨特的表達模式，在所測試的所有階段中檢測到的其轉錄本水平都非常低，而在10dpp和過熟階段檢測到中等水平的轉錄本。在果實中的空間表達模式還進行RNA印跡分析，以測定在各種果實組織中的轉錄物累積。因為所述TBG基因的時間表達模式不同，所以使用青熟階段和轉換階段果實進行RNA提取(圖6)。在所測試的所有青熟果實組織中都檢測到TBG2和TBG6轉錄本。TBG7轉錄本存在於所測試的所有果實組織中，子房室除外。在由所有轉換階段果實組織中提取出的RNA樣品中都檢測到TBG1和TBG4轉錄本。值得注意的是，TBG4轉錄本在果皮中更加豐富。TBG3和TBG5的表達模式是獨特的，分別除了外果囊皮和子房室之外，在所有的組織中都檢測到它們的轉錄本。對比正常和突變果實的表達為了更好地了解所述TBG產物的潛在作用和轉錄調節機制，使用來自成熟突變體rin、nor和N′的果實組織進行RNA分析。該分析是重要的，因為它可能獲得初步確定任一所述TBG可能具有任何潛在的成熟和/或軟化作用的線索。突變果實的RNA分析的結果提示，在突變果實組織中TBG1、2、3、5和7的轉錄調節未受影響，它們的轉錄本以正常的時序(dpp)模式存在(圖7)。然而在所述突變果實中TBG4和6轉錄本的豐度是不同的。在N′果實組織中未檢測到TBG4轉錄本，而在rin和nor中檢測到比野生型果實組織低得多的TBG4轉錄本水平。通常在果實發育的早期過程中檢測到高水平的TBG6轉錄本，但在青熟階段(40-42dpp)之後檢測不到TBG6轉錄本。在所有三種突變體的果實中TBG6轉錄本甚至持續至50dpp。用乙烯調節轉錄使用突變體和野生型果實進行的RNA分析表明，乙烯可能上調節TBG4表達，而可能下調節TBG6表達。為了評價此假說，採集青熟果實，使其經受連續氣流的混合在空氣中的10ppm乙烯。在1、2、12和24小時使用對照和乙烯處理的果實進行RNA提取。該試驗的結果證實了突變果實RNA分析的發現。正如所料，TBG1、2、3、5和7轉錄本的存在和豐度在經受外來乙烯處理的青熟組織中基本不受影響(圖8)。然而，在乙烯存在的情況下，在青熟組織中的TBG4轉錄本豐度增加。根據給出的數據，用外來乙烯處理是否降低TBG6轉錄本的豐度並不清楚，因為其轉錄本水平通常在果實發育的這個階段降低。酶活性為了確定所述TBG編碼產物的作用，我們使用異源表達系統開始表達cDNA編碼的酶的試驗。試驗了幾種大腸桿菌表達系統，但由於毒性(參見下文實施例)產物的得率非常低。因此我們使用分泌成熟氨基末端FLAG融合蛋白至培養基中的酵母表達系統。首先測試所述TBG4cDNA，結果導致每50ml培養物產生約1mgTBG4活性蛋白。首先使用TBG4是因為該cDNA編碼所述酶β-半乳糖苷酶Ⅱ，該酶純化自番茄果實並已相當詳細地特徵鑑定(Carey等1995,Smith等1998)。所以我們能夠對比異源系統表達的蛋白和純化自番茄的天然酶的活性。使用抗FLAG親和樹脂成功地親和純化了所述TBG4蛋白(圖9)。證實所述親和純化的TBG4酶利用其水解合成底物對硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷的能力(Smith等，1998)具有β(1→4)-D-半乳糖苷酶活性。該酶可切割各種細胞壁底物中的半乳糖基殘基並因此具有外切半乳聚糖酶活性(表Ⅲ)。目前對其餘成功表達活性酶的全長cDNA克隆進行了試驗。初步的結果已顯示TBG1編碼的酶還具有β-D-半乳糖苷酶活性和外切半乳聚糖酶活性(表Ⅲ)。表Ⅲ．在酵母中表達的TBG4和TBG1的細胞壁降解活性。由純化自番茄果實的螯合劑可溶性果膠(CSP)和鹼溶性果膠(ASP)以及半纖維素(HCF)細胞壁部分中去除半乳糖基殘基。釋放的半乳糖μg酶底物煮熟的新鮮的aTBG4CSP05ASP014.5HCF04bTBG1ASP01.22mg底物；於37℃4小時a.005單位酶/rxb.0005單位酶/rx編碼β-半乳糖苷酶的pZBG2-1-4將TBG4ORF按閱讀框架克隆入阻遏/誘導型細菌表達載體pFLAG-CTC。宿主菌株XL1-BlueMR是突變株，既不含內源β-半乳糖苷酶活性，也不含α互補。在30-37℃，用(IPTG)誘導基因轉錄使大腸桿菌生長立即停止。然而，在20℃誘導確實能使某些大腸桿菌有限生長。當在20C培養包含pZBG2-1-44ORF的克隆並用IPTG誘導時，所述細胞在包含所述β-半乳糖苷酶底物X-GAL的培養基中生長36小時後緩慢變藍(圖10)。如果不用IPTG誘導，則即使是在包含X-GAL的培養基中延時培養之後也未觀察到藍色。至於另外的陰性對照，在用或不用IPTG誘導的情況下，即使是在培養7天後，由用所述FLAG載體單獨轉化的XL1-BlueMR組成的克隆也從未顯示任何β-半乳糖苷酶活性(圖10)。至於最大β-半乳糖苷酶活性的陽性對照(得自大腸桿菌β-半乳糖苷酶)，將克隆載體pGEM轉化到宿主菌株DH5α中，結果也示於圖10。圖10顯示對在大腸桿菌中表達的pZBG2-1-4的β-半乳糖苷酶活性的檢測。收穫細胞並每隔12小時製備提取物，檢測A615。將培養物在外加顯色底物X-GAL(空心符號)或X-GAL和轉錄誘導劑IPTG(實心符號)的所述培養基中進行培養。用作大腸桿菌β-半乳糖苷酶活性陽性對照的載體是pGEM(■)，而用作陰性對照和用於表達的載體是或不含(○,●)或含pZBG2-1-4ORF(△,▲)的pFLAG-CTC。對植物組織結構的作用為進一步證實TBG4編碼的β-半乳糖苷酶Ⅱ的功能，進行以下的試驗。包含抑制TBG4mRNA的反義構建物的番茄植物果實與親代系果實相比，堅硬度最多大40％(比較圖11A-11E(1-4)中的親代系#1和反義系#2的平均值)。在所述轉化體中具有最堅硬果實的株系也具有最低的總TBG4mRNA水平(圖12A、B)。這種相關性表明TBG4mRNA的減少與果實堅硬度的增加有關。較堅硬的果實可以導致(1)較少運輸損傷(a)較少緣於損傷的損失和(b)能夠在產生較好味道的較後階段採集上市；(2)對於市場和顧客而言都具有較長的保存期限；(3)對於新鮮切片銷售而言果實品質更好；在較堅硬時粉紅色/紅色階段的果實更好切割。方法為測定TBG4編碼的β-半乳糖苷酶Ⅱ的功能，使用組成型表達的35SCaMV啟動子製備反義構建物，以表達TBG4反義RNA(圖13)。使用農桿菌介導的轉化將構建物移入番茄中。為了評價TBG4抑制對加工的番茄(cv『UC82b')果泥品質的作用，已經轉化了4個番茄栽培品種和3個新的精選栽培品種。所述新的精選栽培品種中的一個品種是軟果實鮮櫻桃色番茄(softfruitlargecherrytomato)(cv『AilsaCraig')，第二個是軟果實老繁殖系(cv『Rutgers')，而第三個是最新研製的稍微堅硬的載培品系『NewRutgers'。在這些其中TBG4mRNA受到抑制的品系當中，我們期望發現硬度和果泥粘性增加。結構儘管此項目接近完成，但還未完成全部的生物化學和分子分析。對所述『NewRutgers』載培品系分析的初步結果列於圖11A-E(1-4)和12A、B。在此實施例中使用叫做『NewRutgers』的新精選栽培品系。培養購買種子植株並使其自交，產生的種子用作親代對照(系1)。培養7個包含TBG4反義構建物的獨立轉化植物(系2-8)並使其自交。通過DNA印跡分析證實轉化(T-DNA插入片段)(未列出數據)。培養每種轉化系的各5株植物連同10株親代系植物。在花端著色階段(第一次發生顏色變化)對果實進行標記並在花端著色+7天採集。使用每種系的15-20個果實收集數據。對每個果實都進行兩次每種類型的結構檢測，使用StableMicroSystem的TA-XT2i結構分析儀對果實進行4種類型的結構檢測。所述4種檢測是1、2英寸平板壓至3mm(圖11A)，2、4mm球形硬度試驗壓頭(indenter)壓至3mm(圖11B),3、4mm圓柱形硬度試驗壓頭壓至3mm(圖11C)和4、4mm圓柱形硬度試驗壓頭穿刺至10mm(圖11D)。這些數據的概述於圖11E(1-4)。在圖11A-E(1-4)中，系1是親代系，而系2-8每個都代表獨立的包含1個T-DNA拷貝的所述TBG4反義構建物的轉化體。對所述數據的統計學分析(Duncans和Scheffé)揭示，轉化系3、7和8的果實和親代系沒有明顯不同，但轉化系2、4、5和6明顯比親代系果實更堅硬。最值得注意的是轉化系2的果實的平均硬度比所述親代系的果實堅硬40％(圖11A-D)。RNA印跡分析目前我們正在研究其中TBG4mRNA水平被抑制的果實中的生物化學成分的任何變化。這些試驗用來顯示在果實硬度增加和TBG4mRNA抑制、TBG4編碼的酶活性抑制、細胞壁可能的改變(例如半乳糖基殘基含量增加)以及在果實成熟過程中游離半乳糖水平降低之間的關係。這些試驗雖然不完整，但進行了一些初步的RNA印跡試驗，數據示於圖12A、B。在圖12A、B中沒有顯示親代或不成對的對照果實RNA，因為這些植物最後培養，並且RNA提取現在正在進行。作為對比的正常果實TBG4mRNA水平參見以上圖5。圖5的數據顯示TBG4mRNA水平在青熟階段較低，在轉換階段達到峰值，並在紅色階段減少。除系2和3之外所有的品系都表達反義TBG4mRNA(圖12A、B)。所述反義轉錄本表現為兩條帶，在長度上比內源mRNA小。這兩條帶可能原因是1、由NOS終止子提供預期的轉錄終止信號和2、在所述反義TBG4cDNA中的隱藏轉錄終止信號。最值得注意的結果是在系2中於轉換階段未檢測到TBG4mRNA。系2也具有最堅硬的紅色果實(參見圖11A-D)。沒有可檢測的TBG4mRNA可能是由內源和反義mRNA二者共抑制造成。當與較早的印跡(例如圖4)相比時，所有的所述品系似乎都具有大體降低的TBG4mRNA水平，但在同一RNA分析中沒有親代和不成對對照RNA的情況下，所以不可能賦予此說明以具體數值。本說明書公開了β-半乳糖苷酶Ⅱ多肽參與果實成熟過程中的細胞壁果膠的降解。在本發明中，說明了番茄中β-半乳糖苷酶在果實成熟和軟化過程中的作用，並描述了對編碼表達於成熟番茄果實組織中的β(1→4)半乳聚糖降解酶的β-半乳糖苷酶cDNA克隆的克隆。本發明研究指出，pZBG2-1-4是得自所述TBG4基因轉錄本的cDNA，它編碼β-半乳糖苷酶Ⅱ是由於以下原因首先，預期的成熟pZBG2-1-4翻譯產物的高度保守的氨基末端部分的推斷的胺基酸序列和由Carey等(1995)純化並命名為TOMAA的β-半乳糖苷酶Ⅱ的氨基末端序列幾乎完全匹配(30個胺基酸中的28個匹配)。重要的是，在所述β-半乳糖苷酶Ⅱ序列(TOMAA)中不匹配本發明的pZBG2-1-4推斷胺基酸序列的兩個胺基酸(KY)據信是不正確的，因為在資料庫中的所有植物β-半乳糖苷酶序列和4個另外的從番茄鑑定的β-半乳糖苷酶相關cDNA同pZBG2-1-4推斷胺基酸序列在這兩個相同的胺基酸(ST)位置上全部匹配或具有保守置換(圖3)。其次，在檢測到β-半乳糖苷酶Ⅱ活性的同時也用pZBG2-1-4在正常成熟果實中檢測到轉錄本(圖5；Carey等，1995)。而且，在45和50dpa的所述突變體nor、rin和Nr的果實中幾乎未檢測到或未檢測到轉錄本(圖7)。這個觀測結果也與Carey等(1995)提供的數據一致β-半乳糖苷酶Ⅱ活性保持在和青熟果實相等的水平上，並在45-65dpa的nor或rin植物的果實中沒有升高。令人關注的是Carrington和Pressey(1996)已經報導在成熟的轉換階段之後只在『Rutgers』果實中檢測到β-半乳糖苷酶Ⅱ活性。在本發明中的RNA數據表明，最大的β-半乳糖苷酶Ⅱ活性僅在轉換階段後出現，假定mRNA水平表示可提取的酶活性(圖5)。第三，由所述pZBG2-1-4序列預測的成熟蛋白表觀分子量為77.9kD,pⅠ為8.9，這與以下對β-半乳糖苷酶Ⅱ的測定結果相似Pressey(1983)通過凝膠過濾柱層析測定的分子量為62Kd和通過等電聚焦測定的pⅠ為7.8，另一方面Carey等(1995)通過SDS-PAGE測定的分子量為75kD，通過等電聚測定的pⅠ為9.8。第四，使用異種酵母表達系統由pZBG2-1-4ORF產生的酶具有β-半乳糖苷酶活性和外切半乳聚糖酶活性。所引用的參考文獻AltschulSF,GishW,MillerW,MeyersEW,LipmanDJ(1990)Basiclocalalignmentsearchtool.JMolBiol215:403-410AusubelF,BrentR,KingstonR,MooreD,SeidmanJ,SmithJ,StruhlK,eds,(1987)CurrentProtocolsinMolecularBiology.JohnWileyandSons,NewYorkCareyAT,HoltK,PicardS,WildeR,TuckerGA,BirdCR,SchuchW,SeymourGB(1995)Tomatoexo-(1→4)-β-D-galactanase.Isolation,changesduringripeninginnormalandmutanttomatofruit,andcharacterizationofarelatedclone.PlantPhysiol108:1099-1107CarringtonCM,PresseyR(1996)β-galactosidaseⅡactivityinrelationtochangesincellwallgalactosylcompositionduringtomatoripening.JAmerSocHortSci121:132-136ChurchGM,GilbertW(1984)Genomicsequencing.ProcNatlAcadSciUSA81:1991-1995DeVeauEJ,GrossKC,HuberDJ,WatadaAE(1993)Degradationandsolubilizationofpectinbyβ-galactosidasespurifiedfromavocadomesocarp.PhysiolPlant87:279-285FischerRL,BennettAB(1991)Roleofcellwallhydrolasesinfruitripening.AnnuRevPlantPhysiolPlantMolBio42:675-703GiovannoniJJ,DellaPennaD,BennettAB,FischerRL(1989)Expressionofachimericpolygalacturonasegeneintransgenicrin(ripeninginhibitor)tomatofruitresultsinpolyuronidedegradationbutnotfruitsoftening.PlantCell1:53-63GoldenKD,JohnMA,KeanEA(1993)β-GalactosidasefromCoffeaarabicaanditsroleinfruitripening.Phytochemistry34:355-360GrossKC(1984)Fractionationandpartialcharacterizationofcellwallsfromnormalandnon-ripeningmutanttomatofruit.PhysiolPlant62:25-32GrossKC,SamsCE(1984)Changesincellwallneutralsugarcompositionduringfruitripening:Aspeciessurvey.Phytochemistry23:2457-2461GrossKC,WallnerSJ(1979)Degradationofcellwallpolysaccharidesduringtomatofruitripening.PlantPhysiol63:117-121HallLN,TuckerGA,SmithCJS,WatsonCF,SeymourGB,BundickY,BoniweilJM,FletcherJD,RayJA,SchuchW,BirdCR,GriersonD,(1993)Antisenseinhibitionofpectinesterasegeneexpressionintransgenictomatoes.PlantJ3:121-129HuberDJ(1983)Theroleofcellwallhydrolasesinfruitsoftening.HortRev5:169-219KangIK,SuhSG,GrossKC,ByunJK(1994)N-terminalaminoacidsequenceofpersimmonfruitβ-galactosidase.PlantPhysiol105:975-979KimJ,GrossKC,SolomosT(1991)Galactosemetabolismandethyleneproductionduringdevelopmentandripeningoftomatofruit.PostharvBiolTechnol1:67-80MarckC(1988)DNAStrider:a「C」programforthefastanalysisofDNAandproteinsequencesontheAppleMacintoshfamilyofcomputers.NucleicAcidsRes16:1829-1836MitchamEJ,GrossKC,NgTJ(1989)Tomatofruitcellwallsynthesisduringdevelopmentandsenescence.Invivoradiolabelingofcellwallfractionsusing[14C]sucrose.PlantPhysiol89:477-481NakaiK,KanehisaM(1992)Aknowledgebaseforpredictingproteinlocalizationsitesineukaryoticceils.Genomics14:897-911NielsenH,EngelbrechtJ,BrunakS,vonHeijneG(1997)Identificationofprokaryoticandeukaryoticsignalpeptidesandpredictionoftheircleavagesites.ProteinEngineering10:1-6PresseyR(1983)β-Galactosidasesinripeningtomatoes,PlantPhysiol71:132-135RossGS,RedgwellRJ,MacRaeEA(1993)Kiwifruitβ-galactosidase:isolationandactivityagainstspecificfruitcell-wallpolysaccharides.Planta189:499-506RossGS,WegrzynT,MaeRaeEA,RedgwellRJ,(1994)Appleβ-galactosidase.ActivityagainstcellwallpolysaccharidesandcharacterizationofarelatedcDNAclone.PlantPhysiol106:521-528SeymourGB,GrossKC(1996)Cellwalldisassemblyandfruitsoftening.PostharvestNewsInfo7:45N-52NSmithCJS,WatsonCFS,RayJ,BirdCR,MorrisPC,SchuchW,GriersonD(1988)AntisenseRNAinhibitionofpolygalacturonasegeneexpessionintransgenictomatoes.Nature334:724-726SmithDL,FedoroffNV(1995)LRPl,ageneexpressedinlateralandadventitiousrootprimordiaofArabidopsis.PlantCèll7:735-745SmithDL,StarrettDAandGrossKC(1998)Agenecodingfortomatofruitβ-galatosidaseⅡisexpressedduringfruitripening.PlantPhysiol.117:417-423TiemanDM,HarrimanRW,RamamohanG,HandaAK(1992)Anantisensepectinmethylesterasegenealterspectinchemistryandsolublesolidsintomatofruit.PlantCell4:667-679TigehelaarEC,MeGlassonWB,BuescherRW(1978)Geneticregulationoftomatofruitripening.HortScience13:508-513TuranoFJ,ThakkarSS,FangT,WeisemannJM(1997)CharacterizationandexpressionofNAD(H)dependentglutamatedehydrogenasegenesinArabidopsisthaliana.PlantPhysiol113:1329-1341VerwoerdTC,DekkerBMM,HoekemaA(1989)Asmall-scaleprocedurefortherapidisolationofplantRNAs.NucAcidsRes17:2362WegrzynTF,MacRaeEA(1992)Pectinesterase,polygalacturonase,andβ-galactosidaseduringsofteningofethylene-treatedkiwifruit.HortScience27:900-90權利要求1．包括具有與選自以下的序列具有至少95％同一性的核苷酸序列的多核苷酸的分離的核酸分子(a)編碼具有選自以下的完全胺基酸序列的β-半乳糖苷酶Ⅱ多肽的核苷酸序列SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15和SEQIDNO:16，並命名為TBG1、TBG2、TBG3、TBG4、TBG5、TBG6和TBG7，分別示於圖2或由選自以下的cDNA克隆編碼包含於GenBank收錄號為AF023847、AF154420、AF154421、AF020390、AF154423、AF154424和AF154422中的cDNA克隆；(b)編碼具有在選自以下的序列中約位置24-724的胺基酸序列的成熟β-半乳糖苷酶Ⅱ多肽的核苷酸序列SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15和SEQIDNO:16，並命名為TBG1、TBG2、TBG3、TBG4、TBG5、TBG6和TBG7，分別示於圖2或由選自以下的cDNA克隆編碼包含於GenBank收錄號為AF023847、AF154420、AF154421、AF020390、AF154423、AF154424和AF154422中的cDNA克隆；和(c)與在以上(a)或(b)中的任一核苷酸序列互補的核苷酸序列。2．權利要求1的核酸分子，其中所述多核苷酸具有選自以下的完全核苷酸序列SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6和SEQIDNO:7，如圖2所示。3．權利要求1的核酸分子，其中所述多核苷酸具有在圖2(SEQIDNO:4)中的核苷酸序列，該核苷酸序列編碼具有在圖2中稱為TBG4的胺基酸序列的β-半乳糖苷酶Ⅱ多肽。4．權利要求1的核酸分子，其中所述多核苷酸具有在圖2(SEQIDNO:4)中的核苷酸序列，該核苷酸序列編碼具有在圖2中稱為TBG4的胺基酸序列中的約24至約724的胺基酸序列的成熟多肽。5．權利要求1的核酸分子，其中所述多核苷酸具有包含於GenBank收錄號為AF023847中的cDNA克隆的完全核苷酸序列。6．權利要求1的核酸分子，其中所述多核苷酸具有包含於GenBank收錄號為AF154220中的cDNA克隆的完全核苷酸序列。7．權利要求1的核酸分子，其中所述多核苷酸具有包含於GenBank收錄號為AF154421中的cDNA克隆的完全核苷酸序列。8．權利要求1的核酸分子，其中所述多核苷酸具有包含於GenBank收錄號為AF020390中的cDNA克隆的完全核苷酸序列。9．權利要求1的核酸分子，其中所述多核苷酸具有包含於GenBank收錄號為AF154423中的cDNA克隆的完全核苷酸序列。10．權利要求1的核酸分子，其中所述多核苷酸具有包含於GenBank收錄號為AF154424中的cDNA克隆的完全核苷酸序列。11．權利要求1的核酸分子，其中所述多核苷酸具有包含於GenBank收錄號為AF154422中的cDNA克隆的完全核苷酸序列。12．包含在嚴格雜交條件下與具有和在權利要求1的(a)、(b)或(c)中的核苷酸序列同等的核苷酸序列的多核苷酸雜交的多核苷酸的分離的核酸分子，其中所述雜交的多核苷酸在嚴格雜交條件下不和具有僅由A殘基或僅由T殘基組成的核苷酸序列的多核苷酸雜交。13．包含一種多核苷酸的分離的核酸分子，所述多核苷酸編碼具有權利要求1的(a)、(b)或(c)中的胺基酸序列的β-半乳糖苷酶Ⅱ多肽的帶有表位部分的胺基酸序列。14．製備重組載體的方法，該方法包括將權利要求1的分離的核酸分子插入到載體中。15．通過權利要求14的方法產生的重組載體。16．製備重組宿主細胞的方法，該方法包括將權利要求15的重組載體引入到宿主細胞中。17．通過權利要求16的方法產生的重組宿主細胞。18．生產β-半乳糖苷酶Ⅱ多肽的重組方法，該方法包括在便於表達所述多肽的條件下培養權利要求17的重組宿主細胞和回收所述多肽。19．包含與選自以下的序列具有至少95％同一性的胺基酸序列的分離的β-半乳糖苷酶Ⅱ多肽a)在選自以下的序列中的約位置24-724的胺基酸序列SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15和SEQIDNO:16，並命名為TBG1、TBG2、TBG3、TBG4、TBG5、TBG6和TBG7，分別示於圖2；和b)由選自以下的cDNA克隆編碼的胺基酸序列包含於GenBank收錄號為AF023847、AF154420、AF154421、AF020390、AF154423、AF154424和AF154422中的cDNA克隆。20．包含所述β-半乳糖苷酶Ⅱ蛋白的帶有表位部分的分離的多肽。21．特異性結合權利要求20的β-半乳糖苷酶Ⅱ多肽的分離的抗體。22．包含和選自以下的序列具有至少95％核苷酸序列同一性的核苷酸序列的多核苷酸的分離的核酸分子(a)編碼具有選自以下的完全胺基酸序列的β-半乳糖苷酶Ⅱ多肽的核苷酸序列SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15和SEQIDNO:16，並命名為TBG1、TBG2、TBG3、TBG4、TBG5、TBG6和TBG7，分別示於圖3或由選自以下的cDNA克隆編碼包含於GenBank收錄號為AF023847、AF154420、AF154421、AF020390、AF154423、AF154424和AF154422中的cDNA克隆；(b)編碼具有在選自以下的序列中的約位置24-724的胺基酸序列的成熟β-半乳糖苷酶Ⅱ多肽的核苷酸序列SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15和SEQIDNO:16，並命名為TBG1、TBG2、TBG3、TBG4、TBG5、TBG6和TBG7，分別示於圖3或由選自以下的cDNA克隆編碼包含於GenBank收錄號為AF023847、AF154420、AF154421、AF020390、AF154423、AF154424和AF154422中的cDNA克隆；和(c)與在以上(a)或(b)中的任一核苷酸序列互補的核苷酸序列。23．權利要求22的核酸分子，其中所述多核苷酸具有在圖2中的選自SEQIDNO:1-3和5-7的完全核苷酸序列。24．權利要求22的核酸分子，其中所述多核苷酸具有在圖2中的選自SEQIDNO:1-3和5-7的核苷酸序列，所述SEQIDNO:1-3和5-7分別編碼具有稱為TBG1-3和5-7的完全胺基酸序列的β-半乳糖苷酶多肽。25．權利要求22的核酸分子，其中所述多核苷酸具有在圖2中的選自SEQIDNO:1-3和5-7的核苷酸序列，所述SEQIDNO:1-3和5-7分別編碼具有稱為TBG1-3和5-7的完全胺基酸序列的成熟多肽。26．權利要求22的核酸分子，其中所述多核苷酸具有包含於選自以下的GenBank收錄號序列中的cDNA克隆的完全核苷酸序列，其中所述GenBank收錄號選自AF023847、AF154420、AF154421、AF020390、AF154423、AF154424和AF154422的ATCC保藏號(whereinsaidpo1ynucleotidehasthecompletenucleotidesequenceofthecDNAclonecontainedinanGenBankAccessionNo.selectedfromthegroupconsistingofATCCDepositNo.selectedfromthegrorpconsistingofAF023847、AF154420、AF154421、AF020390、AF154423、AF154424andAF154422)。27．改變植物中的細胞壁代謝的方法，該方法包括用適合改變β-半乳糖苷酶活性的DNA構建物轉化所述植物、培育所述植物或其後代並選擇具有改變的細胞壁特徵的植物，所述構建物包含在植物中有效的、可操作地連接至編碼至少一個β-半乳糖苷酶的DNA序列的轉錄起始區。28．權利要求27要求保護的方法，其中所述DNA序列選自在權利要求1或權利要求22中要求保護的核酸分子的序列。29．用權利要求1或權利要求22要求保護的核酸分子轉化的植物細胞。30．用權利要求29要求保護的植物細胞產生的植物。31．用權利要求30要求保護的植物產生的植物種子。32．用於改進植物中β-半乳糖苷酶基因表達的方法，該方法包括用權利要求1或權利要求22要求保護的核酸分子轉化所述植物、培育所轉化的植物並選擇相比於未轉化植物具有改進的β-半乳糖苷酶基因表達的植物。全文摘要提供新β－半乳糖苷酶基因家族和得自編碼這些基因產物的cDNA的克隆的DNA序列,以由cDNA克隆pZBG2－1－4編碼的β－半乳糖苷酶Ⅱ蛋白作為實例。還提供改變細胞壁代謝的方法,該方法包括改變至少一個β－半乳糖苷酶的活性並因此改變所述果實的品質。本發明還提供DNA構建物,該構建物包括在植物中有效的轉錄起始區控制下的部分或全部β－半乳糖苷酶DNA序列,以使其可以在植物細胞中產生RNA和可選地產生β－半乳糖苷酶多肽。本發明還涉及包括本發明的分離的核酸分子的重組載體、包含所述重組載體的宿主細胞以及製備這樣的載體和宿主細胞的方法和使用它們通過重組技術生產β－半乳糖苷酶多肽或肽的方法。本發明還提供包含本發明的DNA構建物的植物細胞;由其產生的具有修飾的β－半乳糖苷酶基因表達的植物;和由這樣的植物產生的種子。文檔編號C12N9/38GK1311816SQ99809249公開日2001年9月5日申請日期1999年6月8日優先權日1998年6月9日發明者K·C·格羅斯,D·L·史密斯申請人:美國政府農業部