一種嗜根考克氏菌的製作方法
2023-04-23 11:49:21 1
本發明涉及微生物技術領域，更具體地，涉及一種嗜根考克氏菌。
背景技術：
真菌毒素是真菌在食品或飼料裡生長所產生的代謝產物，對人類和動物都有害，真菌毒素汙染是我國農產品質量和食品安全中的重大問題，食品安全關係到每個人的利益，因此有效的防止真菌毒素汙染食品或農產品是一個亟需解決的問題。
現有技術中對於真菌毒素的防治可以分為物理法、化學藥劑法和生物防治法，物理法治標不治本，化學藥劑法效率高，對真菌毒素的殺傷力大，但卻存在嚴重的化學藥劑殘留的問題，化學藥劑的殘留會使吃了飼料的動物體內殘留，從而影響人類的身體健康；生物防治法主要是利用能夠降解或者抑制體內殘留的微生物防治真菌毒素，然而現有分離出來的微生物對毒素的降解作用太弱，出現的微生物種類少，難以滿足真菌毒素的防治的需求。
技術實現要素：
本發明所要解決的技術問題是克服現有技術存在的上述問題，提供一株新的能夠降解真菌毒素的嗜根考克氏菌。
本發明的目的是通過以下技術方案予以實現的：
一株嗜根考克氏菌，嗜根考克氏菌被稱為CAMT21651（KR-51），於2016年6月21日保藏於廣東省微生物菌種保藏中心（GDMCC），地址為：廣州市先烈中路100號大院59號樓5樓，廣東省微生物研究所；保藏編號為：GDMCC No.60048，分類學命稱：Kocuria rhizophila。
優選地，所述嗜根考克氏菌的16S rRNA的序列如SEQ ID NO：1所示。
優選地，所述嗜根考克氏菌為球狀、革蘭氏陽性，菌落為亮黃色，呈圓形凸起，整齊溼潤不透明，菌落直徑為0.423～1.283 mm。
優選地，所述嗜根考克氏菌的硝酸鹽還原試驗為陽性，接觸酶陽性。
優選地，所述嗜根考克氏菌的氧化酶、V-P試驗、吲哚試驗、檸檬酸鹽利用試驗、明膠液化試驗、酪氨酸水解、脲酶、糖發酵試驗均為陰性。
該菌對真菌毒素具有降解作用，特別是對DON毒素具有降解作用。
將該菌的菌懸液添加入飼料中餵養動物，發現動物體內毒素殘留明顯的下降。
與現有技術相比，本發明具有以下有益效果：
本發明通過從攝取真菌毒素的對蝦體內成功分離獲得耐真菌毒素的微生物，該微生物被鑑定為嗜根考克氏菌CAMT21651（KR-51），於2016年6月21日保藏於廣東省微生物菌種保藏中心（GDMCC），地址為：廣州市先烈中路100號大院59號樓5樓，廣東省微生物研究所；保藏編號為：GDMCC No：60048；該菌能夠顯著降低動物體內真菌毒素的殘留量，從而為真菌毒素的生物防治奠定了基礎。
附圖說明
圖1為嗜根考克氏菌CAMT21651（KR-51）的電鏡掃描圖。
圖2為嗜根考克氏菌CAMT21651（KR-51）的的系統發育樹。
具體實施方式
下面結合說明書附圖和具體實施例對本發明作進一步的解釋說明，但具體實施例並不對本發明作任何限定。除非特別說明，實施例中所涉及的試劑、方法均為本領域常用的試劑和方法。本發明對化合物的來源不做任何形式的限定。
實施例1 耐DON的微生物的分離
（1）製備DON蓄積的蝦仁
隨機挑選體質健康、個體大小均一的南美白對蝦（5±0.5g），按照每組40尾（設3個平行）隨機分配到長方形硬塑養殖箱（容積40×30×12cm3）中，利用充氣式養殖系統保持海水溶氧量DO>6mg/L，pH6.5～7.5；水溫24～28 ℃；鹽度9.18～11.99 ‰。每天換1/3體積的水，採用自然光照，每日飼料量為南美白對蝦體重的5%，每日分為三次，早上9點一次，下午3點一次，晚上9點一次，每日飼料飼餵比為2：3：5。
以四天為一個周期，DON真菌毒素按照四天換一種劑量添加到飼料中餵養對蝦，真菌毒素的起始添加劑量是6 mg/kg·feed，每天染毒，每個周期真菌毒素的添加劑量遞增1.5倍。四天為一個周期取樣一次，在無菌超淨臺去除蝦頭、蝦尾、蝦殼、蝦腸、以及提取出肝胰腺等，得到蝦肌肉於-20 ℃保存。
（2）染毒蝦仁中分離DON的耐受菌
在無菌超淨臺中用滅菌剪刀將一尾蝦的蝦仁剪細碎，從中取出蝦肉25.0 g於滅菌225mL生理鹽水，在漩渦混合器中漩渦120 s，製成1：10的樣品勻液。用移液槍吸取1：10的樣品勻液1mL，沿試管內壁緩慢注入裝有9mL的滅菌生理鹽水的試管中，搖晃試管或者用移液槍頭反覆吹打混合均勻，製成1：100的樣品勻液。以此類推製備10倍系列稀釋樣品的勻液，每遞增稀釋一次，更換一次1mL移液槍頭，最後得到10-1～10-3稀釋度的樣品勻液。在三個稀釋度中分別取0.1mL樣品稀釋液於營養瓊脂培養基（NA）上，均勻塗布，置於30℃培養48h後計算菌落總數並選擇具有代表性單菌落，用三段劃線法劃線純化。從冷凍蝦仁中分離到一株耐 DON的菌KR-51，耐受DON濃度為1 mg/kg。
（3）毒素耐受菌KR-51的生長特性及生理生化鑑定
KR-51菌落為亮黃色革蘭氏陽性球菌，菌落直徑為0.423～1.283 mm，菌落呈圓形凸起，整齊溼潤不透明，最適生長培養基為改良TGY培養基（10g 胰蛋白腖，5g 酵母浸粉，1g 葡萄糖，30g NaCl，1000 mL 蒸餾水，pH為7.0～7.5），最適生長溫度為 30 ℃，硝酸鹽還原試驗陽性，接觸酶陽性，而氧化酶、V-P試驗、吲哚、檸檬酸鹽利用試驗、明膠液化、酪氨酸水解、脲酶、糖類發酵試驗（葡萄糖、海藻糖、麥芽糖、乳糖、蔗糖、D-木糖）等均呈現陰性，該菌株的電鏡掃描圖如圖1。
（4）耐受菌KR-51分離株的16S rRNA 基因序列測 序 及 同 源 性 比 較
將目標菌的菌株劃線接種於改良TGY培養基中，於30 ℃恆溫培養箱中培養24h，得到單菌落。
以引物1：5』-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3』和引物2：5』-CGGCTACCTTGTTACGAC-3』 作為上下遊引物。建立30µL的PCR反應體系： 15 µL 2×MightyAmp polymerase Ver.2，12.9µL雙蒸水，0.75µL上遊引物1，0.75µL下遊引物2 和0.6µL DNA聚合酶。最後挑取微量的單菌落作為DNA模板，加入30 µL PCR反應體系中進行擴增。PCR反應程序第一階段： 98 ℃預變性2min；第二階段：98 ℃變性10 s、58 ℃退火15 s、68 ℃延伸90 s，40個循環；第三個階段10 ℃保存20 min。
PCR擴增結束後，取2 µL擴增產物與1 µL核酸染料混合，點樣於凝膠孔上，進行1.5%瓊脂糖電泳（121V，30min），用凝膠成像儀觀察擴增產物的電泳結果，16S rRNA的PCR擴增產物由上海生工生物工程計算服務有限公司完成。根據測序結果，將16S rRNA序列登陸資料庫EzBioCloud中進行相似性比對搜索，從中獲得相似性較高且是有效描述的典型菌株的16S rRNA序列作為參比對象，，利用MEGA6.0的Neighbor Joining法建立系統發育樹，並進行Bootstraps檢驗。結果檢測發現毒素耐受菌KR-51被鑑定為嗜根考克氏菌（Kocuria rhizophila），該菌株的遺傳系統發育樹如圖2。
該毒素耐受菌KR-51被稱為CAMT21651（KR-51），於2016年6月21日保藏於廣東省微生物菌種保藏中心（GDMCC），地址為：廣州市先烈中路100號大院59號樓5樓，廣東省微生物研究所；保藏編號為：GDMCC No：60048。
實施例2 KR-51對水產飼料中DON 毒素在對蝦體內殘留量的消減
選取對蝦600 尾，隨機分成4個處理組，分別為基礎飼料組、基礎飼料+ DON組、基礎飼料 + 嗜根考克氏菌製劑組、基礎飼料 + DON + 嗜根考克氏菌製劑組（嗜根考克氏菌製劑的添加量為1000 mL/kg·feed（0.02%質量分數，1×108～3.6×108CFU/g·feed））。
（1）基礎飼料 + DON組：製備DON微膠囊毒飼料，DON毒素設 6、9、13.15、20.25和30.375 mg/kg·feed劑量組。
（2）基礎飼料 + 嗜根考克氏菌製劑組：挑取實施例1所述嗜根考克氏菌株接種在改良TGY培養基中，32 ℃培養24 h。將培養24h的嗜根考克氏菌發酵液按1：1的比例均勻噴灑到基礎飼料中（嗜根考克氏菌在飼料中的含量為1×108～3.6×108 CFU/g·feed）。
（3）基礎飼料+DON+嗜根考克氏菌製劑組：配製不同劑量的DON飼料組，加入嗜根考克氏菌（嗜根考克氏菌在飼料中的含量為1×108～3.6×108 CFU/g·feed）。
試驗採用劑量遞增法染毒，以飼料中DON含量為6 mg/kg·feed作為起始染毒劑量，每天染毒，4天為一周期，每期遞增1.5倍，連續染毒20天，並設置空白對照。
採用LC-MS/MS方法檢測對蝦肌肉中DON毒素的殘留量，結果發現：和基礎飼料+DON組相比，基礎飼料+DON + 嗜根考克氏菌製劑組中消除DON殘留率最高為37.01%±0.75，最終消除殘留量為8.55±0.93 ng/g。
SEQUENCE LISTING
廣東海洋大學
一種嗜根考克氏菌
3
PatentIn version 3.3
1
1132
DNA
16S rRNA序列
1
gtgcaatgcg cagctaccat gcagtcgacg ctgagcttgg tgcttgcact gggtggatga 60
gtggcgaacg ggtgagtaat acgtgagtaa cctgcccttg actctgggat aagcctggga 120
aactgggtct aatactggat acgacatgtc accgcatggt ggtgtgtgga aagggtttta 180
ctggttttgg atgggctcac ggcctatcag cttgttggtg gggtaatggc tcaccaaggc 240
gacgacgggt agccggcctg agagggtgac cggccacact gggactgaga cacggcccag 300
actcctacgg gaggcagcag tggggaatat tgcacaatgg gcggaagcct gatgcagcga 360
cgccgcgtga gggatgacgg ccttcgggtt gtaaacctct ttcagcacgg aagaagcgaa 420
agtgacggta cgtgcagaag aagcgccggc taactacgtg ccagcagccg cggtaatacg 480
tagggcgcaa gcgttgtccg gaattattgg gcgtaaagag ctcgtaggcg gtttgtcgcg 540
tctgctgtga aagcccgggg cttaaccccg ggtgtgcagt gggtacgggc agacttgagt 600
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accgatggcg aaggcaggtc tctgggctgt tactgacgct gaggagcgaa agcatgggga 720
gcgaacagga ttagataccc tggtagtcca tgccgtaaac gttgggcact aggtgtgggg 780
aacattccac gttttccgcg ccgtagctaa cgcattaagt gccccgcctg gggagtacgg 840
ccgcaaggct aaaactcaaa ggaattgacg ggggcccgca caagcggcgg agcatgcgga 900
ttaattcgat gcaacgcgaa gaaccttacc aagggcttga catacaccgg accgggccag 960
agatgtcttt ccccttgtgg ggctggtgta caggtggtgc atggttgtcg tcagctcgtg 1020
tcgtgagatg tggttaagtc ccgcacgagc gcaaccctcg ttctatgttg gcagcacgtg 1080
atggtgggga ctcaatagga gaactgcccg gggtcaactt cggaaggaat gt 1132
2
21
DNA
引物1
2
gagagtttga tcctggctca g 21
3
18
DNA
引物2
3
cggctacctt gttacgac 18