複合場三維細胞培養裝置的製作方法
2023-04-23 03:00:51 4
專利名稱：複合場三維細胞培養裝置的製作方法
技術領域：
本實用新型涉及細胞培養實驗設備，特別是將應變場與電磁場複合作用於三維基質支架中的細胞進行細胞培養的實驗裝置。
在我國，因創傷、疾病而致的組織缺損病人數量越來越多，已成為最常見的臨床問題，是致殘的重要因素。組織缺損常用替換植入方法治療。替換物包括異種、同種異體以及自體組織和人工合成材料。異種組織引起相當快速的排斥反應、同種異體移植排斥反應不可避免，且組織來源有限；自體組織移植會造成供區損傷以及所能供給的組織源有局限性；傳統的人工合成材料植入後引起異物反應，繼發感染及裸露等，這些都迫使科學工作者尋求新型組織替代物。
體外構建新型組織替代物要求將高濃度的功能相關的活細胞種植於天然或人工合成的細胞外基質中，形成與人體組織相同或類似的組織，然後移植於人體內「就地生長」，達到形成新的有功能的組織的目的。而現有的細胞培養方法不能適應體外構建新型組織替代物的需要，如傳統的單層細胞貼壁培養是從體內取出組織細胞，模擬體內生理條件，在無菌、適當溫度和一定營養條件下，使之生存和生長並維持其結構和功能的方法。這種方法中細胞是在二維平面內生長和增殖，要受到細胞接觸抑制的影響；培養時間過長，特別是反覆傳代，很容易導致細胞發生變異或反分化現象(如軟骨細胞)；傳代時經消化處理，對細胞有一定的損傷。因此，用傳統的細胞培養法其克隆形成率低，不能在體外生成三維組織結構。
為了提高克隆形成率，產生了微載體培養法，包括微囊培養法或中空纖維培養法。這些培養技術以微囊或中空纖維為載體，增加了細胞附著面積，達到大量培養細胞的目的(Jauregui HO et al Primary cultures of rat hepatocytes inhollow fiber chambers.In Vitro Cell Dev Biol，1994；30A23)。用微載體細胞培養的主要特點是需要進行適宜的攪動，以增加細胞附著的面積，但卻增加了細胞與載體附著和生長的隨機性，不利於體外有目的地生產具有特定形態結構和功能的組織替代物。
新近發展的細胞三維培養技術，既充分考慮到細胞與基質接觸面積，又使細胞能在三維空間生長和增殖，是目前體外構建組織替代物的首選技術(Naughton GK et al.Three-dimensional cell and tissue culture system.Int.PCT.WO90 02796,1990)。但是，普通的細胞三維培養技術仍然存在著細胞生長隨機性強，沒有確定方向；而且細胞生長緩慢，組織形成周期長的局限性，顯然不利於臨床應用。
本實用新型的目的正是為了克服上述現有技術中的不足之處而提供一種將細胞種植在三維基質支架中，置於應變場和電磁場複合作用下，使細胞在三維基質支架中取向生長，提高細胞代謝，促進其分泌功能，以構建出具有特定形態和功能的組織替代物的裝置。
本實用新型是由微機系統、功率放大器等組成的控制部分；由步進電機、連杆機構構成的機械部分；由電源、亥姆霍茲線圈組構成的電磁部分和由培養瓶、種植有細胞的三維基質支架構成的組織反應器部分構成。微處理系統分別控制步進電機帶動連杆機構上的絲槓作周期性往復運動和控制直流電源，輸出脈衝電流，使繞在固定架上的亥姆霍茲線圈組產生電磁場；組織反應器是園柱形玻璃培養瓶，兩端分別開有小孔固定夾持具和供絲槓伸出，種植有細胞的三維基質支架材料置於培養液中，兩端由夾持具固定，設有培養瓶蓋，固定在絲槓上的三維基質支架材料隨絲槓運動產生動態應變場，應變場與電磁場複合作用於支架材料中的細胞，組織反應器置於CO2培養箱中以保證細胞生長的外界條件，培養箱中設有散熱器，培養箱上有專用孔作管線進出。
本實用新型與現有技術相比具有如下優點和產生的積極效果1.採用摺疊或捲成的三維基質支架，為細胞生長提供三維定向生長空間，極大地增加了細胞的附著面積；同時可在支架中加入各種促進細胞粘附、生長和分化的因子，有效地模擬在體內組織中細胞生長的微環境。
2.三維基質支架中的細胞在動態應變場中，在一定程度上增加了基質支架中細胞的通透性，提高了培養體系傳熱傳質效果，從而顯著改善了細胞在基質支架中的營養條件，提高了組織生成效率。
3.細胞在動態應變場和電磁場的複合作用下大大改善了細胞在三維基質支架中的生長條件，從而加快了細胞生長過程，使細胞培養周期縮短，代謝產物含量提高，細胞分泌膠原纖維量大，並按一定方向排列。
4.本實用新型結構簡單、使用方便，應用廣泛，給組織缺損病人帶來福音。
以下是本實用新型附圖的圖面說明
圖1是本實用新型的結構示意圖。
圖2是本實用新型控制部分、機械部分、電磁部分、組織反應器部分連接框圖。
圖3是本實用新型控制部分的電路原理圖。
圖4是本實用新型控制部分的軟體工作流程圖。
圖5是本實用新型機械部分主視示意圖。
圖6是本實用新型機械部分俯視示意圖。
圖7是本實用新型三維基質支架構成示意圖。
本實用新型以下將結合附圖和實施例作進一步詳述實施例1一種複合場三維細胞培養裝置(見附
圖1-7)由微處理器系統1分別控制步進電機2帶動連杆機構3上的絲槓4作周期性往復運動和控制直流電源5，輸出脈衝電流，使繞在固定架6上的亥姆霍茲線圈組7、8、9、10產生脈衝電磁場；組織反應器11是園柱形玻璃培養瓶，兩端分別開有小孔固定夾持具12和供絲槓伸出，種植有細胞13的三維基質支架材料14置於培養液15中，兩端由夾持具12和16固定，17為培養瓶蓋，固定在絲槓上的三維基質支架材料隨絲槓運動產生動態應變場，應變場與電磁場複合作用於支架材料中的細胞，組織反應器置於CO2培養箱18中以保證細胞生長的外界條件，培養箱中設有散熱器19，培養箱上有專用孔20供管線進出，其具體的控制部分、機械部分、電磁部分和組織反應器部分分述如下(1)控制部分是由硬體部分和軟體部分組成(1.1)硬體部分是由一片低功耗8位單片微處理器，一個LCD液晶顯示器，一個鍵盤監控接口，一個過零檢測位置的光電信號檢測電路，步進電機各相細分值鎖存器，功率放大器；以及脈衝信號驅動電路，VMOS開關管，直流電源及亥姆霍茲線圈組成，(1.2)軟體工作原理如下開機後執行初始化程序，隨後在LCD上顯示開機初始狀態，等待鍵盤輸入電機工作參數設定值和電磁場參數設定值，此後啟動微處理器發出啟動脈衝驅動步進電機及觸發VMOS開關管，分別使電機按預設轉速轉動和使直流電源輸出脈衝電流，電機工作時間結束後，由過零檢測光電開關電路發出位置檢測脈衝與設定位置比較，使電機停到預設位置，停機時間結束，電機又重新開始工作，直至總工作時間和電磁場作用時間結束後，程序結束，其工作流程圖見說明書附圖4。
(2)機械部分是由位於密封腔21內的步進電機2帶動轉動圓盤22上的滑槽23使連接的驅動臂24和連杆25驅動帶有運動軸承26的推動杆27作周期性往復運動，固定在推動杆上的絲槓4及其連接的支架材料14與推動杆一起運動，設有標尺28指示伸縮長度，轉動園盤上有偏心孔29，由偏心距調節鈕30調節偏心距，滑槽的支點31位於驅動臂上，各部件由緊固螺釘32固定，33為滑動軸，34為絕熱墊，35為機座，進氣管36有兩個，排氣管37有一個，進、排氣管連同控制步進電機的導線一起從CO2培養箱的專用出孔20引出，(2.1)連杆機構作周期性往復運動的幅度和頻率由電機驅動的圓盤的偏心距和轉速決定，電機驅動園盤的偏心距0、2、4、6、8、10、15、20mm，共8檔，電機的轉速為0～300轉/分，應變場強度0～100％，頻率0～5Hz，應變場強度和頻率獨立變化，(3)電磁部分是微處理器輸出觸發脈衝信號，控制電源輸出電流驅動繞在固定架上的亥姆霍茲線圈組，以產生電磁場，電磁場的強度與流過亥姆霍茲線圈的電流成正比，通過調節直流電源輸出電流大小來調節電磁場強度，通過調節觸發脈衝信號的頻率來調節電磁場頻率，(3.1)電源為直流電源，其輸出電流I與亥姆霍茲線圈產生的電磁場強度B的關係是B=204RnI]]>R、n分別為亥姆霍茲線圈半徑和匝數，R＝40mm，nI＝0～10000安匝，μ0＝0.4π×10-6牛頓/米2，電磁場強度0～0.1特斯拉(T)，頻率0～1kHz，電磁場強度與頻率無依賴性，(4)組織反應器是園柱形培養瓶，培養瓶蓋蓋於培養瓶上，培養瓶兩端分別開有小孔固定夾持具12和供絲槓4伸出，絲槓與小孔的縫隙用封口膜作動態密封，種植有細胞的三維基質支架置於培養液中，兩端由夾持具12和16固定，三維基質支架是由直徑為5～100μm的聚合物纖維編織成網孔為4～1000μm2的纖維網構成，組織反應器置於CO2培養箱中以保持適於細胞生長的CO2濃度和有溼度的空氣環境，電磁場和應變場複合作用於組織反應器的支架材料中的細胞，(4.1)培養條件CO2濃度5～10％，溫度35～37℃，相對溼度90％以上，三維基質支架材料為聚合物，包括可降解聚合物、不可降解聚合物和用可降解聚合物包埋不可降解聚合物(1)可降解聚合物有聚乳酸、聚羥基乙酸、聚乳酸與聚羥基乙酸按90～1010～90比例共聚的無規共聚物；不可降解聚合物有聚乙烯醇、聚己內醯胺、聚氨酯、聚甲基丙烯酸羥乙基酯，(2)用可降解聚合物包埋不可降解聚合物有聚乳酸包埋聚乙烯醇、聚羥基乙酸包埋聚氨酯、聚乳酸與聚羥基乙酸共聚物包埋聚己內醯胺，聚合物纖維網可以捲成長方體支架、園柱體支架、稜柱體支架、橢園柱體支架或其它形態。
在連杆機構的推動杆上並聯有兩套以上的組織反應器及亥姆霍茲線圈組，以提高工作效率。
上述(2.1)、(3)、(3.1)、(4)中的參數設置、三維基質支架材料(1)、(2)的改變是根據所培養的細胞特點不同進行選擇的。
實施例2.一種複合場三維細胞培養裝置(見附
圖1-7)其裝置的結構同實施例1，三維基質支架材料是由直徑為5μm的可降解聚合物聚乳酸纖維編織成網孔為4μm2的纖維網捲成長方體支架，在支架中種植軟骨細胞後，在無應變場(強度為0％)和無電磁場(場強為0特斯拉)的情況下進行靜態三維細胞培養。
實施例3.一種複合場三維細胞培養裝置(見附
圖1-7)其裝置的結構同實施例1，三維基質支架材料使用可降解聚合物，如聚乳酸與聚羥基乙酸按10∶90比例共聚的無規共聚物，聚合物纖維網可以捲成六稜柱體支架，在支架中種植軟骨細胞後，在強度為1％、頻率為0.5Hz的應變場和場強為0.05特斯拉、頻率為500Hz的電磁場複合作用下進行三維細胞培養。
實施例4.一種複合場三維細胞培養裝置(見附
圖1-7)其裝置的結構同實施例1，三維基質支架材料由直徑為20μm的可降解聚合物纖維，如聚乳酸與聚羥基乙酸按90∶10比例共聚的無規共聚物纖維編織成網孔為20μm2的纖維網捲成園柱體支架，在支架中種植肌腱細胞後，在強度為5％、頻率為5Hz的應變場和場強為0.01特斯拉、頻率為1kHz的電磁場複合作用下進行三維細胞培養。
實施例5.一種複合場三維細胞培養裝置(見附
圖1-7)其裝置的結構同實施例1，三維基質支架材料由直徑為40μm的可降解聚合物纖維，如聚乳酸與聚羥基乙酸按50∶50比例共聚的無規共聚物纖維編織成網孔為50μm2的纖維網捲成橢園柱體支架，在支架中種植成肌細胞後，在強度為100％、頻率為2Hz的應變場和場強為0.1特斯拉、頻率為50Hz的電磁場複合作用下進行三維細胞培養。
實施例6.一種複合場三維細胞培養裝置(見附
圖1-7)其裝置的結構同實施例1，三維基質支架材料由直徑為80μm的不可降解聚合物纖維，如聚甲基丙烯酸羥乙基酯纖維編織成網孔為1000μm2的纖維網捲成三稜柱體支架，在支架中種植成骨細胞後，在強度為0.5％、頻率為0.2Hz的應變場和場強為0.08特斯拉、頻率為200Hz的電磁場複合作用下進行三維細胞培養。
實施例7.一種複合場三維細胞培養裝置(見附
圖1-7)其裝置的結構同實施例1，三維基質支架材料由可降解聚合物包埋不可降解聚合物構成的直徑為100μm的纖維，如聚乳酸與聚羥基乙酸共聚物包埋聚己內醯胺纖維編織成網孔為1000μm2的纖維網捲成長方體支架，在支架中種植肺泡細胞後，在強度為80％、頻率為1.5Hz的應變場和場強為0.06特斯拉、頻率為150Hz的電磁場複合作用下進行三維細胞培養。
權利要求1.一種複合場三維細胞培養裝置，其特徵在於由微處理器系統1分別控制步進電機2帶動連杆機構3上的絲槓4作周期性往復運動和控制直流電源5，輸出脈衝電流，使繞在固定架6上的亥姆霍茲線圈組7、8、9、10產生脈衝電磁場；組織反應器11是園柱形玻璃培養瓶，兩端分別開有小孔固定夾持具12和供絲槓伸出，種植有細胞13的三維基質支架材料14置於培養液15中，兩端由夾持具12和16固定，17為培養瓶蓋，固定在絲槓上的三維基質支架材料隨絲槓運動產生動態應變場，應變場與電磁場複合作用於支架材料中的細胞，組織反應器置於CO2培養箱18中以保證細胞生長的外界條件，培養箱中設有散熱器19，培養箱上有專用孔20供管線進出，其具體的控制部分、機械部分、電磁部分和組織反應器部分分述如下(1.1)控制部分是由硬體部分和軟體部分組成(1.1.1)硬體部分是由一片低功耗8位單片微處理器、一個LCD液晶顯示器、一個鍵盤監控接口，一個過零檢測位置的光電信號檢測電路，步進電機各相細分值鎖存器，功率放大器，以及觸發脈衝信號驅動電路、VMOS開關管、直流電源及亥姆霍茲線圈組成，(1.2)機械部分是由位於密封腔21內的步進電機2帶動轉動圓盤22上的滑槽23使連接的驅動臂24和連杆25驅動帶有運動軸承26的推動杆27作周期性往復運動，固定在推動杆上的絲槓4及其連接的支架材料14與推動杆一起運動，設有標尺28指示材料伸縮長度，轉動園盤上有偏心孔29，由偏心距調節鈕30調節偏心距，滑槽的支點31位於驅動臂上，各部件由緊固螺釘32固定，33為滑動軸，34為絕熱墊，35為機座，進氣管36有兩個，排氣管37有一個，進、排氣管連同控制步進電機的導線一起從CO2培養箱的專用出孔20引出，(1.2.1)連杆機構作周期性往復運動的幅度和頻率由電機驅動的圓盤的偏心距和轉速決定，電機驅動園盤的偏心距0、2、4、6、8、10、15、20mm，共8檔，電機的轉速為0～300轉/分，應變場強度0～100％，頻率0～5Hz，應變場強度和頻率獨立變化，(1.3)電磁部分是由微處理器輸出觸發脈衝信號，控制電源輸出電流驅動繞在固定架上的亥姆霍茲線圈組，以產生電磁場，電磁場的強度與流過亥姆霍茲線圈的電流成正比，通過調節直流電源輸出電流大小來調節電磁場強度，通過調節觸發脈衝信號的頻率來調節電磁場頻率，(1.4)組織反應器是園柱形培養瓶，培養瓶蓋蓋於培養瓶上，培養瓶兩端分別開有小孔固定夾持具12和供絲槓4伸出，絲槓與小孔的縫隙用封口膜作動態密封，種植有細胞的三維基質支架置於培養液中，兩端由夾持具12和16固定，三維基質支架是由直徑為5～100μm的聚合物纖維編織成網孔為4～1000μm2的纖維網構成，組織反應器置於CO2培養箱中以保持適於細胞生長的CO2濃度和有溼度的空氣環境，電磁場和應變場複合作用於組織反應器的支架材料中的細胞，(1.4.1)培養條件CO2濃度5～10％，溫度35～37℃，相對溼度90％以上。
2.根據權利要求1所述的複合場三維細胞培養裝置，其特徵在於聚合物纖維網可以捲成長方體支架、園柱體支架、稜柱體支架、橢園柱體支架。
3.根據權利要求1所述的複合場三維細胞培養裝置，其特徵在於在連杆機構的推動杆上並聯有兩套以上的組織反應器及亥姆霍茲線圈組。
專利摘要本實用新型是將組織細胞種植在三維基質支架中,置於應變場和電磁場中,使細胞取向生長,提高其代謝,促進其分泌功能,以構建出具有特定形態和功能的組織替代物的裝置。本設計由微機系統、功率放大器等組成的控制部分,由步進電機、連杆機構構成的機械部分,由直流電源、亥姆霍茲線圈組成的電磁部分,由培養瓶、種植有細胞的三維基質支架等構成的組織反應器部分構成。結構簡單、使用方便,應用廣泛,給組織缺損病人帶來福音。
文檔編號C12N1/00GK2373453SQ98229818
公開日2000年4月12日 申請日期1998年11月5日 優先權日1998年11月5日
發明者秦廷武, 楊志明 申請人:華西醫科大學附屬第一醫院