製造具有生物受體協同劑、拮抗劑與/或反向協同劑的人類抗體方法
2023-04-23 03:11:26 1
專利名稱：製造具有生物受體協同劑、拮抗劑與/或反向協同劑的人類抗體方法
技術領域：
本發明是關於一種製造完全人類抗體的方法，其抗體具有該受體的協同劑、拮抗劑與/或反向協同劑等性質。
背景技術：
一般而言，藥物必須到達體內細胞表面受體位置，才可與藥物分子作用。藥物與受體的交互作用或結合的結果可能會活化受體或阻斷受體，因此在藥物動力學中，一組藥物或配體具有相同或相似生理效用的稱為協同劑(agonist)。同理，當一藥物的功效相反於其它藥物或配體時，則被稱為拮抗劑(antagonist。而當一配體對於同一受體的作用相反於協同劑時，此配體被稱為反向協同劑(inverse agonist)。
人類抗體已經成功地作為各種疾病的治療藥物，特別是如呼吸融合病毒(respiratory syncytial virus，RSV)等的傳統感染性疾病。雖然臨床上尚未完全使用，但近來仍有些報告揭示了少數具有藥物動力學活性的抗體。如WO00/32231、美國專利第5,811,097號、美國專利第5,855,887號與美國專利第6,051,227號揭示了抗小鼠CD152(殺手T淋巴細胞抗原-4，CTLA-4)的鼠源單株抗體，是將小鼠CD152與人類IgG1的融合蛋白免疫倉鼠。由於CD152隸屬於稱為CD28共激(costimulation)受體超家族的免疫調控受體，具有負向調節抗體及細胞免疫反應的作用，故將對此受體專一的抗體注入帶有腫瘤的小鼠後，實驗鼠會產生抗腫瘤免疫反應，進而抑制腫瘤生長(Leach等人，Science 2711734，1996)。此種「CTLA-4(抗體)阻斷」的概念來自於CD152的負向功能可被抗體阻斷，因此抗體可作為拮抗劑，活化了既有但微弱的抗腫瘤免疫反應。
現今已有的抗人類CD152人類單株抗體僅可作為拮抗阻斷劑，於臨床應用上有其限制。本發明公開對CD152受體具有不同結合及訊息傳遞能力的人類抗體分子合成方法，同時揭示以體外試驗方式針對T細胞反應來篩選此類分子的方法，以利於治療、預防及疫苗接種等各種應用。
發明內容
本發明可針對特定受體或受體的特定部位製造人類抗體，且於日後使用於人類不會產生如人抗小鼠過敏反應等副作用；本發明同時提供一種簡易、有效的方法，可針對特定人類CD152受體製造協同劑、拮抗劑及反向協同劑，且過敏反應較其它方式所產生的抗體為少，並可辨識人類CD152的至少三種不同抗原區；此外，本發明亦提供一種方法，以確認可作為受體的體外協同劑、拮抗劑與/或反向協同劑的抗體的藥理學功效；本發明還提供一種以電腦資訊建構及預測抗原決定部位胺基酸序列的方法，以誘導抗體反應。
本發明包括一種鑑別作為受體的體外協同劑、拮抗劑與/或反向協同劑抗體藥理功效的方法，包含有下列步驟(a)提供人類淋巴細胞、分裂促進劑、配體或多株活化劑；(b)將分裂促進劑或多株活化劑加入個別容器並增加配體濃度，形成一混合物；(c)提供一含分裂促進劑的第一控制組培養基，與含一受體天然協同劑的第二控制組培養基；(d)將人類淋巴細胞培養於該第一控制組培養基、該第二控制組培養基及該數個配體與分裂促進劑混合物中；(e)決定各培養基及各混合物中人類淋巴細胞凋亡與/或分化的程度以及(f)利用該混合物配體濃度增加的程序性細胞死亡(凋亡)與/或分化程度決定配體對受體的效用。
此外，本發明進一步提供一種產生人類抗體的方法，此抗體可辨識至少三種不同的人類CD152抗原位置。因此，以一抗原免疫淋巴細胞並以重組的CD152抗原來篩選受免疫的淋巴細胞，即可獲得辨識生理上完整受體的完全人類抗體。任何人可利用常見的延長抗體生產能力的公知技術，如經由EB病毒的轉形或與異骨髓瘤細胞融合以形成三元融合瘤(trioma)細胞，使其可長久存活並穩定地產生抗體。或者可應用各種基因重組方法，使此類抗體於細菌、酵母菌或哺乳類細胞中生產。
因此，本發明的又提供了一種製備可辨識生理受體的完全人類抗體的方法，其步驟包含有(a)使用一源自靜息(未受抗原刺激)人類捐贈者的淋巴細胞；(b)以電腦輔助的生物資訊設計出抗原進行體外免疫該淋巴細胞；(c)加入EB病毒於該免疫淋巴細胞；(d)確認EB病毒感染的細胞所產生可辨識該受體的抗體；以及(f)篩選步驟(d)所產生抗體的藥理學功能。
本方法還可於步驟(b)之前加入一步驟(a1)，由淋巴細胞中移除CD8+及CD56+細胞。CD8+及CD56+細胞的移除可依據任何已建立的公知技術，如可利用特定的CD8及CD56抗體來移除這類細胞。在一實施例中，這些抗體可連接於磁珠。另外，本方法可於步驟(d)後另外包含一步驟(e)，形成一三元融合瘤細胞或基因重組免疫球蛋白以獲得完全的人類單株抗體。其中多株抗體可利用本發明方法進行製備。
本發明中，抗體辨識抗原較佳為具有Kd值約100nM或更小、約30nM或更小、約10nM或更小、約3nM或更小，或約1nM或更小的抗原；抗體為IgG抗體，較佳為IgG1及IgG4。
確認或篩選方法亦可使用其它分裂促進劑或多株活化劑，例如洋刀豆血球凝集素A(concanvalin A，ConA)、美洲商陸分裂促進劑(Pokeweedmitogen，PWM)、12-十四酸佛波脂-13-乙酸鹽(phorbol 12-myriState 13-acetate，PMA)及超抗原如葡萄球菌腸毒素A(SEA)，以取代或用於與其中的植物血凝素(phycohemagglutinin，PHA)接合。本發明同時提供一包含抗體的藥物組成物，其可包含藥學上可接受載體或佐劑。
圖1A表示T細胞表面上CD152受體的同源二聚體蛋白質結構與三個類似免疫球蛋白CDR區的相對位置。
圖1B是轉譯於cDNA(基因庫編號L15006，NCBI蛋白質編號P16410)的人類CD152胺基酸序列。星號顯示成熟胜肽、膜間區及胞內區的起點。CDR1、CDR2與CDR3類似區以方框表示。
圖2A、2B與2C分別描述人類CD152的CDR1與相連區的疏水性、鏈變動性與表面可能性。圖2D、2E與2F分別描述CDR2與相連區的疏水性、鏈變動性與表面可能性。
圖2G、2H與21分別描述CDR3與相連區的疏水性、鏈變動性與表面可能性。箱型區指CDR類似區，其胺基酸序列顯示於下方。箭頭標示出所預測胺基酸組成的鏈結構。
圖3顯示PHA刺激的人類PBMC細胞分化(□)與凋亡(■)的反應情形。圖3A、3B、3C、3D與3E分別為PHA單獨刺激(12.5、5及20μ/ml)、1.25μg/ml PHA伴隨交聯性CD80(0.2、1及5μg/ml)、抗-CDR1、抗-CDR2及抗-CDR3抗體(0.1、1及10μg/ml)所得的結果。
具體實施例方式
除非另有指明，本發明所使用的名詞定義如下配體是指結合至另一分子的化合物，例如受體蛋白；受體是指與細胞外生理訊號作用並轉換為細胞內部效應的蛋白；完全人類抗體是指一抗體僅含有人類序列；靜息( )人類捐贈者是指未暴露於所欲抗原的人，其血液可作為免疫細胞或因子的來源，靜息捐贈者血液測不到抗原的循環抗體，典型的靜息人類捐贈者為健康正常的捐血人，其HIY抗體偵測為持續陰性；以抗原免疫細胞或動物是指將細胞或動物暴露於抗原的動作，細胞或動物可以任何方式進行免疫，只要細胞或動物接觸到抗原即可。
體外定位免疫是指體外淋巴細胞刺激過程，以達到對所欲蛋白片段的抗體反應，依據合成的異質偶合決定部位免疫原，其含有T細胞與B細胞抗原決定部位的胜肽，可引發體液免疫反應以對抗整個蛋白；治療或改善疾病或醫療狀況是指減少或消除疾病或醫學上的症狀，或緩和疾病/醫療狀況的進程；預防疾病或醫學症狀是指檢測一不具疾病或醫學症狀的受測者，其中，最後受測者未發展成帶有該疾病/醫學狀況，或者疾病/醫療狀況僅些許發展。
有效量是指一藥劑的量足以達到所欲效用，以抗體的治療或改善一疾病而言，一有效量意謂足以降低或消除疾病症狀或緩和疾病進程的抗體量；協同劑是一配體具有與另一天然發生的內生性配體或配體族群相同或相似效用者的；拮抗劑是一配體或藥物的作用阻斷一協同劑者；反向協同劑是指一配體，其產生的效用相反於協同劑卻可佔用相同的受體；受體阻斷是指利用藥理拮抗劑結合至受體來阻斷天然內生性配體(如荷爾蒙或神經傳導因子)結合至受體後所發生的效用。
樣本是指分裝物或物質、材料或族群的代表部分，一樣本可為水、汙物、油、砂、血液、生物組織、尿液或糞便的樣本；生物樣本是指由生物性受測者如動物、植物或微生物所收集到的樣本。
本發明亦包括藥物組成物，包含可作為活性成份的一或多種抗體，並配合藥學上可接受載體或佐劑。在製備本發明組成物方面，活性成分/抗體通常與佐劑混合、以佐劑稀釋或以載體包封，其型式可製成膠囊、小袋、紙樣或其它容器。
當藥學上可接受的佐劑為一稀釋劑時，可為固體、半固體或液體材料，並作為活性成分的溶媒、載體或媒介。因此，本組成物可為溶液(尤指無菌的可注射溶液)、藥片、藥丸、粉末、錠劑、小袋、膠囊、酏劑、懸液、乳液、糖漿、氣霧劑(如固體或液體媒介)、含有如10％重量百分比抗體的藥膏、軟或硬凝膠膠囊、栓劑及無菌包裝粉末等形式。
適用佐劑的某些範例包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、澱粉、阿拉伯膠、磷酸鈣、藻多醣、黃著膠粉、凝膠、矽酸鈣、微晶纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、纖維素、無菌水、糖漿、甲基纖維素。本組成可還包括潤滑劑例如滑石粉、硬脂酸鎂及礦物油；保溼劑；乳化劑及懸浮劑；防腐劑如甲基-與丙基羥苯酸酯；甘味劑；以及調味劑。本發明組成物可配置為供應病患投藥後的快速、緩慢或延遲釋放其活性成分，其方式如公知技術中所示。
本發明新組成物的液體形式可配置成口服或注射給藥，包括水溶液(例如PBS)、適當調味糖漿、水性或油性懸液，及經調味的乳液，其含有可食用油如玉米油、棉籽油、芝麻油、椰子油、或花生油，以及酏劑與類似的藥學上溶媒。本發明的其它適用配，方可見於雷氏藥學大全(Remington’s Pharmaceutical Science)。
下列範例只是用來對本發明作說明，非做為局限本發明範疇。例如，類似的研究亦針對其它CD28受體超家族成員及其如CD28異型(CD28i)、可誘發的共激蛋白(ICOS)、B與T淋巴細胞衰減蛋白(BTLA)及程序細胞死亡蛋白-1(PD-1)。同樣地，亦可應用於其它受體家族，包括離子通道、G-蛋白偶合受體、酪氨酸激酶連接受體及轉錄因子等。
表一
實施例一、胜肽抗原的製備人類CD152受體的整體結構繪於圖1A。符合於人類CD152的胺基酸序列則列於圖1B。由整合科學文獻所得的資訊，CDR3區與天然CD80及CD86配體之間的重要關聯性因而建立。另外的證據顯示，位於CDR1區的胺基酸扮演某種與CD80/CD86作用的角色。然而，CDR2的協同劑結合機制至今卻尚未被完整探討。
想要引發可結合至本體蛋白的抗體，所使用蛋白的胜肽必須具有類似其構造的特性。因此，CDR1、CDR2與CDR3區的完整序列被保留下來以設計合成的免疫原。此外，延長每個CDR胜肽部分以符合前述抗原決定部位模式。作為一有效免疫原，若欲實際使用所產生的抗體，則此胜肽必須選自蛋白的易構區(accessible region)。蛋白的易構區為暴露於結構外側的部位。由於這些區域與水溶液環境接觸，故經常為親水性。而後人們使用GeneWork軟體(IntelliGenetics)建立疏水性繪圖以決定延長方向。鏈變動性或表面可能性亦以GeneWork計算，而CDR附近區域亦視為胜肽設計的二級參數(圖2)。
經運算後所得的高分CDR胜肽用於連接破傷風毒素「輔助」序列，其胺基酸位置為830-844(SEQ ID NO1)。
實施例二、抗CD152人類抗體的產生健康血液捐贈者經HIV-1/2、HTLV-I/II、HCV、HbsAg篩選為陰性，並含有正常量的丙胺酸轉移酶(ALT)的血液，來自中華血液基金會臺南捐血中心(臺南，臺灣)。周邊血單核細胞(PBMC)以密度離心(400xg)方式分離於Ficoll-Paque(Amersham Biosiences)；細胞隨後以PBS洗滌兩次並以100xg離心收集。
所得PBMC首先以CD45RO MACS微珠(Miltenyi Biotec)進行磁標定，再以VarioMACS(Miltenyi Biotec)進行分離。在磁標定後，將細胞通過分離管柱，其置於強力永久磁鐵上。通磁管柱的基質可產生高階磁場。磁標定細胞會停留於管柱內並濾出未標定細胞。在管柱磁場解除後，衝提出細胞。衝提出的CD45RO+細胞以100xg離心取得並立即使用。將CD45RO+T-細胞培養於組織培養瓶中，其密度為2×106細胞/mL RPMI-1640(HyQTM，HyClone)，並補充1x非必需胺基酸(Life Technologies)、10％人類血清、50μm/ml慶大黴素/卡那黴素(China Chemical Pharmaceutical)、50μM 2-乙基硫醇及10μg/ml美洲商陸分裂促進劑(PWM，Sigma)。培養24小時後，細胞以400xg離心並移出。最後，收集上清液以製備CD45RO+T-細胞替代因子，以0.45mm濾膜過濾並於-20℃冷凍儲存。
將PBMC以磁性細胞去除法去除細胞毒性族群，以體外抑制免疫反應。膠體超磁性微珠結合至單株抗小鼠CD8與抗CD56抗體(MiltenyiBiotech)的用法如前述。細胞毒性細胞去除的PBMC於體外以二步驟免疫法進行免疫作用初級免疫作用，是將細胞培養於含10nM胜肽抗原的培養基6天，亦即TT-CDR1(ext)、TT-CDR2(extC)與TT-CDR3(ext)於含50μM2-乙基硫醇、10％熱去活化人類血清、0.05ng/mlrIL2(Calbiochem)及25％(v/v)CD45RO+T細胞替代因子，在第7天收取初級免疫細胞並以40％Ficoll-Paque離心；針對次級免疫反應，將3×107個細胞與胜肽抗原混合於事先以5μg/ml的CD40L(CD154，Vinci-Biochem)固定隔夜的培養瓶；再以含有5％人類血清、50μM 2-乙基硫醇及10nM胜肽抗原的培養基培養細胞3-5天。
體外免疫的細胞隨後以EB病毒感染將107個淋巴細胞於37℃下培養2小時，以1ml含EB病毒的上清液進行再懸浮，此上清液源自產生EB病毒的狨猴細胞株B95-8(ATCC CRL 1612)。將感染的細胞以105/孔的數量種於96孔盤並加入絲裂黴素(Kyowa Hakko Kogyo)處理的PBMC以作為餵養細胞(104/孔)。
抗體專一性ELISA的進行，首先於室溫下以1μg/ml BHK細胞表現的重組人類CD152(CTLA-4)-muIg融合蛋白(Ancell Corporation)、1μg/ml單株鼠類IgG2a(Ancell)、10μg/孔的牛血清白蛋白(BSA，Sigma)或破傷風類毒素(ADImmune Corporation)隔夜塗覆於微量滴定盤。將培養的上清液以含0.5M氣化鈉及0.1％Tween-20的10mM磷酸鈉緩衝液，pH8.0稀釋至所欲濃度。塗覆的滴定盤以稀釋的培養基上清液進行培養，洗滌後以過氧化酶標定的山羊抗體辨識人類IgG(Zymed Laboratories)，並加入100μl色原基質鄰-苯二胺(OPD，Sigma)顯影15min；30in後加入1M硫酸停止反應，於490nm吸光值下判讀結果。
以上述固態ELISA確認EB病毒感染的淋巴細胞所釋出可能的抗-CD152抗體。每孔所含淋巴細胞的專一性抗體生成量的積分，是以下列標準進行(a)重組人類CD152-muIg融合蛋白的OD值至少為陰性對照組OD值的五倍；以及(b)反應性指數(R1)＞2，其中RI＝[ODCD152-muIg-OD培養基控制組對CD152-muIg]/[OD鼠類IgG2a-OD培養基控制組對鼠類IgG2a]。
含淋巴細胞的孔若於上述分析中呈陽性，則收集其上清液，並以ELISA定量及標準化以進一步研究。CDR區反應性的確認是利用個別胜肽進行ELISA競爭反應。這些培養孔以限數稀釋法轉殖並冷凍保存。
實施例三、改變抗CD152抗體的能力以誘發細胞凋亡及細胞分化並與天然協同劑相比較不同抗-CD152人類抗體結合位置的確認是將合成的胜肽相應於一級烷基胺衍生的纖維素膜(Rapp Polymere GmbH)。為進一步評估不同抗-CD152抗體與較佳的天然協同劑CD80的藥理學效用，進行人類周邊淋巴細胞體外植物血凝素刺激後的細胞生長及PBMC培養。簡單而言，準備平底的96孔微量滴定盤並加入50μl山細胞懸浮液(105個細胞)、60μl含PHA培養基(培養的最終濃度為1.25μg/ml，Amersham BiosciencesAB)、40μl自體血漿及50μl RPMI-1640培養基，其含抗-CD152抗體或單體的人類CD80-muIg融合蛋白(Ancell)濃度範圍由0.2至5μg/ml。在CD80刺激反應中，加入5μg/ml山羊抗小鼠IgG2a(SouthernBiotechnology Assocetes)以提供交聯形式的訊號。培養的總體積為200μl。培養於37℃的5％CO2潮溼環境中達96h。在收集前204小時，每孔加入50μl含0.5μCi的氚化胸腺嘧啶的培養基(TRA 306，Amersham，特定活性2Ci/mol)。以玻璃纖維濾膜配合半自動多重收集器(PHD，Cambridge Technology Inc.)收集培養基。細胞結合[3H]-胸腺嘧啶的決定是以LKB液體閃爍計數儀進行計數。在有些培養中，末期以錐蟲藍(Trypanblue)染劑進行細胞存活率的測量。進行相同的三重複培養，並以三者的中間值進行運算。
評估細胞調亡百分比，是將細胞以200xg離心，再懸浮於冰冷的80％酒精並且劇烈震蕩混合直到最終密度1×106/ml。將細胞培養於4℃至少30min。酒精固定的細胞隨後離心並於1ml碘化丙啶(PI，Sigma)染劑(PBS0.15M pH7.4、0.1％Triton X-100、0.1mM EDTA二鈉鹽、50μg/ml RNase A及50μg/ml PI)中進行再懸浮。樣本於室溫下黑暗保存直到分析，並於24小時內進行。細胞核內的DNA量以碘化丙啶染色及FACScan細胞儀配合Lysis H software(Becton Dicknson)決定。凋亡細胞的決定是利用流式細胞儀測量碘化丙啶染色後的次雙套DNA百分比。
提供一盤抗-CD152的人類抗體，以決定這些配體在PHA活化下對人類T細胞的功用，可產生中度細胞分化與細胞凋亡(圖3A)。交聯的CD80所誘發的細胞凋亡並未觀察到有明顯細胞分化(圖3B)。類似地，含CDR3的胜肽免疫原所誘發的抗體亦引發快速的細胞死亡而非分化，因而確認了協同劑活性(圖3E)。CDR1誘發的人類抗體的刺激作用明顯降低，但未完全去除PHA驅動的細胞死亡(圖3C)。當PHA活化的PBMC單獨與CDR2誘發人類抗體培養時，可觀察到高度且具再現性的細胞分化情形，且PHA造成的細胞死亡可完全去除(圖3D)。由抗-CDR2誘發的細胞分化所造成CD152的驅動情形類似於5ng/ml IL-2處理情形，並造成典型凋亡細胞型態變化現象的消失(如，細胞膜泡沫化與細胞不完整及核形成小泡)。
上述實施例僅是為了方便說明而舉例而已，本發明所主張的權利範圍自應以申請專利範圍所述為準，而非僅限於上述實施例。
序列表110Chin，Li-TeHsu，Shu-Ching120具有協同劑、拮抗劑或反向協同劑特性的人類抗體製造方法130P7226/06001608170PatentIn version 3.3210121115212PRT213破傷風毒素220
221胜肽222(1)..(15)300
301Stephane Demotz，Antonio Lanzavecchia，Ulrich Eisel，HeinerNiemann，Christian Widmann，and Giampietro Corradin302描述多種DR-限制的T細胞抗原決定部位306394-4023071989-01-15313(1)..(15)4001Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu1 5 10 15210221115212PRT213現代人220
221胜肽222(1)..(15)4002Glu Tyr Ala Ser Pro Gly Lys Ala Thr Glu Val Arg Val Thr Val1 5 10 15210321115212PRT213現代人220
221胜肽222(1)..(15)4003Ala Ala Thr Tyr Met Met Gly Asn Glu Leu Thr Phe Leu Asp Asp1 5 10 15210421115212PRT213現代人220
221胜肽222(1)..(15)4004Lys Val Glu Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Tyr Leu Gly Ile Gly1 5 10 15210521130212PRT
213人工合成220
223合成CDR胜肽並用於製備相合的抗原決定部位以連接源自破傷風病毒「TT」序列。
220
221胜肽222(1)..(30)4005Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu Glu1 5 10 15Tyr Ala Ser Pro Gly Lys Ala Thr Glu Val Arg Val Thr Val20 25 30210621130212PRT213人工合成220
223合成CDR胜肽並用於製備相合的抗原決定部位以連接源自破傷風病毒「TT」序列。
220
221胜肽222(1)..(30)4006Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu Ala1 5 10 15Ala Thr Tyr Met Met Gly Asn Glu Leu Thr Phe Leu Asp Asp20 25 30210721130
212PRT213人工合成220
223合成CDR胜肽並用於製備相合的抗原決定部位以連接源自破傷風病毒「TT」序列。
220
221胜肽222(1)..(30)4007Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu Lys1 5 10 15Val Glu Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Tyr Leu Gly Ile Gly20 25 302108211223212PRT213現代人220
221胜肽222(1)..(223)300
308P164103092004-03-15313(1)..(223)4008Met Ala Cys Leu Gly Phe Gln Arg His Lys Ala Gln Leu Asn Leu Ala1 5 10 15Thr Arg Thr Trp Pro Cys Thr Leu Leu Phe Phe Leu Leu Phe Ile Pro20 25 30
Val Phe Cys Lys Ala Met His Val Ala Gln Pro Ala Val Val Leu Ala35 40 45Ser Ser Arg Gly Ile Ala Ser Phe Val Cys Glu Tyr Ala Ser Pro Gly50 55 60Lys Ala Thr Glu Val Arg Val Thr Val Leu Arg Gln Ala Asp Ser Gln65 70 75 80Val Thr Glu Val Cys Ala Ala Thr Tyr Met Met Gly Asn Glu Leu Thr85 90 95Phe Leu Asp Asp Ser Ile Cys Thr Gly Thr Ser Ser Gly Asn Gln Val100 105 110Asn Leu Thr Ile Gln Gly Leu Arg Ala Met Asp Thr Gly Leu Tyr Ile115 120 125Cys Lys Val Glu Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Tyr Leu Gly Ile Gly130 135 140Asn Gly Thr Gln Ile Tyr Val Ile Asp Pro Glu Pro Cys Pro Asp Ser145 150 155 160Asp Phe Leu Leu Trp Ile Leu Ala Ala Val Ser Ser Gly Leu Phe Phe165 170 175Tyr Ser Phe Leu Leu Thr Ala Val Ser Leu Ser Lys Met Leu Lys Lys180 185 190Arg Ser Pro Leu Thr Thr Gly Val Tyr Val Lys Met Pro Pro Thr Glu195 200 205
Pro Glu Cys Glu Lys Gln Phe Gln Pro Tyr Phe Ile Pro Ile Asn210 215 220
權利要求
1.一種製造人類抗體的方法，其中該抗體對受體具有協同劑、拮抗劑與/或反向協同劑的特性，包含有下列步驟(a)利用該受體的各細胞外部位的生物資訊學特徵定義出該受體各別細胞外部位的胜肽片段；(b)將該胜肽片段與一T輔助細胞抗原決定位偶合，所產生的複合胜肽至少含有一T輔助細胞抗原決定位；(c)製備一具有該偶合片段胺基酸序列的免疫原；(d)以該免疫原進行體外刺激人類淋巴細胞；(e)鑑別並篩選產生可辨識該受體的抗體的人類淋巴細胞；以及(f)收集該抗體。
2.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，其中與該細胞外部位相符合的該胜肽片段胺基酸序列具有與SEQ ID Nos2至7至少75％的胺基酸序列一致性。
3.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，其中該受體為人類CD152。
4.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，其中該T輔助細胞抗原決定位包含有一示於SEQ ID NO1胺基酸序列。
5.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，其中該受體各細胞外部位的生物資訊學特徵為疏水性、變動性或表面可能性。
6.一種結合於偶合片段的抗體，其中該偶合片段具有一T輔助細胞抗原決定部位及相符於受體各細胞外部位的胜肽片段。
7.一種鑑別作為受體的體外協同劑、拮抗劑與/或反向協同劑抗體藥理功效的方法，包含有下列步驟(a)提供一人類淋巴細胞、一分裂促進劑、一配體及選擇性地多株活化劑；(b)將該分裂促進劑或多株活化劑加入個別容器並增加配體濃度，形成一混合物；(c)提供含一分裂促進劑的第一控制組培養基，與含一受體天然協同劑的第二控制組培養基；(d)將人類淋巴細胞培養於該第一控制組培養基、該第二控制組培養基及該複數個配體與分裂促進劑混合物中；(e)決定各培養基及各混合物中人類淋巴細胞程序性凋亡與/或複製活化的程度；以及(f)利用該混合物配體濃度增加的程序性凋亡與/或複製活化程度決定配體對受體的效用。
8.如權利要求7所述的方法，其特徵在於，其中該人類淋巴細胞為周邊血液單核細胞。
9.如權利要求7所述的方法，其特徵在於，其中該分裂促進劑或多株活化劑為植物血凝素、洋刀豆血球凝集素A、美洲商陸分裂促進劑、12-十四酸佛波脂-13-乙酸鹽及超抗原，以單獨或混合方式使用。
10.一種製備人類抗體的方法，該抗體可辨識生理上的受體，包含有下列步驟(a)提供一源自於靜息人類捐贈者的淋巴細胞；(b)取依生物資訊學特徵設計的合成抗原，在體外對該淋巴細胞進行免疫反應；(c)加入Epstein-Barr病毒於該免疫淋巴細胞；(d)鑑別EB病毒感染乏細胞所產生可辨識該受體的抗體；以及(e)篩選步驟(d)所產生抗體的藥理學功能。
全文摘要
本發明是關於一種針對特定的生物生理受體來發展並取得該生物受體的協同劑、拮抗劑與反向協同劑的方法；以電腦資訊設計合成免疫原，於體外作用於人類淋巴細胞族群；本發明適用的受體為人類CD152，特別是可分別引發抗體以作為拮抗劑、反向協同劑與協同劑的CDR1、CDR2與CDR3區域；本發明亦包括一種確認可作為受體的體外協同劑、拮抗劑與/或反向協同劑的抗體藥理學功效的方法。
文檔編號A61P31/00GK1752106SQ200410079889
公開日2006年3月29日 申請日期2004年9月24日 優先權日2004年9月24日
發明者金立德, 許淑菁 申請人:金立德, 許淑菁