分析活檢樣品中幹擾素調節因子-1特異性核糖核酸以診斷癌症，癌變前狀態的方法

2023-04-22 21:53:01

專利名稱：分析活檢樣品中幹擾素調節因子-1特異性核糖核酸以診斷癌症，癌變前狀態的方法
技術領域：
本發明涉及使用一種分子標記，幹擾素調節因子-1(IRF-1)診斷癌症，癌變前狀態以及對其它形式疾病的易感性的方法。
惡性細胞的轉化是一個多步驟過程，該過程是由於在參與調節細胞生長的多個遺傳位點處進行性地獲得結構變化引起的。已經有文獻完整地記載，在人類惡性細胞中，起顯性作用的原癌基因中發現的功能增加的突變常常伴隨有腫瘤抑制基因中功能損失的突變的發生。已經鑑別出了幾種腫瘤抑制基因，這些基因的突變或缺失似乎是人類癌症發生的關鍵，在這些基因中，p53，RB和WT1的基因產物存在於核中，並且作為基因轉錄的調節子起作用(參見Kaelin，Jr.，et al.，1991；Lewin，1991；Marshall，1991；Weinberg，1991；Haber and Housman，1992；Vogelstein and Kinzler，1992；Levine，1993的評論)。
最初鑑別出的兩個結構相關的轉錄因子，IRF-1和IRF-2是作為幹擾素(IFN)系統的調節子(Miyamoto et al.，1988；Harada etal.，1989；Tanaka and Taniguchi，1992)。還有其他人在不同文章中記載了鑑定出IRF-1(Pine et al.，1990；Yu-Lee et al.，1990；Abdollahi et al.，1991；Stark and Kerr，1992)。IRF-1作為一種轉錄激活子起作用，而IRF-2通過與IRF-1競爭結合到相同的DNA序列成分(IRF-Es)上而抑制IRF-1的作用(Harada et al.，1989；Tanaka et al.，1993)。IRF-Es既存在於IFN-α啟動子也存在於IFN-β啟動子中，還在存在於IFN-誘導性基因啟動子中的IFN-受激應答因子(ISREs)中(Friedman and Stark，1985；Shirayoshiet al.，1987；Levy et al.，1988)。已經證實對於I型IFN基因和某些IFN誘導性基因IRF-1起著激活子的作用(Fujita et al.，1989；Harada et al.，1990；Au et al.，1992；Pine et al.，1992；Reis et al.，1992；Matsuyama et al.，1993；Ruffner et al.，1993；Kamijo et al.，1994)。
還有人提供了證實IRF-1具有腫瘤抑制劑作用的證據；(i)IRF-1顯示抗增殖活性(Yamada et al.，1990；Kirchhoff et al.，1993；T.Tamura，M.S.L.，and T.Kawakami，結果未出版)(ii)在NIH3T3細胞中，阻遏物IRF-2的過量表達導致細胞轉化並且通過激活劑IRF-1的伴隨過量表達而抑制這種細胞轉化(Harada et al.，1993)以及(iii)帶有IRF-1基因中的無效突變的一級胚胎成纖維細胞(EFs)(IRF-1-/-小鼠)對激活形式的c-Ha-ras的轉化敏感，這種轉化特性也可以在來自p53-/-小鼠的EFs中看到，但不存在於野生型EFs中(Tanaka et al.，1994)。這些結果共同暗示著IRF-1功能的損失歸因於人類瘤的形成發育。
已將人類IRF-1基因定位到5q31.1(Itoh et al.，1991； Willmanet al.，1993；Harada et al.，1994)。以前曾測出在人白血病和間質缺失染色體5q的MDS中染色體譜帶5q31是最普遍缺失的片段，稱之為「關鍵區」(Le Beau et al.，1986； Nimer and Golde，1987；Le Beau et al.，1989；Pederson and Jensen，1991)。Del(5q)也是具有頑固性貧血和異常巨核細胞的特定臨床脊髓發育紊亂的一個標誌，稱作為「5q-綜合症」，其中所述的「紊亂」主要出現於老年婦女(Van den Berghe et al.，1985)。因此，人們認為該染色體區包含了一個腫瘤抑制基因。但是，根據與del(5q)相關的骨髓疾病反覆不定的臨床特徵，這種腫瘤抑制基固的失活可能伴隨了變異的其它遺傳活動的發生例如不同類型的骨髓紊亂症中癌基因的激活(Carter et al.，1992)。
曾有人證實，在具有del(5q)或5q31易位的MDS和白血病的13例典型病例中每一病例都缺失了一個或兩個IRF-1等位基因。再者，在一例再發急性白血症中發現伴隨有殘留等位基固的缺失的一個IRF-1等位基因的失活基因重排(Willman et al.，1993)。該結果支持了這樣的觀點，即IRF-1可能是del(5q)中缺失的關鍵的腫瘤抑制基因；因此，一個或兩個IRF-1等位基因的丟失可歸因於未抑制的細胞增殖，從而促進了人白血症和MDS的發生。另一方面，兩個IRF-1等位基因仍保留於某些顯示了5q缺失的MDS/白血症患者(Bou-ltwood et al.，1993；Le Beau et al.，1993)。
本發明解決的問題是找到一種使用分子標記診斷癌症的新方法以及提供該方法的手段。
本發明提供的診斷癌症，癌變前狀態或對其它形式疾病的易感性的新方法依據對血液或其它活檢樣品中IRF-1特異性RNA的分析。
本發明是基於意想不到地發現腫瘤抑制基因IRF-1的失活的新機理似乎在腫瘤和癌變前狀態，尤其是在造血系統疾病中起著決定性作用。該機理似乎並不依賴於以前描述的IRF-1的缺失或突變，因為它發生於不可檢測到這種變化的病例中。失活作用是通過一種拼接方式經改變的初級轉錄本實現的，因而是在RNA水平上。更具體地講，在來自於健康的供體或患有白血病或脊髓發育不良綜合症的患者的樣品中可以檢測到缺失了外顯子2或外顯子2和3的RNA分子。這些經改變的轉錄本並不導致產生功能性IRF-1多肽。對這種不尋常的外顯子遺失的敏感性似乎是人類IRF-1基因的內在特性。令人興奮的是，與健康供體相比，大量具有癌變前狀態或惡性造血系統的患者中，全長轉錄本與失去了外顯子2或外顯子2和3的轉錄本之間的比例顯著地發生變化。因此，拼接方式發生改變的IRF-1轉錄本可以作為惡性疾病，尤其是白血病，或癌變前的狀態，特別是脊髓發育不良綜合症，或對其它形式疾病的易感性分子標記。
由本發明提供的診斷癌症，癌變前狀態，或對其它形式型疾病的易感性的新方法依據於對血液或其它活檢樣品中IRF-1特異性RNA分析。優選的是，這種分析是通過使用IRF-1特異性引物的聚合酶鏈反應(PCR)，尤其是擴增步驟前結合逆轉錄(RT)步驟來實現。用於PCR的優選的引物具有下列序列5′TTCCCTCTTCCACTCGGAGT3′(SEQ ID NO1)或5′GATATCTGGCAGGGAGTTCA3′(SEQ ID NO2)。能恰當地適用於逆轉錄的引物具有下列序列5′CTCTGGTCTTTCACCTCCTC3′(SEQ ID NO3).應該注意到上面公開的特異引物僅是舉例，並且可由其它合適的寡聚核苷酸替代。
除RT/PCR外，也可以使用其它的分析RNA的方法，例如RT與連接酶鏈反應(LCR)結合。
在另一方面，本發明包括IRF-1特異性寡聚核苷酸，優選的是具有SEQ ID Nos.1，2或3的序列的這類核苷酸，及其它們在上述方法中的應用。
再者，為了診斷目的，可以採用合適的生物學或免疫學檢測法測出從血液或其它活檢物質獲得的樣品中生物學活性IRF-1多肽的含量。
人類IRF-1基因中外顯子的缺失人類IRF-1基因由10個外顯子組成，其中在第二個外顯子內定位了起始因子ATG序列(圖1A，Cha et al.，1993；Harada et al.，1994)。在利用S1定位法分析各種細胞系中IRF-1 mRNA表達期間，我們注意到不尋常的轉錄本的表達。如圖1B所示，使用來自於健康供體(參見注1)的外周血單核(PBM)細胞的總RNA檢測到三條被保護的譜帶。最上部的譜帶(譜帶1,248個核苷酸)與完整的IRF-1mRNA相一致。從其大小判斷，其它兩條譜帶分別對應於缺失外顯子2的RNA(譜帶2，180個核苷酸)，和缺失外顯子2和3的RNA(譜帶3，80個核苷酸)。但是，在兩種造血細胞系，HL-60和HEL中，由於mRNA表達水平低，這些結果不明顯。對於HL-60，這可以解釋為缺少一個IRT-1等位基因，因為該細胞已經失去了一個染色體5(Gall-agher et al.，1979)。為了獲得更多的這些RNA的定量及定性分析結果，接著，我們進行了一個聚合酶鏈反應(PCR)試驗。在該試驗中，mRNA的逆轉錄之後緊接著PCR擴增(RT-PCR)，其中將PCR產物(擴增子)標記為高比活性(參見詳細的實驗程序)。如圖1C所示，再次用來自PBM細胞的RNA檢測三條譜帶，該RNA用於診斷由S1定位分析產生的譜帶1、2和3(圖1A)。對PCR擴增的cDNAs進行的核苷酸序列分析結果表明，事實上上部的、中間的以及下部的譜帶分別對應於完整IRF-1 mRNA，缺失外顯子2的IRF-1 mRNA(△2 mRNA)，以及缺失外顯子2和3的IRF-1 mRNA(△23 mRNA)(結果未表示)。在HL-60以及HEL細胞中也表達△2和△23 mRNAs。另外，含有轉染得的19 kb人IRF-1基因的小鼠NIH 3T3衍生的R27-3細胞系(Harada etal.，1993)也顯示相同的外顯子缺失類型，表明這種外顯子缺失的發生不依賴於宿主細胞類型以及染色體的位置。相反，利用小鼠特性引物對小鼠IRF-1 mRNA進行類似的RT-PCR分析時，在R27-3和鼠造血細胞系BAF/BO3中僅擴增了代表完整mRNA的單一譜帶(圖1D)。因此所觀察到的外顯子缺失可能是人IRF-1基因的內在特性。重要的是，在△2和△23 mRNAs中外顯子2的缺失應該導致真正的起始因子AUG序列的缺失(圖1A，Harada et al.，1994)(見下文)。
(注1)檢測了來自健康供體的另外9個樣品，並且它們都基本上顯示有類似於該例中觀察到的表達方式。
在MDS/白血病中加速了IRF-1 mRNA外顯子缺失已經證實IRF-1起著腫瘤抑制劑的作用(Harada et al.，1993；Tanaka et al.，1994)，並且一個或兩個IRF-1等位基因的缺失和/或重排是人MDS和白血病發展的關鍵(Willman et al.，1993)。另一方面，僅一定比例的這些造血紊亂症伴隨有5q異常(Kerim etal.，1990； Pederson-Bjergaard et al.，1990；Willman et al.，1993)。上述發現促使我們檢查來自於MDS或繼發性MDS白血病患者的細胞中外顯子缺失的情形。從骨髓(BM)細胞或PBM細胞分離出總RNA並進行RT-PCR分析。某些典型例子的結果示於圖2中。在來自健康供體的BM細胞和來自MDS/白血病患者的BM細胞之間明顯地存在顯著差異。事實上，這裡提供的兩個樣本(Pts.228和356)中幾乎沒有可檢測到的代表完整IRF-1 mRNA的擴增子，然而仍可檢測到代表△23 mRNA的擴增子。相反，β-肌動蛋白mRNA特異性擴增子的量保持相對恆定(參見實驗程序和表1)。
我們對來自MDS或繼發性MDS白血病患者的總共25個RNA樣本進行類似的分析，結果概括於表1。首先通過圖像分析(Fujix Bas2000)定量地測定IRF特異性擴增子的量，然後將其量標準化到來自相同樣本的-肌動蛋白擴增子的量；在該樣本RNAs中β-肌動蛋白mRNA的表達相對地是恆定的(Makino et al.，1990；Foley et al.，1993)。進一步將這些數目標準化到在來自健康供體的NBM.1細胞中存在的IRF-1和IRF-2擴增子的水平(任意地規定到1.00)。因此，表1中顯示的數目表示與健康供體RNAs有關的完整的，△2、△23IRF-1 mRNAs和IRF-2 mRNA的表達，儘管表中數據沒有提供關於絕對mRNA拷貝數的信息。
顯然，代表完整IRF-1 mRNA的擴增子並沒有在來自Pts.581和117細胞的RNA樣本中被檢測到，其中沒有任何一個樣本顯示在5q區發生細胞遺傳畸變(表1)(參見注2)。另外，從其它5個樣品(Pts.190，356，228，255，578)檢測到非常低水平的完整擴增子，而△2和△23擴增子，特別是△23擴增子仍可檢測的。還採用RT-PCR/SSCP分析法分析這些患者樣本中的六個樣本的p53突變，並且除一個樣本(Pt.356)外所有樣本都沒有顯示發生這種突變的證據(表1；Sugi-moto et al.，1993)。儘管沒有象在上述樣品中觀察到的那樣深的程度，幾個其它樣本(例如Pts.570，716，194，199，707)也明顯地顯示了更低水平的完整IRF-1 mRNA擴增子。我們還分析了來自不同類型造血惡性症患者的RNA，並且發現在某些樣品，包括僅表達△23mRNA的4AML患者之中的兩個中有微量的或沒有完整IRF-1擴增子(結果未顯示)。值得注意的是一些RNA樣本顯示出含量增加的IRF-2特異性擴增子(例如Pts.581，199，534，715)。
(注2)就此範圍來說，對顯示有外顯子缺失加速的四個MDS或白血症患者(Pts.255，356，707和716)進行RT-PCR/SSCP分析既沒有顯示在IRF-1外顯子序列內有任何DNA缺失或突變，DNA測序結果也沒有顯示已知影響拼接的內含子序列的任何改變。另外，對這些患者的DNAs進行Southern印跡分析也沒有顯示IRF-1基因有顯著重排的跡象(結果未顯示)。
△2和△23 mRNA產物的分析雖然△2和△23 mRNAs缺少IRF-1的真正的起始密碼子，但這些mRNA可能仍能指導新蛋白質的合成。構建與△2和△23 mRNAs相對應的cDNAs，並用於指導體外轉錄-翻譯反應。當採用SDS-PAGE分析35S甲硫氨酸標記的產物時，檢測到野生型的△2和△23 cDNA的特徵譜帶(圖3A)。稱作為IRF-1 △2和IRF-1 △23的△2和△23cDNA產物的大小相當於其合成分別在AUG密碼子32(在外顯子3中)和85(在外顯子4中)開始的被截短了的IRF-1蛋白質。如圖3B所示，凝膠電泳移動分析顯示IRF-1 △2和IRF-1 △23沒有結合到含有兩個高親合力IRF-Es的寡聚體(C1寡聚體；Tanaka et al.，1993)。每個cDNA與一個在其啟動子含有IRF-Es的報導質粒一起共轉染到IRF-陽性細胞系(P19；Harada et al.，1990)結果顯示由完整IRF-1cDNA編碼的蛋白質，但不是由△2或△23 cDNAs編碼的蛋白質，能激活該報導質粒(圖3c)。△2和△23 cDNAs與完整IRF-1 cDNA的共轉染並不影響IRF-1介導的基因的激活，這表明既不是IRF-1 △2也不是IRF-1 △23以顯性-陰性方式作用於IRF-1介導的轉錄活化(結果未顯示)。
完整的人類IRF-1但不是IRF-1 △23顯示腫瘤抑制劑活性在大多數完整IRF-1 mRNA的表達較低或不能檢測到的樣本中，△23 mRNA卻以相當高的水平進行表達(表1)。因此我們提出是否IRF-1 △23顯示了腫瘤抑制劑活性的論點。用含有為完整IRF-1或IRF-1 △23編碼的cDNA的表達載體，和潮黴素(hgr)抗性基因(pMiwhph；Kato et al.，1990)一起轉染能表達c-Ha-ras癌基因(Tanaka et al.，1994)的活性形式的IRF-1-/-EFs。將轉染子平鋪於甲基纖維素凝膠上培養。隨後計算hgr-抗性菌落數目。如表2所示，編碼IRF-1的cDNA的轉染導致深度地抑制菌落的形成，而對於編碼IRF-1 △23的cDNA沒有觀察到這樣的效果。這些結果表明，可能是由於失去了其DNA結合活性，IRF-1 △23缺少腫瘤抑制劑活性。
表1完整的IRF-1和交替拼接形式的IRF-1在來自MDS/白血病患者細胞中的表達年齡， ％原始a來源 性別 細胞 p53mut.b核型c[正常BM](NBM)NBM.1 BM 38，MN.D. N.D. N.D.
NBM.2 BM 65，MN.D. N.D. N.D.Pt.190 BM 38，F5.0％(-) N.D.
Pt.356 BM 74，M4.0％(+) 46，XY，-18.5q-，9q-，+marPt.441 BM 43，M4.0％(-) 46，XY，12p-，20q-，21p+/46，XY，12p-，20q-，21p+，21p+Pt.581 BM 65，M4.9％(-) 46，Xq-，Y，Bq+Pt.585 BM 45，F0.8％(-) 46，XX[RAEB]Pt.535 BM 54，M12.4％ (-) 46，XYPt.570 BM 61，M8.1％(+) 47，XY，-5，-7，-12，-18，+22，15p+，+4mar[RAEB-t]Pt.228 BM 72，M30.0％ (-) 46，XY[CMMol.]Pt.255 BM 34，M5.8％N.D. 46，XY，5q-，8p+，13q+，20q+Pt.492 PB 57，M9.0％N.D. 46，XYPt.519 BM 28，M0.5％N.D. 46，XYPt.711 PB 77，F0.0％N.D. N.D.
Pt.716 BM 52，M5.7％N.D. 46，XY，3q+，5p·q-，10p+，13q-[MDS/LEU.]Pt.117 PB 42.M-100％(-) 45，X，-YPt.194 BM 68，M43.6％ N.D. 46，XY/44，XY，-2，-5，-7，-9，-10，-17，-18，-20，19p+，+6marPt.199 BM 60，F68.0％ (-) 46，XXPt.231 BM 55，M77.6％ N.D. 46，XYPt.447 BM 44，F67.0％ (-) 46，XX，t(1119)Pt.534 BM 60，F50.0％ (-) 46，XXPt.543 BM 44，F35.3％ (-) 46，XX，t(1119)Pt.578 BM 55，F71.6％ (-) 46，XX，7p-，11q+Pt.706 PB 44，M30.0％ N.D. 46，XYPt.707 PB 56，M50.0％ N.D. 47，XY，+8Pt.713 BM 57，M43.6％ N.D. 44，X，-Y，-18，5qPt.715 BM 64，M70.6％ N.D. 46，XY細胞系Ht.60K562HELHelaGM637
表1(續)IRF-1IRF-1△2IRF-1△23IRF-2d[正常BM](NBM)NBM1 1.00 0.160.831.00NBM2 0.97 0.070.460.76(RA)Pt.190 0.05 0.052.361.31Pt.356 0.08 0.121.310.91Pt.441 0.42 0.030.191.40Pt.581 0.00 0.000.153.24Pt.585 0.43 0.070.322.68Pt.535 0.89 0.160.731.26Pt.570 0.39 0.060.291.73(RAEB.t)Pt.228 0.08 0.020.200.73(CMMol.)Pt.255 0.09 0.645.392.49Pt.492 1.03 0.010.322.36Pt.519 0.86 0.190.750.75Pt.711 0.93 0.150.532.23Pt.716 0.37 0.010.462.59[MDS/LEU.]Pt.117 0.00 0.007.801.89Pt.194 0.37 0.150.520.49Pt.199 0.30 0.334.016.51Pt.231 0.77 0.141.191.20Pt.447 1.00 0.481.061.69Pt.534 0.63 0.130.383.76Pt.543 1.90.080.382.77Pt.578 0.15 0.000.151.83Pt.706 0.75 0.030.472.94Pt.707 0.39 0.020.421.09Pt.713 0.47 0.070.421.21Pt.715 0.67 0.040.213.21細胞系HL.600.34 0.030.080.44K562 1.01 0.030.291.91HEL 0.55 0.040.200.90Hela 0.51 0.170.490.081GM6370.29 0.120.220.81
注RA，頑固性貧血；RAEB，原始細胞過多性頑固性貧血；RAEB-t，轉化中的RAEB；CMMoL，慢性骨髓單核細胞性白血病；MDS/LEU，由骨髓增生異常綜合症引起的明顯性白血病；BM，骨髓；PB，外周血；F，女性；M，男性；N.D.，未檢測；p53mut.，p53突變。
a.根據利用FAB分類法的形態學標準進行測定。
b.(-)沒有檢測到突變。(+)檢測到突變。按Sugimoto etal.，(1993)描述通過RT-PCR/SSCP分析測定MDS/白血病患者的p53基因的突變。
c.根據人類細胞遺傳學術語的國際系統(ISCN，1991)對具有代表性的中期染色體擴散進行核型分析。
d.相對於β-肌動蛋白信號將IRF-1和IRF-2值定到標準值。將具有代表性的正常骨髓NBM.1的IRF-1完整形式和IRF-2的值分別定為1.00。每個值都是三個重複檢測的平均值。
表2由完整的或交替拼接形式的IRF-1對菌落形成能力的抑制經轉染的 菌落數目構建體實驗1 實驗2實驗3pAct-C 995 934 699pAct-H1 381 246 353pAct-H1△23 844 803 813注經轉染的構建體如下所示pAct-c，對照肌動蛋白啟動子載體；pAct-H1，完整IRF-1 cDNA表達的肌動蛋白啟動子；pAct-H1△23，缺失外顯子2和3的ITF-1 cDNA表達的肌動蛋白啟動子。
實施例RNA分離，S1定位圖分析，以及RNA印跡分析採用硫氰酸胍方法分離總的細胞RNA。按照以前曾經描述的方法進行S1定位圖分析(Fujita et al.，1987)。為了製備探針DNA，將含有AIRF-1 cDNA FspI-KpnI片段有意義鏈的pBluescript IISK(+)噬菌體DNA作為模板，合成32p標記的反意義DNA。然後採用BamHI消化該產物，分離含有核苷酸殘基217至464(Maruyama etal.，1989)的探針DNA。Harada et al.(1990)描述了RNA印跡分析的程序。為了製備探針DNA，採用隨機引物法(Amersham)標記用於β-肌動蛋白的1Ha-204的2.0 kb BamHI-PvuII片段(Miyamoto etal.，1988)。
合成的引物設計用於特異性地擴增cDNA的引物。人IRF-1基因的引物(Mar-uyama et al.，1989)是用於逆轉錄(RT)的反意義引物，核苷酸(nt)490到471；用於PCR的有意義引物，nt 92至111；用於PCR的反意義引物，nt 470到451。IRF-2基因的引物(Itoh et al.，1989)是用於RT的反意義引物，nt 391到372；用於PCR的有意義引物，nt 19至38；用於PCR的反意義引物，nt 367到348。β-肌動蛋白的引物(Ponte et al.，1984)是用於RT的反意義引物，nt 470至451；用於PCR的有意義引物，nt 311至330；用於PCR的反意義引物，nt 448至429。小鼠IRF-1基因的引物(Miyamoto et al.，1988)是用於RT的反意義引物，nt 498至479；用於PCR的有意義引物，nt105至124，用於PCR的反意義引物，nt 478至459。
RT-PCR分析基本上按照以前描述的方法(Makino et al.，1990)進行RT-PCR分析。由於在緊隨第一級指數動力學的PCR反應階段可以定量地檢測擴增子(Wang et al.，1989；Makino et al.，1990；Foleyet al.，1993)，因而認為高度特異性標記和更少的擴增循環提供了更高的靈敏度和更清晰的結果。在該檢測分析中，將來自相同RNA樣品的IRF-1，IRF-2和β-肌動蛋cDNAs進行PCR擴增，並將β-肌動蛋白擴增子用作為mRNA定量分析的參考(Makino et al.，1990)。
採用Chomczynski和Sacchi(1987)中描述的單步驟方法分離總RNA。向含有1pmol RT引物，3.8ml 5×RT緩衝液(250mM Tris-HCl[pH8.3]，375mM KCl，15mM MgCl2)的12.5ml體積的反應混合物中加入500毫微克的總RNA。將該混合物在95℃加熱2分鐘，置於冰上冷卻，並在37℃溫育30分鐘。在退火反應之後，向該混合物中添加0.2ml 5×RT緩衝液，2ml的0.1M DTT，4.0ml 2.5 mM的各種dNTPs，20U的RNA酶抑制劑(Takara)，以及100U的莫洛尼氏鼠白血病病毒(MMLV)逆轉錄酶(GIBCO BRL)至體積為20ml，然後在37℃溫育60分鐘。然後將RT反應產物在90℃溫育5分鐘，置冰上冷卻，並加入40ml蒸餾水。在體積為10ml含有10mM Tris-HCl(pH8.3)，50mM KCl，1.5mM MgCl2，0.01％(w/v)明膠，200ml dNTPs，各為1mM的5′和3′32p末端標記的PCR引物，0.25U TaqDNA聚合酶(Perkin-Elmer Cetus)，以及3ml的RT反應產物的反應混合物中進行PCR反應。用Perkin-Elmer Cetus DNA熱循環儀按如下所示進行擴增在95℃反應30秒，55℃反應30秒，72℃反應1分鐘。在擴增的指數階段測定反應的循環數；對於IRF-1和IRF-2為24個循環，對於β-肌動蛋白為18個循環。將每種PCR反應混合物各1ml在5％聚丙烯醯胺凝膠以及0.5×TBE緩衝液中進行電泳。將凝膠乾燥，採用Fujix Bas 2000成像分析儀定量檢測適當譜帶的放射性。將IRF-1和IRF-2特異性擴增子的量校正為相同樣品的β-肌動蛋白擴增子的量。針對在健康供體的NBM.1細胞中存在的IRF-1和IRF-2擴增子的水平(任意地定為1.00)進一步校正這些數據。對於IRF-1擴增子，可以用Wang et al.(1989)描述的相同引物對多個不同mRNA種類進行定量分析。
質粒的構建將每個含有完整的或交替拼接形式的IRF-1 cDNA的上述RT-PCR產物亞克隆到pCRTMII(Invitrogen)。為了構建用於體外轉錄的質粒(pBH1，pBH1△2和pBH1△23)，連接下面DNA片段；(i)來自pBlu-escript II SK(+)的EcoRI-BamHI主鏈片段(ii)來自含有IRF-1cDNA的pCRTMII衍生物的EcoRI-EcoRV片段(iii)來自pHIRF31的EcoRV-BamHI片段(Maruyama et al.，1989)。通過用pAct-C的HindIII-BamHI主鏈片段(Harada et al.，1990)取代pBluescript衍生物的HindIII-BamHI主鏈片段而構建處於肌動蛋白啟動子控制下的IRF-1表達載體(pAct-H1，pAct-H1△2和pAct-H1△23)。
體外轉錄和翻譯在帽類似物和三磷酸核糖核苷酸存在下，使用含有完整的或突變的IRF-1 cDNAs的各種pBluescript II衍生物(pBH1，pBH1△2，或pBH1△23)的T7啟動子以及T7 RNA聚合酶將加帽的合成mRNA進行轉錄。反應按照製造者的方案(Stratagene)進行。用苯酚-氯仿萃取該RNA並用乙醇沉澱。再將該RNA重新溶於水中，並將0.8mg的RNA加到利用兔網狀細胞溶解產物(Amersham)的體外翻譯反應中，在30℃進行60分鐘。
凝膠轉移試驗基本上按照以前描述的方法(Harada et al.，1990)完成該試驗。使用32p-標記的C1寡聚體(含有兩個IRF結合基元；Tanaka etal.，1993)作為探針DNA。
DNA轉染和CAT檢測分析使用含有四個IRF結合基元的5mg p-55C1B報導基因(Fujitaet al.，1987；Tanaka et al.，1993)，以及5mg的IRF-1表達載體轉染P19胚胎癌細胞(2.5×105個細胞/6cm平皿)。按照所述(Harada et al.，1990)進行CAT檢測分析。
在甲基纖維素凝膠上進行的菌落形成檢測分析採用磷酸鈣方法(Harada et.al.，1990)用15mg的IRF-1表達載體和0.3mg的pMiwhph(Kato et al.，1988)共轉染活化形式的c-Ha-ras，rasEF11表達的IRF-1-/-胚成纖維細胞(Tanaka et al.，1994)(5×105個細胞/10cm/平皿)。轉染72小時後，用溶於含有200 mg/ml潮黴素的培養基中的1.3％甲基纖維素凝膠懸浮細胞，並平鋪於由0.53％瓊脂糖和培養基組成的瓊脂糖床層上。鋪平板3周後計算菌落數。


圖1(A)交替拼接方式的人IRF-1前mRNA。在上部的泳道中外顯子按如圖所述進行編號，連接外顯子的線條表示拼接。該圖指出了位於外顯子2內的起始因子ATG序列。在較低的泳道中，顯示完整的和交替拼接形式的IRF-1 mRNA。圖中標出了被保護免受S1消化的探針的預期大小以及RT-PCR擴增的產物。
(B)通過S1定位圖譜分析檢則交替拼接形式的IRF-1前maNA。從健康志願者(NPB.1)的外周血單核(PBM)細胞，HL-60細胞，以及HEL細胞中分離總RNA。較上部泳道；將15mg的RNAs進行S1定位圖譜分析(參見實驗程序)。1道，32p-標記的HaeIII-消化的pBR322 DNA片段；2道，酵母tRNA，作為陰性對照；3道，來自健康供體(NPB.1)的PBM細胞；4道，HL-60；5道，HEL。箭頭指示如在(A)中描述的被保護的探針的位置。較低部的泳道；將2.5mg的RNAs進行Northern印跡分析並且用β-肌動蛋白探針與濾紙進行雜交。
(C)對來自健康供體的PBM細胞，HL-60以及HEL中的IRF-1，IRF-2和β-肌動蛋白mRNA進行的RT-PCR分析。利用與IRF-1、IRF-2和β-肌動蛋白的引物分別將500毫微克的總RNA逆轉錄為cDNA。使用標記的引物將cDNA產物進行PCR(參見實驗程序)。1道，酵母tRNA作為陰性對照；2道，來自健康供體(NPB.1)的PBM細胞；3道，HL-60；4道，HEL；5道，32p標記的HaeIII消化的pBR322 DNA片段。在上部泳道中，箭頭指示在(A)中描述的PCR產物的位置。在中間以及下部泳道中，分別表示IRF-2和β-肌動蛋白特異性擴增子。
(D)人以及鼠IRF-1 mRNA的RT-PCR分析比較。利用人或鼠IRF-1特異性引物將來自用人IRF-1基因組DNA轉染的NIH 3T3衍生的克隆的總RNA(R27-3；Harada et al.，1993)以及來自鼠BAF/B03的總RNA進行RT-PCR分析(參見實驗程序)。箭頭指示(A)中描述的PCR產物的位置。1道，32p-標記的HaeIII消化的pBR322 DNA片段，2道，NIH 3T3衍生的克隆(R27-3)中人IRF-1擴增子；3道，R27-3中鼠IRF-1擴增子；4道，BAF/B03中鼠IRF-1擴增子。
圖2來自具有代表性的MDS/白血病患者的mRNA的RT-PCR分析。
用來自健康供體的總RNA以及來自MDS/白血病患者的總RN進行RT-PCR分析(參見實驗程序)。在上部泳道中，箭頭指示如圖1A中描述的PCR產物的位置。1道，32p-標記的HaeIII消化的pBR322 DNA片段；2道，來自健康供體的骨髓細胞(NBM.1)；3道，Pt.441；4道，Pt.228；5道，Pt.356；6道，Pt.231。在下部泳道中，顯示β-肌動蛋白特異性擴增子。
圖3(A)完整的以及交替拼接形式的IRF-1的體外翻譯產物。在12.5％SDS-聚丙烯醯胺凝胺上分析每種翻譯反應(10ml)的1ml溶液。
(B)IRF-1突變體的DNA結合活性。將(A)中顯示的體外翻譯蛋白質進行凝膠轉移分析。4道，沒有RNA的體外翻譯產物；5道，沒有提取物。箭頭指示IRF-1 DNA複合物的位置。
(C)由IRF-1突變體引起的轉錄激活。用5mg的CAT報導基因p-55ClB和5mg的效應因子基因轉染P19細胞。經轉染的效應因子基因如下所示對照，5mg的pAct-C；IRF-1，2.5mg的pAct-H1和2.5mg的pAct-C；IRF-1△2，2.5mg的pAct-HI△2以及2.5mg的pAct-C；IRF-1△23，2.5mg的pAct-H1△23以及2.5mg的pAct-C。重複轉染並且將檢測分析重複三次，結果基本上可重複。
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權利要求
1.一種診斷癌症，癌變前狀態，或對其它形式疾病的易感性的方法，其特徵在於在從血液或其它活檢材料獲得的樣品中分析IRF-1特異性RNA。
2.根據權利要求1所述方法，其特徵在於測定該樣品是否含有與一種RNA分子相比，長度縮短的IRF-1特異性RNA分子，其中所述的一種RNA分子為IRF-1基因的全長胺基酸序列編碼。
3.根據權利要求2所述方法，其特徵在於測定所說的IRF-1特異性RNA分子是否缺失IRF-1基因的外顯子2或外顯子2和3。
4.根據權利要求2或3所述方法，其特徵在於測定全長IRF-1-RNA，IRF-1△2-RNA和IRF-1△23-RNA的相對含量。
5.根據權利要求1～4任一項所述方法，其特徵在於所述分析方法是通過逆轉錄/聚合酶鏈反應並且隨後分析經擴增的cDNA來實現的。
6.根據權利要求5所述方法，其特徵在於至少使用下列一種寡聚核苷酸作為引物。5′TTCCCTCTTCCACTCGGAGT3′(SEQ ID NO1)，5′GATATCTGGCAGGGAGTTCA3′(SEQ ID NO2)，或5′CTCTGGTCTTTCACCTCCTC3′(SEQ ID NO3)
7.根據權利要求1～6任一項所述方法，其特徵在於所說癌症，癌變前狀態，或其它形式疾病是造血系統疾病。
8.根據權利要求7所述方法，其特徵在於所述造血系統疾病是脊髓發育不良或白血病。
9.根據權利要求7或8所述方法，其特徵在於所述樣品取自於外周血單核細胞(PBM)或骨髓細胞。
10.至少一種IRF-1特異性寡核苷酸在診斷癌症，癌變前狀態，或對其它形式的疾病的易感性的方法中的使用，其中在取自於血液或其它活檢材料的樣品中分析所說的IRF-1特異性RNA。
11.根據權利要求10所述的使用方法，其特徵在於所述分析方法是通過逆轉錄/聚合酶鏈反應並且隨後分析經擴增的cDNA來實現的。
12根據權利要求10或11所述的使用方法，其特徵在於所述寡核苷酸具有下列序列5′TTCCCTCTTCCACTCGGAGT3′(SEQ ID NO1)，5′GATATCTGGCAGGGAGTTCA3′(SEQ ID NO2)，或5′CTCTGGTCTTTCACCTCCTC3′(SEQ ID NO3)
13.具有下列序列的寡核苷酸5′TTCCCTCTTCCACTCGGAGT3′(SEQ ID NO1)，5′GATATCTGGCAGGGAGTTCA3′(SEQ ID NO2)，或5′CTCTGGTCTTTCACCTCCTC3′(SEQ ID NO3)
14.診斷癌症，癌變前狀態或對其它形式疾病的易感性的方法，其特徵在於在取自於血液或其它活檢材料的樣品中測定生物活性IRF-1多肽的含量。
全文摘要
本發明涉及通過使用分子標記，幹擾素調節因子-1(IRF-1)診斷癌症，癌變前狀態，以及對其它形式的疾病的易感性的方法。該方法特徵在於優選地採用逆轉錄/聚合酶鏈反應方法分析取自於血液或其它活檢材料的樣品中的IRF-1特異性RNA。
文檔編號C12Q1/68GK1124779SQ9510229
公開日1996年6月19日 申請日期1995年2月23日 優先權日1994年2月24日
發明者谷口維紹 申請人:貝林格爾·英格海姆國際有限公司