殺菌/透性增加蛋白缺失類似物的製作方法

2023-04-23 09:21:51

專利名稱：殺菌/透性增加蛋白缺失類似物的製作方法
背景技術：
本發明提供新的具有生物活性的殺菌/透性增加蛋白(BPI)缺失類似物的製劑和含有這些製劑的藥物組合物，其中的新類似物特徵在於具有更好的穩定性與均一性以及增強的體內活性。
BPI是一種從對抵禦入侵微生物至關重要的哺乳動物血細胞，稱為多形核白細胞(PMN或噬中性的細胞)顆粒中分離的蛋白。已知BPI結合脂多糖，一種刺激可導致膿毒性休克(septic shock)強大免疫反應的格蘭氏陰性細菌外膜蛋白的主要組分。通過酸提取結合離子交換層析[Elsbach，生物化學雜誌，254:11000(1979)]或大腸桿菌[E.coli]親和層析[Weiss等，血液，69:652(1987)]，人BPI蛋白從PMNs中得到分離。用這種方式獲得的BPI在此稱為天然BPI並且已顯示其對廣譜格蘭氏陰性細菌具有強大的殺菌活性。人BPI的分子量大約55,000道爾頓(55kD)。完整的人BPI蛋白序列和編碼該蛋白的DNA核酸序列報導於Gray等，生物化學雜誌，264:9505(1989)的

圖1中，在此摻入該文獻供參考。Gray等的胺基酸序列示於這裡的SEQIDNO:1中。美國專利No.5,198,541(在此公開僅供參考)公開了編碼BPI蛋白，包括重組BPI全蛋白(稱為rBPI)和BPI重組片段的基因和用於表達這些蛋白的方法。
具有大約25kD分子量的蛋白水解性BPI N-末端具有雙親性特性，含有交替的疏水及親水區。人BPI的此N-末端擁有天然55kD人BPI全蛋白的抗菌活性[Ooi等，生物化學雜誌，262:14891-14894(1987)]。與N-末端部分相反，分離的人BPI蛋白C-末端區域對格蘭氏陰性生物僅僅顯示出略微可檢測到的抗菌活性[Ooi等，實驗醫學雜誌(J.Exp.Med),174:649(1991)]。一種大約23kD的N-末端BPI片段，稱為「rBPI23」已由重組方法得到製備並且也維持對格蘭氏陰性生物的抗菌活性[Gazzano-Santoro等，感染。免疫(Infect.Immun.)60:4754-4761(1992)]。一種BPI的N-末端類似物，rBPI21，已按照Horwitz等在蛋白表達純化，8:28-40(1996)中所述得到了製備。
BPI的殺菌效應報導為對格蘭氏陰性菌種類是高度特異性的，例如，在Elsbach與Weiss，發炎基本原理與臨床相關性，Gallin等編，第30章，Raven出版有限公司(1992)中所述。此報導的靶細胞特異性認為是BPI對脂多糖(LPS)，格蘭氏陰性生物外膜(或包被)特異性成分的強烈吸收的結果。雖然BPI通常認為對其它微生物，包括酵母和更高等的真核細胞是無毒的，但是最近發現，如下文所討論的，BPI蛋白產物也對格蘭氏陽性細胞、支原體、分枝桿菌、真菌、原生動物和衣原體表現出活性。
雖然BPI殺死格蘭氏陰性細菌的確切機制尚未完全闡明，但認為BPI必須首先通過帶正電的BPI蛋白和LPS上帶負電的位點之間的靜電及疏水性相互作用而結合到該細菌的表面上。由於其刺激的強大炎症反應，即由宿主炎症細胞釋放(炎症)介質，這可最終導致不可逆的內毒性休克，故LPS又稱為「內毒素」。BPI與報導為LPS最具毒性的並且生物活性最強的部分，脂質A結合。
在易感的格蘭氏陰性細菌中，BPI結合認為打斷了LPS結構，導致降解磷脂和肽聚糖的細菌酶的活化，從而改變細胞外膜的透性，並且啟動最終導致細胞死亡的事件。[Elsbach與Weiss(1992)，見上文]。BPI認為在兩個時期起作用。第一個稱為亞致死時期，其特徵為立即生長停止，穿透外膜並且選擇性活化水解磷脂與肽聚糖的細菌酶類。此時期的細菌可培養於補充血清蛋白的培養基中而得到挽救[Mannion等，臨床研究雜誌(J.Clin.Invest.,)85:853-860(1990)]。在長時間將細菌暴露於BPI之後，定義為不能夠由血清蛋白所逆轉的生長抑制的第二個時期發生，其特徵在於廣泛的生理與結構改變，包括對內膜的明顯損傷。
BPI與LPS的最初結合導致組織的變化，這可能是源於通過結合Mg++和Ca++而結合LPS的陰離子基團，該結合通常穩定外膜。BPI附著到格蘭氏陰性細菌外膜導致疏水性藥物如放線菌素D迅速穿透外膜。BPI的結合以及隨後格蘭氏陰性細菌的殺死至少部分依賴於LPS多糖鏈的長度，其中具有較長O-鏈的「光滑型」生物較具有短O-鏈的「粗糙型」生物對BPI的殺菌效應具有更強的抗性[Weiss等，臨床研究雜誌，65:619-628(1980)]。此BPI作用的第一個時期，格蘭氏陰性菌外包被的穿透在BPI解離(一種需要高濃度二價陽離子和新LPS合成的過程)時是可逆轉的[Weiss等，免疫學雜誌，132:3109-3115(1984)]。然而，通過恢復包被的完整性，格蘭氏-陰性細菌的存活的喪失沒有得到逆轉，表明該殺菌作用由在靶生物中誘導的其它損傷所介導的，並且該損傷可能位於質膜上(Mannion等，臨床，研究雜誌，86:631-641(1990))。對該可能性的特定研究已顯示在摩爾基礎上，BPI至少與多粘菌素B具有相同的質膜載體抑制功能(In′tVeld等，感染與免疫，56:1203-1208(1988))，但是確切的機制以及該載體與完整生物研究間的相關性還未得到闡明。
已經表明BPI蛋白產物(包括天然和重組製備的BPI蛋白；天然、合成和重組的具有生物學活性的BPI蛋白多肽片段；具有生物學活性的BPI蛋白或其片段的多肽變異體，包括雜交融合蛋白和二聚體；具有生物學活性的BPI蛋白或其片段或變異體的類似物，包括半胱氨酸替代的類似物；和BPI衍生肽)具有多種有利的活性。已知BPI蛋白產物對格蘭氏陰性細菌具有殺菌效應，如在美國專利Nos.5,198,541和5,523,288中所述，在此摻入二者供參考。同時已知BPI蛋白產物增強在格蘭氏陰性細菌感染中抗生素的效應，如在美國專利No.5,523,288和相應的國際公開No.WO 95/08344(PCT/US 94/11225)中所述，在此摻入供參考。同時已知BPI蛋白產物對格蘭氏陽性細菌和支原體具有殺菌效應，並且增強抗生素在格蘭氏陽性菌感染中的效應，如在美國專利No.5,578,572和相應的國際公開No.WO 95/19180(PCT/US95/00656)中所述，在此引用供參考。還進一步已知BPI蛋白產物顯示出抗真菌活性和增強其它抗真菌劑的活性，如在美國專利No.5,627,153和相應的國際公開No.WO 95/19179(PCT/US 95/00498)中所述，並且在共同擁有、共同未決的提交於1996年3月21日的美國申請系列No.08/621,259(其反過來又是提交於1994年7月20日的美國申請系列No.08/504,841的部分繼續)和相應的國際公開Nos.WO 96/08509(PCT/US 95/09262)和WO 97/04008(PCT/US 96/03845)中進一步描述為抗真菌肽，引入所有文獻供參考。還進一步已知BPI蛋白產物顯示出抗原生動物活性，如在美國專利No.5,646,144和相應的國際公開No.WO 96/01647(PCT/US 95/08624)中所述，在此引入文獻供參考。已知BPI蛋白產物顯示出抗-衣原體活性,如在共同擁有的、共同未決的提交於1996年8月9日的美國申請系列No.08/694,843和相應的國際公開No.WO 98/06415(PCT/US 97/13810)中所述，在此引入的所有文獻供參考。最後，已知BPI蛋白產物顯示出抗分支桿菌活性，如在共同擁有、共同未決的提交於1996年4月1日的美國申請系列No.08/626,646(其反過來又是提交於1994年8月14日的美國申請系列No.08/285,803的部分繼續，後者又成為1993年3月12日提交的美國申請系列No.08/031,145的部分繼續)和相應的國際公開No.WO 94/20129(PCT/US 94/02463)中所述，所有引入的文獻供參考。
BPI蛋白產物在人類中對循環中內毒素的效應，包括對TNF、IL-6和內毒素的效應描述於美國專利Nos.5,643,875和5,753,620以及相應的國際公開No.WO 95/19784(PCT/US 95/01151)中，引入所有文獻供參考。
同時已知BPI蛋白對於治療以下特異性病情中是有用的，例如人腦膜炎球菌血症(meningococcemia)(如在共同擁有、共同未決的提交於1996年5月10日的美國申請系列No.08/644,287和相應的國際公開No.WO 97/42966(PCT/US 97/08016)中所述，在此引入供參考)，人創傷性出血(如在共同擁有、共同未決的美國申請系列No.08/862,785，提交於1996年5月23日的美國系列No.08/652,292的部分延續，現在的美國專利No.5,756,464和相應的國際公開No.WO 97/44056(PCT/US 97/08941)中所述，在此引用所有文獻供參考)，燒傷(如在美國專利No.5,494,896和相應的國際公開No.WO 96/30037(PCT/US 96/02349)中所述，在此引入該二篇文獻供參考)，局部缺血/再灌注(reperfusion)損傷(如在美國專利No.5,578,568中所述，在此引入供參考)和肝臟切除(如在共同擁有、共有未決的提交於1998年3月16日的美國申請序列No.08/582,230中所述，該申請是對提交於1996年1月3日的相同系列號的延續申請，其反過來又是提交於1994年10月5日的美國申請系列No.08/318,357的延續，後者又是提交於1993年10月5日的美國申請系列No.08/132,510的部分延續，以及相應的國際公開No.WO 95/10297(PCT/US 94/11404)，所有引入文獻供參考)。
同時已知BPI蛋白產物中和外源性肝素的抗凝劑活性，如在美國專利No.5,348,942中所述，在此引入供參考，以及對治療慢性炎症疾病如類風溼和反應性關節炎是有用的，如在美國專利No.5,639,727中所述，在此引用供參考，並且用於抑制血管生成和治療血管生成有關的疾病包括惡性瘤，目鏡視網膜病(ocular retinopathy)和子宮內膜異位(endometriosis)，如在共同擁有的、共同未決的美國申請系列Nos.08/435,855,08/466,624和08/466,826和相應的國際公開No.WO94/20128(PCT/US 94/02401)中所述，所有引入文獻在此供參考。
同時已知BPI蛋白用於抗血栓形成的方法中，如在美國專利No.5,741,799和相應的國際公開No.WO 97/42967(PCT/US 97/08017)中所述，在此引入供參考。
美國專利Nos.5,420,019和5,674,834和相應的國際公開No.WO94/18323(PCT/US 94/01235)(所有引入文獻供參考)公開了在胺基酸位置132或135的半胱氨酸用其它胺基酸代替使得到的BPI多肽對二聚化和半胱氨酸加合化合物的形成具有抗性。其同時公開了在BPI胺基酸位置193終止N-末端BPI片段導致具有減少的羧基末端不均一性的表達產物。
令人感興趣的是Capodici和Weiss在免疫學，156:4789-4796(1996)中的報導，即編碼成熟BPI胺基酸殘基1到193(BPI1-193)和殘基13到193(BPI13-193)的DNA的體外轉錄/翻譯產物表現出對固定LPS類似的LPS-依賴性結合。
在本領域中仍然存在著這樣的必要，即(製備)具有更高生物學活性的BPI蛋白產物製劑，特別是那些具有增強的穩定性、均一性和/或體內生物學活性的製劑。
本發明進一步提供了編碼這些BPI蛋白產物的新的純化且分離的多核苷酸序列(例如，DNA或RNA)；用於其重組製備的材料與方法，包括載體及包括該DNA的宿主細胞；包括這些BPI蛋白產物的更為穩定的藥物組合物；單獨使用這些組合物或同時與其它治療劑施用的改進的治療方法。同時涉及的還有本發明BPI缺失類似物在製備用於治療將從施用BPI蛋白產物中獲益患者的藥劑中的使用。
本發明眾多的其它方面和優勢在考慮到下面本發明詳述時對本領域中的技術人員將是顯而易見的，該詳述描述了目前其優選的實施方案。
發明詳述本發明提供由成熟人BPI胺基酸殘基10到193(列於SEQ ID NO:2)所組成的新的BPI缺失類似物，其中的BPI胺基酸位置132的半胱氨酸殘基由別的胺基酸，優選為非極性氨酸如絲氨酸或丙氨酸所替代。其中的132位置半胱氨酸由丙氨酸所替代的優選實施方案命名為rBPI(10-193)C132A或rBPI(10-193)ala1a132。
BPI蛋白產物rBPI21為編碼成熟人BPI胺基酸殘基1至193 DNA的表達產物，其中的132位殘基半胱氨酸由丙氨酸所替代，如在美國專利No.5,420,019中所述。用於通過達到更高細胞密度和更高rBPI21滴度重組方法製備rBPI21的發酵方法中的變化也導致了純化產物氨酸末端不均一性的明顯增加。在有些發酵循環中，觀察到高達大約20％的純化產物為具有BPI胺基酸10-193的種類，而不是編碼的1-193個胺基酸。500升發酵樣品在發酵循環過程中的SDS-PAGE凝膠顯示該10-193種類出現在該循環的最後2-3天，其中最大量出現於收穫當天。進一步研究表明rBPI21與CHO-K1細胞勻漿溫育產生消化產物，提示與該細胞有關的蛋白酶活性參與(該過程)。為了以控制的方式模擬蛋白酶活性，rBPI21與氨肽酶M和彈性蛋白酶溫育。rBPI21對氨肽酶M消化具有抗性，但彈性蛋白酶迅速將rBPI21轉換成40％的BPI(8-193)和60％的BPI(10-193)。
如這裡所描述的，穩定均一的rBPI(10-193)C132A製劑通過蛋白水解和重組方法得到製備。純化和測試該蛋白的生物學活性。在數個體外生物學測定、2個不同的動物效率模型和藥物動力學及毒理學研究中進行實驗以比較rBPI(10-193)C132A與rBPI21。如在實施例5-7中所述，rBPI(10-193)C132A和rBPI21在下面的比較中具有類似的體外活性，包括用大腸桿菌J5的徑向擴散和培養基微稀釋(microdilution)殺菌測定，用L-形金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的徑向擴散測定，用大腸桿菌J5 LPS的競爭結合測定，和用RAW與THP1細胞的LPS中和測定。描述於實施例5中的其它實驗顯示rBPI(10-193)C132A似乎在用速度濁度測定法(nephelometry)的LPS結合測定中大約是rBPI21強度的兩倍。如實施例8中所述，純化的rBPI(10-193)C132A和rBPI21在劑量達120mg/kg/天三天的大鼠GLP毒理學研究中具有類似的毒性分布並且在劑量為2mg/kg大鼠中具有類似的藥物動力學。實施例8中描述的實驗也顯示在小鼠內毒素接種模型中，rBPI(10-193)C132A在兩個研究中似乎至少較rBPI21活性強兩倍，而在小鼠致死菌血模型中，rBPI(10-193)C132A與rBPI21同樣有效。除了在有意識大鼠的體內實驗外，灌注rBPI2140與50mg/kg的劑量與載體對照相比導致血壓顯著的暫時下降，而相同劑量的rBPI(10-193)C132A與對照相比沒有導致血壓統計上顯著的暫時下降。因此，與灌注rBPI21相比，灌注rBPI(10-193)C132A似乎提供了血液中副作用的下降。
本發明進一步涉及rBPI(10-193)C132A與至少一種其它多肽的至少一部分的融合。這種雜交融合蛋白的實例描述於美國專利No.5,643,570和相應的國際公開No.WO 93/23434(PCT/US 93/04754)中(在此引入所有文獻供參考)並且包括雜交融合蛋白，其氨基末端包括BPI蛋白或其生物活性片段並且其羧基末端包括至少免疫球蛋白重鏈的一個恆定區或其等位變異體。
本發明還涉及編碼本發明新的BPI缺失類似物或融合蛋白的純化及分離的多核苷酸序列(例如，DNA或RNA)；含有該多核苷酸的表達載體，其中的多核苷酸優選可操作地連接到內源或異源表達調控序列上；用本發明DNA或載體穩定轉染或轉化的原核或真核宿主細胞；和用於本發明新的缺失類似物BPI蛋白產物重組製備的方法，例如，將其中的宿主細胞培養於適當營養的培養基中並且從該細胞或培養基中分離缺失類似物BPI蛋白產物的方法。這些多核苷酸序列或載體可任選編碼27-胺基酸BPI前導序列和小鼠輕鏈多腺苷酸化信號。
本發明重組製備的新BPI缺失類似物可根據描述於美國專利No.5,439,807和相應的國際公開No.WO 93/23540(PCT/US 93/04752)(在此引入供參考)中的方法加以製備。美國專利No.5,439,807公開了在培養物中純化表達並分泌於遺傳轉染哺乳動物宿主細胞中的重組BPI蛋白產物的方法，並且公開了人們如何製備大量適用於摻入穩定、均一藥物製劑中的重組BPI產物。
本發明進一步提供了包括新BPI缺失類似物的更為穩定的藥物組合物和單獨用這些組合物或與其它治療劑同時施用的改進的治療方法。預期這種組合物可用於已知BPI蛋白產物，包括上文所討論的那些產物的任何一種治療用途中。
一般地，施用BPI蛋白產物，包括BPI缺失類似物優選以藥物組合物加以完成，該組合物包括BPI蛋白產物和藥物上可接受的稀釋劑、佐劑或載體。BPI蛋白產物可單獨施用或與已知的表面活性劑、其它化療劑或別的已知抗-衣原體的藥物聯合施用。含有BPI蛋白產物(例如，rBPI23)的穩定的藥物組合物包括檸檬酸緩衝鹽(5或20mM檸檬酸鹽，150mM NaCl,pH5.0)中1mg/ml濃度的BPI蛋白產物，其中包括0.1％重量的poloxamer 188(Pluronic F-68,BASF,Parsippany,NJ)和0.002％重量的聚山梨醇酯(polysorbate)80(Tween 80,ICIAmericas有限公司，Wilmington,DE或JT Baker,Phillipsburg,NJ)。另一種含有BPI蛋白產物(例如rBPI21)的穩定藥物組合物包括在5mM檸檬酸鹽、150mM NaCl、0.2％poloxamer 188和0.002％聚山梨醇酯80中2mg/ml濃度的BPI蛋白產物。這種優選的組合描述於美國專利Nos.5,488,034和5,696,090以及相應的國際公開No.WO 94/17817(PCT/US 94/01239)中，在此引入所有文獻供參考。如在1996年1月12日提交的美國申請序列No.08/586,133(其又是1995年9月19日提交的美國申請系列No.08/530,599的部分延續，後者又是1995年1月13日提交的美國申請系列No.08/372,104的部分延續)和相應的國際公開No.WO 96/21436(PCT/US 96/01095)(在此引入所有文獻供參考)中所述，其它具有增強活性BPI蛋白產物的poloxamer製劑也可使用。
包括BPI蛋白產物的治療組合物可系統或局部施用。系統施用途徑包括口腔及腸道外施用，包括靜脈內、肌肉內或皮下注射(包括進存貯室(depot)中供長期釋放)、眼內及眼球後、鞘內、腹膜內(例如，腹膜內灌洗)、肺內(用粉狀藥物或霧化或噴霧化藥物溶液)、或經皮施用。改進的霧化製劑描述於共同擁有、共同未決的1997年10月31日提交的美國申請系列No.08/962,217和相應的國際公開No.WO98/19694(PCT/US 97/19850)中，在此引入二文獻供參考。
當腸道外給藥時，BPI蛋白產物組合物一般以下面的劑量注射，包括每天1μg/kg至100mg/kg，優選每天0.1mg/kg至20mg/kg，更優選1到20mg/kg/天且最優選為2到10mg/kg/天。該治療可通過以相同劑量或減少或增加劑量每天連續灌注或間歇性注射或灌注，例如1到3天，並且另外由治療醫生決定該劑量。當靜脈內施用時，BPI蛋白產物優選通過開始的簡單灌注後持續灌注而加以施用。優選的靜脈內治療方案為1到20mg/kg簡單靜脈內灌注BPI蛋白產物後以20mg/kg/天劑量持續靜脈內灌注，持續達一周。尤為優選的靜脈內劑量方案為1到4mg/kg起始簡單的靜脈內灌注後以1到4mg/kg/天的劑量持續靜脈內灌注，持續達72小時。
局部途徑包括以下面的形式施用，即軟膏、乳膏(cream)、凝膠、眼滴液或軟膏(如在共同擁有、共同未決的提交於1995年11月14日的美國申請系列No.08/557,289和美國專利No.5,686,414及相應的國際公開Nos.WO 97/17990(PCT/US 96/18632)及WO 97/17989(PCT/US 96/18416)中所述，所有引入文獻供參考)、耳滴液、栓劑、洗液(例如，洗傷口)或藥用香波。例如，對於液滴形式的局部施用，根據治療醫生的判定，可施用每天1次或多次大約10至200μL BPI蛋白產物組合物。
本領域技術人員根據良好的醫療實踐和單個患者的臨床病情可容易地優化包括BPI蛋白產物治療組合物的有效劑量和施用方案。
通過下面的說明性實施例本發明其它方面和優勢將會明了。實施例1描述編碼rBPI(10-193)C132A表達載體pING 1742的構建。實施例2描述用pING 1742對CHO細胞的轉化以及分泌rBPI(10-193)C132A最高產量克隆的篩選。實施例3描述在2-L和500-L發酵罐中rBPI(10-193)C132A的製備與純化。實施例4描述了對rBPI(10-193)C132A和rBPI21的生化特徵分析。實施例5、6和7分別描述與rBPI21相比在下面測定分析中體外LPS-結合活性，包括競爭結合測定分析和用速度濁度測定法、殺菌活性和rBPI(10-193)C132A的LPS中和活性測定複合物形成速率的分析。實施例8強調了rBPI(10-193)C132A的體內活性。
實施例1表達載體pING1742的構建rBPI(10-193)C132A表達載體，pING 1742，按如下加以構建。首先通過連接以下片段構建表達載體pING 4115，包括含有pING 3174neo基因的BamHⅠ-BsaⅠ片段與含有CMV啟動子的BsaⅠ-XhoⅠ片段和來自pING 4144的rBPI21基因以及含有來自pING 4537小鼠(卡巴)輕鏈3′非翻譯區的XhoⅠ-BamHⅠ片段(pING 3174,pING 4144和pING4537描述於美國專利No.5,420,019中，在此引入供參考)。得到的pING4155載體含有融合到人IgG增強子、人CMV啟動子和小鼠(卡巴)輕鏈3′非翻譯區上的編碼rBPI21的基因。其同時含有編碼新黴素磷酸轉移酶的neo基因用於篩選對抗生素遺傳黴素(Geneticin)(G418)抗性的轉化子。
通過刪除含有人Ig增強子的pING4155 0.7kbp的HindⅢ-HindⅢ片段而製備載體pING 1732。然後，用下面的引物通過疊加PCR誘變從pING 1732中刪除編碼成熟rBPI21部分胺基酸1到9的27個核苷酸引物15′-CTGCTCTAAAAGCTGCTGCAG-3′(SEQ ID NO:3)引物25′-CCAGGCCCTTCTGGGAGGCCGCTGTCACGGCGG-3′(SEQ ID NO:4)引物35′-GCCGTGACAGCGGCCTCCCAGAAGGGCCTGGAC-3′(SEQ ID NO:5)引物45′-CTGGGAACTGGGAAGCTG-3′(SEQ ID NO:6)疊加的互補引物2和3摻入編碼胺基酸1到9的27bp核苷酸的缺失，而引物1和4分別編碼位於pING 1732特有的SaⅡ和EcoRⅠ位點上遊和下遊的核苷酸。首先，用寡核苷酸引物1與3及2與4的組合通過PCR擴增獲得這些片段。獲得這些單獨片段後，將其與引物1與4退火、延伸並再次擴增。此擴增的片段然後用SalⅠ和EcoRⅠ消化並克隆入SalⅠ-EcoRⅠ消化的pING 1732中從而得到質粒pING 1742。
為了證實PCR過程中無突變發生，測序pING 1742的SalⅠ-EcoRⅠ區域。在成熟的BPI編碼區沒有觀察到變化。然而，在編碼信號序列的DNA中發現兩鹼基對改變(ACC-＞GCT)，從而導致相對於成熟蛋白-6位置的胺基酸由Thr轉換為Ala。
實施例2用pING 1742對CHO細胞的轉化按下述將CHO-K1細胞(美國典型培養物保藏中心(ATCC)許可號No.CCL 61)適應於無血清的Ex-Cell 301培養基中生長。將培養於Ham′s F12培養基中的CHO-K1細胞用胰蛋白酶消化、離心並重懸於Ex-Cell 301培養基中。將細胞培養於100rpm的125ml培養瓶中並用125ml或250ml培養瓶每兩天到三天傳代一次。
將這些Ex-Cell 301-適應的CHO細胞通過電穿孔用pING 1742加以轉染。轉染前，用線性化該質粒的NotⅠ消化pING 1742。回收後48小時將細胞以大約104個細胞/孔種植於含有補充0.6mg/mL G418(Life Technologies,Gaithersburg,MD)Ex-Cell 301培養基的96孔平板中。大約2周時，用抗-BPI單克隆抗體通過ELISA篩選含有單個集落的大約250孔上清液中BPI-反應性蛋白的存在。
將具有最高表達水平的15個克隆轉移至含有Ex-Cell 301培養基的24孔平板中。為了篩選產率，將細胞培養於含有補充以2％FBS和40μL無菌S-Sepharose小珠Ex-Cell培養基的24孔平板中10天，然後取出小珠，以低鹽緩衝液(10mM乙酸鈉中0.1M NaCl,pH 4.0)衝洗，並在相同的緩衝液中用1.5M NaCl洗脫BPI。用ELISA測定分泌rBPI(10-193)C132A的水平。於12％非-還原性SDS凝膠中的洗脫物的Western印跡分析顯示出遷移較rBPI21略快的明顯條帶。
將產量最高的前八個集落轉移至無菌125mL三角瓶(Erlenmeyer)中並培養於Ex-Cell培養基中。通過將其培養於含有補充以2％FBS和1％(v/v)無菌S-Sepharose小珠Ex-Cell 301培養基的三角瓶中而再次評估其產率。從摻入培養基中的S-Sepharose小珠中洗脫rBPI(10-193)C132A並用HPLC測定rBPI(10-193)C132A的水平。挑選出位於最高產量中的克隆139用於進一步培養和產物製備。
實施例3rBPI(10-193)C132A的製備與純化通過在2或研究用發酵罐(Biolafitte,St.Germain en Laye,France)並且然後在500升ABEC發酵罐(ABEC,Allentown,PA)中培養克隆139細胞而製備大量的rBPI(10-193)C132A用於特徵分析。獲自2升發酵罐的蛋白產物用於下述的體外研究中，而獲自500升發酵罐的產物用於動物毒理學及效率的研究。A．在2升發酵罐中的培養將克隆139細胞於含有補充以1％FBS Ex-Cell培養基逐漸加大體積的旋轉培養瓶中傳代直到達到足夠的體積與細胞濃度從而以大約2×105個細胞/mL接種2升的生物反應器。將細胞於37℃,150rpm培養於三個2升的發酵罐中，其中的培養基補充了1％的FBS,pH為7.2,溶解的氧維持於5-10％。以1.5％(V/V)加入大型的無菌SP-Sepharose小珠(Pharmacia與Upjohn,Piscataway,NJ)。最初的葡萄糖水平大約為3.5g/L並且每天在發酵過程中將葡萄糖脈衝式補至3g/L。於238小時時終止發酵，此時細胞的生存力為63％,80％和84％。
發酵後，收穫每隻發酵罐的小珠，使其沉積(settle)並用pH7.0的10mM磷酸鈉/0.15M NaCl衝洗數次從而去除小珠的細胞組分和微弱結合的雜質。將衝洗的小珠裝柱，用pH7.0的10mM磷酸鈉，0.25mMNaCl衝洗，並用含有0.8M NaCl,5mM甘氨酸的相同緩衝液洗脫。洗脫物然後用3倍體積的無菌注射水(WFI)洗脫，裝入CM-spherodex柱(Sepracor,Marlborough,MA)並用pH7.0的10mM磷酸鈉、0.25MNaCl衝洗，然後用pH4.0 20mM的乙酸鈉、0.2M NaCl衝洗，然後用pH4.0 20mM的乙酸鈉、0.3M NaCl衝洗，並將樣品於相同的緩衝液中加以洗脫。用10,000MW截斷的Centricon膜(Amicon,Beverly,MA)濃縮後，將來自CM柱的洗脫物裝入用pH5.0 5mM檸檬酸鈉、0.15M NaCl平衡的Sephacryl S-100柱(Pharmacia與Upjohn)中。將含有通過280nm處吸收值鑑定的rBPI(10-193)C132A的部分合併，並且用Amicon濾膜濃縮至1.9mg/mL並用0.002％聚山梨醇脂80(JT Baker,Phillipsburg,NJ)、0.2％poloxamer 188(PluronicF-68,BSAF,Parsippany,NJ)加以配製。最終製劑用0.2μm濾膜過濾除菌。B．於500升發酵罐中的培養將克隆139細胞於含有1％FBS的無胎球蛋白Ex-Cell培養基的一系列逐漸增加體積的旋轉瓶中傳代從而提供用於35升Bellco旋轉瓶(Bellco Glass,Vineland,NJ)的接種物，後者反過來又為500L ABEC發酵罐提供接種物。將細胞培養於無胎球蛋白但補充以1％FBS、額外的葡萄糖(至10g/L)和穀氨醯胺(至10mM)的完整Ex-Cell培養基中。發酵罐以補料-分批的方式運行，在其中的運行中以一個0.5％Primatone RL補充脈衝和一個葡萄糖/穀氨醯胺脈衝進行。500升發酵罐接種後24小時加入5至6升大型的SP-Sepharose小珠。用10％的碳酸氫鈉手工調節pH至7.0，氧氣控制在5％且溫度控制在37℃。用兩個三-刃的漿狀推進器維持25rpm的攪動。發酵運行於184小時時終止，此時細胞的生存力為90％。
如上述的2升發酵一樣，發酵後讓小珠沉積且然後用低鹽(0.1M)磷酸緩衝液衝洗數次。除了在S-Sepharose小珠洗脫後包括進pH3.0的病毒失活步驟和第二個CM-spherodex柱被包括進作為濃縮步驟外，純化步驟與上述用於2升樣品的條件類似。對於第二個CM柱，用三倍體積的WFI稀釋洗脫物，調節pH至5.0，用pH5.0的20mM乙酸鈉、0.3M NaCl平衡並衝洗該柱並且於相同的緩衝液中以1.0MNaCl洗脫樣品。用pH5.0的5mM檸檬酸鈉、0.15M NaCl從SephacrylS-100柱上洗脫rBPI(10-193)C132A，調節至2mg/mL，並且經過0.2μm濾膜過濾。然後用0.002％聚山梨醇酯80,0.2％poloxamer 188配製rBPI(10-193)C132A，無菌過濾，並裝入10mL Ⅰ型玻璃瓶中。
實施例4rBPI(10-193)C132A的生化特徵分析A．來自2升發酵的蛋白觀察到實施例3中純化的rBPI(10-193)C132A產物在SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)為遷移較rBPI21條帶稍快的單一條帶，這與rBPI21N-末端9個胺基酸缺失相一致。序列分析表明rBPI(10-193)C132A含有預計的N-末端序列SQKGLDYASQQGTAALQKEL。質譜分析(ESI-MS)時觀察到兩種組分，一個為20,470道爾頓的分子量，這與預計的rBPI(10-193)C132A的20,472道爾頓分子量相一致，並且第二個具有20,225道爾頓的分子量，這與預計的rBPI(10-191)的20,258道爾頓的分子量相一致。rBPI(10-193)C132A和rBPI21的離子-交換HPLC圖形(HeWlett-Packard,Model 1050,Palo Alto,CA)均表現出單一的峰且具有相同的滯留時間。B．來自500升發酵的蛋白進行SDS-PAGE時，rBPI(10-193)C132A為遷移較rBPI21條帶稍快的單一條帶。進行質譜(分析)時，有一個20,471道爾頓分子量的主要條帶，其與rBPI(10-193)C132A的預計的20,474道爾頓分子量相一致，以及兩個次要組分，一個分子量為20,668道爾頓，與添加N-乙醯己胺(預計分子量20,677道爾頓)相一致，並且另一個分子量為20,843道爾頓，與添加N-乙醯已胺加上己糖(預計分子量為20,839道爾頓)相一致。在製備rBPI21過程中，經常觀察到一個具有添加N-乙醯己胺的類似組分。
進行反相HPLC(Shimadzu，京都，日本)時，rBPI(10-193)C132A和rBPI21均洗脫成一個主要的峰和一個次要的峰。然而，rBPI(10-193)C132A峰較對照中的相應rBPI21峰稍早洗脫出來。rBPI(10-193)C132A圖形中的次要峰最有可能代表在質譜中鑑定出的糖基化形式。rBPI(10-193)C132A與rBPI21的離子-交換HPLC圖形均表現出單一的峰且具有類似的滯留時間。
根據傳統方法進行了胰蛋白酶作圖分析。丙酮沉澱的rBPI21或rBPI(10-193)C132A首先用二硫蘇糖醇(DTT)處理後用碘乙胺處理且然後用胰蛋白酶處理。胰蛋白酶處理的產物用C18柱(BeckmanUltrasphere)通過HPLC(Beckman Model 126)加以分析。在rBPI21中，有2條源自對前導序列不準確切割的N-末端胰蛋白酶片段(T1和Ala-T1)。如預計的，除了缺失N-末端片段外，rBPI(10-193)C132A的胰蛋白酶水解圖與rBPI21的類似。
實施例5rBPI(10-193)C132A的體外LPS-結合活性A．競爭結合分析中(的活性)在競爭結合分析中評估根據實施例3A製備的純化rBPI(10-193)C132A和rBPI21與標記的rBPI21競爭結合LPS的能力。簡言之，將固定濃度(0.5nM)的125I-標記的rBPI21與未標記的rBPI21或rBPI(10-193)C132A以DMEM中5μM到0.01nM的稀釋範圍混合，該DMEM中含有HEPES緩衝液和牛血清蛋白(BSA)[U.S.Biochemicals,Cleveland,OH]並且將100μL混合物加入到以2.5μg/mL大腸桿菌J5LPS預先包被的Immulon-Ⅱ平板孔(Calbiochem,San Diego,CA)中。將平板於4℃溫育5小時並用DMEM培養基洗3次。加入75μL0.1N的NaOH並且移出結合的125I-rBPI21並計數。結果表明兩種蛋白均類似地與放射性標記的rBPI21競爭。B．在測定複合物形成速率分析中的活性用速度濁度測定法比較rBPI(10-193)C132A與rBPl21的LPS結合活性、評估rBPI21結合LPS的方法測定由於溶液中LPS-BPI蛋白產物複合物的形成所造成的光發散增加速率。所有實驗用BeckmanArray 360速度濁度測定儀(Rate Nephelometer)進行，該儀器自動混合樣品，測定光發散並進行速度計算。
用該方法的前面實驗測定了最佳LPS種類和濃度、測定分析特異性、可重複性以及分析結果與殺菌測定的相關性。觀察到大腸桿菌J5LPS和脂質A與rBPI21形成可在濁度測定儀中測定到的複合物，但是大腸桿菌O111:B4 LPS沒有形成可測到的複合物。根據這些研究結果，依據LPS份額，挑選大腸桿菌J5 LPS以49.4到61.7μg/ml的濃度與5到30μg/ml的rBPI21濃度(細胞流中)聯合使用。必須對每個LPS份額加以測定的最佳rBPI21濃度範圍為大約15到25μg/ml，其代表該曲線的最線性的部分。聚集速率(RT)值的最佳範圍為從700到2000。當製劑緩衝液變成包括PLURONIC P103或當NaCl濃度增加時，需要更低濃度的rBPI21以達到相同的聚集速率。加入結合LPS的重組脂多糖結合蛋白(rLBP50)或結合BPI蛋白產物的肝素抑制rBPI21-LPS聚集物的形成，表明該相互作用的特異性。通過測定多份額的BPI和測定相同份額的rBPI21多次證實分析測定的可重複性。通過45℃處理一周而部分失活的rBPI21樣品的濁度測定分析與用大腸桿菌J5細胞的培養基微稀釋殺菌測定分析結果很好地一致。
比較rBPI(10-193)C132A和rBPI21的濁度測定實驗按如下進行。將超聲處理的LPS[來自List Biochemicals的大腸桿菌J5 LPS Lot No.30119B]與rBPI(10-193)C132A或rBPI21[兩者均用0.2％PLURONICF68(poloxamer 188)、0.002％TWEEN 80(聚山梨醇脂80)、5mMpH5.0的檸檬酸鹽、150mM NaCl加以配製]直接稀釋入由Beckman供應的PBS緩衝液(補充以PEG)中。固定LPS濃度但BPI蛋白產物濃度依每個實驗而改變。測定兩個濃度的LPS:24.7和49.4μg/mlLPS。通過加入60μl PBS-PEG緩衝液至細胞流後加入42μl BPI蛋白產物稀釋液而開始每個反應。建立基線後，加入42μl的大腸桿菌J5LPS溶液。加入最後一種組分後，根據光擴散的範圍濁度測定儀測定複合物形成的速率。通過用含有給定BPI蛋白產物濃度的每個測試樣品的RT值除以標準相應的RT值以產生百分對照值而分析數據。對於每個測定的BPI蛋白產物濃度，測定最大聚集速率並建立曲線。僅僅位於最大值左邊的數據點(等價數據點)用於比較分析不同的BPI蛋白產物樣品。通過比較用於測定的RT值與曲線線性區域的標準份額而測定樣品的相對活性。可使用點到點或曲線適合方法(curve fitapproach)。
除了測試純化的rBPI(10-193)C132A和純化的rBPI21[含有大約7.8％rBPI(10-193)C132A]，還對這些蛋白的相等混合物以及具有16％rBPI(10-193)C132A的rBPI21進行評估(僅在49.4μg/ml LPS時)。這些結果顯示在49.4μg/ml LPS時，rBPI(10-193)C132A與大約25％更低濃度的rBPI21達到類似的聚集速率。rBPI(10-193)C132A在27.4和49.4μg/ml LPS時均較rBPI21達到更高的最大聚集速率。兩種分子的等量混合物產生介於rBPI21與rBPI(10-193)之間的曲線而7.8％份額的rBPI21與16％份額的10-193彼此表現一致。此結果的點到點分析(49.4μg/ml LPS)表明rBPI(10-193)在該分析中大約是rBPI21活性的兩倍。
實施例6rBPI(10-193)C132A的體外殺菌活性該實施例中的所有分析測定均以實施例3A中的2升發酵罐中製備的rBPI(10-193)C132A進行。A．放射擴散分析中大腸桿菌的效應該放射擴散分析比較純化的rBPI(10-193)C132A和rBPI21對大腸桿菌J5的殺菌效應，該大腸桿菌為光滑型大腸桿菌菌株011B4的UDP-半乳糖-4-差向異構酶的「粗糙型」突變子。將大腸桿菌J5細胞(Mannion等，臨床研究雜誌，85:853-860(1990)；List BiologicalLaboratories,Campbell,CA)培養至指數時期，離心並用pH7.4的10mM磷酸鈉衝洗兩次並且以大約1×106CFU/ml的終濃度加入到補充以3％Trypticase Soy Broth(TSB,DIFCO Laboratories,Detroit,MI)、10mM磷酸鈉的熔解瓊脂糖中。在硬化的瓊脂糖中製備3mm直徑的小孔並將5μL序列稀釋的rBPI21或rBPI(10-193)C132A加入到小孔中。將平板於37℃溫育3小時從而使擴散發生，且然後加入含有6％TSB的熔解的瓊脂糖覆蓋層。將平板於37℃溫育過夜並以抑制的淨面積對濃度作圖。結果表明在該分析中rBPI(10-193)C132A與rBPI21表現類似。B．在放射擴散分析中對金黃色葡萄球菌L-形式的效應該放射擴散分析比較純化的rBPI(10-193)C132A與rBPI21對培養成L-形而無細胞壁的格蘭氏-陽性細菌金黃色萄萄球菌的殺菌效應。如在美國專利No.5,578,572(在此引入供參考)中所述，將金黃色葡萄球菌L-形細胞在補充以3.5％NaCl、10mM CaCl2和1000U/mL青黴素G的心臟灌注(HI)培養基中培養至對數期。將細胞在含有補充NaCl的HI培養基的熔解0.8％瓊脂糖中稀釋至大約5×104或5×105個細胞/mL，並且將8ml細胞-瓊脂糖懸液倒入10cm平板中。製備3mm直徑的小孔，並將5μL系列稀釋的rBPI21或rBPI(10-193)C132A加入到該小孔中。將平板於37℃溫育24小時並且以抑制的淨面積對濃度作圖。結果顯示rBPI21和rBPI(10-193)C132A在該分析中均以類似的方式在細胞濃度約5×104和5×105時抑制金黃色萄萄球菌L-形式的生長。C．在培養基微稀釋分析中對大腸桿菌J5的效應該培養基微稀釋分析比較純化的rBPI(10-193)C132A與rBPI21對大腸桿菌J5的殺菌效應。按照以前Horwitz等在感染，免疫，63:522-527(1995)中所述將大腸桿菌J5細胞在胰化蛋白腖酵母提取物(TYE)培養基中培養過夜且然後在TEA培養基中培養至對數期。將細胞從大約1×104和1×105個細胞/mL接種於心臟灌注(HI)培養基中，並將95μL加入到96孔平板中。在配製緩衝液中製備的5μL rBPI(10-193)C132A或rBPI21的各種稀釋液加入到每孔中並將平板於37℃溫育24小時。結果顯示rBPI(10-193)C132A和rBPI21在這些分析中具有類似的活性。
實施例7rBPI(10-193)C132A的體外LPS中和活性該實施例A部分的分析用在實施例3A中2升發酵罐中製備的rBPI(10-193)C132A進行，而該實施例B中的分析用實施例3B中500升發酵罐中製備的rBPI(10-193)C132A進行。A．在RAW細胞增殖分析中的活性
RAW細胞增殖分析用於比較rBPI21與rBPI(10-193)C132A的體外LPS中和活性。在該分析中，LPS抑制RAW細胞的增殖，並且rBPI21中和LPS的該效應。
在分析前24小時首先將維持於RPMI 1640培養基(GIBCO)中的小鼠RAW 264.7細胞(ATCC許可號T1B71)通過在5U/mL重組小鼠γ-幹擾素(Genzyme,Cambridge,MA)存在下的溫育而加以誘導，其中的RPMI 1640培養基補充了10mM HEPES緩衝液(pH7.4)、2mML-穀氨醯胺、青黴素(100U/mL)、鏈黴素(100μg/mL)、0.075％碳酸氫鈉、0.15M 2-巰基乙醇和10％胎牛血清(Hyclone，有限公司，Logan,UT)。然後機械收集誘導的細胞並於4℃500×g離心且然後重懸於50mL RPMI 1640培養基(無補充物)中，再次離心並再次重懸於RPMI 1640培養基(無補充物)中。計數細胞，將其濃度調整至2×105個細胞/mL並且加入100μL等份至96孔板的每個小孔中。
然後將這些細胞與大腸桿菌O113 LPS(Control Standard,Assoc.of Cape Code,Woods Hole,MA)溫育大約15小時，該LPS以無血清RPMI 1640培養基中1ng/mL的濃度(該濃度為其中的LPS濃度為50Pg/mL到100ng/mL的滴定實驗的結果)100μL/孔等份而加入。該溫育在25ng/mL到50ng/mL濃度的rBPI21或rBPI(10-193)C132A存在或不存在的情況下進行。重組的人rBPI21，也稱為rBPI21Δcys(為rBPI1-93，其中132位的丙氨酸為半胱氨酸所替代[見共同擁有的美國專利No.5,420,019])以1μg/mL的濃度用作對照。通過在分析開始後5小時加入1μCi/孔[3H]-胸腺嘧啶而定量測定細胞增殖。溫育15小時後，用細胞收穫器(cell harvesker)(Inotech Biosystems,INB-384，樣品處理及濾膜計數系統，Lansing,MI.)將標記的細胞收穫至玻璃纖維濾膜上。LPS-介導的對RAW 264.7細胞增殖的抑制依賴於作為血清成分或重組LBP(以1μg/mL的濃度)而加入到反應混合物中的LBP的存在。
在這些實驗中，rBPI21和rBPI(10-193)C132A兩者均類似地抑制LPS-介導的對RAW細胞增殖的抑制。B．在TNF抑制分析中的活性腫瘤壞死因子(TNF)抑制分析用於比較rBPI21和rBPI(10-193)C132A的體外LPS中和活性。在該分析中，LPS與純化的LBP(或含有LBP的血清)一起刺激THP-1細胞(人單核細胞系)的TNF合成，並且rBPI21中和LPS的該效應。
將THP.1細胞(ATCC許可號TIB-202)維持於具有10％FBS的RPMI(GibcoBRL,Gaithersburg,MD)中並且在用LPS處理前三天培養於具有10％FBS加50 ng/ml 1,25二羥基維生素D(BIOMOLResearch Laboratories有限公司，Plymouth Meeting,PA)的RPMI中從而誘導CD 14的表達。以LPS誘導前，將細胞用RPMI衝洗三次並懸於具有10％FBS的RPMI中或無血清的培養基[補充1％HB101的RPMI(Irvine Scientific,Santa Ana,CA)]中。在96孔平板中以大約5×104個細胞每孔用1ng/ml大腸桿菌0128 LPS(Sigma,St.Louis,MO)誘導TNF的表達。將平板於37℃,5％CO2下溫育，然後取出上清液等分並且用CellTiter 96TMAQ(Promega公司，Madison,WI)通過WEHI 164毒性分析監測細胞生存力。重組人TNFα(GenzymeDiagnostics,Cambridge,MA)用作陽性標準。rBPI21和rBPI(10-193)C132A二者均類似地抑制LPS-誘導的對TNF合成的刺激。
實施例8rBPI(10-193)C132A的體內生物學活性用在實施例3B中500升發酵罐中製備的純化rBPI(10-193)C132A進行下述的體內分析。A．在大鼠中的毒性研究比較在大鼠中rBPI21和rBPI(10-193)C132A的毒性分布，在該研究中，六隻雄性和六隻雌性Sprague-Dawley大鼠實驗組接受或者載體對照(配製緩衝液)，低劑量(50mg/kg/天)或高劑量(120mg/kg/天)的rBPI21或rBPI(10-193)C132A。通過以4.2mL/lkg/小時(100mL/kg/天)的灌注速率連續三天的植入的femoral導管(indwelling femoralcatheter)連續靜脈內灌注而施用這些劑量。臨床觀察結果每日至少記錄兩次並且每日記錄體重。接近結束時收集血尿樣品用於血液學、臨床化學及尿分析測定。結束時，稱量器官並收集組織用於組織病理學檢查。沒有死亡或顯著測試文章(test article)有關的效應。該數據表明當施以連續灌注時rBPI21與rBPI(10-193)C132A具有類似的毒性分布。B．藥物動力學2mg/kg的rBPI21與rBPI(10-193)C132A的藥物動力學在大鼠中進行了研究。rBPI21與rBPI(10-193)C132A的血漿清除通過三-指數藥物動力學處理函數(tri-exponential pharmacokinetic dispositionfunction)得到很好描述。沒有檢測到rBPI產物藥物動力學參數中的統計差異性(非參數Wicoxon rank檢驗，p＜0.05)。大多數施用的藥物(＞96％)在0.2-0.4分鐘的半壽期α期與3.9-4.3分鐘的β半壽期得到清除，而其餘部分在27-33分鐘半壽期的γ期期間得到清除。中央部分(central compartment)分布的體積(Vc)為41-45mg/kg，並且清除速率(CL)為24-30mL/分鐘/kg。該分布的穩定態體積為152-184mL/kg。C．在小鼠內毒素接種中的效率基本上按照Ammons等，在「治療膿毒病的新治療策略」，Morrison和Ryan編，Marcel Dekker，紐約(1996),55-69頁在小鼠致死內毒素血症(endotoxemia)模型中進行兩次單獨的研究從而測定rBPI21與rBPI(10-193)C132A的相對活力。在兩個研究中，在每次處理及對照組中有14隻小鼠。在第一個研究中，CD1小鼠靜脈內接種25mg/kg的大腸桿菌O111∶B4的脂多糖(LPS)。接種後立即將小鼠以15、20、25和30mg/kg的劑量的rBPI21或rBPI(10-193)C132A或對照載體(僅僅配製緩衝液)靜脈內處理。連續七天每日兩次記錄致死率。
示於下表1中的第一個研究結果表明用rBPI(10-193)C132A和rBPI21處理均較載體對照顯著增加了存活。此外，rBPI(10-193)C132A較rBPI21至少效率高兩倍，因為在較rBPI21低兩倍劑量的rBPI(10-193)C132A中見到與此劑量rBPI21類似的存活效率。
表1
1NA，不適用**，與對照比p＜0.01#，與rBPI21比p＜0.05##，與對照比p＜0.01在第二個研究中，研究了更寬範圍的rBPI(10-193)C132A的劑量(5、10、15、20、25、30mg/kg)。下表中所示的結果證實儘管與第一個研究一樣，rBPI21與rBPI(10-193)C132A兩者均較對照得到了明顯的存活效應，但是rBPI(10-193)C132A至少效率高兩倍，因為用低於2倍的劑量得到與rBPI21類似的效率。
表2
1NA，不適用；ND，沒有進行**，與對照比p＜0.05**，與對照比p＜0.01#，與rBPI21比p＜0.05D．在致死菌血症鼠模型中的效率進行了兩個單獨的研究從而測定rBPI21與rBPI(10-193)C132A在致死菌血症小鼠模型中的相對效率。在第一個研究中，CD 1小鼠通過靜脈內施用而接種以6.8×107個大腸桿菌07∶K1的菌落形成單位(CFU)。接種後立即用10、20和30mg/kg劑量的rBPI21或rBPI(10-193)C132A或對照載體(僅僅配製緩衝液)通過靜脈內處理小鼠。連續七天每日兩次記錄致死率。
示於下表3中的第一個研究結果表明用10和30mg/kg rBPI21處理的組別存活顯著增加(p＜0.05，與對照相比)。儘管與對照相比rBPI(10-193)C132A沒有觀察到存活明顯的增加，但在該研究中rBPI21與rBPI(10-193)C132A處理的組別間存活優勢沒有顯著的差異。
表3
*，與對照相比p＜0.05為了更為充分地對rBPI21與rBPI(10-193)C132A在該模型中的效應進行特徵分析，用更為廣泛的劑量範圍進行第二個實驗。在該研究中，CD 1小鼠通過靜脈內施用而接種2.57×108個大腸桿菌07∶K1菌落形成單位(CFU)。接種後立即用1.0、3.0、10和30mg/kg rBPI21以及0.3、1.0、3.0、10和30mg/kg rBPI(10-193)C132A靜脈內處理小鼠。示於下表4中的結果表明兩者均提供保護，並且在任何劑量兩種變異體之間的保護效應無明顯差異。
表4
1ND，沒有測定*，與對照相比p＜0.05**，與對照相比p＜0.01E．在有意識大鼠中的心血管效應進行一系列實驗從而測定rBPI21與rBPI(10-193)C132A對大鼠血壓的相對效應。用Ketamine(Fort Dodge Labs,Fort Dodge,IA)與Rompum(Bayer公司，Shawnee Mission,KS)的混合物麻醉每隻大鼠。然後將一導管置於右carotid動脈中並與血壓傳導僅(pressuretransducer)連接以記錄血壓。將第二根導管置於右jugular靜脈中以注射rBPI或載體。然後在實驗開始前讓大鼠恢復。當大鼠變得警覺、可活動並且血壓穩定於正常範圍內時開始實驗。然後將rBPI21、rBPI(10-193)C132A或對照載體(配製緩衝液)作為bolus而經15秒注射並記錄以後60分鐘的平均動脈壓(mmHg)。
在預實驗中，測得20和30 mg/kg劑量的rBPI21較載體對血壓沒有明顯的效應，但是40mg/kg的劑量在5分鐘內得到血壓的顯著的下降。此低血壓反應在注射後15分鐘達到最大，此時血壓降低48±12mmHg(平均值±SE；p＞0.05)。60分鐘後，rBPI21-處理動物的血壓恢復並且與載體處理動物的血壓沒有顯著差異。
為了比較rBPI21與rBPI(10-193)C132A的效應，5隻大鼠的實驗組給以40mg/kg的每種藥物物質或載體對照，並將血壓反應分析為曲線下面積(AUC)。與以前觀察到的一樣，圖1顯示rBPI21導致血壓顯著的下降，表現為較對照載體升高的AUC。通過比較，與載體對照相比，rBPI(10-193)C132A對血壓無明顯影響。50mg/kg劑量的rBPI21(N=4隻大鼠)較40mg/kg的劑量具有更大的低血壓效應，表現為圖1中AUC的進一步上升。在此更高的劑量時，雖然在施用rBPI(10-193)C132A的大鼠(N=3)中也出現一些血壓的下降，但此效應與載體對照相比不明顯。
對於本發明的技術人員來說對上述本發明的眾多修飾和變異預計會發生。因此，僅僅那些如出現在附屬權利要求中的限定才應置於其中。
序列表110XOMA技術公司Horwitz,Arnold(發明人)Carroll,Stephen F．(發明人)Burke,David(發明人)120殺菌/透性-增加蛋白(BPI)缺失類似物13029715/3576514014115009/099,7251511998-06-191606170PatentIn Ver.2.021012111813212DNA213人220221CDS222(31)..(1491)220221成熟肽222(124)..(1491)220223rBPI4001caggccttga ggttttggca gctctggagg atg aga gag aac atg gcc agg ggc 54Met Arg Glu Asn Met Ala Arg Gly-30 -25cct tgc aac gcg ccg aga tgg gtg tcc ctg atg gtg ctc gtc gcc ata 102Pro Cys Asn Ala Pro Arg Trp Val Ser Leu Met Val Leu Val Ala Ile-20 -15 -10ggc acc gcc gtg aca gcg gcc gtc aac cct ggc gtc gtg gtc agg atc 150Gly Thr Ala Val Thr Ala Ala Val Asn Pro Gly Val Val Val Arg Ile-5 -1 1 5tcc cag aag ggc ctg gac tac gcc agc cag cag ggg acg gcc gct ctg 198Ser Gln Lys Gly Leu Asp Tyr Ala Ser Gln Gln Gly Thr Ala Ala Leu10 15 20 25cag aag gag ctg aag agg atc aag att cct gac tac tca gac agc ttt 246Gln Lys Glu Leu Lys Arg Ile Lys Ile Pro Asp Tyr Ser Asp Ser Phe30 35 40aag atc aag cat ctt ggg aag ggg cat tat agc ttc tac agc atg gac 294Lys Ile Lys His Leu Gly Lys Gly His Tyr Ser Phe Tyr Ser Met Asp45 50 55atc cgt gaa ttc cag ctt ccc agt tcc cag ata agc atg gtg ccc aat 342Ile Arg Glu Phe Gln Leu Pro Ser Ser Gln Ile Set Met Val Pro Asn60 65 70gtg ggc ctt aag ttc tcc atc agc aac gcc aat atc aag atc agc ggg 390Val Gly Leu Lys Phe Ser Ile Ser Asn Ala Asn Ile Lys Ile Ser Gly75 80 85aaa tgg aag gca caa aag aga ttc tta aaa atg agc ggc aat ttt gac 438Lys Trp Lys Ala Gln Lys Arg Phe Leu Lys Met Ser Gly Asn Phe Asp90 95 100 105ctg agc ata gaa ggc atg tcc att tcg gct gat ctg aag ctg ggc agt 486Leu Ser Ile Glu Gly Met Ser Ile Ser Ala Asp Leu Lys Leu Gly Ser110 115 120aac ccc acg tca ggc aag ccc acc atc acc tgc tcc agc tgc agc agc 534Asn Pro Thr Ser Gly Lys Pro Thr Ile Thr Cys Ser Ser Cys Ser Ser125 130 135cac atc aac agt gtc cac gtg cac atc tca aag agc aaa gtc ggg tgg 582His Ile Asn Ser Val His Val His Ile Ser Lys Ser Lys Val Gly Trp140 145 150ctg atc caa ctc ttc cac aaa aaa att gag tct gcg ctt cga aac aag 630Leu Ile Gln Leu Phe His Lys Lys Ile Glu Ser Ala Leu Arg Asn Lys155 160 165atg aac agc cag gtc tgc gag aaa gtg acc aat tct gta tcc tcc aag 678Met Asn Ser Gln Val Cys Glu Lys Val Thr Asn Ser Val Ser Ser Lys170 175 180 185ctg caa cct tat ttc cag act ctg cca gta atg acc aaa ata gat tct 726Leu Gln Pro Tyr Phe Gln Thr Leu Pro Val Met Thr Lys Ile Asp Ser190 195 200gtg gct gga atc aac tat ggt ctg gtg gca cct cca gca acc acg gct 774Val Ala Gly Ile Asn Tyr Gly Leu Val Ala Pro Pro Ala Thr Thr Ala205 210 215gag acc ctg gat gta cag atg aag ggg gag ttt tac agt gag aac cac 822Glu Thr Leu Asp Val Gln Met Lys Gly Glu Phe Tyr Ser Glu Asn His220 225 230cac aat cca cct ccc ttt gct cca cca gtg atg gag ttt ccc gct gcc 870His Asn Pro Pro Pro Phe Ala Pro Pro Val Met Glu Phe Pro Ala Ala235 240 245cat gac cgc atg gta tac ctg ggc ctc tca gac tac ttc ttc aac aca 918His Asp Arg Met Val Tyr Leu Gly Leu Ser Asp Tyr Phe Phe Ash Thr250 255 260 265gcc ggg ctt gta tac caa gag gct ggg gtc ttg aag atg acc ctt aga 966Ala Gly Leu Val Tyr Gln Glu Ala Gly Val Leu 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400Gln Asp Ile Met Asn Tyr Ile Val Pro Ile Leu Val Leu Pro Arg Val405 410 415Asn Glu Lys Leu Gln Lys Gly Phe Pro Leu Pro Thr Pro Ala Arg Val420 425 430Gln Leu Tyr Asn Val Val Leu Gln Pro His Gln Asn Phe Leu Leu Phe435 440 445Gly Ala Asp Val Val Tyr Lys450 455210321121212DNA213人工序列220223人工序列描述引物4003ctgctctaaa agctgctgca g 21210421133212DNA213人工序列220223人工序列描述引物4004ccaggccctt ctgggaggcc gctgtcacgg cgg 33210521133212DNA213人工序列220223人工序列描述引物4005gccgtgacag cggcctccca gaagggcctg gac 33210621118212DNA213人工序列220223人工序列描述引物4006ctgggaactg ggaagctg 18
權利要求
1．一種由成熟人BPI胺基酸殘基10到193所組成的殺菌/透性增加蛋白(BPI)缺失類似物，其中位置132的半脫氨酸殘基由不同的胺基酸所替代。
2．權利要求1的BPI缺失類似物，其中代替所述半胱氨酸殘基的胺基酸為選自丙氨酸或絲氨酸的非極性胺基酸。
3．權利要求1的BPI缺失類似物，其中的位置132的半胱氨酸殘基由丙氨酸所替代。
4．編碼權利要求1的BPI缺失類似物的多核苷酸。
5．編碼權利要求3的BPI缺失類似物的多核苷酸。
6．權利要求4的多核苷酸，進一步包括BPI的27個胺基酸的前導序列。
7．權利要求4的多核苷酸，它為DNA。
8．包括權利要求7DNA的表達載體。
9．宿主細胞，它以允許所述多核苷酸缺失類似物在所述宿主細胞中表達的方式用權利要求7的DNA穩定轉化或轉染。
10．權利要求9的真核宿主細胞。
11．權利要求10的宿主細胞，它為CHO細胞。
12．製備BPI缺失類似物多肽的方法，包括在適當的培養基中培養權利要求9的宿主細胞和從所述的宿主細胞或所述的培養基中分離所述的多肽。
13．權利要求12方法的多肽產物。
14．一種包括權利要求1的BPI缺失類似物和藥物上可接受稀釋劑、佐劑或載體的組合物。
15．一種包括權利要求3的BPI缺失類似物和藥學上可接受的稀釋劑、佐劑或載體的組合物。
16．一種包括權利要求13的BPI缺失類似物和藥學上可接受的稀釋劑、佐劑或載體的組合物。
17．一種改進的施用BPI蛋白產物至受試者的方法，包括施用權利要求14的組合物至所述的受試者。
18．一種改進的施用BPI蛋白產物至受試者的方法，包括施用權利要求15的組合物至所述的受試者。
19．一種改進的施用BPI蛋白產物至受試者的方法，包括施用權利要求16的組合物至所述的受試者。
全文摘要
本發明提供新的BPI缺失類似物,其由成熟的人BPI(10到193位)胺基酸殘基所組成,其中位於胺基酸位置(132)的半胱氨酸殘基由另一種胺基酸所替代。同時提供了包括這些類似物的融合蛋白、編碼這些產物的多核苷酸、用於其重組製備的材料與方法、這些產物的組合物及藥劑以及這些產物的治療用途。
文檔編號A61P31/04GK1312858SQ99809726
公開日2001年9月12日 申請日期1999年6月18日 優先權日1998年6月19日
發明者A·霍爾維茨, F·S·卡羅爾, D·布爾克 申請人:愛克索馬技術有限公司