一種以農用廢棄甘薯藤為原料製備微生物油脂的方法
2023-05-03 23:48:06 1
專利名稱：一種以農用廢棄甘薯藤為原料製備微生物油脂的方法
技術領域：
本發明屬於生物化工領域，特別涉及一種微生物利用農用廢棄甘薯藤發酵生產微生物油脂的方法。
背景技術：
油脂不但是維持生命的重要營養物質，也是工業生產的重要原料。傳統的食用油脂，主要來源於動物或油料植物，在當今工業生產不斷發展以及世界人口數量不斷增多的情況下，油脂呈現了供不應求的趨勢。針對這一問題，科學家們藉助於生物工程技術，通過微生物體內生物合成的方法製取微生物油脂，為開闢新的油脂資源闖出了一條新路。微生物油脂，又稱單細胞油脂(Single cell oils，SCOs)，可以由一些產油微生物例如酵母、 真菌、細菌、微藻等產生，其在組成成分上類似植物油，主要有中性油脂、游離脂肪酸、類脂物及不皂化物，其中亞油酸、α-亞麻酸、二十碳五烯酸等多不飽和脂肪酸具有特殊的生理功能。目前利用微生物生產油脂的技術可行性已不存在太大問題，主要還是經濟可行性。降低微生物油脂生產的原料成本是增加其經濟可行性的一個重要方面。開發各種廉價的農用廢棄物作為微生物油脂的生產原料已成為該領域一個重要的研究方向。甘薯屬旋花科甘薯屬，俗稱紅薯、白薯、番薯、甜薯、地瓜、山芋等。目前是我國的主要糧食作物之一。國內外對甘薯塊根及其製品開發研究很多，但甘薯莖、葉及藤(地上部分) 的分析研究才剛剛起步。事實上，甘薯地上部分產量相當於薯塊1. 56倍，而這些地上部分多數是丟棄的。近幾年，人們開始重視甘薯莖葉的營養價值的同時，發現其的藥用價值也很高。但是我們也發現，這些營養價值和藥用價值都屬於新鮮、幼嫩的甘薯莖葉，而那些在甘薯塊莖收穫期還存留的甘薯藤仍舊被大量廢棄。利用這些老的、廢棄的甘薯藤生產微生物油脂可降低生產成本，也使得資源最大化得被利用。
發明內容
本發明的目的在於提供一種微生物油脂的製備方法，以廢棄甘薯藤為原料，可提高微生物油脂生產效率，簡化生產工藝，降低原料成本。本發明的目的是通過以下技術方案來實現的一種以農用廢棄甘薯藤為原料製備微生物油脂的方法，該方法包括以下步驟
(1)製備甘薯藤水解液按質量體積比1:5-10(g/ml)將粉碎或切絲的甘薯藤與濃度為0. 05mol/L、pH為4. 8的檸檬酸緩衝液進行混合，固液混合物於115°C下滅菌20分鐘；在每克無菌的固液混合物中加15IU的纖維素酶和100IU的果膠酶，得加酶混合物；加酶混合物在50°C下振蕩處理4天，固液分離後得到的液體部分為甘薯藤水解液；
(2)製備液態深層發酵培養基甘薯藤水解液用NaOH調pH至5.5，然後在115°C下滅菌20min，得到液態深層發酵培養基；或者按照質量體積比3-6:100 (g/ml)將糖加入甘薯藤水解液中，製得含糖甘薯藤水解液，含糖甘薯藤水解液用NaOH調pH至5. 5，然後在115°C下滅菌20min，得到液態深層發酵培養基；
(3)製備產油菌發酵種子低溫保藏的產油菌種子用YPD液體培養基進行活化，產油菌種子活化後，接種到另一 YPD液體培養基，培養至對數生長期，獲得產油菌發酵種子；
(4)發酵生產微生物油脂按體積比為5%將產油菌發酵種子與液態深層發酵培養基混合，在下，180-200rpm通風振蕩培養8_12天，獲得發酵產物，發酵產物固液分離後收集固體，得到油脂菌體。(5)超聲提取微生物油脂按質量體積比1:4 (g/ml)將油脂菌體與濃度為2 mol/ L的鹽酸相混合，煮沸IOmin後，加入等體積由氯仿和甲醇按體積比為2:1混合組成的提取液，得混合液，混合液超聲萃取30分鐘後，靜置或離心分層，收集下層有機相；剩餘的固液混合物用等體積氯仿超聲萃取30分鐘後，靜置或離心分層，收集下層有機相，氯仿超聲萃取2-3次後，將所有的下層有機相混合，蒸餾回收有機溶劑，剩下的透明、澄清的液體組分即為微生物油脂。進一步地，所述步驟(1)中，甘薯藤為甘薯塊莖收穫後被廢棄的地上部分，即甘薯莖葉藤的總和，可以為粉碎的幹甘薯藤或切絲的新鮮甘薯藤。進一步地，所述步驟(3)中，產油菌可以是發酵性絲孢酵母、皮狀絲孢酵母或粘紅酵母。本發明的有益效果是
1、原料成本低，是一項資源高值化技術甘薯藤作為農業副產品，其產量相當於薯塊 1.56倍，目前，甘薯藤中除少部分鮮嫩的莖葉被開發利用，大部分甘薯藤都被燒毀丟棄。我國是世界上最大的甘薯生產國，所以甘薯藤的收集和加工相對容易。2、油脂生產效率高、工藝簡便本發明採用纖維素酶水解法製備水解液，製備條件溫和，水解液中幾乎不含抑制菌體生長代謝的物質，因此產油菌以該水解液為主要營養進行發酵，油脂產量較高。此外番薯藤含有較高的氮成分和一定量微量元素，採用這種營養組分相對豐富的材料製備得到水解液具有微生物發酵所必需的碳氮源和微量元素，無需再額外添加。而採用秸稈、甘蔗渣等材料製備的水解液就必須添加額外的營養和氮源。3.本發明可用於油脂的大量生產，可以連續生產，不受場地，季節變化的影響，是對傳統生產油脂的一個補充，從資源利用的角度上說，本發明達到了變廢為寶，實現了資源利用的最大化。
具體實施例方式本發明微生物油脂的製備方法，以成熟期廢棄的甘薯藤(甘薯的莖葉藤的總稱)為原料，經粉碎或切絲後，與含有纖維素酶的檸檬酸緩衝液混合得到固液混合物，固液混合物在50°C下處理4天後，經固液分離可獲得水解液，將產油微生物的種子液接種到水解液或水解液與糖的混合物中，經常規液體深層發酵獲得發酵產物。從發酵產物中收集油脂菌體， 經常規有機溶劑提取方法獲得微生物油脂。本發明以農用廢棄甘薯藤為原料製備微生物油脂的方法，包括以下步驟
1、製備甘薯藤水解液按質量體積比1:5-10 (g/ml)將粉碎或切絲的甘薯藤與濃度為 0. 05mol/L、pH為4. 8的檸檬酸緩衝液進行混合，固液混合物於115°C下滅菌20分鐘；在每克無菌的固液混合物中加15IU的纖維素酶和100IU的果膠酶，得加酶混合物；加酶混合物在50°C下振蕩處理4天，固液分離後得到的液體部分為甘薯藤水解液。甘薯藤為甘薯塊莖收穫後被廢棄的地上部分，即甘薯莖葉藤的總和，可以為粉碎的幹甘薯藤或新鮮的切絲甘薯藤；
2、製備液態深層發酵培養基甘薯藤水解液用NaOH調pH至5. 5，然後在115°C下滅菌 20min，得到液態深層發酵培養基。或者按照質量體積比3-6:100 (g/ml)將糖加入甘薯藤水解液中，製得含糖甘薯藤水解液，含糖甘薯藤水解液用NaOH調pH至5. 5，然後在115°C下滅菌20min，得到液態深層發酵培養基。糖可以為葡萄糖、木糖、果糖或含糖混合物。3、製備產油菌發酵種子低溫(4°C以下)保藏的產油菌種子用YPD液體培養基進行活化，產油菌種子活化後，接種到另一 YPD液體培養基，培養至對數生長期，獲得產油菌發酵種子。產油菌可以是發酵性絲孢酵母、皮狀絲孢酵母或粘紅酵母。4、發酵生產微生物油脂按體積比為5%將產油菌發酵種子與液態深層發酵培養基混合，在下，180-200rpm通風振蕩培養8_12天，獲得發酵產物，發酵產物固液分離後收集固體，得到油脂菌體。5、超聲提取微生物油脂按質量體積比1:4 (g/ml)將油脂菌體與濃度為2 mol/ L的鹽酸相混合，煮沸IOmin後，加入等體積由氯仿和甲醇按體積比為2:1混合組成的提取液，得混合液，混合液超聲萃取30分鐘後，靜置或離心分層，收集下層有機相；剩餘的固液混合物用等體積氯仿超聲萃取30分鐘後，靜置或離心分層，收集下層有機相，重複氯仿超聲萃取步驟2-3次後，將所有的下層有機相混合，蒸餾回收有機溶劑，剩下的透明、澄清的液體組分即為微生物油脂。本發明提出的微生物油脂製備方法，以純甘薯藤水解液為液態深層發酵培養基， 微生物油脂產量可達7. 79g/l ；以純甘薯藤水解液和50g/l的葡萄糖的混合液為發酵培養基，油脂產量達24. 43g/l ；以純甘薯藤水解液和60g/l的木糖的混合液為發酵培養基，油脂產量達25. 5g/l ；以純甘薯藤水解液和60g/l的果糖的混合液為發酵培養基，油脂產量達 27. 6g/L·下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。在不背離本發明精神和實質的情況下，對本發明的方法、步驟或條件所做的修改或替換，均屬於本發明範圍，若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟悉的常規手段。實施例1 製備甘薯藤水解液(一)
將經風乾或曬乾後的甘薯藤幹樣粉碎至20目左右。在500ml的三角燒瓶中，加入樣品乾粉25g、檸檬酸緩衝液(0. 05M, pH4. 8) 250ml，混勻後用錫薄紙紗布報紙封口，於115度下滅菌20分鐘。混合樣品冷卻後，加入175ul纖維素酶和250ul果膠酶。加酶混合液於50 度，IOOrpm振蕩處理4天，然後用紗布去渣，去渣液進一步過濾獲得澄清的甘薯藤水解液。實施例2 製備甘薯藤水解液(二)
將新鮮的甘薯藤切絲，取50g切絲樣品加入250ml檸檬酸緩衝液(0. 05M，pH4. 8)，用榨汁機勻漿獲得固液混合物，將固液混合物轉移到500ml的三角燒瓶中，錫薄紙紗布報紙封口，於115度下滅菌20分鐘。混合樣品冷卻後，加入175ul纖維素酶和250ul果膠酶。加酶混合液於50度，IOOrpm振蕩處理4天，然後用紗布去渣，去渣液進一步過濾獲得澄清的甘薯藤水解液。實施例3 製備液態深層發酵培養基(一)
用NaOH將甘薯藤水解液的pH調為5. 5，在115度下，滅菌20min後即為液態深層發酵
培養基。實施例4 製備液態深層發酵培養基(二)
對甘薯藤水解液中額外添加50g/l的葡萄糖或含有50g/l葡萄糖的木質纖維素水解液，混勻後用NaOH調pH至5. 5後115°C滅菌20min即為液態深層發酵培養基。實施例5 製備液態深層發酵培養基(三)
對甘薯藤水解液中額外添加60g/l的木糖或含有60g/l木糖的木質纖維素水解液，混勻後用NaOH調pH至5. 5後115°C滅菌20min即為液態深層發酵培養基。實施例6 製備液態深層發酵培養基(四)
對甘薯藤水解液中額外添加60g/l的果糖或含有60g/l果糖的濃縮糖蜜廢液，混勻後用NaOH調pH至5. 5後115°C滅菌20min即為液態深層發酵培養基。實施例7 產油菌發酵種子的製備
挑取低溫保藏的發酵性絲孢酵母(Trichosporon fermentans CICC1368)接種YPD液體培養基中進行活化，將活化後的T. fermentans CICC1368轉接到新鮮的YPD液體培養基， 培養20小時後，獲得產油菌發酵種子。YPD液體培養基為葡萄糖20 g/Ι，蛋白腖10 g/1， 酵母膏 10 g/1, pH 5. 5。實施例8 微生物油脂的發酵和提取(一)
按體積比為5%將產油菌發酵種子與按實施例3製備的液體深層發酵培養基混合，在 28-30度下，180rpm-200rpm通風振蕩培養12天獲得發酵產物，發酵產物按照常規的固液分離法進行固液分離，收集油脂菌體。按照固液比為1:4的比例，在油脂菌體中加入2M HCL 溶液，煮沸10分鐘後，加入等體積氯仿甲醇體積比為2 1的提取液，提取液與油脂菌體充分混合後，混合液用超聲波處理30分鐘後，離心分層後，收集下層有機相。剩餘的固液混合物用氯仿重複萃取2-3次，將所有的有機相混合，旋轉蒸發回收有機溶劑，剩下的透明、澄清的液體組分即為微生物油脂。用此工藝流程獲得的幹菌體油脂含量可達到28. 85%，最高油脂產量可達到7. 79g/l。實施例8 微生物油脂的發酵和提取(二)
按體積比為5%將產油菌發酵種子與按實施例4製備的液體深層發酵培養基混合，在 28-30度下，180rpm-200rpm通風振蕩培養10天獲得發酵產物，發酵產物按照常規的固液分離法進行固液分離，收集油脂菌體。油脂提取工藝同實施例7。用此工藝流程獲得的幹菌體油脂含量可達到73. 43%，最高油脂產量可達到24. 43g/l。實施例9 微生物油脂的發酵和提取(三)
按體積比為5%將產油菌發酵種子與按實施例5製備的液體深層發酵培養基混合，在 28-30度下，180rpm-200rpm通風振蕩培養10天獲得發酵產物，發酵產物按照常規的固液分離法進行固液分離，收集油脂菌體。油脂提取工藝同實施例7。用此工藝流程獲得的幹菌體油脂含量可達到69. M%，最高油脂產量可達到25. 5g/l。實施例9 微生物油脂的發酵和提取(四)按體積比為5%將產油菌發酵種子與按實施例6製備的液體深層發酵培養基混合，在 28-30度下，180rpm-200rpm通風振蕩培養7天獲得發酵產物，發酵產物按照常規的固液分離法進行固液分離，收集油脂菌體。油脂提取工藝同實施例7。用此工藝流程獲得的幹菌體油脂含量可達到76. 99%，最高油脂產量可達到27. 6g/l。 上述實施例用來解釋說明本發明，而不是對本發明進行限制，在本發明的精神和權利要求的保護範圍內，對本發明作出的任何修改和改變，都落入本發明的保護範圍。
權利要求
1.一種以農用廢棄甘薯藤為原料製備微生物油脂的方法，其特徵在於，該方法包括以下步驟(1)製備甘薯藤水解液按質量體積比1:5-10(g/ml)將粉碎或切絲的甘薯藤與濃度為0. 05mol/L、pH為4. 8的檸檬酸緩衝液進行混合，固液混合物於115°C下滅菌20分鐘；在每克無菌的固液混合物中加15IU的纖維素酶和100IU的果膠酶，得加酶混合物；加酶混合物在50°C下振蕩處理4天，固液分離後得到的液體部分為甘薯藤水解液；(2)製備液態深層發酵培養基甘薯藤水解液用NaOH調pH至5.5，然後在115°C下滅菌20min，得到液態深層發酵培養基；或者按照質量體積比3-6:100 (g/ml)將糖加入甘薯藤水解液中，製得含糖甘薯藤水解液，含糖甘薯藤水解液用NaOH調pH至5. 5，然後在115°C 下滅菌20min，得到液態深層發酵培養基；(3)製備產油菌發酵種子低溫保藏的產油菌種子用YPD液體培養基進行活化，產油菌種子活化後，接種到另一 YPD液體培養基，培養至對數生長期，獲得產油菌發酵種子；(4)發酵生產微生物油脂按體積比為5%將產油菌發酵種子與液態深層發酵培養基混合，在下，180-200rpm通風振蕩培養8_12天，獲得發酵產物，發酵產物固液分離後收集固體，得到油脂菌體；(5)超聲提取微生物油脂按質量體積比1:4(g/ml)將油脂菌體與濃度為2 mol/L的鹽酸相混合，煮沸IOmin後，加入等體積由氯仿和甲醇按體積比為2:1混合組成的提取液， 得混合液，混合液超聲萃取30分鐘後，靜置或離心分層，收集下層有機相；剩餘的固液混合物用等體積氯仿超聲萃取30分鐘後，靜置或離心分層，收集下層有機相，氯仿超聲萃取2-3 次後，將所有的下層有機相混合，蒸餾回收有機溶劑，剩下的透明、澄清的液體組分即為微生物油脂。
2.根據權利要求1所述以農用廢棄甘薯藤為原料製備微生物油脂的方法，其特徵在於，所述步驟(1)中，甘薯藤為甘薯塊莖收穫後被廢棄的地上部分，即甘薯莖葉藤的總和，可以為粉碎的幹甘薯藤或切絲的新鮮甘薯藤。
3.根據權利要求1所述以農用廢棄甘薯藤為原料製備微生物油脂的方法，其特徵在於，所述步驟(3 )中，產油菌可以是發酵性絲孢酵母、皮狀絲孢酵母或粘紅酵母。
全文摘要
本發明提供了一種以農用廢棄甘薯藤為原料製備微生物油脂的方法，將成熟期廢棄的甘薯藤粉碎或切絲後，與含有纖維素酶的檸檬酸緩衝液混合得到固液混合物，固液混合物在50℃下處理4天後，經固液分離可獲得水解液，將產油微生物的種子液接種到水解液或水解液與糖的混合物中，經常規液體深層發酵獲得發酵產物。從發酵產物中收集油脂菌體，經常規有機溶劑提取方法獲得微生物油脂。本方法充分利用成熟期廢棄的甘薯藤，是一項資源高值化技術；採用纖維素酶和果膠酶複合水解法製備甘薯藤水解液，處理方法溫和，獲得的水解液營養豐富，油脂轉化效率高。
文檔編號C12P7/64GK102286558SQ201110273419
公開日2011年12月21日 申請日期2011年9月15日 優先權日2011年9月15日
發明者周啟發, 林輝, 詹局妹, 趙宇華 申請人:浙江大學