用於預防和延遲色素性視網膜炎的絲氨酸棕櫚醯轉移酶抑制劑的製作方法

2023-04-22 22:10:56 1

專利名稱：用於預防和延遲色素性視網膜炎的絲氨酸棕櫚醯轉移酶抑制劑的製作方法
技術領域：
本發明涉及絲氨酸棕櫚醯轉移酶抑制劑用於預防和延遲遺傳性視網膜變性的用途，並涉及含有它們的組合物，特別是基於脂類納米球的組合物。技術現狀術語色素性視網膜炎(RP)包括一類遺傳性的病症，涉及雙眼視網膜的進行性變性。受影響的個體受累於暗視覺的逐漸喪失，以及周邊視覺的下降(也稱為「管狀視」)，並且中心視力也可能隨時間而丟失，疾病可發展為弱視(hypovision)和失明。另一個典型特徵是對閃光的增加的敏感度，換言之，對由明亮向黑暗的轉變(反之亦然)適應滯後。所述病症可影響光受體(視錐和主要是視杆，後者負責周邊視覺)或視網膜色素上皮，伴隨有特徵性的色素沉積，這是疾病名稱的由來。受色素性視網膜炎影響的在4000人中約有1人，發現於世界各地並且目前是不可治癒的。在義大利，至少15000人受影響，弱視，在沒有有效治療的條件下，產生明顯的經濟和社會衝擊。在EU至少150000人受累於該不可治癒的病症。該疾病雖是遺傳性的，但不影響生育能力，由於工業化國家增加的預期壽命，其發病率有增加的趨勢。Hodge WG 等(Can J Ophthalmol. 2006Aug ；41 (4) :481_90)描述了 ω-3 脂肪酸來治療視網膜和晶狀體的病症的潛在用途，特別是預防或延遲色素性視網膜炎的進展。然而， 作者強調臨床試驗仍處於初步階段。還提出使用一些神經營養因子，然而這仍處於試驗階段，並且受這樣的事實局限， 即這類物質具有蛋白質結構、高分子量且並非自由的滲透細胞。特別而言，Thanos C.， Emerich D. (Expert Opin Biol Ther. 2005Nov ；5 (11) 1443-52)描述了神經營養因子的受控釋放，如CNTF、BDNF,⑶NF、LEDGF, PEDF和其他用於視網膜病症治療的因子，所述視網膜病症例如色素性視網膜炎、黃斑變性、青光眼等。根據一些作者，用抗氧化劑(如二十二碳六烯酸(DHA))或膳食補充劑(如維生素 A棕櫚酸鹽)口服治療，延遲視網膜視錐的次級變性。然而，這類治療的效果在科學團體中仍有爭議。Berson EL. (Int Ophthalmol Clin. 2000Fall ；40(4) :93_111)描述了使用營養學方法治療影響光受體的退行性視網膜病症的嘗試，例如維生素A、E、K和B6補充成分，低
蛋白膳食等。高比重治療不是特別有效，雖然一些研究觀察到陽性的細胞反應，視網膜電圖 (ERG)予以有益的證實，其顯示在高壓艙用氧治療的患者的振幅具有統計學顯著的增加。發明概述目前發現，體內施用無毒量的絲氨酸棕櫚醯轉移酶的抑制劑，通過降低光受體的變性速率、延長其存活和改善其功能性質，能夠延遲所述病症(即，色素性視網膜炎)的進展，特別是殘留視覺的時間窗，其中所述絲氨酸棕櫚醯轉移酶催化神經醯胺生物合成的第一個關鍵階段。還發現，使用脂類納米球製劑不僅允許納米球負載絲氨酸棕櫚醯轉移酶抑制劑，其中所述抑制劑獲得水性分散體，從而濃度可與用於眼內注射的製劑相當，而且還在視網膜上(尤其是在與視網膜色素上皮的界面上)提供了高濃度的化合物，釋放藥物而不引起毒性。發明的描述本發明涉及絲氨酸棕櫚醯轉移酶(SPT)抑制劑用於預防和延遲遺傳性視網膜變性，即色素性視網膜炎的用途，並涉及基於脂類納米球的、含有SPT抑制劑的組合物。絲氨酸棕櫚醯轉移酶抑制劑的實例包括多球殼菌素和在下列目錄參考文獻中說明的化合物。Sasaki, S.等，J. Antibiot. 47 :420_33 (1994)描述了 mycestericins (與多球殼菌素結構性相關的化合物)作為SPT抑制劑。VanMiddlesworth F.，等，J. Antibiotics 45 :861_7(1992)描述了另一類有效的 SPT抑制劑，鞘氨酸抗菌素(sphingofungins)。其他的SPT抑制劑包括環絲氨酸、D-絲氨酸、綠黃菌素(Viridiofungin)A和脂黃毒素。US 20080249274描述了通過施用多球殼菌素治療動脈粥樣硬化的方法。WO 2005092325描述了多球殼菌素用於製備用於治療哺乳動物中高甘油三酯血症的藥物的用途。WO 2008046071描述了具有SPT調控活性的化合物，用於治療胰島素耐受、心血管病症、代謝症候群和炎性病症。WO 2008083280描述了作用於SPT的化合物，用於治療胰島素耐受、胰腺β細胞凋亡、肥胖、心血管病症、脂代謝紊亂(dyslipidaemias)和脆性X症候群。WO 2004039351描述了適合眼科領域使用的、含有脂類納米微粒的藥物組合物。更特別的是，本發明涉及多球殼菌素用於預防和延遲遺傳性視網膜變性，即色素性視網膜炎的用途，以及基於負載了多球殼菌素的脂類納米球的組合物。多球殼菌素是真菌來源的天然化合物，可溶於(細胞)膜並能夠自由的滲透細胞， 具有對絲氨酸棕櫚醯轉移酶的抑制作用。多球殼菌素的施用誘導對神經醯胺的從頭合成的抑制，神經醯胺是鼠RP模型中存在的鞘脂。已發現在視網膜施用的多球殼菌素能夠直接作用於光受體的代謝通路，選擇性抑制在遺傳性視網膜變性病症的光受體細胞死亡過程中激活的代謝通路，因而部分的抑制受累於RP的光受體的死亡。然而，應該注意到多球殼菌素對正常細胞沒有作用，也沒有不利。該化合物因而可用於延遲色素性視網膜炎中的光敏感性視網膜細胞的進行性變性過程，從而延長受累於所述病症的對象的可用視覺期。因為這是一種緩慢的進行性病症，因此延遲，即使是部分的延遲都涉及受累對象的視覺性能的可觀的改善，從而改善了他/她的生活質量。已發現，在實驗動物體內施用多球殼菌素導致視網膜光受體的選擇性改變，使其存活延長，並觀察到這些細胞變性速率的同時減少。此外，用視網膜電描記術法測量，觀察到增加的視網膜視覺性能。多球殼菌素治療抑制了視網膜細胞死亡的活性過程，無視導致該過程的突變。這是所用方法的巨大優勢，因為RP治療涉及的主要困難是由於它的大的遺傳異質性。實驗部分在rdlO突變小鼠模型中進行設計探討多球殼菌素治療RP的功效的研究。該小鼠體現了視杆細胞特異性磷酸二酯酶基因的β亞基的錯義突變，並模擬了常染色體隱性的人RP形式。視杆細胞死亡開始於生活史的約第12天(Ρ12)，峰值在Ρ24，如這樣的事實所證實的，所述事實是視杆細胞產生的ERG(視網膜電圖)可以記錄至Ρ25。關於視網膜視錐細胞的死亡，反應在Ρ45消失。視杆細胞變性體現了凋亡的特徵。使用基於生物化學、形態學和電生理學的多學科方法，在rdlO突變小鼠中建立了光受體死亡作為通過鞘脂信號傳導的目標，並獲得下列結果A.內源件神經醯胺水平在從各年齡組的麻醉的rdlO突變和野生型(wt)小鼠中分離視網膜後，測試鞘脂內源性神經醯胺的水平。處理分離的視網膜進行脂類抽提，用二醯甘油激酶測試來確定總內源性神經醯胺/無機磷酸鹽的比例。發現在大量的光受體變性之時，rdlO突變小鼠的視網膜中的內源性神經醯胺水平增加，並且在所有的測試年齡都保持恆定的升高。相反，在具有相同的遺傳背景的野生型(wt)對照動物中，在整個視網膜成熟後，視網膜神經醯胺的水平不發生改變。這些結果表示，神經醯胺在影響光受體的凋亡過程中扮演了病因性的角色，導致光受體死亡。因此，已知將進行性變性的剩餘視網膜細胞(例如，視錐細胞、雙極細胞和水平視杆細胞)也將由於神經醯胺依賴性過程而死亡。Β.向P19齡的rdlO和wt小鼠的右眼施用單次玻璃體內注射500納升多球殼菌素 (188mM)。在同一動物的左眼只注射載體(DMSO)。在P21分離左右視網膜，如上所述分別處理進行生物化學的神經醯胺測試。因此在用多球殼菌素處理的rdlO小鼠的眼中發現比對照眼中顯著更低的神經醯胺水平。該神經醯胺水平的降低對應於rdlO突變小鼠中緻密型(瀕死)光受體數量的顯著降低，根據下列定量的形態學方法證實。相反，多球殼菌素注射沒有顯著降低Wt小鼠中的視網膜神經醯胺水平。C.緻密型光受體計數在P21收集P19時注射的動物，摘出其眼睛並固定。分離左右視網膜，用螢光DNA 結合分子染色，放於玻片上。沿著視網膜的四條子午線以相等的間隔在共聚焦顯微鏡下對含有光受體核的外核層採樣。圖像輸出到計算機工作站，對每個掃描視野中的緻密型光受體計數。計算每對治療的和對照的視網膜的緻密型光受體的總數。發現多球殼菌素注射降低了光受體死亡率約50% (使用的rdlO小鼠η = 17，注射和計數了 34隻眼睛)。在僅用DMSO處理的視網膜中的緻密型光受體的評估數仍然落入用於其他研究的未治療rdlO小鼠的視網膜中之前觀察到的相同範圍內。P.組織學觀察從組織學的觀點看，觀察到用多球殼菌素注射的rdlO和wt小鼠都呈現出正常的視網膜形態。此外，經過與其他相類似注射的、在神經節細胞中含GFP(綠色螢光蛋白)的小鼠(Thy I-GFP小鼠)的視網膜表現出優秀的維持了神經節細胞的形態和結構，且視網膜的分層整體良好。E.毒件研究在上文示例的研究之前和過程中進行的對照實驗證實，眼內注射多球殼菌素沒有對rdlO或wt小鼠產生副作用。應該注意到，迄今為止，多球殼菌素極少在體內使用，並從未眼內注射過。劑量是基於可獲得的關於培養細胞的文獻而選定的，由於玻璃狀液，計算7/8 倍的稀釋度。出於阻止大部分光受體進入凋亡周期的關鍵性原因，眼內施用的所選擇的時間窗是在凋亡性光受體的死亡峰值之前。最後，在這樣的事實的基礎上排除了毒性效應，所述事實是在處理的動物中沒有觀察到普遍的或局部的炎症應答症狀(例如巨噬細胞侵入) 或增加的眼部反應。F.光警體的功能恢復通過記錄瞬間的視網膜電圖(ERG)研究光受體的功能恢復，這是普遍用於測試人類患者的視網膜生理學的技術，所述患者特別是患RP的患者。在兩組如上所述眼內注射的rdlO小鼠中，相比用載體注射的另一眼睛，用多球殼菌素注射的眼中的ERG應答/反應沒有呈現出恢復，提示用單次注射施用的多球殼菌素的劑量太低，不足以在光受體對光的顯著反應中產生可檢測的改變。即使重複的玻璃體內注射多球殼菌素，也沒用建立起適合小鼠眼睛的小尺寸的規程(同樣地小鼠約P19)重複的全麻和眼內注射分別涉及動物的高死亡風險和出現白內障的高風險。因此開發了多球殼菌素施用的新型非侵入性方法，基於使用脂類納米球。這些是由脂類組成的顆粒，具有優選在40和240納米之間的平均直徑，根據EP 526666和WO 2004039351生產。使用所述製劑的結果是能夠將脂類納米球負載多球殼菌素，獲得水性分散體，其濃度與用於眼內注射的濃度相當。首先評估了螢光納米球到達眼內部的能力，所述納米球負載了螢光染料且未負載活性成分(空的)。基於用共聚焦顯微鏡觀察，發現在眼表面施用這類納米球24小時後，螢光顆粒高度濃縮在視網膜上，尤其是與色素上皮的界面上。將負載了濃度為0. 27mg/mL的多球殼菌素的脂類納米球施用於rdlO突變小鼠的幼崽。當它們的眼睛睜開(P14)時，將每隻幼崽分為2組第一組以每天眼用藥水的形式接受負載了多球殼菌素的納米球(每隻眼睛750納升)，第二組接受未負載(空的)的納米球，使用相同的化學製劑但不含多球殼菌素。從P21天起(該突變體中可記錄的ERG最大時的年齡)，採用ERG記錄來評估光受體的可能的功能恢復，並持續至P30。在未治療的 rdlO動物中，此年齡時由視杆細胞誘導的ERG已消失。在用負載了多球殼菌素的納米球治療的rdlO動物中，特別在P24(光受體的死亡峰值)和P28-P30間隔觀察到藥物的治療效果。在該後一年齡，相比對照組，在用多球殼菌素治療的動物中持續清楚的視錐細胞誘導的應答。在ERG總體消失的時間後，rdlO突變小鼠中持續視錐細胞誘導的應答是非常重要的結果。人RP患者的剩餘的視覺是基於視錐細胞的，所述細胞在視杆細胞死亡後是無情地註定會死亡的。在ERG記錄後，摘出動物的眼睛，固定並切片，用螢光核染料染色視網膜切片，用於評估外核層(ONL)的厚度和視網膜的整體形態學。
圖Ia顯示了從中獲得ERG的同一視網膜的組織切片。從兩隻年齡P24的rdlO小鼠獲得了對增加強度的光的閃爍的ERG應答。較大的灰色痕跡是來自一隻MYR-SLN (多球殼菌素_固體脂類納米球)處理小鼠的應答，同時黑色痕跡是來自對照動物的。在多球殼菌素治療的小鼠中，ONL中保留的核帶(nuclear row)的數目顯著高於對照小鼠。圖Ib中給出了在MYR-SLN和U_SLN(未負載固體脂類納米球)處理的小鼠的ONL 中的平均核帶數的定量分析。顯示了從一群年齡為P21-P35 WrdlO小鼠中獲得的暗視ERG應答的圖。正值表示ERG的b波，而負值表示a-波振幅。在時間窗P27-P35中，以MYR-SLN處理的小鼠(灰色圖)顯示出更好的a-波應答Γ :p < 0. 05 ；WiIcoxson-Mann-Whitney測試)。圖Ic顯示了來自2隻SLN處理的小鼠的視網膜垂直切片，從所述小鼠中記錄了左側的ERG痕跡。MYR-SLN處理動物中的光受體帶(photoreceptor row)的數目高於對照中的，表示增加的存活。圖Id中，T測試分析顯示了在P24-P30時間間隔中，在MYR-SLN處理的視網膜中， 光受體核帶的數目更高。因此，以脂類納米球形式持續施用多球殼菌素構建了保護色素性視網膜炎中光受體免受進行性變性的非侵入性方式。G.討論上述結果證實，通過抑制神經醯胺的從頭生物合成，降低視網膜的神經醯胺水平， 可以降低光受體的凋亡性死亡速率。所獲得的結果因而證實了在施用多球殼菌素後，可以維持光受體變性的降低。因此，使用根據本發明的多球殼菌素可被認為是幫助保持光受體(否則註定死亡的光受體) 存活更長時間的有效治療對策。考慮這一事實是特別有趣的，所述事實是中等侵犯性的(aggressive)表型和 rdlO突變小鼠的典型視網膜結構的維持鑑別出患隱性磷酸二酯酶突變的患者，作為基因治療的潛在候選對象。一般還認為視杆細胞存活速率的少量增加可能導致成比例更長的視錐細胞活力。關於推薦的治療用途，根據本發明的組合物可優選的如上述配製成供局部眼睛施用的脂類納米球形式，構成本發明的一個方面。如上所述，製備所述納米球的方法公開在EP 526666 和 WO 2004039351 中。根據本發明的組合物還可以配製成適合局部眼睛施用的其他方式，例如供眼部使用的眼用藥水或注射液的形式，如玻璃體內的、結膜下的、房內或眼球後的注射，允許的條件下可使用合適的賦形劑，並可根據藥物技術領域普遍已知的常規方法來製備，例如在 "Remington' s Pharmaceutical Handbook", Mack Publishing Co. , N. Y. , USA Φ^Jf法。
權利要求
1.絲氨酸棕櫚醯轉移酶抑制劑用於製備藥物的用途，所述藥物用於預防和延遲遺傳性視網膜變性，其中遺傳性視網膜變性是色素性視網膜炎。
2.權利要求1所述的用途，其中絲氨酸棕櫚醯轉移酶抑制劑是多球殼菌素。
3.權利要求1或2所述的用途，其中所述藥物是以適合眼部施用的藥物形式。
4.權利要求3所述的用途，其中所述藥物是以脂類納米球的形式。
5.脂類納米球形式的組合物，所述納米球負載了絲氨酸棕櫚醯轉移酶抑制劑。
6.權利要求5所述的組合物，其中絲氨酸棕櫚醯轉移酶抑制劑是多球殼菌素。
全文摘要
本發明涉及絲氨酸棕櫚醯轉移酶抑制劑用於預防和延遲遺傳性視網膜變性的用途，以及含有它們的組合物。
文檔編號A61K31/201GK102333527SQ201080009303
公開日2012年1月25日 申請日期2010年2月23日 優先權日2009年2月26日
發明者E·斯特雷特伊, M·C·加裡吉尼, P·加斯科, R·吉多尼 申請人:國家研究委員會, 比薩大學, 米蘭大學, 納諾韋科特有限公司