利用超聲結合edta溶液去除狂犬病疫苗製品中殘留dna的方法

2023-04-22 18:55:31 3

專利名稱：：利用超聲結合edta溶液去除狂犬病疫苗製品中殘留dna的方法
技術領域：
：本發明涉及在疫苗製品中去除宿主DNA及雜蛋白的方法，具體說是利用超聲結合EDTA溶液去除狂犬病疫苗製品中殘留DNA的方法。EDTA溶液是一種絡合劑，化學名稱為乙二胺四乙酸或乙二胺四乙酸二鈉，本發明中提到的EDTA可以是乙二胺四乙酸，也可以是乙二胺四乙酸二鈉，或者是二者的混合物。
背景技術：
：狂犬病疫苗是將狂犬病毒接種於適合的動物細胞上，經繁殖後病毒釋放到培養液中，此間一些殘餘的宿主細胞或其碎片也會隨著混在培養液中.經澄清，濾過，濃縮純化後，提取得到狂犬病病毒疫苗原液中，會產生游離的宿主DNA及與抗原蛋白結合的宿主DNA，原液中還含有大量的宿主蛋白，濃縮純化工藝會將一定比例的游離的DNA除去，但仍會有殘餘DNA存在，特別是與病毒或抗原蛋白結合的DNA會殘留在純化原液中，如去除不徹底，這部分DNA會隨著疫苗一起被注入到人體內，可能會在人體內引起不良反應，或具有導致癌症發生的可能。目前狂犬病疫苗傳統工藝的提取普遍採用簡單超濾濃縮、分子篩層析純化，使用這種工藝提取得到的狂犬病疫苗，存在以下缺陷1、病毒疫苗提取後殘留的宿主DNA含量過高。2、病毒疫苗在提取後仍含有過高的宿主蛋白，去除雜蛋白率不高，導致疫苗在臨床使用後有較大的副作用。3、上述缺陷，影響了病毒疫苗產品的質量，制約了疫苗產品的生產。為此許多人在提取過程中，改變超濾濃縮的倍數，對層析柱連接方式進行嘗試，對平衡鹽PH值進行調節，比如使用傳統工藝的分子篩層析對狂犬病疫苗濃縮液進行純化，具體例如，選取超濾濃縮25倍的狂犬病疫苗濃縮液(指濃度是收穫液的25倍)40ml，批號是S-20100201，通過XK50層析柱，S印harose4FF凝膠層析純化，紫外檢測系統檢測範圍設定為0.2A，輸出設定為100mV，記錄儀紙速設定為2cm/h。用pH7.6的10mmol/LPBS作流動相，收集第一個吸收峰，即狂犬病病毒蛋白吸收峰，收集到的狂犬病疫苗純化液批號為S-20100202。將S-20100201、S-20100202分別經行抗原含量、DNA殘留量檢測。檢測數據見表l，DNA雜交膜見附圖5，分子篩層析純化圖譜見附圖1;再比如，使用超聲波細胞粉碎機超聲處理狂犬病疫苗濃縮液，再使用傳統工藝的分子篩層析純化對超聲處理後的狂犬病疫苗濃縮液進行純化，具體例如，選取超濾濃縮25倍的狂犬病疫苗濃縮液(批號S-20100201)40ml，使用①6變幅杆的Scientz-IID型超聲波細胞粉碎機對狂犬病疫苗濃縮液進行超聲處理，在冰浴保護下進行超聲，保證濃縮液溫度不超過26t:，設置超聲功率為600W(64%)，工作時間2s，間隙時間3s，總工作時間20min(240次)，得到的超聲後濃縮液批號為S_20100203。按照上述同樣方法理狂犬病疫苗濃縮液40ml，通過XK50層析柱，S印harose4FF凝膠層析純化，紫外檢測系統檢測範圍設定為0.2A，輸出設定為100mV，記錄儀紙速設定為2cm/h。用pH7.6的10mmol/LPBS作流動相，收集到純化液S-20100204。將S-20100203、S-20100204分別經行抗原含量、DNA殘留量檢測。檢測數據見表l，DNA雜交膜見附圖5，分子篩層析純化圖譜見附圖2。結果僅取甚微的效果，沒有在實質上解決問題。
發明內容為了實現在處理狂犬病疫苗的過程中儘可能不損失抗原，即不影響疫苗製品的藥效，有效地去除雜蛋白及殘留宿主DNA的目標，本發明的目的在於提供一種方法，即向狂犬病疫苗濃縮液中加入乙二胺四乙酸(EDTA)溶液，以期達到保護病毒，分散病毒團塊，再使用一定頻率及一定強度的超聲波處理，將DNA分子打成小片段，再用分子篩柱層析達到將小分子DNA片段去除的目的.從而達到成品狂犬病病毒疫苗DNA殘餘量達到合格標準。本發明的技術方案如下本發明的技術方案是以狂犬病疫苗濃縮液為原料，向狂犬病疫苗濃縮液中加入EDTA溶液，加入後使EDTA的最終濃度為0.5-1000mmol/L，二者反應後，再使用超聲波細胞粉碎機超聲處理狂犬病疫苗濃縮液，最後使用分子篩層析純化對超聲處理後的狂犬病疫苗濃縮液進行純化。利用EDTA螯合二價陽離子，有助於DNA分子的分散，有助於病毒結團後的分散，有助於對病毒的保護，有助於已結合到病毒體上的DNA的解離，同時超聲處理時將宿主基因組DNA進一步打碎，經過分子篩層析純化則更易於被去除掉.在合理的調整超聲頻率，強度及作用時間，可選出對DNA破壞最大，而對病毒本身無損害的最佳條件。與現有技術相比，本發明的創新之處在於，在保證疫苗抗原原始結構的前提下，有效去除宿主DNA的含量，突破疫苗製品的質量瓶頸，提高產品質量及合格率。下面結合實施例及圖譜詳盡說明本發明。圖1是狂犬病疫苗濃縮液分子篩層析純化後的圖譜。圖2是狂犬病疫苗濃縮液超聲後，再進行分子篩層析純化的圖譜。圖3是在狂犬病疫苗濃縮液加入EDTA溶液(終濃度1Ommol/L)後進行超聲處理，最後進行分子篩層析純化的圖譜。圖4是狂犬病疫苗濃縮液加入EDTA溶液(終濃度lmmol/L)後進行超聲處理，最後進行分子篩層析純化的圖譜。圖5是DNA殘留量檢測圖譜。圖6是DNA的瓊脂糖凝膠電泳圖譜。具體實施例方式以下實施例詳細說明了本發明，但不用於限制本發明的範圍。本實施例採用常規實驗技術，這些均是本
技術領域：
人員所熟悉的，可以按照本實施例使用材料廠商所提供的說明書即可進行。實施例一選取超濾濃縮25倍的狂犬病疫苗濃縮液40ml，用移液槍加入100mmol/L的EDTA溶液4.444ml，使EDTA的終濃度為1Ommol/L，搖勻後在室溫下靜置40min，然後使用①6變幅杆的Scientz-IID型超聲波細胞粉碎機對狂犬病疫苗濃縮液進行超聲處理，在冰浴保護下進行超聲，保證濃縮液溫度不超過26t:，設置超聲功率為600W(64%)，工作時間2s，間隙時間3s，總工作時間20min(240次)，得到的超聲後濃縮液批號為S_20100205。再通過XK50層析柱，S印harose4FF凝膠層析純化，紫外檢測系統檢測範圍設定為0.2A，輸出設定為100mV，記錄儀紙速設定為2cm/h。用pH7.6的1Ommol/LPBS作流動相，收集到純化液S-20100206。實施例二選取超濾濃縮25倍的狂犬病疫苗濃縮液40ml，用移液槍加入1Ommol/L的EDTA溶液4.444ml，使EDTA的終濃度為lmmol/L，搖勻後在室溫下靜置40min，然後使用①6變幅杆的Scientz-IID型超聲波細胞粉碎機對狂犬病疫苗濃縮液進行超聲處理，在冰浴保護下進行超聲，保證濃縮液溫度不超過26°C，設置超聲功率為600W(64%)，工作時間2s，間隙時間3s，總工作時間20min(240次)，得到的超聲後濃縮液批號為S_20100207。再通過XK50層析柱，S印harose4FF凝膠層析純化，紫外檢測系統檢測範圍設定為0.2A，輸出設定為100mV，記錄儀紙速設定為2cm/h。用pH7.6的lmmol/LPBS作流動相，收集到純化液S_20100208。將S-20100205、S_20100206、S_20100207、S-20100208分別經行抗原含量、DNA殘留量檢測。檢測數據見表1，DNA雜交膜見附圖5，S-20100206分子篩層析純化圖譜見附圖3、S-20100208分子篩層析純化圖譜見附圖4。表1:S-20100201S-20100208抗原含量、DNA殘留量檢測結果tableseeoriginaldocumentpage5tableseeoriginaldocumentpage6通過實驗結果，分析抗原回收率及DNA殘留量，比較進過不同工藝對相同狂犬病疫苗濃縮液處理後宿主基因組DNA去除情況，數據如表2表2:不同工藝對相同狂犬病疫苗濃縮液處理後檢測數據比較tableseeoriginaldocumentpage6由表2可知，在狂犬病病毒抗原幾乎無損失的前提下，濃縮液經過超聲處理後再純化，宿主DNA去除效果明顯好於常規工藝的層析純化；加入EDTA後超聲，再經行純化，宿主DNA去除效果又優於濃縮液經過超聲處理後再純化的純化液。結合分子篩層析純化圖譜，濃縮液直接層析純化的狂犬病毒蛋白吸收峰高於濃縮液經過超聲處理後再純化的狂犬病毒蛋白吸收峰，濃縮液經過超聲處理後再純化的狂犬病毒蛋白吸收峰高於濃縮液加入EDTA後超聲，再經行純化的狂犬病毒蛋白吸收峰，狂犬病毒蛋白吸收峰的高度隨著加入EDTA的濃度增加而降低。綜上，EDTA溶液在濃縮液超聲過程中有影響宿主DNA與狂犬病抗原結合，使DNA在超聲的處理下更容易破碎，達到去除更多宿主DNA的目的。最後，DNA的瓊脂糖糖凝膠電泳檢測超聲破碎的效果；狂犬病疫苗濃縮液經超聲處理後，宿主基因組DNA分子被打斷，變成分子量更小的核酸分子。為了檢測超聲破碎的效果，對加入EDTA(終濃度為1Ommol/L)再超聲的樣品進行核酸電泳，並與超聲前的樣品對比，檢測超聲破碎的效果。如附圖6所示，狂犬病疫苗常規濃縮液在>2000bp處有塗抹帶，加入EDTA(終濃度為1Ommol/L)再超聲的樣品在<lOObp處有條帶。瓊脂糖凝膠電泳圖譜見附圖6。上述蛋白含量檢測方法為《中華人民共和國藥典》2005版三部附錄中要求的Lowery法；抗原含量檢測方法為《中華人民共和國藥典》2005版三部附錄中要求的ELISA法；DNA檢測方法是按照中國藥品生物製品鑑定所2009年最新提供的《Vero細胞DNA殘留量測定標準操作規程》進行檢測。權利要求一種利用超聲結合EDTA溶液去除狂犬病疫苗製品中殘留DNA的方法，其特徵是以狂犬病疫苗濃縮液為原料，向狂犬病疫苗濃縮液中加入EDTA溶液，加入後使EDTA的最終濃度為0.5-1000mmol/L，二者反應後，再使用超聲波細胞粉碎機超聲處理狂犬病疫苗濃縮液，最後使用傳統工藝的分子篩層析純化對超聲處理後的狂犬病疫苗濃縮液進行純化。2.按照權利要求1所述的利用超聲結合EDTA溶液去除狂犬病疫苗製品中殘留DNA的方法，其特徵是選取超濾濃縮25倍的狂犬病疫苗濃縮液40ml，用移液槍加入lOOmmol/L的EDTA溶液4.444ml，使EDTA的終濃度為10mmol/L，搖勻後在室溫下靜置40min，然後使用①6變幅杆的Scientz-IID型超聲波細胞粉碎機對狂犬病疫苗濃縮液進行超聲處理，在冰浴保護下進行超聲，保證濃縮液溫度不超過26°C，設置超聲功率為600W，工作時間2s，間隙時間3s，總工作時間20min，得到的超聲後濃縮液批號為S_20100205。再通過XK50層析柱，S印harose4FF凝膠層析純化，紫外檢測系統檢測範圍設定為0.2A，輸出設定為lOOmV，記錄儀紙速設定為2cm/h。用pH7.6的1Ommol/LPBS作流動相，收集到純化液S_20100206。3.按照權利要求1所述的利用超聲結合EDTA溶液去除狂犬病疫苗製品中殘留DNA的方法，其特徵是選取超濾濃縮25倍的狂犬病疫苗濃縮液40ml，用移液槍加入1Ommol/L的EDTA溶液4.444ml，使EDTA的終濃度為lmmol/L，搖勻後在室溫下靜置40min，然後使用①6變幅杆的Scientz-IID型超聲波細胞粉碎機對狂犬病疫苗濃縮液進行超聲處理，在冰浴保護下進行超聲，保證濃縮液溫度不超過26t:，設置超聲功率為600W，工作時間2s，間隙時間3s，總工作時間20min，得到的超聲後濃縮液批號為S_20100207。再通過XK50層析柱，S印harose4FF凝膠層析純化，紫外檢測系統檢測範圍設定為0.2A，輸出設定為100mV，記錄儀紙速設定為2cm/h，用pH7.6的lmmol/LPBS作流動相，收集到純化液S-20100208。全文摘要本發明提供了一種利用超聲結合EDTA溶液去除狂犬病疫苗製品中殘留DNA的方法，所要解決的問題是濃縮、純化等提取狂犬病疫苗方法只能將一定比例的游離DNA去除，不能去除與抗原蛋白結合的宿主DNA；臨床不良反應現象屢見不鮮。本發明的要點是向狂犬病疫苗濃縮液中加入EDTA溶液，再使用超聲波對狂犬病疫苗進行超聲處理，使宿主DNA在超聲作用下更易被破碎，通過層析純化去除宿主DNA。其效果是在保證疫苗效價的前提下，提高疫苗產品質量，去除大量雜蛋白及宿主DNA，使疫苗製品中殘餘DNA含量達到了100pg/劑以下，解決了目前狂犬病疫苗行業面臨的質量問題。文檔編號A61P31/14GK101780276SQ20101013255公開日2010年7月21日申請日期2010年3月26日優先權日2010年3月26日發明者張譯,徐德啟,汪春義,王凱,程曉耕,蘇文全申請人:遼寧依生生物製藥有限公司