培養水體中添加特殊成分物提高微藻細胞的油脂含量的製作方法
2023-04-23 09:23:41 2
專利名稱：培養水體中添加特殊成分物提高微藻細胞的油脂含量的製作方法
技術領域：
本發明屬於微藻生物培養技術領域，具體是涉及一種在培養水體中，採用最佳化添加特殊成分物培養條件培養微藻，達到有效提高微藻細胞油脂含量的技術方法。
背景技術：
生物柴油(Biodiesel)即脂肪酸甲酯，是典型的「綠色能源」，它是各種以油料作物、工程微藻、動物油脂、餐飲業的廢棄油脂等為原料，通過酯交換工藝製成的可代替石化柴油的再生性生物燃料，是一種可生物降解、無毒的可再生能源。生物柴油是生物質能的一種，作為一種清潔的低碳燃料，其含硫和含氮量均較低，同時灰分含量也很小，所以燃燒後SO2, NO和顆粒物排放量比化石燃料要小得多，是可再生能源中理想的清潔燃料之一。但是由於較高的原材料成本，生物柴油的價格遠高於傳統柴油，因此選取合適的、低成本的植物油脂資源來積極發展生物柴油產業，是今後的必然趨勢。微藻具有分布廣泛、生物量大、光 合作用效率高、環境適應能力強、生長周期短、繁殖快、產量高等突出特點，從微藻中萃取出的油脂通過酯交換反應可轉化成脂肪酸甲酯，即生物柴油，因此，微藻是製備生產生物燃油潛在的良好材料。自1988年以來，國際上的發達國家如美國、德國、日本，到次發達的國家南非、巴西、韓國，以及發展中的國家印度、泰國等都先後開始投入資金，加大生物柴油研究開發的力度，將生物柴油作為傳統柴油的替代品加以利用，並取得了較好的效果。大力發展生物柴油對國家經濟的可持續發展、推進能源替代、減輕環境壓力、環境保護以及控制城市大氣汙染等方面都具有重要的戰略意義。不同於高等油料作物，微藻的生物化學成分容易隨環境條件改變而發生變化。許多生長條件對微藻細胞脂質含量的積累都可以產生影響，如pH、氮元素的缺乏、光照強度、溫度、鹽度等培養的一般條件部會對積累有影響。在一般的生長條件下，微藻積累的油脂相對而言較少，而在環境脅迫條件下，油脂的積累則可能成倍地增長，因此探索微藻的最優產油培養條件顯得尤為重要。影響微藻油脂含量的因素有很多，例如化學因素，主要表現在氮、磷、矽、硫酸鹽等營養物質的可利用度方面。一般來說，氮缺乏最容易刺激微藻油脂尤其是三醯甘油的積累，許多實驗已經證明了這一點。在硅藻中，矽元素成為其油脂代謝的關鍵影響因素。磷和硫酸鹽的缺乏同樣能導致大部分微藻積累油脂。溫度和光照強度等物理因素也同樣會影響微藻油脂的含量，當溫度升高時，微藻飽和脂肪酸的含量增大；溫度降低的時候，不飽和脂肪酸含量增大，但影響的程度依不同的微藻種類有很大的差異。在不同光強條件下，微藻的化學成分、色素含量以及光合反應活力都可能發生變化，一般而言，低光強能誘導極性油脂的合成，而高光強則能導致中性油脂的積累。微藻的生長過程包括延緩期、指數生長期、相對生長下降期、靜止期與死亡期等五個階段，每個階段油脂的含量和成分都會有相當大的變化。一般來說，靜止期是微藻油脂積累最多的階段，也是飽和脂肪酸增加、不飽和脂肪酸減少的階段。藻種的年齡對油脂和脂肪酸的積累也有影響。一般而言，老齡藻積累更多的油脂，因此微藻細胞處於不同的生長階段時，會有不同的油脂累積能力。由於微藻油脂的含量隨微藻種類的不同有較大差異，利用微藻製備生產生物燃油過程中，除了首先涉及到應篩選出具有較高的油脂含量的藻品系外，另一個關鍵重要的技術問題是必須解決如何通過調控培養條件，促進藻細胞油脂的生成和累積，達到培養的藻具有較高的油脂含量的效果，尤其是大水體情況下的調控培養。總的來說，應針對不同的微藻種類，開展有利於微藻細胞油脂生成和積累的相關研究，通過探討單個或者多個影響因素作用效應，優化培養條件，使培養的微藻細胞油脂含量高。微藻細胞中的脂肪酸甘油酯的生物合成牽涉到許多不同的生物化學反應過程，這些生物化學反應過程的進行需要各種不同輔助因子的參與。因此，從微藻細胞生物合成油脂的關鍵性反應入手，需要考察各種不同關鍵性輔助因子可能通過生物化學反應途徑，進而影響到微藻細胞脂肪酸甘油酯的生成和累積。通過在微藻培養體系中採用添加特殊成分物、增強關鍵性輔助因子的效應作用，提高微藻細胞油脂的生成和含量
發明內容
本發明所要解決的技術問題就是針對上面所述的背景技術，通過採用最佳化添加特殊成分物培養條件培養微藻，達到明顯提高微藻細胞油脂含量的效果。屬於微藻生物培養提高藻細胞油脂含量技術領域。通過設計7因子3水平的正交實驗方案，同時運用ANOVA分析方法，考察主效應因子(磷酸鈉、丙酮酸鈉、檸檬酸鈉、碳酸氫鈉、泛酸鈉、三氯化鐵和生物素)對微綠球藻細胞油脂含量的影響，分析這些關鍵性因子對藻油脂含量影響程度大小的順序。通過構建優化的藻油脂含量與添加特殊成分培養條件的相關響應面數學模型，確定出最佳化添加特殊成分培養條件。在最佳化添加特殊成分培養條件下，微藻細胞油脂含量可比無添加特殊成分培養的微藻細胞高62%以上，採用最佳化添加特殊成分培養條件培養微藻，可達到有效提高微藻細胞油脂含量。本發明採用的培養水體中添加特殊成分物提高微藻細胞的油脂含量的技術方法具有效果顯著、操作實施簡單可行等優點。目前尚缺少通過採用最佳化添加特殊成分培養條件培養微藻，有效促進微藻細胞油脂含量提高的相關研究和報導。本發明採用的研究材料和方法(I)微藻種類、培養及前處理本研究採用的微藻種類是微綠球藻。微藻細胞採用適宜的培養基成分、並按實驗設計的方案條件進行培養。微藻細胞接種於三角燒瓶，營養鹽並添加特殊成分物，在適宜的光照，溫度，鹽度條件下培養，每天搖動3-5次，至微藻細胞增殖到最大密度的穩定期，採收藻細胞，藻液離心濃縮，用蒸餾水洗滌、離心，去除微藻細胞鹽分，溼藻細胞用冷凍乾燥機處理後，製備成冷凍乾燥藻粉作為萃取油脂之用。採用常規的酸熱萃取法測定微藻細胞油脂含量，即稱取一定量微藻幹品，按每克幹藻體加入一定濃度、體積量的鹽酸，混和均勻，室溫下靜置處理一定的小時數，然後沸水浴處理適宜的時間，冷卻後分別加入等體積的氯仿和甲醇，混勻搖動、充分萃取，離心後取上層液，旋轉蒸發器上揮發除去溶劑後得到微藻油脂，稱取微藻油脂重量。基於藻樣品乾重，微藻細胞油脂含量表達為mg. g—V，即藻油脂含量(％)=油脂重量/微藻幹品重量。(2)微藻細胞調控培養的添加特殊成分物研究採用的添加特殊成分物為磷酸鈉(Na3PO4. 12H20)、丙酮酸鈉(CH3COCOONa)、碳酸氫鈉(NaHCO3)、檸檬酸鈉(Na3C6H5O7. 2H20)、泛酸鈉(C9H16NaO5)、三氯化鐵(FeCl3 *6H20)和生物素(Biotin，C10H16N2O3S)。(3)考察添加特殊成分物培養對微藻細胞油脂含量的影響通過設計7因子3水平的正交實驗方案，同時運用ANOVA分析方法，考察主效應因子(磷酸鈉、丙酮酸鈉、檸檬酸鈉、碳酸氫鈉、泛酸鈉、三氯化鐵和生物素)對微綠球藻細胞油脂含量的影響，分析這些關鍵性因子對藻油脂含量影響程度大小的順序。通過構建優化的藻油脂含量與添加特殊成分培養條件的相關響應面數學模型，確定出最佳化添加特殊成分培養條件。並從多個方面評價構建的數學模型的適配擬合性。(4)數學模型的構建經過嘗試多種形式的變量響應性模式，最後確定出以採用多元二次回歸模型(Quadratic model)的適配擬合效果最好，因而添加特殊成分物培養條件下獲得的藻油脂含量實驗數據採用下述的數學模型進行最小二乘法適配擬合，即模型的表達式為
權利要求
1.一種培養水體中添加特殊成分物提高微藻細胞的油脂含量的方法，其特徵在於添加的特殊成分物是磷酸鈉、丙酮酸鈉、檸檬酸鈉、碳酸氫鈉、泛酸鈉、三氯化鐵和生物素。採用多因子多水平的正交實驗方案，同時運用ANOVA分析方法，考察主效應因子(磷酸鈉、丙酮酸鈉、檸檬酸鈉、碳酸氫鈉、泛酸鈉、三氯化鐵和生物素)對微綠球藻細胞油脂含量的影響，分析這些關鍵性因子對藻油脂含量影響程度大小的順序。通過構建優化的藻油脂含量與添加特殊成分培養條件的響應面數學模型，確定出最佳化添加特殊成分培養條件。在最佳化添加特殊成分培養條件下，使微藻細胞油脂含量達最高。
2.按照權利要求I所述的ー種培養水體中添加特殊成分物提高微藻細胞的油脂含量的方法，其特徵是所述的用於提高微藻細胞的油脂含量的微藻可以是微綠球藻、小球藻、金藻、角毛藻、褐指藻等微藻，或是各種微藻的混合培養物。
3.按照權利要求I所述的ー種培養水體中添加特殊成分物提高微藻細胞的油脂含量的方法，其特徵是所述的微藻培養水體中，加入一定量的磷酸鈉。
4.按照權利要求I所述的ー種培養水體中添加特殊成分物提高微藻細胞的油脂含量的方法，其特徵是所述的微藻培養水體中，加入一定量的丙酮酸鈉。
5.按照權利要求I所述的ー種培養水體中添加特殊成分物提高微藻細胞的油脂含量的方法，其特徵是所述的微藻培養水體中，加入一定量的檸檬酸鈉。
6.按照權利要求I所述的ー種培養水體中添加特殊成分物提高微藻細胞的油脂含量的方法，其特徵是所述的微藻培養水體中，加入一定量的碳酸氫鈉。
7.按照權利要求I所述的ー種培養水體中添加特殊成分物提高微藻細胞的油脂含量的方法，其特徵是所述的微藻培養水體中，加入一定量的泛酸鈉。
8.按照權利要求I所述的ー種培養水體中添加特殊成分物提高微藻細胞的油脂含量的方法，其特徵是所述的微藻培養水體中，加入一定量的三氯化鉄。
9.按照權利要求I所述的ー種培養水體中添加特殊成分物提高微藻細胞的油脂含量的方法，其特徵是所述的微藻培養水體中，加入一定量的生物素。
全文摘要
本發明涉及一種在水體中添加特殊成分物培養微藻，提高藻細胞油脂含量的方法。屬於微藻生物培養技術領域。具體操作實施過程為採用7因子3水平的正交實驗方案，同時運用ANOVA分析方法，考察主效應因子(磷酸鈉、丙酮酸鈉、檸檬酸鈉、碳酸氫鈉、泛酸鈉、三氯化鐵和生物素)對微綠球藻細胞油脂含量的影響，分析這些關鍵性因子對藻油脂含量影響程度大小的順序。通過構建優化的藻油脂含量與添加特殊成分培養條件的響應面數學模型，確定出最佳化添加特殊成分培養條件。在最佳化添加特殊成分培養條件下，微藻細胞油脂含量可比無添加特殊成分培養的微藻細胞高62％以上，採用最佳化添加特殊成分培養條件培養微藻，可達到有效提高微藻細胞油脂含量。
文檔編號C12P7/64GK102776250SQ20111012301
公開日2012年11月14日 申請日期2011年5月11日 優先權日2011年5月11日
發明者林汝榕, 林祥志, 林翩然, 柯秀蓉, 蔡文旋, 邢炳鵬 申請人:國家海洋局第三海洋研究所