一種芳香烴化合物的降解細菌及其分離純化和生產方法

2023-04-23 09:39:16 1

專利名稱：一種芳香烴化合物的降解細菌及其分離純化和生產方法
技術領域：
本發明涉及細菌，尤其涉及一種芳香烴化合物的降解細菌及其分離純化和生產方法。
背景技術：
芳香烴類化合物在自然界中普遍存在，它們是煤炭、石油等化石性燃料的天然組成成分；植物體也可產生多種酚類次生代謝產物；另外人類在工業(特別是製藥、印染等工業)生產過程中也會產生大量結構複雜的芳香烴類化合物。在自然界中它們多以酚或滷代烴的形式存在。由於它們的化學結構具有特殊的熱穩定性，同時又難溶於水，所以一般很難消除。而極低含量的這類物質就可以對人體造成強效的或潛在的危害。
以多環芳香烴為例，這是一類在環境中普遍存在的物質，其產生主要是有機物的不完全燃燒。如煤和石油製品的燃燒、原油加工、木材加工、汽車排放的尾氣汙染物以及生活或工業廢物的焚燒處理等。在自然界中，這類物質[特別是較高分子量(四環以上)的]可以保持其固有的毒性而持久存在。它們難溶於水，能在土壤中積累，且它們在食物鏈中有累積作用。在這類物質以較低濃度存在的情況下，就能引發人體組織器官的癌變以及肝、腎、心肌等多種組織器官的功能衰竭。
如何消除這類汙染物在很長時間內一直困擾著人們。微生物降解法顯然是比較優秀的方法之一，而其關鍵就在於如何獲得具有特定降解能力的微生物菌株。

發明內容
本發明的目的在於提供一種芳香烴化合物的降解細菌。
本發明的另一個目的在於提供一種芳香烴化合物的降解細菌分離純化方法。
本發明的再一個目的在於提供一種芳香烴化合物的降解細菌的生產方法。
本發明通過如下措施來實現一種芳香烴化合物的降解細菌，從餐櫥油煙的汙染土壤與來自針葉林的腐殖土混合中分離出來，現已在中國典型培養物保藏中心保藏。
一種芳香烴化合物的降解細菌，其特徵在於，該細菌為類黃氫噬胞菌，分類命名Hydrogenophaga pseudoflava LHJ39，保藏在CCTCC，保藏編號NoM203054，保藏日期2003年6月20日。
類黃氫噬胞菌的特徵為G+，個體形態為彎杆狀，大小為0.4μm×1.5～2.6μm，具周生鞭毛，產淺黃綠色-褐色色素，代謝乳糖；最適宜生長溫度為26-28℃，最適宜生長pH為6.8-7.2，兼性自養，兼厭氣性。
一種芳香烴化合物的降解細菌分離純化方法，其特徵在於取餐櫥油煙的汙染土壤與來自針葉林的腐殖土混合；將該混合土壤與溶解於橄欖油的芳香烴化合物混合均勻，密閉培養3天。將含芳香烴化合物的土壤與生理鹽水混合，離心分離，去除大顆粒物質後保留上層均勻渾濁的液體；將渾濁的液體再進行離心分離，收集離心所得的沉澱；將該沉澱在以萘為唯一碳源的基礎鹽固體瓊脂平板培養基上劃線接種，培養溫度為27～29℃，培養2～7天，直至出現明顯單個菌落；將篩選獲得的單菌落，在以萘為唯一碳源的基礎鹽培養基上連續傳6代，使之成為菌落形態穩定的純培養。
本發明所用基礎鹽培養基配方為單位為克/升A液Na2HPO4·12H2O 9.0KH2PO41.5NH4Cl 2.0B液MgSO4·7H2O 0.2MnSO4·H2O 3.0毫克ZnSO4·7H2O 0.2毫克CoCl2·6H2O 15.3毫克分別配製A、B液，按A液與B液的體積比為1∶0.8-1.2混合，調節pH至6.8-7.2，攪拌均勻，靜置，使其無沉澱產生；將基礎鹽液體培養基121℃滅菌15分鐘後冷卻。
基礎鹽固體瓊脂平板培養基配方在上述培養基A、B液混合均勻，靜置，無沉澱後，加入2.0～2.5wt％瓊脂粉，攪拌均勻，121℃滅菌15分鐘。趁熱倒入培養皿平板，冷卻後保藏在萘蒸氣環境中。
本發明的碳源由萘組成，用丙酮溶解，丙酮與萘的質量比為5∶1-1.8。
本發明的芳香烴化合物選自萘、芴或蒽。
該菌株可用一般發酵工業中的通用發酵罐進行培養。
本發明的細菌，一個工藝流程。從常規分離、篩選方法不超過20天，且很容易將萘代謝菌與具有忍受高濃度萘的自養菌分離。
本發明採用的生產方法為靜置培養出的單菌落→種子液→種子罐→生產罐→產品分裝(或用吸附劑吸附後再包裝)。
一種芳香烴化合物的降解細菌的生產方法，其特徵在於，該方法包括以下步驟1)將菌種接種在基礎鹽簡單培養基中，培養基配方為單位g/LNa2HPO4·12H2O 9.0KH2PO41.5NH4Cl 2.0MgSO4·7H2O 0.2檸檬酸鐵銨 5.0mgMnSO4·H2O 3.0mgZnSO4·7H2O 0.2mgCoSO410.0mg三乙醇胺 10.0mg加蒸餾水至1000.0ml，靜置過夜，滅菌後倒制固體瓊脂平板，含瓊脂2.0-2.5wt％，冷卻備用。
將菌種固體瓊脂平板劃線接種，碳源為萘蒸氣，28℃培養48小時，至出現典型的單菌落培養物。
2)將上述培養菌種接入基礎種子瓶，培養至對數生長期；培養基配方為單位g/L
Na2HPO4·12H2O 9.0KH2PO41.5NH4Cl2.0MgSO4·7H2O 0.2檸檬酸鐵銨 5.0mgMnSO4·H2O 3.0mgZnSO4·7H2O 0.2mgCoSO410.0mg三乙醇胺 10.0mg用時加入10ml/L碳源，其中丙酮與萘的質量比為5∶1-1.8；3)將種子液接入種子罐培養，種子罐培養基為單位g/L蛋白腖10.0酵母浸膏 5.0NaCl 5.0葡萄糖2.0加蒸餾水充分溶解，攪拌均勻，121℃滅菌30min後冷卻備用；用時加入10ml/L碳源，其中丙酮與萘的質量比為5∶1-1.8，作為限制因子。
4)將種子液接入生產罐培養，生產罐培養基為單位g/L蛋白腖10.0酵母浸膏 5.0NaCl 5.0葡萄糖2.0加蒸餾水充分溶解，攪拌均勻，121℃滅菌30min後冷卻。
5)培養液可直接分裝成產品也可用吸附劑吸附後再進行分裝。
降解微生物菌株的定性檢測方法為用pH6.8～7.2的磷酸鹽緩衝溶液將培養收穫的菌體清洗兩次，並使至成為靜止細胞，用此靜止細胞在含有飽和萘的磷酸鹽緩衝液體系中反應2小時，離心去除細胞後，將上清液用二氯甲烷等體積萃取，無水硫酸鎂乾燥樣品後做氣相色譜-質譜聯用(GC/MS)檢測，得到GC/MS譜。由此可知菌株對萘是否具有降解能力。
本發明的降解細菌，可使萘等芳香烴類環境汙染物降解90％以上。本發明的細菌至少可用於降解廢水或環境中殘留的芳香化合物和稠環芳香化合物，對於保護環境，保護人們的健康具有重要的意義。它可用於被芳香烴類化合物汙染的土壤及水體的環境修復，以及特殊汙染物的高效、安全的集中處理，在芳香烴類化合物汙染環境的修復以及特殊汙染物的集中無害化處理中能長期、高效使用。適合在全國石油化工行業及因長期使用化石類燃料而出現芳香烴汙染的地區使用。它使用方便，成本低，效果好。能在芳香烴類化合物過飽和的水體中生存並使其得到快速降解。
試驗表明，該技術在芳香烴類化合物汙染環境的修復以及特殊汙染物的集中無害化處理中能長期、高效使用，與已有技術相比，本發明的菌株專一性和適應性強，便於增殖和利用開發。
具體實施例方式
實施例1採集針葉林腐殖土與餐櫥油煙混合，噴溼，密閉，28℃發酵2天。待發酵的土壤樣品表面出現大量放線菌、真菌菌絲體時，用橄欖油溶解萘、芴或蒽，傾倒在土壤樣品表面。密閉，28℃發酵3天。將此發酵土壤與2倍體積的生理鹽水混合，在1000轉/分鐘條件下離心3分鐘，去除大顆粒物質後保留上層均勻渾濁的液體。將此均勻渾濁的液體在6000轉/分鐘的離心速度下離心15分鐘，收集離心所得的沉澱。將該沉澱在以萘為唯一碳源的基礎鹽培養基上劃線接種，27～29℃培養2天，即出現明顯單個菌落。將篩選獲得的單菌落，分別在以萘為唯一碳源的基礎鹽培養基上連續傳6代，每代培養48小時，使之成為菌落形態穩定的純培養。將菌種接種在基礎鹽簡單培養基中，培養基配方為單位g/LNa2HPO4·12H2O 9.0KH2PO41.5NH4Cl 2.0MgSO4·7H2O 0.2檸檬酸鐵銨 5.0mgMnSO4·H2O 3.0mgZnSO4·7H2O 0.2mg
CoSO410.0mg三乙醇胺10.0mg加蒸餾水至1000.0ml，靜置過夜，滅菌後倒制固體瓊脂平板，含瓊脂2wt％，冷卻備用。
將菌種固體瓊脂平板劃線接種，碳源為萘蒸氣，28℃培養48小時，至出現典型的單菌落培養物。
2)將上述培養菌種接入基礎種子瓶，培養至對數生長期；培養基配方為單位g/LNa2HPO4·12H2O9.0KH2PO41.5NH4Cl 2.0MgSO4·7H2O0.2檸檬酸鐵銨5.0mgMnSO4·H2O 3.0mgZnSO4·7H2O0.2mgCoSO410.0mg三乙醇胺 10.0mg用時加入10ml/L碳源，其中丙酮與萘的質量比為5∶1-1.8；鑑定所獲得的菌株，每克活菌能在36小時內降解1克萘，具有較強的萘降解能力。這個菌株的主要特徵為G+，個體形態為彎杆狀，大小為0.4μm×1.5～2.6μm，具周生鞭毛，具有比較明顯的溶瓊脂性，產淺黃綠色-褐色色素。最適生長溫度為26-28℃，最適生長pH為6.8-7.2，兼性自養，兼厭氣性。
實施例2將瓊脂斜面上的菌種接種在固體瓊脂平板上，碳源為萘蒸氣，28℃培養48小時，培養至出現典型的單菌落培養物。配製4000.0ml種子瓶培養基，分裝至20隻500ml的錐形瓶中，121℃滅菌30min後冷卻備用。用時加入40ml/L丙酮∶萘＝5∶6(w/w)，挑取固體瓊脂平板上的單個菌落，接入基礎種子瓶，恆溫水浴搖床培養，培養溫度控制在26-28℃，攪拌速度為180轉/分，密閉培養24小時。24小時後更換全部基礎種子瓶的無菌空氣。再繼續培養24小時後6000轉/分，離心15分鐘收穫菌體。將離心獲得的菌體接入種子罐。種子罐為0.5噸，投料量為0.4噸，培養基成分為蛋白腖4kg，酵母浸膏2kg，NaCl 2kg，葡萄糖0.8kg。加蒸餾水充分溶解，攪拌均勻，121℃滅菌30min後冷卻備用。用時加入4L丙酮/萘溶液，其中含萘1.6kg。種子罐須先用蒸汽滅菌並冷卻至26-28℃攪拌速度為220轉/分，無菌空氣通入量為1∶0.8，培養至對數生長期後，將種子液接入生產罐，生產罐為5噸，投料量4噸，培養基成分為蛋白腖40kg，酵母浸膏20kg，NaCl 20kg，葡萄糖8kg。生產罐預先用蒸汽滅菌。
權利要求
1.一種芳香烴化合物的降解細菌，其特徵在於，該細菌為類黃氫噬胞菌，分類命名Hydrogenophaga pseudoflava LHJ39，保藏在CCTCC，保藏編號NoM203054。
2.如權利要求1所述的降解細菌，其特徵在於，類黃氫噬胞菌為G+，個體形態為彎杆狀，大小為0.4μm×1.5～2.6μm，具周生鞭毛，產淺黃綠色-褐色色素，代謝乳糖；最適宜生長溫度為26-28℃，最適宜生長pH為6.8-7.2，兼性自養，兼厭氣性。
3.如權利要求1所述的降解細菌分離純化方法，其特徵在於取餐櫥油煙的汙染土壤與來自針葉林的腐殖土混合；將該混合土壤與溶解於橄欖油的芳香烴化合物混合均勻，密閉培養3天。將含芳香烴化合物的土壤與生理鹽水混合，離心分離，去除大顆粒物質後保留上層均勻渾濁的液體；將渾濁的液體再進行離心分離，收集離心所得的沉澱；將該沉澱在以萘為唯一碳源的基礎鹽固體瓊脂平板培養基上劃線接種，培養溫度為27～29℃，培養2～7天，直至出現明顯單個菌落；將篩選獲得的單菌落，在以萘為唯一碳源的基礎鹽培養基上連續傳6代，使之成為菌落形態穩定的純培養。
4.如權利要求3所述的方法，其特徵在於，基礎鹽培養基配方為單位為克/升A液Na2HPO4·12H2O9.0KH2PO41.5NH4Cl2.0B液MgSO4·7H2O0.2MnSO4·H2O 3.0毫克ZnSO4·7H2O0.2毫克CoCl2·6H2O15.3毫克按A液與B液的體積比為1∶0.8-1.2混合，調節pH至6.8-7.2，攪拌均勻，靜置，使其無沉澱產生；將基礎鹽液體培養基121℃滅菌15分鐘。
5.如權利要求3或4所述的方法，其特徵在於，基礎鹽固體瓊脂平板培養基配方培養基A、B液混合均勻，靜置，無沉澱後，加入2.0～2.5wt％瓊脂粉，攪拌均勻，121℃滅菌。
6.如權利要求3所述的方法，其特徵在於，碳源由萘組成，用丙酮溶解，丙酮與萘的質量比為5∶1-1.8。
7.如權利要求3所述的方法，其特徵在於，芳香烴化合物選自萘、芴或蒽。
8.實現權利要求1所述的降解細菌的生產方法，其特徵在於，該方法包括以下步驟1)將菌種接種在基礎鹽簡單培養基中，培養基配方為單位g/LNa2HPO4·12H2O 9.0KH2PO41.5NH4Cl2.0MgSO4·7H2O 0.2檸檬酸鐵銨 5.0mgMnSO4·H2O 3.0mgZnSO4·7H2O 0.2mgCoSO410.0mg三乙醇胺 10.0mg加蒸餾水至1000.0ml，靜置過夜，滅菌後倒制固體瓊脂平板，含瓊脂2.0-2.5wt％；將菌種固體瓊脂平板劃線接種，碳源為萘蒸氣，28℃培養48小時，至出現典型的單菌落培養物；2)將上述培養菌種接入基礎種子瓶，培養至對數生長期；培養基配方為單位g/LNa2HPO4·12H2O 9.0KH2PO41.5NH4Cl2.0MgSO4·7H2O 0.2檸檬酸鐵銨 5.0mgMnSO4·H2O 3.0mgZnSO4·7H2O 0.2mgCoSO410.0mg三乙醇胺 10.0mg用時加入10ml/L碳源，其中丙酮與萘的質量比為5∶1-1.8；3)將種子液接入種子罐培養，種子罐培養基為單位g/L蛋白腖10.0酵母浸膏 5.0NaCl 5.0葡萄糖2.0加蒸餾水充分溶解，攪拌均勻，121℃滅菌30min；用時加入10ml/L碳源，其中丙酮與萘的質量比為5∶1-1.8，作為限制因子；4)將種子液接入生產罐培養，生產罐培養基為單位g/L蛋白腖10.0酵母浸膏 5.0NaCl 5.0葡萄糖2.0加蒸餾水充分溶解，攪拌均勻，121℃滅菌30min；5)培養液直接分裝成產品或用吸附劑吸附後再進行分裝。
全文摘要
本發明涉及細菌，尤其涉及一種芳香烴化合物的降解細菌及其分離純化和生產方法。降解細菌，從餐櫥油煙的汙染土壤與來自針葉林的腐殖土混合中培養出來，現已在中國典型培養物保藏中心保藏。細菌為類黃氫噬胞菌，分類命名Hydrogenophaga pseudoflava LHJ39，保藏在CCTCC，保藏編號NoM203054。該細菌為G
文檔編號C12N1/20GK1800351SQ20041008235
公開日2006年7月12日 申請日期2004年12月31日 優先權日2004年12月31日
發明者章儉, 夏春谷 申請人:中國科學院蘭州化學物理研究所