一種具有抗衰老及美容作用的複合生物製劑的製作方法
2023-04-23 06:05:11 1
專利名稱：一種具有抗衰老及美容作用的複合生物製劑的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種生物製劑組合物，特別涉及一種具有抗衰老和美容作用的重組人表皮生長因子複合生物製劑。
背景技術：
Cohen和Levi Montalcin於1960年，在小鼠頜下腺純化神經生長因子NGF時發現，不含神經生長因子的一種組分注射到新生小鼠後可以引起眼瞼早開，門齒早萌，毛髮生長抑制以及生長遲緩。1962年Cohen報導了這種具有熱穩定和酸穩定的蛋白，可以促進眼瞼和門齒的發育。組織學研究表明，眼瞼早開是由於表皮厚度和角質化的特徵性增加引起的。皮膚或表皮組織塊體外培養的研究證實該蛋白對表皮生長具有直接的作用，因此將其命名為表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)。經過數十年的研究，目前已經發現EGF是一個蛋白質家族。Brown研究小組通過隨機研究顯示，重組人表皮生長因子(recombinant human epidermal growthfactor，rhEGF)具有明顯的促進創面癒合作用。Thornton研究小組以及其他研究小組研究發現rhEGF可以明顯促進大鼠II度燒傷以及淺I度創面癒合(P＜0.01)，對供皮區也有促進癒合的作用(P＜0.01)；而且rhEGF的促進作用主要表現在創面癒合的後期。在創面癒合早期，表層的壞死組織緊覆於創面，使局部應用的rhEGF無法穿透而作用到殘存的真皮層和皮膚附件的上皮細胞，只能待壞死組織溶解或脫落，創面出現明顯的皮島後才能發揮其促進生長作用。研究表明，在rhEGF臨床使用期間，使用者的肝、腎功能及血常規等均未發現異常，全身和局部無過敏反應，未見毒副作用發生。局部使用rhEGF後創面滲出明顯而且迅速減少，這可能與rhEGF促進上皮迅速再生等因素有關。
EGF對多種上皮細胞具有促進其有絲分裂作用，同時還刺激各種間質細胞增值，包括角膜內皮細胞、腸胃黏膜細胞、血管內皮細胞、血管平滑肌細胞、成纖維細胞和軟骨細胞，這就為整個表皮的生長提供了所需的基礎物質。除了促增殖作用外，EGF還能促進某些細胞如角膜內皮細胞和血管內皮細胞的遷移，這對於創傷的修復是必要的。EGF可促進角膜及皮膚創面上皮細胞及胃腸黏膜潰瘍創面的修復，促進表皮細胞增殖，並可通過刺激成纖維細胞和其他細胞的增殖，促進膠原的沉積。EGF在一定時期內可以非持續性地提高成纖維細胞的增殖的能力。EGF對真皮成纖維細胞的生長有極大地促進作用，促進了細胞周期蛋白Cyclin D1和CDk4的表達增強，細胞周期變短，增殖能力增強。Savage在1972年研究發現EGF可以促進角膜上皮增殖，很多學者採用角膜切口、角膜刮傷、角膜上皮切除以及鹼燒傷等動物角膜損傷模型也證實這一點。另外，在一些角膜上皮的非營養不良性疾病中還發現EGF對角膜損傷的修復有較好的促進作用。Brown等人1989年對12例整形外科手術和燒傷病人進行皮膚移植後，使用EGF可以明顯的促進創面癒合。除此之外，EGF還對胃潰瘍有明顯治療作用。
胃壁細胞、十二指腸黏膜上皮細胞上均有EGF受體。EGF由唾液直接進入消化道或由十二脂腸腺直接分泌於小腸而發揮對消化道黏膜的生物效應。EGF是一種重要的胃黏膜保護因子，通過與胃腸黏膜細胞上的特異性受體EGFR結合而發揮作用。胃液中EGF水平是潰瘍癒合質量中再生黏膜功能成熟度評價的重要指標之一。動物實驗表明，小鼠胃內灌注EGF可預防由阿斯匹林所誘發的胃潰瘍，而且，外源性EGF可明顯抑制藥物引起的胃和十二指腸潰瘍。
已有研究表明，消化性潰瘍患者胃液EGF含量比正常人明顯降低，提示EGF的降低可能與胃潰瘍的發生有一定的關係；胃潰瘍癒合後其胃液EGF含量亦明顯增高，表明EGF在潰瘍癒合中可能起作用。目前，根據實驗推測EGF參與消化性潰瘍修復的可能機制是①激活鳥氨酸脫羧酶(ODC)，增加黏膜DNA合成；②抑制胃酸分泌；③促進胃黏膜粘液糖蛋白的合成和分泌；④增加胃黏膜血流量。在臨床工作中可以通過動態監測胃液EGF含量來預測潰瘍發生的可能性，同時在治療過程中亦可以此來觀察藥物療效。
EGF是一種強有力的促細胞分裂、分化、增殖的因子，已知它對多種組織有促進增殖和刺激DNA合成的作用，通過作用於靶細胞膜上的特異性受體而發揮其促細胞生長的活性。體外研究表明，EGF能主動刺激皮膚上皮細胞和成纖維細胞的增殖、促進新生血管形成及核酸、蛋白質和羥脯氨酸的合成。動物試驗證實，極微量的重組人表皮生長因子(recombinant human epidermal growth factor，rhEGF)即能發揮作用，劑量增加反而因細胞膜上的EGF受體數目受到rhEGF「負調節」而減少影響其作用。
有資料顯示，EGF是通過細胞外基質(ECM)的改建而調控細胞的行為，或ECM的改建結果即是通過EGF的釋放而啟動了細胞表型的變化，ECM能分離EGF結合蛋白，即相關生長因子活性調控的理論。隨著細胞生物學和分子生物學技術的進展，細胞因子在創傷修復過程中的作用正逐漸被人們所重視。
胰島素由胰島β細胞分泌，胰島素原含有86個胺基酸，分子量約6,000，胰島素由51個胺基酸組成。不同動物其結構略有差異，但不影響其生理活性。胰島素能促進細胞對葡萄糖、胺基酸和離子的攝取，增強細胞內酪氨酸和色氨酸的磷酸化作用，調整調節酶的活性，刺激或抑制特異性基因的轉錄以及促進細胞的生長。局部使用可以促進傷口癒合，防止疤痕的形成和攣縮。
氫化可的松是由腎上腺皮質分泌的一種糖皮質激素，調節全身的糖、水、鹽代謝，臨床上使用可以抗炎症、抗過敏、抗毒等。氫化可的松能增加多種抗炎分子蛋白合成，如SLPT，促進炎症減輕或消失。另外，氫化可的松還可以通過抑制自由基的生成來減輕自由基對細胞的攻擊。一些學者發現血管源性水腫與周圍細胞外間質氧自由基清除程度密切相關，而氫化可的松是氧自由基非酶類清除劑，可直接清除OH2與LOO-等自由基。氫化可的松分子疏水基團嵌入膜雙分子疏水區多不飽和脂肪酸拱道中，使磷脂雙分子結合緊密，粘性增加，並阻斷花生四烯酸從細胞膜釋放，從而減輕氧自由基的攻擊。同時，氫化可的松不僅在富含磷脂環境中抑制鐵催化的脂質過氧化反應，在無膜成份參與下也可抑制該反應。氫化可的松經其受體介導使脂皮素及巨皮素合成及釋放增加，抑制磷酸二脂酶活性，從而阻斷及抑制前列腺素級聯反應，減少氧自由基及TXA2、白三烯以及PG的生成和釋放，從而降低血管通透性。氫化可的松可抑制巨噬細胞一氧化氮合成酶活性，減少巨噬細胞-NO及氧自由基的生成。在生物製劑中與其他成分聯合使用可以不僅促進潰爛處組織的快速修復，還保護新生組織不受自由基的攻擊和破壞。
人類長期罹患靜脈曲張、靜脈炎、靜脈血栓症等靜脈疾病，類風溼關節炎和糖尿病，導致機體或局部組織營養供給不足。疾病後期將不同程度地導致腿腳部皮膚潰瘍/潰爛長期不愈的症狀，這些患者大多數的預後為截肢。
潰瘍/潰爛是機體局部炎性壞死皮膚腐爛的結果。靜脈曲張/靜脈炎性潰瘍/潰爛是由一種慢性的靜脈機能不全造成的。下肢靜脈曲張是外科常見病之一，患病率在各國差別很大。許多歐美國家的發病率高達20％-40％，熱帶非洲僅為01％。例如，在英國50歲以上的人群中，50％的人有輕微的靜脈曲張症狀，其中10％住院治療。有5％的成年人不同程度地罹患慢性靜脈機能不全；女性患病率高於男性。在中國，張培華等調查15歲以上人群的發病率為8.6％，45歲以上為16.4％，由此推算中國現有病人約8000萬至1億例。長期靜脈過度緊張或靜脈回流不暢，就會在腿部的股靜脈、隱靜脈和腿彎部的靜脈部分較常發生靜脈疾病。10-25％的靜脈曲張患者同時罹患動脈疾病；12％的糖尿病和類風溼關節炎病患者同時罹患靜脈曲張或靜脈炎。到目前為止，導致靜脈曲張的病因還不清楚，可能與家族史、肥胖症、懷孕以及口服避孕藥等因素有關，同時長期站立的職業會加重靜脈曲張的症狀。
目前治療靜脈潰瘍的方法有以下幾種1.患者穿兩級或三級(梯級)有高彈性的襪子，以擠壓膝蓋以下的靜脈血管，以防壞死進一步發生；2.在患處十字交叉纏裹4層繃帶，分別為棉紗、crepe、Elset和Coban繃帶；這兩種治療要持續12周左右，大約有45％的患者症狀可以得到改善，有些患者潰瘍還可以癒合。3.手術切除對於淺表性靜脈曲張或靜脈炎患者可以切除淺表靜脈，但是治癒率僅僅為2％，而且4年後100％復發，有時可以將貫穿腿部的股靜脈全部抽出，但療效都不明顯；對於深層靜脈曲張或炎症的患者通常採用切除潰瘍、清除腐肉後移植顆粒性皮膚，但很少有治癒的；4.雷射照射治療至少3個月，可以減緩靜脈的壓力；5.蠅蛆治療法，蠅蛆可以有效清除創口腐肉幫助創口癒合。
以上所有的治療方法不是繁瑣費時，就是療效甚微，因此，有潰爛或潰瘍的患者要忍受多年的疼痛，給他們的精神造成巨大壓力，給生活帶來了很大不便。而且，靜脈疾病等一旦引起腿部和腳部的潰爛後，如果以上治療的療效特別緩慢或無效，潰爛會在原來壞死的基礎上繼續擴展，靜脈回流不暢營養供給不足更加劇了這種症狀的發展，最終導致患者高位截肢。
放射性皮膚潰瘍多見於放射性事故和腫瘤放療等引起的併發症，其特點為頑固性反覆發作、長期不癒合，最後可能發展為癌變。此病變發生發展的分子機制尚不清楚，更缺乏有效的治療手段。
發明創造內容本發明的目的是提供一種重組人表皮生長因子複合生物製劑。
本發明所提供的重組人表皮生長因子複合生物製劑，包括2-30ng/ml重組人表皮生長因子，2-10％D-葡萄糖，0-20％胎牛血清，0-10μg/ml胰島素，0-5μg/ml氫化可的松，0-100μg/ml氨苄青黴素和0-100IU/ml硫酸鏈黴素，溶劑為多重蒸餾水。
胺基酸的含量以胎牛血清(FBS，GIBCO)的添加含量計算。
其中，所述重組人表皮生長因子複合生物製劑，優選為包括5-10ng/ml重組人表皮生長因子，5％D-葡萄糖，0-20％胎牛血清，0-8μg/ml胰島素，0-2μg/ml氫化可的松，0-100μg/ml氨苄青黴素和0-100IU/ml硫酸鏈黴素。
當所述重組人表皮生長因子複合生物製劑，由5ng/ml重組人表皮生長因子，5％D-葡萄糖，5μg/ml胰島素，100IU/ml硫酸鏈黴素和多重蒸餾水組成時，可用於治療眼科疾病。
當所述重組人表皮生長因子複合生物製劑，由10％胎牛血清，5ng/ml重組人表皮生長因子，5％D-葡萄糖，1μg/ml氫化可的松，5μg/ml或8μg/ml胰島素，100μg/ml氨卞青黴素，100IU/ml硫酸鏈黴素和多重蒸餾水組成時，可用於治療靜脈曲張、靜脈炎等引起的潰爛和糖尿病後期併發症引起的潰爛，為達到更佳的治療效果，可配合輔助治療液5％D-葡萄糖或者5％D-葡萄糖+20％FBS，配合20％甘油水溶液+5％FBS(後者可以不用FBS)使用。
當所述重組人表皮生長因子複合生物製劑，由5％胎牛血清，5ng/ml重組人表皮生長因子，5％D-葡萄糖，3μg/ml胰島素，100μg/ml氨卞青黴素，100IU/ml硫酸鏈黴素和多重蒸餾水組成時，可用於治療健康創傷、燒傷和手術後刀口癒合，為達到更佳的治療效果，可配合輔助治療液5％D-葡萄糖或者5％D-葡萄糖+20％FBS使用。
當所述重組人表皮生長因子複合生物製劑，由5％胎牛血清，5ng/ml重組人表皮生長因子，5％D-葡萄糖，3μg/ml胰島素和多重蒸餾水組成時，可抗衰老、美容；為達到更佳效果可配合輔助液20％甘油水溶液+5％FBS使用。
當所述重組人表皮生長因子複合生物製劑，由10ng/ml重組人表皮生長因子，5％D-葡萄糖，2μg/ml氫化可的松和多重蒸餾水組成時，可用於治療胃潰瘍。
本發明的重組人表皮生長因子複合生物製劑主要以重組人表皮生長因子(hrEGF)為主要成分，添加包含人體所需的必需胺基酸和非必需胺基酸的胎牛血清(FBS)、右旋葡萄糖(D-glucose)、胰島素、氨苄青黴素、硫酸鏈黴素和氫化可的松，既提供了損傷/健康組織修復所需的生長因子，同時又提供了組織快速修復時所需的各種營養物質以及促進細胞利用這些營養物質的成分，從而使得由於長期靜脈曲張、靜脈炎、糖尿病後期、放射線等引起的潰瘍或潰爛可以快速癒合；使得褥瘡等類似皮膚創口快速癒合；使得燒傷或意外創傷可以快速癒合；使得胃潰瘍症狀減輕甚至康復；使得損傷性眼科疾病迅速康復；使得顏麵皮膚保持嬌嫩、皺紋減少以及色斑黯淡甚至消失。本發明的重組人表皮生長因子複合生物製劑可用於製備治療潰瘍、潰爛、創傷、燒傷的藥物；還可以用於生產抗衰老的化妝品和美容產品，使皮膚保持嬌嫩、皺紋減少、色斑黯淡甚至消失，皮膚最終有光澤有彈性；也可以用於製備治療損傷性眼科疾病的藥物。
具體實施例方式
以下供試人員均為志願者，使用後無任何不良的生理反應；rhEGF購自美國Sigma公司，貨號為E 9644，胺基酸的含量以胎牛血清(FBS，GIBCO)的添加含量計算。
實施例1、治療眼科疾病製劑的配方5ng/ml rhEGF+5％D-葡萄糖+5μg/ml胰島素+100IU/ml硫酸鏈黴素，基礎溶液為多重蒸餾水，混勻後過濾除菌，4℃冷藏。
使用前，需要在室溫放置5分鐘左右，然後滴眼，每次一滴，每天3-4次。特別是晚上臨睡前使用一次效果最佳。其治療眼科疾病的效果如表1所示，治療前由焊接造成的焊接工人的眼睛灼傷表現為眼睛充血，持續疼痛，久治不愈，使用該製劑1周後，症狀消失並痊癒且無反彈。
表1.治療眼科疾病的效果
實施例2、治療靜脈曲張、靜脈炎等引起的潰爛和糖尿病後期併發症引起的潰爛主製劑配方10％FBS+5ng/ml rhEGF+5％D-葡萄糖+1μg/ml氫化可的松+5μg/ml(8μg/ml)胰島素+100μg/ml氨卞青黴素+100IU/ml硫酸鏈黴素，基礎溶液為多重蒸餾水，混勻後過濾除菌，4℃冷藏。
輔助治療液5％D-葡萄糖+20％FBS，配合20％甘油水溶液，過濾除菌，4℃冷藏。
首先使用0.9％生理鹽水清洗創口(嚴重者首先使用雙氧水或75％酒精清洗)，然後將主製劑塗抹創口，每天早晚各一次。皮膚乾燥或已經形成痂皮的患者，還需使用輔助治療液塗抹以保持創口溼潤，促進吸收和療效。所有的患者使用主製劑的同時，需在主製劑使用的間隙使用輔助治療液塗抹，增加治療效果，每天3-4次。對於沒有潰爛口的壞死組織面，由於痂皮的存在妨礙了製劑有效成分的吸收，因此，可以採用皮下注射的方式，將主製劑直接注射到有活性的組織間隙，一天一次。注射劑量依據皮膚可吸收的程度適量注射，一般為0.05ml-0.1ml；注射點數視壞死面積的大小而定，一般為1點/cm2。該製劑治療靜脈曲張、靜脈炎引起的潰爛、糖尿病後期併發症引起的潰爛及褥瘡的效果如表2所示。
表2.治療靜脈曲張、靜脈炎引起的潰爛、糖尿病後期併發症引起的潰爛及褥瘡的效果
實施例3、治療健康創傷、燒傷和手術後刀口癒合主製劑配方5％FBS+5ng/ml重組人表皮生長因子+5％D-葡萄糖+3μg/ml胰島素+100μg/ml氨卞青黴素+100IU/ml硫酸鏈黴素，溶液過濾除菌，4℃冷藏。
輔助治療液5％D-葡萄糖或者5％D-葡萄糖+20％FBS。
首先使用0.9％生理鹽水清洗創口，然後將主製劑塗抹創口，每天早上一次，傷口較大或嚴重的可以每天兩次。為了使主製劑發揮更好的功效，配合使用輔助治療液，以提供組織再生修復所需的足夠能量和營養物質。輔助治療液使用3-4次/天。治療健康創傷、燒傷和手術後刀口癒合的效果如表3表示。
表3.治療健康創傷、燒傷和手術後刀口癒合的效果
實施例4、抗衰老和美容主製劑配方5％FBS+5ng/ml重組人表皮生長因子+5％D-葡萄糖+3μg/ml胰島素，過濾除菌，4℃冷藏。
輔助液20％甘油水溶液+5％FBS，4℃冷藏。
每天晚上清洗乾淨皮膚後，使用0.5ml主製劑拍打在臉部，使其充分吸收。然後，塗抹適量輔助液，使皮膚充分保溼。該製劑的抗衰老和美容效果如表4所示。
表4.抗衰老和美容效果
實施例5、治療胃潰瘍製劑配方10ng/ml重組人表皮生長因子+5％D-葡萄糖+2μg/ml氫化可的松，葡萄糖水溶液高壓滅菌後，溫度降至室溫時添加其他兩種成分。
空腹口服5-10ml/次，每天2-3次。該製劑治療胃潰瘍的效果如表5所示。
表5.治療胃潰瘍的效果
權利要求
1.一種具有抗衰老及美容作用的複合生物製劑，由下列物質組成2-30ng/ml重組人表皮生長因子，2-10％D-葡萄糖，5-20％胎牛血清和3-10μg/ml胰島素，溶劑為多重蒸餾水。
2.根據權利要求1所述的複合生物製劑，其特徵在於所述重組人表皮生長因子複合生物製劑，由5％胎牛血清，5ng/ml重組人表皮生長因子，5％D-葡萄糖，3μg/ml胰島素和無菌多重蒸餾水組成。
3.權利要求1或2所述複合生物製劑在製備化妝品和美容產品中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種具有抗衰老及美容作用的複合生物製劑，由下列物質組成2－30ng/ml重組人表皮生長因子，2－10％D－葡萄糖，5－20％胎牛血清和3－10μg/ml胰島素，溶劑為多重蒸餾水。本發明的複合生物製劑可以用於生產抗衰老的化妝品和美容產品，使皮膚保持嬌嫩、皺紋減少、色斑黯淡甚至消失，皮膚最終有光澤有彈性，具有廣泛的應用前景。
文檔編號A61Q19/08GK101057823SQ20071011055
公開日2007年10月24日 申請日期2004年1月15日 優先權日2004年1月15日
發明者方昌閣 申請人:方昌閣, 李寧, 北京濟普霖生物技術有限公司