一種從乳腺癌細胞株中富集乳腺癌幹細胞的試劑、試劑盒的製作方法
2023-04-23 05:21:51
本發明屬於幹細胞領域，涉及一種從乳腺癌細胞株中富集乳腺癌幹細胞的試劑、試劑盒。
背景技術：
腫瘤幹細胞研究是從幹細胞研究中脫穎而出的一個新領域，雖起步晚，但發展勢頭迅猛，呈現出良好前景。腫瘤幹細胞的存在及其作為腫瘤形成、生長和轉移基礎的觀點已得到廣泛認同。基本理論為：在腫瘤細胞中有一小部分能夠產生新的腫瘤細胞並且能自我複製的細胞，稱為腫瘤幹細胞。與普通腫瘤細胞不同，腫瘤幹細胞對所有的化療藥物都耐藥，並在化療結束後，用類似幹細胞的特性分化出新的腫瘤細胞，因此，腫瘤幹細胞是腫瘤復發的根源[Cancer stem cells in solid tumors.Curr Opin Biotechnol,2007；18:460-6]。當前腫瘤治療尤其是化療的目的是儘可能殺死所有腫瘤細胞，如果腫瘤體積縮小則認為治療方案有效。但實際上大部分腫瘤經過一段時間緩解期後又復發。這是因為這種傳統的治療方法並沒有將腫瘤幹細胞完全殺死，腫瘤幹細胞仍具有無限增殖能力。因此雖然目前臨床上沒有針對腫瘤幹細胞的藥物，但是發現有選擇性的殺滅腫瘤幹細胞的藥物是將來的重要研究方向。越來越多的學者提出腫瘤治療應該針對腫瘤幹細胞，只有研究出能殺滅腫瘤幹細胞的藥物才能從根源上治癒腫瘤。乳腺癌是婦女最常見的惡性腫瘤。流行病學顯示，乳腺癌的患病率呈上升趨勢，已成為嚴重影響婦女身心健康甚至危及生命的常見病與多發病，近年來已經超過宮頸癌成為女性發病率最高的惡性腫瘤，是女性健康第一殺手。根據腫瘤幹細胞研究顯示，研究出能殺滅乳腺癌幹細胞的藥物才能從根源上治癒乳腺癌。而這些研究的前提是高效富集到乳腺癌幹細胞。
但是，腫瘤幹細胞在全部腫瘤細胞中佔比極低，極難獲得數量充足的腫瘤幹細胞以進行深入研究。因此，從腫瘤細胞中高效富集腫瘤幹細胞是腫瘤幹細胞研究首先要解決的難題。
目前富集乳腺癌幹細胞等腫瘤幹細胞的方法主要有三種：流式細胞分選法、免疫磁珠篩選法和體外無血清懸浮球培養法。其中，流式細胞分選法、免疫磁珠篩選法對設備要求較高、操作複雜且容易損傷細胞，使用者較少。體外無血清懸浮球培養法是目前較為受研究者青睞的方法，其原理是基於腫瘤幹細胞具有幹細胞的特性，而幹細胞在添加生長因子的無血清培養基中仍然具備強大的自我更新和保持未分化狀態的能力，並形成「懸浮球」。體外無血清懸浮球培養法富集腫瘤幹細胞的研究較多，比如：張波等採用體外無血清懸浮球培養法從PC-3人前列腺癌細胞中分離並富集前列腺癌幹細胞[從PC-3細胞中富集前列腺癌幹細胞的實驗研究，江蘇醫藥2012年9月第38卷第17期]；郭開峰等採用體外無血清懸浮球培養法從結腸癌細胞株CW-2分離結腸癌幹細胞[無血清懸浮培養法富集結腸癌幹細胞，四川解剖學雜誌2012年6月第20卷第2期]；廉芳等採用體外無血清懸浮球培養法從乳腺癌MDA-MB-435細胞篩選和培養乳腺癌幹細胞[無血清培養富集乳腺癌幹細胞的初步研究，貴陽醫學院學報2014年2月第39卷第1期]；尹燕雪等採用體外無血清懸浮球培養法從人乳腺癌MCF-7細胞株富集乳腺癌幹細胞[無血清培養有效富集乳腺癌幹細胞，臨床與實驗病理學雜誌2015年9月第31卷第9期]。
但是，體外無血清懸浮球培養法效率較低：(1)懸浮細胞球形成效率低下；(2)懸浮球細胞中CD44+CD24-/low細胞比例、SP細胞比例較低。CD44+CD24-/low是區分細胞成瘤能力的很好的分子標記，動物實驗證明CD44+CD24-/low分子標記的腫瘤細胞少量即可成瘤，表現出了其具有自我更新和分化能力的幹細胞屬性[Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells.Proc NatlAcad Sci.2003Apr 1；100(7):3983-8]。側亞群SP細胞用於腫瘤幹細胞的篩選，從乳腺癌細胞系MCF-7中分選的側亞群細胞較非側亞群細胞具有更高的致瘤性[Side population is enriched in tumorigenic,stem-like cancer cells,whereas ABCG2+and ABCG2-cancer cells are similarly tumorigenic.Cancer Res.2005Jul 15；65(14):6207-19]。以安徽醫科大學孫鑫等人的研究為例[人乳腺癌MCF-7細胞系中腫瘤幹細胞的富集與鑑定，安徽醫科大學學報2012年10月第47卷第10期]：研究者採用無血清懸浮球培養法體外培養人乳腺癌MCF-7細胞，懸浮培養第5天可以開始觀察到懸浮細胞球形成，細胞球形成效率為(0.6±0.5)％，第10天時細胞球形成效率為(2.4±1.2)％，比第5天時明顯增多，培養第15天時細胞球形成效率達到(3.8±1.8)％，MCF-7懸浮成球細胞中側群細胞SP細胞含量為(3.9±1.4)％，高於常規培養的MCF-7貼壁細胞(1.1±0.5)％；培養第15天時細胞球形成效率都不足4％。再以朱敬之等人的研究為例[乳腺癌幹細胞的有效富集，中華臨床醫師雜誌2011年5月第5卷第10期]：培養第7天的MCF-7微球體細胞中CD44+CD24-/low分子標記的腫瘤細胞比例僅8.10％。
現有技術對體外無血清懸浮球培養法的兩種延伸：
1、無血清培養+化療藥物雙重篩選富集乳腺癌幹細胞。陳炬瑩等人發現無血清培養+化療藥物雙重篩選比常規無血清培養提前2天出現懸浮細胞球；但該雙重篩選方法並未明顯提高細胞球中CD44+CD24-/low分子標記的腫瘤細胞的含量(僅僅2.07％)。具體參見陳炬瑩等人的研究[乳腺癌幹細胞富集方法的初步研究，福建醫藥雜誌2015年4月第37卷第2期]。
2、以化療藥物處理並通過荷瘤小鼠模型體內傳代的方法富集乳腺癌幹細胞樣細胞。王欣榮等人[5-FU對小鼠乳腺癌4T1細胞株中腫瘤幹細胞樣細胞的富集作用，中國腫瘤生物治療雜誌2012年10月第19卷第5期]以乳腺癌細胞株4T1皮下接種小鼠製備荷瘤模型，以一定劑量5-FU腹腔注射4周；處死小鼠後取腫瘤組織製成細胞懸液，並接種小鼠製備下一代小鼠荷瘤模型，5-FU處理及再次傳代方法同上，共傳4代；對照組小鼠給予生理鹽水注射，其餘處理同模型組；流式細胞術檢測各代腫瘤組織中CD44+CD24-/low細胞比例，Hoechast33342染色法檢測SP細胞的比例，倒置顯微鏡觀察乳腺癌細胞微球體的形成；結果：各代對照組小鼠模型腫瘤組織中CD44+CD24-/low細胞比例為11.5％，SP細胞比例為9.7％，乳腺癌細胞微球體比例為0.5％；5-FU處理組第4代小鼠模型腫瘤組織中CD44+CD24-/low細胞比例為69.0％，SP細胞比例為61.3％，乳腺癌細胞微球體比例為6.1％。該方法對乳腺癌幹細胞的富集效率雖然很高，但是小鼠模型體內傳代的方法成本高、周期長。
技術實現要素：
本發明旨在克服現有技術的不足，提供一種從乳腺癌細胞株中富集乳腺癌幹細胞的試劑並將其開發成試劑盒，用於便捷、高效地為科研工作者富集乳腺癌幹細胞，為乳腺癌藥物的開發奠定乳腺癌幹細胞原料基礎。
技術方案公布如下：
一種從乳腺癌細胞株中富集乳腺癌幹細胞的試劑，包括篩選劑加蘭他敏和石蒜鹼；所述乳腺癌細胞株為MCF-7乳腺癌細胞株。
進一步地，試劑中所述篩選劑中加蘭他敏和石蒜鹼的摩爾比為1:2-2:1。
進一步地，試劑還包括抗氧化劑亞硫酸鹽，優選亞硫酸鈉。
進一步地，上述試劑具體為一種無血清培養基，包括DMEM/F12培養液、常規生長因子、篩選劑加蘭他敏和石蒜鹼、抗氧化劑亞硫酸鈉。
進一步地，所述常規生長因子包括重組人表皮生長因子EGF、牛血清白蛋白BSA、胰島素和B27；所述重組人表皮生長因子EGF濃度為15-25g/L；所述牛血清白蛋白BSA濃度為3-5g/L；所述胰島素濃度為4-6mg/L；所述B27濃度為1.5-2.5％。
進一步地，所述篩選劑加蘭他敏和石蒜鹼濃度共150nmol/L，二者摩爾比為1:2-2:1。
進一步地，所述抗氧化劑亞硫酸鈉的濃度為40-60μg/L。
一種從乳腺癌細胞株中富集乳腺癌幹細胞的試劑盒，與DMEM/F12培養液混合使用，包括雙抗、篩選劑加蘭他敏和石蒜鹼、篩選劑溶解助劑、抗氧化劑亞硫酸鈉、常規生長因子重組人表皮生長因子EGF、牛血清白蛋白BSA、胰島素和B27。
進一步地，所述雙抗為青黴素和鏈黴素。
進一步地，所述篩選劑溶解助劑為DMSO。
發明效果：
本發明提供的試劑能有效從人乳腺癌MCF-7細胞系中便捷、高效地富集得到乳腺癌幹細胞，細胞球形成周期短、微球體細胞中CD44+CD24-/low分子標記的腫瘤細胞和SP細胞含量高，可以開發成試劑盒提高科研工作者富集乳腺癌幹細胞的效率。
具體實施方式
下面結合具體實施例介紹本發明的技術方案。下述實施例中未特別強調的實驗材料均為常規實驗材料，無特別要求，都是本領域技術人員容易獲得的常規材料。
實施例1：從人乳腺癌MCF-7細胞系中富集乳腺癌幹細胞
1、實驗材料
常規含血清培養基：DMEM/F12培養液中加入10％的胎牛血清FBS和雙抗，1L培養基加入10ml青黴素-鏈黴素溶液(100×雙抗，北京雷根生物技術有限公司)。
常規無血清培養基：DMEM/F12培養液中加入雙抗(濃度同上)、重組人表皮生長因子EGF 20g/L、牛血清白蛋白BSA4g/L、胰島素5mg/L、B272％(1L培養基加20ml 50X B27)。
改進含血清培養基：DMEM/F12培養液中加入10％的胎牛血清FBS和雙抗(濃度同上)、加蘭他敏和石蒜鹼共150nmol/L，二者摩爾比為1:1。
改進無血清培養基：DMEM/F12培養液中加入雙抗(濃度同上)、重組人表皮生長因子EGF 20g/L、牛血清白蛋白BSA4g/L、胰島素5mg/L、B272％(1L培養基加20ml 50X B27)、加蘭他敏和石蒜鹼共150nmol/L，二者摩爾比為1:1。
2、實驗方法
(1)貼壁培養MCF-7細胞系
常規培養法：MCF-7細胞系在常規含血清培養液中於37℃、5％CO2的細胞培養箱內培養，貼壁後當細胞增殖至85％左右時，處於對數生長期，用0.25％胰蛋白酶-EDTA消化、離心、重懸後傳代。
改進培養法：MCF-7細胞系在改進含血清培養液中於37℃、5％CO2的細胞培養箱內培養，貼壁後當細胞增殖至85％左右時，處於對數生長期，用0.25％胰蛋白酶-EDTA消化、離心、重懸後傳代。
(2)微球體培養
常規培養法：取常規培養法下第2代處於對數生長期的MCF-7細胞用常規無血清培養基重懸細胞以2×104/mL接種至塑料培養瓶中於37℃、5％CO2的細胞培養箱內培養每2-3天更換1次培養液，第3、5、7天計數其中的微球體數目、大小，並計算微球體形成效率。其中，微球體形成效率＝微球體數目/接種細胞數×100％。定義≥60μm的球體為微球體。把25cm2的培養瓶底面分割成25個等面積的小格，隨機選取15個小格，計數≥60μm的微球體的數量。
改進培養法：取改進培養法下第2代處於對數生長期的MCF-7細胞用改進無血清培養基重懸細胞以2×104/mL接種至塑料培養瓶中於37℃、5％CO2的細胞培養箱內培養每2-3天更換1次培養液，第3、5、7天計數其中的微球體數目、大小，並計算微球體形成效率。其中，微球體形成效率＝微球體數目/接種細胞數×100％。定義≥60μm的球體為微球體。把25cm2的培養瓶底面分割成25個等面積的小格，隨機選取15個小格，計數≥60μm的微球體的數量。
(3)單細胞懸液的製備
常規培養法第7天微球體單細胞懸液的製備：配製0.05％trypsin-0.53mmol/L EDTA-4Na的幹細胞消化液；消化微球體並吹打；鏡下見大多數單細胞形成時終止消化，1500r/min離心6min，吸棄上清；加入無血清的DMEM-F122ml培養液重懸；加入4℃含2.5％胎牛血清的PBS 2ml重懸，過40μmol/L的細胞篩網，即獲得單細胞懸液；細胞計數。
改進培養法第3天微球體單細胞懸液的製備：配製0.05％trypsin-0.53mmol/L EDTA-4Na的幹細胞消化液；消化微球體並吹打；鏡下見大多數單細胞形成時終止消化，1500r/min離心6min，吸棄上清；加入無血清的DMEM-F122ml培養液重懸；加入4℃含2.5％胎牛血清的PBS 2ml重懸，過40μmol/L的細胞篩網，即獲得單細胞懸液；細胞計數。
(4)流式細胞儀檢測幹細胞表型CD44+CD24-/low細胞比例
常規培養法第7天微球體細胞中CD44+CD24-/low細胞比例測定：取上述單細胞懸液設實驗管和對照管，每管調整濃度為3×105/mL單細胞懸液；螢光抗體標記固定：實驗管中加入CD24-PE 20μL和CD44-FITC 0.5μL，加入200μL 1％多聚甲醛固定，對照管中不加螢光抗體，直接加入200μL 1％多聚甲醛固定；流式分析：以標準程序檢測，一般計數2-3萬個細胞，用對檢測結果分析，檢測細胞系中CD44+CD24-/low細胞比例。
改進培養法第3天微球體細胞中CD44+CD24-/low細胞比例測定：取上述單細胞懸液設實驗管和對照管，每管調整濃度為3×105/mL單細胞懸液；螢光抗體標記固定：實驗管中加入CD24-PE 20μL和CD44-FITC 0.5μL，加入200μL 1％多聚甲醛固定，對照管中不加螢光抗體，直接加入200μL 1％多聚甲醛固定；流式分析：以標準程序檢測，一般計數2-3萬個細胞，用對檢測結果分析，檢測細胞系中CD44+CD24-/low細胞比例。
(5)Hoechast 33342染色法檢測SP細胞比例
常規培養法第7天微球體細胞中SP細胞比例測定：取1×106個單細胞加入Hoechast 33342染液至終質量濃度5μg/ml，37℃水浴90min，每15min震蕩混勻一次，1000×g離心5min，PBS液洗2次，棄上清，塗片，於螢光顯微鏡下以藍色螢光觀察並利用Image capture軟體拍照，隨機計數10個視野中的細胞總數及核無螢光染色細胞(SP細胞)數，計算核無螢光染色細胞百分數，即SP細胞比例。
改進培養法第3天微球體細胞中SP細胞比例測定：取1×106個單細胞加入Hoechast 33342染液至終質量濃度5μg/ml，37℃水浴90min，每15min震蕩混勻一次，1000×g離心5min，PBS液洗2次，棄上清，塗片，於螢光顯微鏡下以藍色螢光觀察並利用Image capture軟體拍照，隨機計數10個視野中的細胞總數及核無螢光染色細胞(SP細胞)數，計算核無螢光染色細胞百分數，即SP細胞比例。
3、實驗結果
(1)MCF-7微球體的形成
常規培養法：懸浮細胞在培養48h後逐漸形成較小的初始細胞團，在倒置相差顯微鏡下可見細胞團由幾個到十幾個正在分裂的新生細胞組成，形態不規則，結構鬆散；第5天出現典型的MCF-7懸浮細胞球，至第7天細胞球形成效率為(1.6±0.7)％。
改進培養法：懸浮細胞在培養12h後逐漸形成較小的初始細胞團，在倒置相差顯微鏡下可見細胞團由幾個到十幾個正在分裂的新生細胞組成，形態不規則，結構鬆散；第3天出現典型的MCF-7懸浮細胞球，細胞球形成效率為(3.4±0.7)％；第5、7天細胞球形成效率分別為(5.7±1.9)％、(9.6±2.2)％。
由此可見，改進培養法可以顯著提高MCF-7微球體的形成效率。
(2)CD44+CD24-/low細胞比例
常規培養法：FCM顯示，CD44+CD24-/low細胞比例為(8.3±0.5)％。
改進培養法：FCM顯示，CD44+CD24-/low細胞比例為(63.6±4.9)％。
由此可見，改進培養法第3天微球體細胞中CD44+CD24-/low細胞比例高達60％以上，而常規培養法第7天微球體細胞中CD44+CD24-/low細胞比例僅(8.3±0.5)％。
(3)SP細胞比例
常規培養法：SP細胞比例比例為(7.4±1.8)％。
改進培養法：SP細胞比例比例為(55.7±5.6)％。
由此可見，改進培養法第3天微球體細胞中SP細胞比例高達50％以上，而常規培養法第7天微球體細胞中SP細胞比例僅(7.4±1.8)％。
實施例2：從人乳腺癌MCF-7細胞系中富集乳腺癌幹細胞
1、實驗材料
改進含血清培養基：加蘭他敏和石蒜鹼共150nmol/L，二者摩爾比2:1，其他同實施例1。
改進無血清培養基：加蘭他敏和石蒜鹼共150nmol/L，二者摩爾比2:1，其他同實施例1。
2、實驗方法
同實施例1。
3、實驗結果
(1)MCF-7微球體的形成
第3天出現典型的MCF-7懸浮細胞球，細胞球形成效率為(3.1±0.9)％；第5、7天細胞球形成效率分別為(5.3±1.6)％、(9.1±2.4)％。
(2)CD44+CD24-/low細胞比例
FCM顯示，改進培養法第3天微球體細胞中CD44+CD24-/low細胞比例為(59.7±5.4)％。
(3)SP細胞比例
改進培養法第3天微球體細胞中SP細胞比例為(52.5±5.1)％。
實施例3：從人乳腺癌MCF-7細胞系中富集乳腺癌幹細胞
1、實驗材料
改進含血清培養基：加蘭他敏和石蒜鹼共150nmol/L，二者摩爾比1:2，其他同實施例1。
改進無血清培養基：加蘭他敏和石蒜鹼共150nmol/L，二者摩爾比1:2，其他同實施例1。
2、實驗方法
同實施例1。
3、實驗結果
(1)MCF-7微球體的形成
第3天出現典型的MCF-7懸浮細胞球，細胞球形成效率為(3.3±0.5)％；第5、7天細胞球形成效率分別為(5.4±1.7)％、(9.3±2.1)％。
(2)CD44+CD24-/low細胞比例
FCM顯示，改進培養法第3天微球體細胞中CD44+CD24-/low細胞比例為(56.5±5.8)％。
(3)SP細胞比例
改進培養法第3天微球體細胞中SP細胞比例為(54.2±4.8)％。
對比實施例1：
1、實驗材料
改進含血清培養基：加蘭他敏150nmol/L，其他同實施例1。
改進無血清培養基：加蘭他敏150nmol/L，其他同實施例1。
2、實驗方法
(1)貼壁培養MCF-7細胞系
改進培養法：同實施例1。
(2)微球體培養
改進培養法：同實施例1。
(3)單細胞懸液的製備
改進培養法第7天微球體單細胞懸液的製備：配製0.05％trypsin-0.53mmol/L EDTA-4Na的幹細胞消化液；消化微球體並吹打；鏡下見大多數單細胞形成時終止消化，1500r/min離心6min，吸棄上清；加入無血清的DMEM-F122ml培養液重懸；加入4℃含2.5％胎牛血清的PBS 2ml重懸，過40μmol/L的細胞篩網，即獲得單細胞懸液；細胞計數。
(4)流式細胞儀檢測幹細胞表型CD44+CD24-/low細胞比例
改進培養法第7天微球體細胞中CD44+CD24-/low細胞比例測定：取上述單細胞懸液設實驗管和對照管，每管調整濃度為3×105/mL單細胞懸液；螢光抗體標記固定：實驗管中加入CD24-PE 20μL和CD44-FITC 0.5μL，加入200μL 1％多聚甲醛固定，對照管中不加螢光抗體，直接加入200μL 1％多聚甲醛固定；流式分析：以標準程序檢測，一般計數2-3萬個細胞，用對檢測結果分析，檢測細胞系中CD44+CD24-/low細胞比例。
(5)Hoechast 33342染色法檢測SP細胞比例
改進培養法第7天微球體細胞中SP細胞比例測定：取1×106個單細胞加入Hoechast 33342染液至終質量濃度5μg/ml，37℃水浴90min，每15min震蕩混勻一次，1000×g離心5min，PBS液洗2次，棄上清，塗片，於螢光顯微鏡下以藍色螢光觀察並利用Image capture軟體拍照，隨機計數10個視野中的細胞總數及核無螢光染色細胞(SP細胞)數，計算核無螢光染色細胞百分數，即SP細胞比例。
3、實驗結果
(1)MCF-7微球體的形成
第5天出現典型的MCF-7懸浮細胞球，至第7天細胞球形成效率為(1.5±0.5)％。
(2)CD44+CD24-/low細胞比例
FCM顯示，改進培養法第7天微球體細胞中CD44+CD24-/low細胞比例為(7.7±0.8)％。
(3)SP細胞比例
改進培養法第7天微球體細胞中SP細胞比例為(7.6±1.5)％。
對比實施例2：
1、實驗材料
改進含血清培養基：石蒜鹼150nmol/L，其他同實施例1。
改進無血清培養基：石蒜鹼150nmol/L，其他同實施例1。
2、實驗方法
(1)貼壁培養MCF-7細胞系
改進培養法：同實施例1。
(2)微球體培養
改進培養法：同實施例1。
(3)單細胞懸液的製備
改進培養法第7天微球體單細胞懸液的製備：配製0.05％trypsin-0.53mmol/L EDTA-4Na的幹細胞消化液；消化微球體並吹打；鏡下見大多數單細胞形成時終止消化，1500r/min離心6min，吸棄上清；加入無血清的DMEM-F122ml培養液重懸；加入4℃含2.5％胎牛血清的PBS 2ml重懸，過40μmol/L的細胞篩網，即獲得單細胞懸液；細胞計數。
(4)流式細胞儀檢測幹細胞表型CD44+CD24-/low細胞比例
改進培養法第7天微球體細胞中CD44+CD24-/low細胞比例測定：取上述單細胞懸液設實驗管和對照管，每管調整濃度為3×105/mL單細胞懸液；螢光抗體標記固定：實驗管中加入CD24-PE 20μL和CD44-FITC 0.5μL，加入200μL 1％多聚甲醛固定，對照管中不加螢光抗體，直接加入200μL 1％多聚甲醛固定；流式分析：以標準程序檢測，一般計數2-3萬個細胞，用對檢測結果分析，檢測細胞系中CD44+CD24-/low細胞比例。
(5)Hoechast 33342染色法檢測SP細胞比例
改進培養法第7天微球體細胞中SP細胞比例測定：取1×106個單細胞加入Hoechast 33342染液至終質量濃度5μg/ml，37℃水浴90min，每15min震蕩混勻一次，1000×g離心5min，PBS液洗2次，棄上清，塗片，於螢光顯微鏡下以藍色螢光觀察並利用Image capture軟體拍照，隨機計數10個視野中的細胞總數及核無螢光染色細胞(SP細胞)數，計算核無螢光染色細胞百分數，即SP細胞比例。
3、實驗結果
(1)MCF-7微球體的形成
第5天出現典型的MCF-7懸浮細胞球，至第7天細胞球形成效率為(1.9±0.8)％。
(2)CD44+CD24-/low細胞比例
FCM顯示，改進培養法第7天微球體細胞中CD44+CD24-/low細胞比例為(8.7±1.2)％。
(3)SP細胞比例
改進培養法第7天微球體細胞中SP細胞比例為(7.9±1.6)％。
實施例4：富集乳腺癌幹細胞的試劑
提供一種商品化的從MCF-7乳腺癌細胞株中富集富集乳腺癌幹細胞的試劑：包括含血清培養基和無血清培養基。
含血清培養基：DMEM/F12培養液中加入10％的胎牛血清FBS和雙抗(1L培養基加入10ml的100×青黴素-鏈黴素溶液)、加蘭他敏和石蒜鹼共150nmol/L，二者摩爾比為1:1。
無血清培養基：DMEM/F12培養液中加入雙抗(1L培養基加入10ml的100×青黴素-鏈黴素溶液)、重組人表皮生長因子EGF 20g/L、牛血清白蛋白BSA4g/L、胰島素5mg/L、B272％(1L培養基加20ml 50X B27)、加蘭他敏和石蒜鹼共150nmol/L，二者摩爾比為1:1。
含血清培養基用於貼壁培養MCF-7細胞系；無血清培養基用於培養微球體。
加蘭他敏和石蒜鹼摩爾比也可為2:1或1:2。
實施例5：富集乳腺癌幹細胞的試劑盒
包括雙抗(青黴素和鏈黴素)、篩選劑加蘭他敏和石蒜鹼、篩選劑溶解助劑DMSO、抗氧化劑亞硫酸鈉、常規生長因子重組人表皮生長因子EGF、牛血清白蛋白BSA、胰島素和B27。該試劑盒可以與DMEM/F12培養液、胎牛血清配合使用，供研究者自行配製實施例4所述的含血清培養基和無血清培養基。
本發明提供的試劑能有效從人乳腺癌MCF-7細胞系中便捷、高效地富集得到乳腺癌幹細胞，細胞球形成周期短(由現有技術的7天縮短至3天且形成效率顯著提高)、微球體細胞中CD44+CD24-/low分子標記的腫瘤細胞和SP細胞含量高(均由現有技術的10％以下提高到50％以上)，可以開發成試劑盒提高科研工作者富集乳腺癌幹細胞的效率。
上述具體實施例僅用於解釋本發明的技術方案，本領域技術人員應當明白，本發明的保護範圍並不受限於上述具體實施例。