一種酵母融合菌株及其發酵造紙汙泥水解液得到乙醇的方法
2023-04-23 00:09:41 5
專利名稱：一種酵母融合菌株及其發酵造紙汙泥水解液得到乙醇的方法
技術領域：
本發明涉及一種菌株及其發酵方法，特別是一種酵母融合菌株及其發酵造紙汙泥水解液得到乙醇的方法。
背景技術：
傳統乙醇發酵中酒精酵母僅僅可以將葡萄糖等己糖轉化成乙醇，而對於木糖等戊糖卻無法利用，這樣纖維素糖化液中約30%左右的糖類就不能被轉化成燃料乙醇，嚴重製約了纖維素燃料乙醇的產業化進程。自然界能發酵木糖產乙醇的微生物並不多，選 育高效的木糖發酵菌株可有效提高對纖維素類可再生資源的利用率。工業上的釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)能厭氧發酵葡萄糖產生酒精，目耐酒精能力較高，但不能發酵木糖產生酒精。自然界中存在的木糖發酵菌株，如樹幹畢赤酵母(Pichia stipitis)、管囊酵母(Pachysolen tannophilus)以及休哈塔假絲酵母(Candida shehatea),多需要在微好氧條件下發酵木糖產生乙醇，其供氧條件難以精確控制，菌株的酒精耐受能力也較差，影響了其在實際生產中的應用。微生物原生質體融合技術始於20世紀70年代，由於這項技術與常規育種方法相比更容易實現基因交流和重組，，獲得性狀優良的雜種，因而該項技術受到了國內外廣大學者的重視，已被廣泛應用於育種領域。本專利通過使用原生質體融合技術，將畢赤酵母和工業釀酒酵母的優良性狀融合起來，獲得既能有效地厭氧發酵葡萄糖和木糖的混合液，又有較高的酒精耐受能力的酵母新菌株，為纖維素水解物特別是造紙汙泥水解液的乙醇發酵奠定基礎。
發明內容
本發明的目在於克服現有技術存在的上述不足，提供一株酵母融合菌株Saccharomyces cerevisiae SHY07-1,該菌株能夠將木糖轉化為乙醇，具有較好的酒精耐受能力。本發明的另一目的是通過利用該酵母融合菌株Saccharomyces cerevisiaeSHY07-1發酵造紙汙泥水解液得到乙醇的方法。本發明的酵母融合菌株Saccharomyces cerevisiae SHY07-1是通過原生質體融合技術得到的一株樹幹畢赤酵母(Pichia stipitis)和工業釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)融合子，具有較好的木糖代謝能力和酒精耐受能力。並且通過長時間的在桉木抽提液中馴化而篩選得到的。本發明中所用的原生質體融合方法是傳統的微生物菌種育種方法，包括原生質體的製備，原生質體的滅活以及聚乙二醇(PEG)誘導融合技術。本發明中的酵母融合菌株Saccharomyces cerevisiae SHY07-1 於 2011 年 9 月 29日保藏在中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC M 2011337，保藏地址為中國武漢。該菌株的菌落質地均勻，表面光滑，邊緣平整。本發明以Saccharomyces cerevisiae SHY07-1為發酵菌株，以pH值3 6的造紙汙泥水解液作為發酵培養基，不添加任何其他營養物質，在25-37°C下厭氧發酵24-96h，搖床的轉速為100-300r/min,然後通過蒸懼可以得到乙醇。本發明通過厭氧發酵技術，提供一種利用纖維素廢棄物(造紙汙泥)水解液，以融合菌株Saccharomyces cerevisiae SHY07-1為生產菌株,通過工藝優化發酵生產乙醇。與現有技術相比，本發明具有如下優點和技術效果(I)構建的融合菌株能夠較好利用混合糖中的木糖，混合糖(10g/L纖維二糖，60g/L葡萄糖和40g/L木糖,20g/L酵母粉，10g/L蛋白腖和3g/L玉米漿)中木糖在24h內能被完全利用，乙醇濃度達到45g/L以上，且具有較好的乙醇耐受能力；(2)馴化的融合菌株能夠以造紙汙泥水解液為原料，無需添加營養物，無需脫毒，直接發酵得到乙醇，乙醇濃度達到40g/L以上。
圖 I 為融合菌株 Saccharomyces cerevisiae SHY07-1 (CCTCC M 2011337)利用混 合糖液進行酒精發酵的曲線。
具體實施例方式下面結合附圖和實施例對本發明作進一步詳細的描述，但本發明的實施方式不限於此。實施例I :融合菌株Saccharomyces cerevisiae SHY07-1的構建和篩選融合菌株Saccharomyces cerevisiae SHY07-1的構建和篩選按照以下步驟進行I、單倍體細胞分離。在生孢培養基(其中按質量體積比g/ml計，醋酸鈉0. 82%,氯化鉀I. 86%，硫酸鎂0. 022%，葡萄糖0. 1%，瓊脂2%，pH 6. 0，115°C滅菌30min)上誘導酵母形成子囊，，用I. 5% (以培養基為基準，按質量體積比g/ml計)蝸牛酶破壁後，分離由子囊孢子形成的單倍體細胞小菌落。回塗生孢培養基，培養14d以上無孢子形成的即確認為單倍體。2、原生質體的製備。培養至對數生長期的菌體中加入0. 2% (以培養基為基準，按質量體積比g/ml計)P -巰基乙醇進行預處理，處理15min後再用PB緩衝溶液(0. 2mol/LNa2HPO412. 3ml, 0. 2mol/LNaH2P0487. 7ml，混勻，pH 5. 8)洗滌，加入 2% (以培養基為基準，按質量體積比g/ml計)蝸牛酶-PBS溶液(在PB緩衝液中添加KCl至濃度為0. 7mol/L)，振蕩酶解，定時檢查酶解情況。當觀察到的酵母絕大多數轉為原生質體時，停止酶解，離心去酶，然後用PBS溶液洗滌2次，加入PBS溶液，使菌體恢復到原來的細胞濃度。3、樹幹畢赤酵母(Pichia stipitis)的紫外滅活。將製備好的原生質體菌液用PBS緩衝溶液稀釋成IO7個/ml，取3ml於無菌平皿中，並放置於磁力攪拌器上進行不同時間的紫外線照射處理(紫外燈的功率為30W，照射的距離為30cm)，用PBS溶液進行適當稀釋後塗於YEI3DS (以培養基為基準，按質量體積比g/ml計，葡萄糖2 %，蛋白腖2 %，酵母膏1%，15%的蔗糖，2%瓊脂，115°C滅菌30min)平板上。同時以未經照射的原生質體以同樣的倍數稀釋後塗於YEPDS平板上，作為對照。28°C條件下避光培養2 3d，待長出菌落後，計算原生質體致死率及確定最佳誘變時間。4、工業釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)原生質體的高溫滅活。取原生質體菌懸液3mL於試管中，分別於50、60、70°C水浴維持30、40和50min，取ImL樣品適當稀釋後塗布於YEPDS液體培養基平板上，28°C培養3 5d，觀察原生質體的滅活效果。5、雙滅活原生質體的融合及再生。將滅活的原生質體等量混合，1000r/min離心5min後，加入聚乙二醇(PEG)，30°C恆溫40min，用PBS離心洗滌兩次，再用PBS稀釋塗布於YEPDS培養基上，28°C培養5 7d，使融合子再生。6、融合子的篩選及鑑定。將再生平板上長出的菌落接種到YEPDS培養基上，28°C培養待長出菌落後倒入IOmL氯化三苯基四氮唑鹽酸鹽(TTC)培養基(TTC 0. 5g，葡萄糖5g，瓊脂15g，蒸餾水1000ml，115°C滅菌30min)，覆蓋菌落，避光保溫2h，從平板中挑出顏色較深的菌株，經活化後，以8%的接種量接種到混合糖發酵培養基中，30°C，150r/min厭氧發酵72h。發酵結束後，測定其酒精度、木糖含量等重要指標。融合子的鑑定採用酯酶同工酶法鑑定。7、融合子的馴化。將融合子從YEH)液體培養基(以培養基為基準，按質量體積比g/ml計，葡萄糖2%，蛋白腖2%，酵母膏1%，15°C滅菌30min)轉接入混合糖培養基(以培養基為基準，按質量體積比g/ml計，葡萄糖2 %，木糖2 %，蛋白腖2 %，酵母膏I %，115°C滅菌30min)，連續轉接10天後接入桉木抽提液培養基(以培養基為基準，按質量體積比g/ml計主要成分為1%木糖，0.5%酵母膏)中，進行長時間(155天)的連續馴化。8、融合酵母的酒精發酵。通過上述方法得到的融合菌株Saccharomycescerevisiae SHY07-1表現出較好的木糖代謝能力。表I是融合酵母在不同pH條件下對造紙汙泥酶解液(纖維二糖7. 6g/L,葡萄糖56. 3g/L,木糖21. 7g/L)進行酒精發酵的結果(葡萄糖、木糖、乙醇生成速率為發酵6h後取樣測定值)，表明融合酵母在pH 5. 5條件下能夠較好的利用木糖。表I
權利要求
1.一種酵母融合菌株cerevisiae SHY07-1,於 2011 年 9 月 29 日保藏在中國典型培養物保藏中心，保藏地址為中國武漢，保藏編號為CCTCC M 2011337。
2.一種利用權利要求I所述的酵母融合菌株發酵造紙汙泥水解液得到乙醇的方法，其特徵在於，以PH值:Te的造紙汙泥水解液作為發酵培養基，在25-37°C下厭氧發酵24-96 h，搖床的轉速為100-300r/min,然後通過蒸懼得到乙醇。
全文摘要
本發明涉及一種酵母融合菌株及其發酵造紙汙泥水解液得到乙醇的方法，該酵母融合菌株Saccharomycescerevisiae SHY07-1於2011年9月29日保藏在中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC M2011337，具備較好的轉化木糖為乙醇的能力。該酵母融合菌株發酵造紙汙泥水解液得到乙醇的方法如下以pH值3~6的造紙汙泥水解液作為發酵培養基，不添加任何其他營養物質，在25-37℃下厭氧發酵24-96h，搖床的轉速為100-300r/min，然後通過蒸餾可以得到乙醇。水解液中的木糖和葡萄糖能夠較好的轉化為乙醇。
文檔編號C12N1/18GK102703335SQ20111030497
公開日2012年10月3日 申請日期2011年10月10日 優先權日2011年10月10日
發明者朱明軍, 祝智勝 申請人:華南理工大學