製備與人a-心房肽有關多肽的方法

2023-04-22 20:53:41 2

專利名稱:製備與人a-心房肽有關多肽的方法
本發明涉及一類多肽，它們對於臨床診斷試劑的發展和病理生理學的研究都是有用的。特別是這些多肽可用於病因診斷或用於原發性高血壓這類心血管失調的病理生理學研究。
最近，Kangawa，Matsuo，等人分離出了一種多肽人α-心房肽(α-human Atrial Natriuretic Polypeptide＝α-h ANP]，它對人的心房有很強的鈉尿效應，並確定了其結構由二十八個胺基酸組成，結構如下，[參考文獻Biochem.Biophs.Res.Comm.118 131(1984)]
據報導，用大鼠做生物測定α-h ANP的利尿效應相當於曾經被作為抗高血壓的利尿劑廣泛使用的furosemide的一千五百倍。雖然α-hANP[下文有時用α-hANP-(1-28)表示]的一些小片段，例如，α-hANP-(7-28)[由N-末段的第七個到第二十八個胺基酸的多肽片段]，α-hANP-(13-28)，α-hANP-(18-28)已經商品化了，但它們的生理學效應和作為抗原的功能還沒有報導。這些多肽其中α-h ANP-(18-28)是N-末端穀氨醯胺環化的多肽，而且α-hANP-(18-28)N-末端穀氨醯胺末環化的還沒有發現。
α-hANP被認為是引起心血管疾病和原發性高血壓的物質之一。本發明的目的是提供下列結構式所示的一些多肽R-門冬醯胺-絲-苯丙-精-酪-OH，其中R是H，半胱，甘-半胱，亮-甘-半胱，甘-亮-甘-半胱，絲-甘-亮-甘-半胱，穀氨醯胺-絲-甘-亮-甘-半胱，丙-穀氨醯胺-絲-甘-亮-甘-半胱，甘-丙-穀氨醯胺-絲-甘-亮-甘-半胱，或者，異亮-甘-丙-穀氨醯胺-絲-甘-亮-甘-半胱，以及它們相應的鹽，可用於製備α-hANP的抗血清，這些試劑可用於臨床診斷心血管失調，或用於病理生理學的研究。
圖1所示α-hANP(1-28)的標準曲線(用●-●表示)，α-rANP-(1-28)的交叉曲線(用△-△表示)，α-hANP-(24-28)的交叉曲線(用○-○表示)，縱軸表示抗原的結合百分比(125碘標記α-hANP)(B)游離的抗原(F)而橫軸表示α-ANP的濃度(微微克/管)。
直到現在，高血壓症被分成兩大類，第一類與第二類高血壓症。第二類高血壓症主要伴隨著腎臟病，內分泌疾病，懷孕，主動脈狹窄，中樞神經失調等等。另外，前者其中病因不明的作為原發性高血壓症，並且80～90%的高血壓症都被劃分到這一類。
就第二類高血壓症來說，藉助於治療有原因的病症改善高血壓症的狀況是可能的，然而原發性高血壓症的患者已經可以得到治療，例如用抗高血壓藥物，即利尿劑、血管舒張劑，腎上腺能抑制因子。不過，上文提到的α-hANP最近認為是與心血管疾病和原發性高血壓症有關的製劑之一，並且廣泛開展了α-hANP對高血壓症意義的研究。
本發明從兩個方面繼續發明家們的研究，闡明α-hANP在控制水和電解質平衡中的病理生理學意義和建立一個特別的測量α-hANP的方法用於診斷和估計包括原發性高血壓症在內的心血管失調。
上文後提到的測定α-hANP其測定方法的建立所必須使用的抗血清就是由本發明提供的一系列多肽來製備的。更特別地，本發明涉及的多肽可用以下通式表示
式中R表示以下結構H，Cys，Gly-Cys，Leu-Gly-Cys，Gly-Leu-Gly-CysSer-Gly-Leu-Gly-Cys，Gln-Ser-Gly-Leu-Gly-CysAla-Gln-Ser-Gly-Leu-Gly-Cys，Gly-Ala-Gln-Ser-Gly-Leu-Gly-Cys，或Ile-Gly-Ala-Gln-Ser-Gly-Leu-Gly-Cys和它們相應的鹽。
所有組成結構式(Ⅰ)的胺基酸都是L-構型。以下的縮寫都是根據理論與應用化學國際聯合會和國際生化聯合會(IUPAC-IUB)的命名法而制定的。
Ala丙氨酸Arg精氨酸Asn天門冬醯氨Cys半胱氨酸Gln穀氨醯胺Gly甘氨酸Ile異亮氨酸
Leu亮氨酸Phe苯丙氨酸Ser絲氨酸Tyr酪氨酸通式所表示本發明的多肽和它們相應的鹽可根據通常的合成方法來延長多肽鏈。即逐步地縮合氨基或將具有兩個或幾個胺基酸的片段縮合在一起，這兩種步驟也可以混合使用。
兩個胺基酸之間，胺基酸和多肽之間，多肽和多肽之間的縮合可根據普通的縮合方法進行，例如，疊氮化物法、混合酸酐法、二環己基碳化二亞胺(DCC)法、活化脂法(其中包括對硝基苯脂法、N-羥基丁二醯亞胺脂法、氰基甲基脂法等)、Woodward試劑K方法、羰基二咪唑方法、氧化還原法。這些縮合反應可在液相或固相進行。就固相延長肽鏈方法而言，多肽的C-末端的胺基酸固定在不溶性的載體上。固相載體與胺基酸C-末端羧基形成的鏈當反應完成以後又很容易解離。例如可以使用囟甲基樹脂、氯甲基樹脂、溴甲基樹脂，羥基甲基樹脂，氨基甲基樹脂，二苯甲基樹脂和叔烷基氧羰基醯肼樹脂。
作為合成多肽的常規方法，要對胺基酸的α-氨基，w-氨基和羧基根據情況需要進行保護和去保護。可用於保護氨基的基團舉例如下苄氧羰醯基(以下縮寫為Z)、間氯苄氧羰醯基(Z(2-Cl)、對硝基苄氧羰醯基(Z(NO2)、對甲氧基苄氧羰醯基(Z(OMe)、叔丁氧羰醯基(BOC)、叔戊氧羰醯基(Aoc)、異莰氧基羰醯基、金剛氧基羰醯基、(2-4-聯苯)-2-丙氧基羰醯基(Bpoc)、9-芴氧基羰醯基(Fmoc)、甲基磺醯乙氧基羰醯基(Msc)、三氟乙醯、苯二甲醯、甲醯基、2-硝基苯基亞磺醯基(NPS)、二苯磷亞硫醯(Ppt)、二甲基磷基亞硫醯(Mpt)還包括以上基團的類似物。
用於保護羧基的基團舉例如下，苄基脂(OBzl)、4-硝基苄基脂(OBzl(NO2))、叔丁基脂(OBut)、4-吡啶基甲基脂(OPic)、和這些基團的類似物。必要時特殊胺基酸如精氨酸、半胱氨酸、絲氨酸，除氨基和羧基需保護外，其功能性基團也要用適當的保護基團保護。例如，精氨酸的胍基可用以下基團保護，如硝基、對甲苯磺醯基、苄氧羰醯基、金剛氧羰醯基、對甲氧基苯磺醯基、4-甲氧基-2，6-二甲基苯磺醯基(Mds)、1，3，5-三甲基苯磺醯基(Mts)和上述基團的類似物。半胱氨酸的巰基可用以下基團保護苄基、對甲基氧苄基、三苯甲基、乙基甲胺、氨基甲酸乙酯、4-甲基苄基、2，4，6-三甲基苄基(Tmb)等。絲氨酸的羥基可用苄基，叔丁基、乙醯基、四氫吡喃基等保護。
下文將以本發明含有12個胺基酸的多肽α-hANP-(17-28)為例詳細地敘述其製備過程。反應的程序表示如下。
反應程序
式中X1表示N-末端胺基酸的氨基保護基團X2表示巰基保護基團X3表示胍基保護基團，AE表示活化脂殘基，Y表示C-末端胺基酸的羧基保護基團。
上述反應中，適合於氨基保護基團X的有Z-、Z(Cl)、Z(OMe)、Boc和它們的類似物，適合於羧基保護的基團Y有-OBzl、OBzl(NO)和其類似物。Tmb可作為巰基的保護基X，Mts作為胍基的保護基X。
上述反應過程中，反應物(1)和反應物(2)的縮合反應，反應物(11)的引入是利用混合酸酐法進行的。本發明中常規的混合酸酐法合成肽可用以下例子表示氨基和胍基都被保護的精氨酸(2)可用氯甲酸乙酯或氯甲酸異丁脂進行酐化反應。成酐反應通常在低溫最好在-15℃到-5℃進行約10分鐘。反應物(1)的酐化反應通常在肽合成溶劑中進行，例如二甲基甲醯胺(DMF)、二甲基亞碸(DMSO)、六甲基磷二醯胺(HMPA)、氯仿、二氯乙烷、四氫呋喃、二氧雜環己烷、乙酸乙酯和其它類似的溶劑。反應在低溫進行需1-24小時(如冰浴)。從反應物(11)縮合到反應物(12)的縮合反應也是用同樣的方法進行，此外，用反應物(12)的脂通過與肼的水合反應很容易得到肼化的反應物(12)。這種肼的形成反應還用於製備反應物(3)、(6)和(9)。
縮合反應按活性脂方法進行，例如(1)、(2)、(3)、(4)的縮合就是利用活化脂完成的，對硝基苯脂、2，4-二硝基苯脂、2，3，4，5，6-五氯苯脂、2，4，5-三氯苯脂、2，3，4，5，6-五氟苯脂、N-羥基丁二脂亞胺脂、或其同系物。
縮合反應在上文所提到的肽合成溶劑中並在低溫或加熱進行，最適反應溫度為-20℃到-40℃。儘管反應還取決於其它因素，但反應時間通常取1-24小時。反應物(5)和反應物(10)的縮合反應也使用這些反應條件。
反應物(3)、(6)、(12)的縮合反應使用疊氮法。疊氮基可利用各自的肼化物經庫爾修斯(Curtius)法(Organic Reaction，Vol.3p.337)即在酸性溶液中與硝酸鈉反應而製成，也可利用Rudinger方法(參見Collect.Czech.Chem.Commun.，26，233(1961))，即使用硝化烷基(如硝化異戊烷)在無水溶劑中反應來製備。所形成的疊氮與相應的多肽發生縮合的反應通常在低溫進行(從-10℃到+10℃)，反應體系中含有化學數量的鹼。最好使用有機鹼，如三乙基胺、三丁基胺、二異丙基乙基胺，二甲基苯胺、吡啶、皮考啉、N-甲基嗎啉和其類似物。上文所提到的肽合成溶劑可作為溶劑適當選擇使用。在進行上述各種反應之前必須除去氨基的保護基團X1。例如，苄氧羰醯基型的保護基團(Z.Z(2Cl)，Z(NO2)、Z(OMe)可用氟化氫、三氟乙酸等也可用鈀催化加氫將其除去。
其它功能基團的保護基直到最後步驟才經過一步或逐步反應被除去。例如，Z(OMe)保護的丙氨酸、Tmb保護的半胱氨酸、Mts保護的精氨酸和Bzl保護的酪氨酸都可在二甲基亞碸存在條件下，與氟化氫反應脫掉保護基團。以下舉例說明。
每一步反應的中間產物和終產物都可利用肽研究領域的常規方法分離純化，如抽取，重結晶，層析(凝膠過濾、離子交換，分配層析、吸附、或反相層析)，電泳，逆流分配。
上面通式(Ⅰ)所表示的肽類[但不是α-hANP-(17-28)]都可以根據上述方法合成。通式(Ⅰ)表示的肽類的鹽可以是具有有機酸或無機酸的鹽，舉例如下，鹽酸鹽，氫溴酸鹽，硝酸鹽，硫酸鹽，乙酸鹽，馬來酸鹽，甲酸鹽，乳酸鹽，酒石酸鹽，丁二酸鹽和檸檬酸鹽。金屬鹽可以是鈉鹽、鉀鹽、鈣鹽和銨鹽或胺鹽如三乙基胺鹽。
本發明目的化合物的製備程序舉例說明如下，本發明卻不僅局限於這些例子。
以下實施例中保護基團的縮寫表示如下Z(OMe)對甲氧基苄氧羰醯基ONp對硝基苯氧基Bzl苄基Z苄氧羰醯基Mts1，3，5-三甲基苯磺醯基(二甲叉磺醯基)Tmb2，4，6-三甲基苄基實施例1α-hANP-(17-28)的製備(1)Z(OMe)-Arg(Mts)-Tyr-OBzl在20ml含有Z(OMe)-Arg(Mts)-OH(由10.0g(16.1mmol)環己胺鹽製取)和異丁基氯甲醯鹽的二甲基甲醯胺(以下縮寫DMF)的混合酸酐反應溶液，加入冰冷的50ml含有H-Tyr-OBzl(由8.25g(19.3mmol)相應的甲苯磺酸鹽製取的DMF溶液，然後在冰浴上攪拌三小時。減壓蒸發除去溶劑得到油狀殘留物，將其溶解於乙酸乙酯，用0.5N鹽酸和氯化鈉的水溶液洗，然後蒸發乾燥殘留物破碎成粉末，樣品經過4.5×25釐米的矽膠柱層析用氯仿∶甲醇(10∶0.5)的溶劑系統洗脫，洗脫物經乙酸乙酯/醚重結晶得到11.5克目的化合物，產率92%，熔點98-102℃。[α]D-3.2°(C＝0.9，DMF，20℃)，薄層層析(TLC)(Kieselge160F245，Merck，下文使用同樣的吸附劑)Rf2＝0.73(溶劑系統氯仿/甲醇/乙酸(9∶1∶0.5)，以下Rf2這術語表示同樣的意義]Rf3＝0.28[溶劑系統∶氯仿/甲醇(10∶0.5)以下Rf3表示同樣的意義。]C40H47N5O9S1的分析理論值(%)C62.08，H6.12，N9.05，
實驗值(%)C62.19，H6.16，N8.66，三氟乙酸(以下縮寫為TFA)/苯甲醚(10ml/2.8ml)加到5.0克(6.46mmole)的Z(OMe)-Arg(Mts)-Tyr-OBzl中，混合物冰浴60分鐘，然後減壓蒸發除去三氟乙酸，殘留物用正己烷洗，減壓條件下用氫氧化鉀(以下簡寫KOH)顆粒乾燥3小時，溶於含有0.9毫升(6.46mmol)三乙基胺的DMF中。將一種由3.34克(7.75mm)Z(OMe)-Ser-Phe-NHNH2的DMF溶液[該溶液用2.59毫升(18.6mm)三乙基胺中和]所製備的疊氮化合物溶液在冰冷條件下加到上述溶液中，混合物在5℃攪拌14小時後濃縮。剩餘物與用上述同樣的抽提方法純化，再經過一個矽膠柱(3.5×20cm)層析，並用氯仿/甲醇(20∶0.5)溶劑系統洗脫。洗脫物經乙酸乙酯/醚重結晶即得到4.85克(76%的產率)本項化合物(2)，熔點98-100℃，[α]D-5.1°(C＝0.6，DMF，20℃)TLCRf1＝0.67溶劑系統為氯仿/甲醇/水(8∶3∶1)，以後Rf1，即代表同樣的意義]C52H61N7O12S的分析理論值(%)C61.95，H6.10，N9.37，實驗值(%)C62.03，H6.08，N9.67，(3)Z(OMe)-Asn-Ser-Phe-Ary-(Mts)-Tyr-OBzl通過上述步驟2所得到的被保護的四肽酯用按上述同樣方法用TFA/苯甲醚(10ml/2.4ml)處理，在減壓的條件下用KOH顆粒乾燥3小時，然後溶於20毫升DMF中，向該溶液中加入0.62毫升(4.46mmol)三乙胺，2.05克(4.91mmol)Z(OMe)-Asn-ONp及0.49毫升(4.46mmol)N-甲基嗎啉(以後簡寫為NMM)，然後將混合物攪拌14小時，用醋酸中和，蒸發。剩餘物在乙醚/水中搗碎並研成粉狀。加入乙醇將粉末從DMF中沉澱出來即得到3.95克(79%的產率)本項化合物(3)。
熔點171-173℃[α]D-15.0°(C＝0.6 DMF，20℃)，TLCRf1＝0.63C56H67N O9S14的分析理論值(%)C59.93，H6.02，N11.23實驗值(%)C59.79，H6.08，N11.14(4)Z(OMe)-Cys(Tmb)-OH在冰浴中將含有4.91克(23.7mmol)Z(OMe)-N3的25毫升四氫呋喃(以下簡稱THF)溶液加到含有5克(19.7mm)H-Cys(Tmb)-OH的25毫升水溶液中，該水溶液含有6毫升(43.3mmol)三乙基胺。反應混合物在5℃攪拌過夜後，用乙醚洗，水層用5%的檸檬酸中和，得到的沉澱抽乾成粉狀，此粉末再經過DMF/乙醚重結晶即得到4.95克(56.%的產率)的本項化合物(4)。熔點為153-158℃[α]D-37.5°(C＝0.6，DMF，20℃)TLCRf1＝0.56C22H27NO5S的分析理論值(%)C63.29，H6.25，N3.36實驗值(%)C63.49，H6.54，N3.41(5)Z(OMe)-Cys(Tmb)-ONp向含有5克(12.0mm)Z(OMe)-Cys(Tmb)-OH及1.83克(13.2mmol)鄰氮苯酚的50毫升THF溶液中加入2.72克(13.2mmol)二環己基碳化二亞胺(以後簡寫為DCC)。混合物在室溫攪拌過夜，過濾，將濾液濃縮，產物再經DMF/2-丙醇結晶純化即得到3.56克(55%的產率)的本項化合物(5)。
熔點121℃，[α]D-25.5°(C＝1.0，DMF，20℃)TLCRf5＝0.71[溶劑系統為氯仿，以後Rf5都代表這個意義]
C28H30N2O7S的分析理論值(%)C62.44，H5.61，N5.20實驗值(%)C62.40，H5.61，N5.20(6)Z(OMe)-Cys(Tmb)-Asn-Ser-Phe-Arg(Mts)-Tyr-OBzl按常規方法將2.0克(1.78mmol)Z(OMe)-Asn-Ser-Phe-Arg(Mts)-Tyr-OBzl用TFA/苯甲醚(4ml/1ml)處理，然後將無水乙醚加到混合物中即得到粉狀產物。經氫氧化鉀顆粒減壓乾燥3小時後，將這些粉末與0.23毫升(1.78mmol)三乙胺，1.06克(1.96mmol)Z(OMe)-Cys(Tmb)-ONp及0.20毫升(1.78mmol)NNM共同溶解在20毫升DMF中。溶液攪拌14小時後用乙酸中和、蒸發，剩餘物在水中搗碎得到的粉末用DMF-乙醇沉澱，即得到2.01克(83%的產率)的本項化合物(6)。
熔點200-203℃[α]D-200°(C＝0.8，DMF，20℃)TLCRf1＝0.51C69H84N10O15S2的分析理論值(%)C61.04，H6.24，N10.32實驗值(%)C60.85，H6.40，N10.03(7)Z(OMe)-Leu-Gly-NHNH2向含有7.02克(19.7mm)Z(OMe)-Leu-Gly-OMe的30毫升甲醇溶液中加入5.90毫升(98.5mmol)80%的水合肼。混合物置室溫反應24小時，蒸發。剩餘物加入水/乙醚結晶。結晶物再用甲醇/乙醚重結晶。即得到5.79克(83%產率)的本項化合物(7)。熔點108-112℃[α]D-6.0°(C＝0.7，DMF，20℃)C17H26N4O5的分析理論值(%)C55.72，H7.15，N15.29
實驗值(%)C55.74，H7.15，N15.20(8)Z(OMe)-Leu-Gly-Cys(Tmb)-Asn-Ser-Phe-Arg(Mts)-Tyr-OBzl向2.01克(1.48mmol)Z(OMe)-Cys(Tmb)-Asn-Ser-Phe-Arg(Mts)-Tyr-OBzl中加入TFA/苯甲醚(4.0ml/1.0ml)，混合物按常規方法在0℃反應1小時，蒸發除去TFA，剩餘物在乙醚中搗碎製成粉狀物。這些粉末經過濾收集、乾燥即為H-Cys(Tmb)-Asn-Ser-Phe-Ary(Mts)-Tyr-OBzl·TFA。將粉末溶於含0.21毫升三乙胺的DMF中，在冰冷條件下，向上述濃度中加入一種由三乙胺中和的疊氮溶液。這種疊氮溶液是由用0.28毫升(2.14mmol)亞硝酸異戊酯/3.2M-HCl/DMF(0.28ml/1.34ml)在DMF中處理的0.65克(1.78mmol)Z(OMe)-Leu-Gly-NHNH2所製備得到的。上述反應混合物在5℃攪拌14小時後濃縮，並向剩餘物中加入水。產物在DMF/乙醇中結晶而得到2.06毫克(91%的產率)本項化合物(8)。熔點210-212℃[α]D-11.4°(C＝0.7，DMF，20℃)。TLCRf1＝0.56C77H98N12O17S2的分析理論值(%)C60.53，H6.47，N11.00實驗值(%)C60.29，H6.69，N10.85(9)Z(OMe)-Ser-Gly-OBzl將7.0克(24.7mmol)Z(OMe)-Ser-NHNH2按常規方法與3.94毫升亞硝酸異戊酯/18.6毫升3.2當量HCl-DMF於10毫升DMF中反應，然後用8.26毫升三乙基胺中和，這樣製備的疊氮化合物溶液，與9.51克(29.6mmol)H-Gly-OBzl。甲苯磺酸鹽，並用4.11毫升三乙基胺中和的30毫升DMF溶液在冰冷條件下在5℃反應14小時，反應混合物經濃縮得到的油狀物溶解在乙酸乙酯中。該溶液用0.5當量的鹽酸，5%的碳酸氫鈉及飽和氯化鈉水溶液洗，在硫酸鈉中乾燥，蒸發剩餘物加入乙醚結晶，結晶產物再在THF/乙醚中重結晶即得到6.89克(67%的產率)本項化合物(9)。熔點95-97℃[α]D+3.0°(C＝0.7，DMF，20℃)。
TLCRf1＝0.89，Rf3＝0.33，C21H24N2O7的分析理論值(%)C60.57，H5.81，N6.73實驗值(%)C60.67，H5.78，N6.84(10)Z(OMe)-Gln-Ser-Gly-OBzl用TFA/苯甲醚(10ml/2.6ml)處理5克(12.0mmol)Z(OMe)-Ser-Gly-OBzl以除去保護基團。產物溶於20毫升DMF，得到的溶液用3.34毫升(24.0mmol)三乙基胺中和，然後加入5.69克(13.2mmol)Z(OMe)-Gln-ONp，該混合物攪拌14小時後濃縮，得到的固體產物用10%檸檬酸和水洗，並在DMF/甲醇中重結晶即得到5.04克(77%的產率)的本項化合物(10)。熔點198-200℃。[α]D+3.9°(C＝0.5，DMF，20℃)，TLCRf1＝0.12，C26H32N4O9的分析理論值(%)C57.34，H5.92，N10.29實驗值(%)C57.31，H5.98，N10.43(11)Z(OMe)-Ala-Gln-Ser-Gly-OBzl按上述操作所獲得的3克三肽按常規方法用TFA/苯甲醚(6.0ml/1.8ml)處理去保護，產物溶於含0.77毫升(5.51mmol)的三乙基胺的30毫升DMF中，在冰浴中，將由1.67克(6.61mmol)Z(OMe)-Ala-OH和0.945毫升(7.27mmol)氯甲酸異丁酯製成的混合酸酐溶液加到上述溶液中，混合物在冰浴中攪拌3小時，蒸發除去溶劑，從加水的剩餘物中沉澱出固體產物過濾收集。在DMF/乙醇中重結晶即得到2.72克(80%的產率)的本項化合物(11)。熔點105-107℃[α]D-3.6°(C＝0.8，DMF，20℃)，TLCRf1＝0.62
C29H37N5O10的分析理論值(%)C56.57，H6.06，N11.38實驗值(%)C56.71，H6.10，N11.58(12)Z(OMe)-Ala-Gln-Ser-Gly-NHNH2將上述過程製備的2.72克(4.42mmol)保護的四肽酯溶於30毫升DMF溶液中，再加入1.3毫升(5當量)80%的水合肼，將混合物反應24小時，蒸發除去溶劑後得到的粉狀物用乙醇洗，並用二甲基亞碸(以後簡稱DMSO)-DMF(1∶1)/乙醇重結晶即得到2.29克(96%的產率)的本項化合物(12)。熔點216-218℃。[α]D-19.1°(C＝0.7，DMSO，20℃)，TLCRf1＝0.21用6當量鹽酸水解後產物的胺基酸組成(%)Ser0.90，Glu1.02，Gly1.00，Ala1.02(穀氨酸的回收率為89%)C22H33N7O9的分析理論值(%)C48.97，H6.17，N18.17實驗值(%)C48.67，H6.38，N18.17(13)Z(OMe)-Ala-Gln-Ser-Gly-Leu-Gly-Cys(Tmb)-Asn-Ser-Phe-Arg-Tyr-OBzl[Z(OMe)-(hANP17-18)-OBzl]用TFA苯甲醚(4ml/1ml)與2.06克(1.35mmol)Z(OMe)-Leu-Gly-Cys(Tmb)-Asn-Ser-Phe-Arg(Mts)-Tyr-OBzl在0℃反應60分鐘。TFA在室溫蒸發除去，其餘產物加入無水乙醇即得到H-Leu-Gly-Cys-(Tmb)-Asn-Ser-Phe-Arg(Mts)-TyrOBzl·TFA的粉末狀沉澱。產物過濾收集，在KOH顆粒中減壓乾燥3小時，然後溶於10毫升含有0.19毫升(1.35mmol)三乙胺的DMF中。
另一方面，1.09克(2.03mmol)Z(OMe)-Ala-Gln-Ser-Gly-NHNH2溶於10毫升DMF-DMSO(1∶1)中，並依次向溶液中加入1.22毫升(4.87mmol)4當量鹽酸/DMF及0.32毫升(2.44mmol)亞硝酸異戊酯。混合物在低溫下反應，並用0.68毫升(4.87mmol)三乙基胺中和即得到相應的疊氮化合物。將該疊氮化合物在冰浴中逐滴加到上述8肽的DMF溶液中，混合物在5℃攪拌過夜，用茚三酮反應陰性確定後，反應混合物用50毫升水稀釋，得到粉狀沉澱過濾收集，乾燥，用DMF/90%甲醇重結晶即獲得本項化合物(13)。熔點242-244℃，[α]D-7.1°(C＝0.6，DMSO，20℃)，TLCRf4＝0.85[溶劑系統為正丁醇/吡啶/乙酸/水(4∶1∶1∶2)用6當量鹽酸水解後產物的胺基酸組成(%)Asp1.03，Ser1.90，Glu1.21，Gly2.17，Ala1.17，Cys0.66，Leu0.98，Tyr0.97，Phe1.00，Arg1.03(苯丙氨酸回收率為97%)C90H119N17O23S2的分析理論值(%)C57.77，H6.41，N12.73實驗值(%)C57.56，H6.48，N12.51(14)H-Ala-Gln-Ser-Gly-Leu-Gly-Cys(SH7-Asn-Ser-Phe-Arg-Tyr-OH[α-hANP-(17-28)].
向上述過程所獲得的100毫克(53.4μmol)Z(OMe)-[α-hANP-(17-28)-OBzl中加入280微升(2.67μmol)間甲酚，197微升(2.67μmol)二甲基硫醚和2毫升氟化氫，該混合物在0℃處理1小時後，0℃蒸發除去氟化氫，其餘產物加入乙醚，所得的粉狀物離心，溶於2毫升含有82毫克(10當量)的二巰基蘇糖醇的水溶液，加入氨水調至PH8.0，混合物在氬氣流條件下攪拌30分鐘，反應混合物通過Sephadex G-25柱(Pharmacia AB)(1.8×140cm，用0.2N醋酸洗脫，每組分體積7毫升)層析純化。洗脫液冰凍乾燥即得到23毫克(33%產率)的本項化合物(14)。[α]D-10.0°(C＝0.1，0.2N乙酸，30℃)，TLCRf4＝0.37用6N HCl水解後產物胺基酸組成Asp0.98，Ser1.85，Glu1.03，Gly2.02，Ala1.09，Cy SH1.36，Leu0.99，Tyr0.78，Phe1.00，Arg0.97(苯丙氨酸回收率為92%)。
實施例2α-hANP(24-28)的合成向上述實施例1-(3)步驟中所獲得的93毫克保護為5肽中加入87微升(0.827mmol)間甲酚，59微升(0.829mmol)二甲基硫醚及2毫升氟化氫，該混合物在0℃反應1小時後，在0℃蒸發除去氟化氫，剩餘物按實施例1中的第14步驟處理即得到34毫升α-hANP-(24-28)[′H-Asn-Ser-Phe-Ary-Tyr-OH]。
實施例3H-Ile-Gly-Ala-Gln-Ser-Gly-Leu-Gly-Cys(SH)-Asn-Ser-Phe-Arg-Tyr-OH[α-hANP-(15-28)的合成。
500毫克(0.267mmol)Z-(OMe)-Ala-Gln-Ser-Gly-Cys(Tmb)-Asn-Ser-Phe-Arg(Mts)-Tyr-OBzl與0.23毫升(2.14mmol)苯甲醚及2毫升三氟乙酸在0℃反應1小時後，蒸發除去三氟乙酸，其餘反應物加入乙醚製成粉狀，得到的顆粒過濾收集，乾燥即得到去保護的產物即H-Ala-Gln-Ser-Gly-Leu-Gly-Cys(Tmb)-Asn-Ser-Phe-Arg(Mts)-Tyr-OBzl·TFA。該產物作為三氟乙酸鹽，其Z(OMe)已去除。
同時，將127毫克Z(OMe)-Ile-Gly-NHNH2與5毫升DMF、280微升4當量-HCl/DMF，55微升亞硝酸異戊酯和116微升三乙基胺反應得到相應的疊氮化物。該疊氮化物在冰浴中逐滴加到在DMSO-DMF(1∶1)中的上述去保護產物，混合物攪拌過夜。反應混合物加入水後過濾收集，乾燥得到固態物質，再經DMF/甲醇重結晶進一步純化即得到433毫克所需的α-hANP-(15-28)，即是Z(OMe)-Ile-Gly-Ala-Gln-Ser-Gly-Leu-Gly-Cys(Tmb)-Asn-Ser-Phe-Arg(Mts)-Tyr-OBzl。TLCRf1＝0.47。
用6當量鹽酸水解的產物胺基酸組成Asp1.00(1)，Ser1.83(2)，Gln1.21(1)，Cystein0.60(1)，Gly3.46(3)，Ala1.24(1)，Ile1.07(1)，Leu1.20(1)，Tyr0.92(1)，Phe1.00(1)，Arg0.92(1)(苯丙氨酸回收率為63%)。
上述去保護的α-hANP-(15-28)(100mg，0.049mmol)在257微升間-甲酚中，用180微升(2.45mmol)甲基硫醚及2毫升氟化氫0℃處理1小時，氟化氫在0℃減壓蒸發除去。剩餘物加入乙醚製成粉狀，得到的產物溶於含75毫克的二巰基蘇糖醇水溶液中，用5%的氨水調至PH8.0，並在流動氬氣中攪拌30分鐘，反應產物經過SephadexG25(1.8×110cm)(Pharmacia AB)柱層析，用0.2N乙酸洗脫(每組分體積為6毫升)收集第30至37組分，冰凍乾燥即得到化合物α-hANP-(15-28)，產率為80%，TLCRf4＝0.29經下述實驗確定，通過上述反應得到的多肽α-hANP-(n-28)(n表示15到24的整數)與α-hANP-(1-28)一樣對動物有抗原性，可用於α-hANP將異的放射免疫分析以闡明α-hANP在能力一控制系統中的病理生理學作用。
實驗例1將α-hANP-(17-28)與牛甲狀腺球蛋白結合(一種複合物製劑)α-hANP-(17-28)通過碳化二亞胺偶聯法(Yoshinase etal，J.Clin.Invest.69，643(1983)，Nakao etak.，Biochem，Biophys，Res，Commun.117，695(1984)]與牛甲狀腺球蛋白結合。
將3毫克α-hANP-(17-28)及25.2毫克牛甲狀腺球蛋白溶於2毫升蒸餾水中，然後加入含30毫克1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亞胺氫化物的溶液。混合物用鹽酸調至PH5.6，室溫攪拌20小時。反應混合物在4℃用5升蒸餾水中透析三次，即得到所需複合物。
免疫作用將100-200微克α-hANP-(15-28)-甲狀腺球蛋白複合物懸浮於等體積Freund氏完全佐劑中。
通過皮下注射，將懸液注射到日本白兔的肩胛骨脊椎區域，每4周用免疫輔助劑處理一次，處理十到十四天後，收集其血液即得到抗血清CR3。
碘化標記按常規的氯胺-T方法[Nature 194 495(1962)]，用1mCi125I標記1微克α-hANP-(1-28)，反應混合物經過Sep-Pak藥筒(Waters Ltd)用50%乙腈/5mM三氟乙酸的混合物洗脫，得到的純產品125I標記的α-hANP放射性比活性為700 Ci/g。
放射免疫測定(RIA)所用的RIA溶液為0.1M的磷酸緩衝液，內含0.5%明膠，0.1mMEDTA·2Na，0.2mM胱氨酸，0.1%Triton X-100及0.01%的硫柳汞。
向100微升α-hANP的標準溶液中加入100微升抗血清CR3溶液(最終稀釋度為1∶4000)，100微升125I-α-hANP(約5，000Cpm)及200微升RIA溶液，混合物在4℃保溫72小時。
然後加入1毫升有旋糖酐塗裹的活性炭懸液，這種活性炭是由300毫克/100毫升活性炭(Norit SX Plus)，30毫克/100毫升右澱糖酐(Dextran T-70，Pharmalia AB)，及1毫升含0.01%硫柳汞的0.05M磷酸緩衝液組成。混合物在4℃反應15分鐘後，通過離心將結合的125I-標記的α-hANP與其游離形成的分開，並測量其放射性強度。
α-hANP-(1-28)的標準曲線及從大鼠心房分離出的α-rANP-(1-28)與合成肽段α-hANP-(24-28)的交叉曲線如圖1所示。在高靈敏度範圍最小可測限度為50微微克。從圖1中清楚可見，由α-hANP-(17-28)所製備的抗血清CR3對於α-hANP-(1-28)及α-rANP(1-28)具有同樣的識別能力。另一方面，分子量換算表明，α-hANP-(24-28)顯示出與α-hANP-(1-28)同樣的活性。正如所預想的那樣，RIA可以從狗、豚鼠、猴、牛、豬及羊的心房抽提物中檢測到α-ANP-LI。結果表明，上述RIA系統不僅可用來檢測α-hANP，而且可用檢測其它動物中的與ANP相關的肽。這個系統還可以用來檢測天然的或合成的與α-ANP相似而其胺基酸順序尚未確定的肽類。
權利要求
1.製備由下式代表的多肽R-Asn-Ser-Phe-Arg-Tyr-OH其中R是H，Cys，Gly-Cys，Leu-Gly-Cys，Gly-Leu-Gly-Cys，Ser-Gyl-Leu-Gyl-Cys，Gln-Ser-Gly-Leu-Gyl-Cys，Ala-Gln-Ser-Gly-Leu-Gly-Cys，Gly-Ala-Gln-Ser-Gly-Leu-Gly-Cys，或Ile-Gly-Ala-Gln-Ser-Gly-Leu-Gly-Cys，及其鹽類的方法，該方法包括，根據常規的肽合成方法，通過胺基酸與胺基酸之間，胺基酸與肽片段之間的逐步縮合，使肽鏈延長，每個胺基酸和肽片段均成為最終多肽的一部分，如果需要，還可進行對胺基酸和(或)肽片段的功能性基團進行保護及去保護。
專利摘要
一種由通式R-Asn-Ser-Phe-Arg-Tyr-OH所表示的多肽，可用於原發性高血壓臨床診斷試劑的發展及其病理生理學研究。其中R為H，Cys，Gly-Cys，Leu-Gly-Cys，Gly-Leu-Gly-Cys，Ser-Gly-Leu-Gly-Cys，Gln-Ser-Gly-Leu-Gly-Gys，Ala-Gln-Ser-Gly-Leu-Gly-Cys，Gly-Ala-Gln-Ser-Gly-Leu-Gly-Gys或Ile-Gly-Ala-Gln-Ser-Gly-Leu-Gly-Cys及其鹽。
文檔編號A61K39/00GK85106564SQ85106564
公開日1987年3月18日 申請日期1985年8月31日
發明者木曾良明, 中尾一和 申請人:鹽野義製藥株式會社導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan