3‑溴丙酮酸在製備治療肺動脈高壓的藥物中的應用的製作方法
2023-04-23 10:28:18 1
本發明屬於藥物化學領域，涉及一種化學藥物3-溴丙酮酸，具體來說是3-溴丙酮酸在製備治療肺動脈高壓的藥物中的應用。
背景技術：
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3-溴丙酮酸是一種烷化劑，是細胞代謝產物丙酮酸、乳酸的類似物，其能夠作用於糖酵解途徑，與己糖激酶(HK-2)活性部位的-XH基結合(EXH+BrCH2-CO-COOH→EX-CH2-CO-COOH+HBr)使該酶的活性被抑制，可有效地減少細胞內ATP的產生。3-溴丙酮酸從化學性質及結構上都與乳酸非常相似，而乳酸是葡萄糖經過糖酵解代謝後的最終產物，這使得3-溴丙酮酸可以藉助與乳酸相同的載體進出細胞，從而發揮抗腫瘤的作用。3-溴丙酮酸對於肝癌、乳腺癌以及多藥耐藥表型的腫瘤細胞具有高效、低毒的作用。但對於肺血管疾病和肺動脈高壓的治療作用目前尚未見報導。
技術實現要素：
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本發明的目的在於提供3-溴丙酮酸在製備治療肺動脈高壓的藥物中的應用，所述的這種3-溴丙酮酸在製備治療肺動脈高壓病的藥物中的應用要解決現有技術中治療肺動脈高壓藥物效果不佳的技術問題。
本發明提供了3-溴丙酮酸在製備治療肺動脈高壓的藥物中的應用。
本發明和已有技術相比，其效果是積極和明顯的。本發明通過大鼠肺動脈高壓模型，給予3-溴丙酮酸幹預治療，明確了3-溴丙酮酸對於肺血管的作用。3-溴丙酮酸可降低肺動脈高壓大鼠的平均肺動脈壓力和肺血管阻力，增加心輸出量，抑制肺動脈平滑肌細胞的異常增殖，促進凋亡，顯著減輕肺血管重構，通過抑制己糖激酶表達治療肺動脈高壓。
附圖說明：
圖1是肺組織蘇木精-伊紅(HE)染色結果。
圖2是肺組織免疫組織化學增殖因子(PCNA)結果。
圖3是肺組織免疫組織化學凋亡(TUNEL)結果。
圖4是肺組織己糖激酶(HK-1和HK-2)蛋白表達結果。
具體實施方式：
實施例1
一、材料與方法
1.1建立大鼠肺動脈高壓模型
雄性SPF級SD大鼠(上海中科院動物房提供)，體重200-220g。一次性皮下注射野百合鹼(Monocrotaline,MCT,60mg/kg)，3周後，隨機採用右心導管方法測定肺動脈壓力及血流動力學參數，鑑定是否造模成功。
1.2實驗分組及藥物幹預
(1)模型組(MCT組)：10隻大鼠，肺動脈高壓模型建立成功後，灌胃給予生理鹽水，連續3周。
(2)3-溴丙酮酸小劑量組(3-BrPA 15mg·kg·d組)：10隻大鼠，肺動脈高壓模型建立成功後，灌胃給予通心絡，連續3周。
(3)3-溴丙酮酸大劑量組(3-BrPA 30mg·kg·d組)：10隻大鼠，肺動脈高壓模型建立成功後，灌胃給予通心絡，連續3周
(4)正常對照組(Control組)：10隻大鼠，正常大鼠，灌胃給予生理鹽水(0.3ml·kg·d)，連續3周。
1.3血流動力學測定
1.3.1右心導管法測定給藥3周後各組動物的平均肺動脈壓(mean pulomonary arterial pressure,mPAP)、右心室收縮末期壓力(right ventricle systolic pressure,RVSP)、心輸出量以及心率等參數。具體方法如下：大鼠經戊巴比妥鈉(40mg·kg)腹腔麻醉，仰臥固定後分離右側頸外靜脈約1cm左右，結紮遠心端，並作「V」形切口，將與換能器連接並充滿肝素鹽水的右心導管(自製末端彎曲PE 50導管，內徑0.6mm，外徑0.9mm)插入，動物生理多導儀記錄右心室收縮末期壓力RVSP、肺動脈收縮壓(pulmonary arterial systolic pressure,PASP)、肺動脈舒張壓(pulmonary arterial diastolic pressure,PADP)，計算mPAP。
mPAP(mmHg)＝1/3PASP(mmHg)+2/3PADP(mmHg)
1.3.2心輸出量(Cardiac Output,CO)測定：熱稀釋法測定心輸出量。具體方法：將右心導管回抽至上腔靜脈，分離左側頸總動脈，結紮遠心端，剪口，將穿有溫度探測器的PE管插入胸主動脈或腹主動脈。用1ml針筒抽取0-4℃肝素化生理鹽水，迅速向上腔靜脈推進0.2-0.3ml，觀察並記錄溫度曲線的變化，計算心輸出量，同時計算肺血管阻力(pulmonary vessel resistance,PVR)。
PVR(Wood)＝mPAP(mmHg)/CO(ml·min)
1.4右心室肥厚指數(right ventricular hypertrophy index,RVHI)測定
血流動力學測定完畢後，開胸取出整個心臟，用預冷生理鹽水衝洗，沿著房室溝剪去心房及大血管根部，沿後室壁間溝將右心室游離壁分離，濾紙吸水後稱量右心室游離壁(RV)及左心室+室間隔(LV+S)的重量，並計算右心室肥厚指數。
右心室肥厚指數(RVHI)＝RV/(LV+S)。
1.5肺組織蘇木精-伊紅(HE)染色
處死大鼠後，取右肺中葉以10％中性甲醛溶液固定1天，石蠟包埋，沿肺門水平橫切，厚度約為5μm，進行HE染色。切片經常規二甲苯脫蠟，經各級乙醇至水洗，蘇木精染色5min，自來水衝洗。根據染色的深淺，用0.5％鹽酸乙醇分化，自來水浸泡15min，置伊紅液2min，常規脫水，透明，封片。
1.6肺小動脈血管形態分析
常規HE染色，隨機選取直徑100～200μm範圍的肺小動脈，運用IPP6.0圖像分析軟體測定血管壁厚度(wall thickness,WT)、血管外徑(external diameter,ED)、血管總面積(total area,TA)以及血管腔面積(lumen area,LA)，分析WT％和WA％等衡量血管重構的指標。
WT％＝(2×WT/ED)×100％
WA％＝[(TA-LA)/TA]×100％
1.7免疫組織化學檢查
將1.6中石蠟包埋組織切片用0.3％的過氧化氫甲醇溶液消除內源性過氧化物酶的影響，然後加入0.3％Triton X100增加細胞的通透性，清洗後，加入血清稀釋的一抗(分別為PCNA和TUNEL)，4℃存放24-48小時，加入相應的二抗。最後，加入ABC複合物，清洗後加入顯色液顯影。
1.8Western Blot蛋白免疫印跡檢查
肺組織在組織勻漿器中，冰上勻漿後，加入蛋白裂解液及PMSF，離心40取上清。以BSA為標準，用Bradford法對上清進行蛋白定量。取40μg蛋白樣品，進行SDS-PAGE電泳，轉移至硝酸纖維素薄膜，放入封閉液中37℃封閉，一抗4℃過夜，辣根過氧化酶標記二抗孵育1小時，用圖像分析測定各帶灰度值作定量分析。檢測的蛋白包括：己糖激酶-1和-2(HK-1和HK-2)和β-actin。
1.9統計學處理
數據均採用均值±標準差(X±S)表示，組間比較採用t檢驗，統計處理由SPSS10.0完成，以p<0.05為差異有統計學意義。
二、結果
2.1大鼠一般情況與死亡情況
對照組及通心絡給藥組大鼠體毛光澤，反應敏捷，飲食正常。MCT組大鼠逐漸變得虛弱，反應遲鈍，蜷縮少動，體毛暗淡無光澤。
實驗動物死亡情況：本實驗共用40隻SD大鼠，死亡2隻，均為MCT組，分別死於實驗第18天和20天。大鼠死亡前表現為呼吸困難、口唇發紺。解剖後可見胸腔積液，腹腔積液，肝臟淤血腫脹。取出心肺後，大體可見肺部瘀點瘀斑，短軸橫切心臟，可見右心室游離壁明顯肥厚，提示大鼠在肺動脈高壓病程中發生了右心衰竭。
2.2血流動力學變化
MCT組大鼠mPAP明顯高於對照組，模型建立成功。與MCT組相比，2個3-溴丙酮酸劑量組均可顯著降低肺動脈高壓大鼠的mPAP和RVSP(p<0.01或p<0.05)，明顯改善肺動脈高壓所致心輸出量減少，降低肺血管阻力(PVR)。(見表1)
表1各組大鼠血流動力學參數比較
p*<0.05,compared with control group；p*<0.01,compared with MCT group；
p#<0.05,compared with control group；p##<0.05,compared with MCT group；
2.3右心室肥厚指數和肺血管重構
一次性皮下注射MCT 21天後，可見明顯的右心室肥厚，RVHI為(0.32±0.03)，3-溴丙酮酸大劑量和小劑量組可明顯改善大鼠右心肥厚指數(p<0.05或p<0.01)。大鼠肺中小動脈圖像分析結果可見，3-溴丙酮酸可明顯改善肺動脈高壓大鼠的右心和肺血管重構。MCT組大鼠肺中小動脈WT％和WA％均明顯高於正常對照組。3-溴丙酮酸組大鼠肺中小動脈WT％和WA％均明顯低於MCT組(p<0.01)。(見表2)
表2各組大鼠中RVHI,WT％W和WA％比較
p*<0.05,compared with control group；p*<0.01,compared with MCT group；
p#<0.05,compared with control group；p##<0.05,compared with MCT group；
肺組織HE染色顯示，對照組大鼠肺小動脈內皮連續性好，細胞分布均勻，薄厚一致；MCT組大鼠內皮細胞連續性破壞，呈立方形或柱狀突向管腔，中層管壁厚度明顯增加，管腔面積明顯變小，伴有血管周圍炎。3-溴丙酮酸劑量組大鼠肺血管小動脈內皮連續性良好，管壁厚度較MCT組明顯減少，管腔變寬，血管周圍炎症減輕。(見圖1)
2.4肺動脈平滑肌細胞增殖和凋亡
肺動脈平滑肌細胞增殖染色(PCNA)結果表明，與正常組相比，MCT組增殖核抗原染色陽性的細胞核明顯增加(紅色箭頭所示)。與MCT組相比，使用了3-溴丙酮酸的各組增殖和抗原染色陽性的細胞核數量顯著降低。(見圖2)
肺動脈平滑肌細胞凋亡染色(TUNEL)結果可見，MCT組與正常組增殖核抗原表達未見差異，表明MCT組肺血管出現凋亡抵抗。然而，與MCT組相比3-溴丙酮酸各組肺動脈平滑肌細胞均出現明顯的染色陽性細胞核，即平滑肌細胞凋亡(紅色箭頭所示)。(見圖3)
2.5己糖激酶蛋白表達下調
與Control組相比，MCT組大鼠己糖激酶-1和-2(HK-1和HK-2)蛋白表達量均顯著升高。然而，與MCT組相比，兩個3-溴丙酮酸劑量組的HK-1和HK-2蛋白表達量均明顯上調。(見圖4)
三、結論
3-溴丙酮酸可降低肺動脈高壓大鼠的平均肺動脈壓力和肺血管阻力，增加心輸出量，抑制肺動脈平滑肌細胞的異常增殖，促進凋亡，顯著減輕肺血管重構，通過抑制己糖激酶表達治療肺動脈高壓。