人工合成的甘藍型黃籽油菜的分子標記及其應用的製作方法
2023-04-22 19:32:01 2
專利名稱：人工合成的甘藍型黃籽油菜的分子標記及其應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於油菜育種技術領域，具體涉及一種人工合成的甘藍型黃籽油菜的分子標記及利用該分子標記進行標記輔助選擇，培育一種遺傳穩定的黃籽油菜新品種。
背景技術：
大量研究表明，在相同遺傳背景下，黃籽油菜較黑籽具有含油量和蛋白質含量高；種皮薄(約為一半)；纖維素、單寧和鞣酸等多酚化合物含量低；油質清澈透明，雜質少；餅粕對畜禽適口性好；成熟度較易鑑定，便於適時收穫等一系列優點。在白菜型油菜、芥菜型油菜和衣索比亞芥都有天然的黃籽種質存在，然而甘藍型油菜黃籽資源缺乏，現有甘藍型黃籽油菜的黃籽性狀不穩定，自交多代仍有黑籽出現，色澤不鮮豔。許多研究者利用遠緣雜交、輻射誘變及人工合成等多種方法積極創造甘藍型油菜黃籽種質。通過對甘藍型黃籽變異株的定向選擇，品種間和種間雜交，輻射誘變，組織培養等途徑和方法可選育出優良的甘藍型黃籽油菜。因此將黃色種皮和高含油量、低纖維素、低芥酸、低硫苷等品質性狀結合在一起，與雜種優勢利用、生物技術相結合，進行綜合性狀育種，培育一種全新油菜品種，已成為提高種子含油量，改進油菜品質，增加種籽產量，提高產量潛力的一條重要途徑。
然而甘藍型黃籽油菜種皮色澤遺傳極不穩定，遺傳機制十分複雜，環境和外界因素影響較大。傳統的表現型選擇的育種方法，受到環境條件影響，存在許多缺點，效率低。分子標記輔助選擇是一種高效的育種方法，與傳統表型選擇相比，它可在任何生長期進行，不受環境條件影響，可排除非等位基因相互作用而造成的幹擾，具有快速、經濟，效率高、準確性強等優點。在甘藍型黃籽油菜育種過程中將分子標記技術與回交育種相結合，藉助分子標記對黃籽性狀的基因型進行直接而快速地選擇，以排除環境和外界因素的影響。同時對背景進行選擇，這樣可加快遺傳背景恢復速度，縮短育種年限和減輕連鎖累贅的作用。
在甘藍型油菜中，Van Deyzne等人(Van Deynze等，The identification of restriction fragment lengthpolymorphisms linked to seed colour gene in Brassicca napus.，Genome，1995，38534-542)鑑定了一個與種皮顏色連鎖的RFLP標記。Somers等(Somers D J等，.Identification of a major gene and RAPD marker foryellow seed coat colour in Brassica napus.，Genome，2001，441077-1082)採用RAPD和BSA(Michelmore等，Identification of markers linked to disease-resistance genes by bulked segregant analysisa rapid methoddetect markers in specific genomic regions by using segregating populations.，Proc Natl Acad Sci USA，1991，889828-9832)結合的方法，找到一個與種皮色澤相關的主基因，獲得了8個與種皮色澤連鎖的RAPD標記，其中一個與色素基因(黑籽)共分離，兩個與黃籽基因緊密連鎖。這些工作為分子標記輔助選擇選育黃籽油菜品種奠定了基礎。目前分子標記輔助選擇(MAS)在甘藍型油菜中應用並不多，在甘藍型黃籽油菜中尚未見有MAS的報導。
發明內容
本發明的目的在於利用DNA分子標記並結合BSA分析方法，找到與油菜黃籽基因緊密連鎖的RAPD和AFLP標記，並將它們轉化成更穩定的顯性SCAR標記或共顯性CAPS標記。應用該SCAR和CAPS標記對黃籽基因進行快速而又準確的選擇，同時應用RAPD和AFLP標記對其遺傳背景進行選擇，以加快黃籽油菜新品種的選育。
本發明通過以下技術方案實現一種製備與甘藍型油菜黃籽基因緊密連鎖的油菜分子標記的方法，包括下列步驟1)雙單倍體(DH)分離群體的獲得以恢5148-2為母本(該品繫於2006年1月18日保藏在中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC-P200601)，以黃籽品系No.2127-17(該品繫於2006年1月18日保藏在中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC-P200602)為父本，雜交，取F1植株的花粉進行小孢子培養(小孢子培養方法參見文獻，餘風群等，提高甘藍型油菜小孢子胚狀體成苗率的某些培養因素研究，作物學報，1997，23(2)165-168)，獲得雙單倍體(DH)分離群體。
2)構建DH分離群體的基因池用集團分析法(bulked seregation analysis，簡稱BSA，參見文獻Michelmore RW等，Identification ofmarkers linked todisease resistance gene by bulked Segregant analysisa rapid method to detect markers inspecific genomic regions using segregating population.，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，889829-9832)，構建黃籽集團和黑籽集團兩個基因池。
3)利用上述步驟2)中構建的DH分離群體的基因池，篩選與甘藍型油菜黃籽基因緊密連鎖的RAPD和AFLP標記用兩親本間有差異的引物對上述2中構建的兩個DNA池進行PCR擴增，在兩個池間表現有差異的引物再對池間的各個單株的DNA樣品進行PCR擴增和電泳檢測。確定為該性狀的連鎖標記後，然後對DH群體的各個單株的DNA樣品進行PCR擴增和電泳檢測。
4)回收、克隆、測序上述3中篩選到的與甘藍型油菜的黃籽基因緊密連鎖的RAPD和AFLP標記的片段。
5)根據上述步驟4)中的測序結果設計特異引物(引物序列見實施例所述)，將篩選到的與甘藍型油菜黃籽基因緊密連鎖的RAPD和AFLP標記轉化為SCAR標記。
6)將上述步驟5)中未成功轉化的SCAR標記發展為CAPS標記。
當上述步驟5)中候選SCAR引物不能擴增出多態性，則進行CAPS酶切分析。用限制性內切酶對擴增產物進行酶切，酶切產物電泳分離同SCAR分析。
7)將上述步驟3)，5)，6)中的RAPD標記，AFLP標記，SCAR標記和CAPS標記進行群體分析和連鎖遺傳分析。
8)利用上述步驟7)中的分子標記及輔助選擇的方法將黃籽基因導入到甘藍型油菜波裡馬細胞質雄性不育的恢復系中，選育出黃籽型油菜恢復系。
更詳盡的技術方案由以下所述1、油菜小孢子培養方法在油菜的初花期取F1植株上3-4mm左右的蕾，放入已滅菌的小燒杯中(所需器件及液體均須滅菌且在無菌條件下操作)，加入70％酒精消毒1min，用0.1％HgCL2消毒10min，然後用無菌水衝洗3次，每次5min。取消毒好的花蕾放入試管中，加入1ml的B5-13(B5液體培養基，蔗糖濃度為13％)提取液，用玻棒碾成勻漿，倒入裝有0.44μm尼龍膜的漏鬥中過濾，用10ml的離心管收集濾液。加B5提取液至所需刻度，離心5min，轉速1000rpm/min。棄上清液，加B5-13提取液重新懸浮，離心5min，轉速500rpm/min，重複該步驟一次。棄上清液，加入NLN-16培養基(含13mg/L秋水仙鹼)重新懸浮，分裝到直徑為6cm的培養皿中，密度為2蕾/ml，每皿2ml，放入32℃，暗培養兩天。每皿加新鮮的NLN-13培養基2ml，放入25℃繼續暗培養2-3星期。待肉眼可見胚，置於25℃恆溫搖床上，在振蕩培養1星期，轉速為55rpm/min，達到子葉期的胚轉入固體B5pG(含0.1mg/LGA3)培養基上繼代培養，成苗後適時移栽。
2、構建黃籽集團和黑籽集團兩個DNA池利用色彩色差計CR-300(日本美能達公司生產，主要原理是儀器具有8毫米直徑測量頭，6個高靈敏2矽光電管，採用漫射照明和0度觀察角，混合室裡的脈衝孤燈為樣品表面提供照明，有儀器的雙光束反饋系統用來測量入射光和反射光，並給出相應的亮度值)，對DH群體的種子進行種皮顏色測量，所有樣品測量值從17到50呈連續變化。我們在對大量樣品進行測量後，參照前人黃籽分類研究結果，並結合肉眼目測，將所有的樣品由黃到黑分成6級，分別是1級(最黃)亮度值為大於40，2級亮度值為35-40，3級亮度值為30-35，4級亮度值為25-30，5級亮度值為20-25，6級(最黑)亮度值為小於20(附圖1)，以同一人按同樣方法和標準分單株記錄自交種子級別。在DH分離群體中，根據各個DH系種皮色澤測量和顏色分析結果，在1級中選取10份DH系和在6級中選取10份DH系，分別將其DNA等量混合構成黃籽基因池(Yellow-seeded bulk)和黑籽基因池(Black-seededbulk)。
3、RAPD分析和AFLP分析RAPD分析RAPD引物購自上海生物工程有限公司(方法參見Rohrer G A等，The useof a randomly ampllified polymorphic DNA marker RAPD in an analysia of susceptibility to heamonchus andcoccidia infestations in goats，jounrnal of animal science，692-3，1991，)。經優化試驗，RAPD分析確定如下最優PCR反應體系1×PCR buffer，1.35mmol/L MgCl2，0.08mmol/L dNTPs，1.0U Taq polymerase(上述四者均為MBI Fermentas，Lithuania)，0.45μmol/L 10-mer RAPD引物(上海生物工程有限公司)，50ng DNA模板，加ddH2O至終體積20μl。反應於PTC-225擴增儀(MJ Research，USA)上進行。熱循環參數為94□3min；94□30s，40□45s，72□60s，38個循環；72□10min；4□保存。擴增產物在水平電泳槽(北京六一儀器公司)上，使用1×TAE緩衝液，電壓3V/cm，電泳2.5h左右，1.2％瓊脂糖凝膠(含EB)電泳分離，利用Lambda DNA/HindIII+EcoRI marker估算擴增產物大小。電泳完畢，於凝膠成像系統(UVP)拍照保存，記錄多態性結果。
AFLP分析(1)總DNA的酶切與連接按表1配製反應體系總DNA 200ng，2U EcoRI和2U MseI(MBI Fermentas，Lithuania)限制性內切酶，終體積為20μl。先在37℃水浴5hrs-8hrs，後轉入65℃水浴45min，完全酶切後加入5μl連接混合液，將酶切連接混合液置於22℃連接過夜。連接完畢，70℃滅活10min，再用ddH2O將反應液稀釋10倍作為PCR預擴增的底物；(2)AFLP接頭和引物序列設計均按Vos等(1995)報導方法進行，由上海生物工程公司合成。接頭製備先將EcoR I、Mse I接頭的左右引物(F，R)按照OD值的多少加入一定數量滅菌ddH2O統一溶解稀釋為100μmol/L，後將等體積的左右引物(F，R)混合於同一滅菌0.5ml離心管中，進行復性。復性參數為65□10分鐘，37□10分鐘，25□10分鐘，一個循環，在DNA-Thermal Cycler 480PCR儀(Perkin elmer Ltd.，USA)上進行，後置於冰上10分鐘，最後置於-20□保存備用。
EcoR I接頭序列左引物(EF)5＇-CTC GTA GAC TGC GTA CC-3＇右引物(ER)3＇-CTG ACG CAT GGT TAA-5＇；Mse I接頭序列
左引物(MF)5＇-GAC GAT GAG TCC TGA G-3＇右引物(MR)3＇-TA CTC AGG ACT CAT-5＇。
表1本發明的DNA酶切、連接體系設計
(3)預擴增在20μl PCR反體系中，含有0.125mmol/L dNTPs，1U Taq polymerase，1.35mmol/L MgCl2，1×PCR buffer(四者均為MBI Fermentas，Lithuania)，50ng EA和50ng MC(或者MG)預擴引物，3μl酶切連接產物(表2)。PCR循環參數為；94□30s，56□30s，72□1min，20個循環，PTC-225 PCR儀上完成。取4μlPCR產物於1.0％瓊脂糖凝膠檢測，若呈彌散狀(Smear，50bp-1000bp)，表明預擴增效果好。剩餘產物稀釋10-15倍，作為下一步PCR選擇性擴增的模板。
對應的預擴增引物序列為EA為5＇-GAC TGC GTA CCA ATT CA-3＇；MC為5＇-GAT GAG TCC TGA GTA AC-3＇；MG為5＇-GAT GAG TCC TGA GTA AG-3＇(4)選擇性擴增在15μl PCR反應體系中含有3μl預擴稀釋增產物，37.5ng EA+2引物(為EA預擴引物另加2個選擇性鹼基，以下類似)和37.5ng MC/MG+2引物，0.15mmol/L dNTPs，0.75U Taqpolymerase，0.45mmol/L MgCl2，1×PCR buffer(後四者均為MBI Fermentas，Lithuania)(表3)。PCR循環參數為第一個循環94℃30s，65℃30s，72℃表2預擴增及選擇性擴增反應體系
表3本發明的AFLP選擇性擴增引物設計
1min，此後每個循環復性溫度下降0.7℃，共計13個循環；然後94℃30s，56℃30s，72℃1min共23個循環，PTC-225 PCR儀上完成。選擇性擴增引物序列和編號見表3。
(5)擴增產物的電泳檢測用洗滌劑將電泳玻璃徹底洗淨，先以去離子水淋洗，後用無水乙醇淋洗並晾乾。在長膠板上用光滑的餐巾紙均勻塗抹2ml矽化液(AMRESCO)。在短膠板上均勻塗1ml反矽化液(95％乙醇，0.5％冰乙酸，2μl反矽化劑)，5min後用95％乙醇輕輕擦洗，除去多餘的矽化液和反矽化液並晾乾5min。將玻璃裝配好並以邊條(0.4mm)隔開，裝配好電泳系統。用注射器將80ml變性凝膠液(6％丙烯醯胺，7mol/L尿素，0.5×TBE緩衝液，灌膠前加入300μl 10％過硫酸銨和30μl TEMED並迅速混勻)從制膠夾底部小孔緩緩注入，最後插入梳子並加夾子保護，凝聚2hrs後即可電泳。
將電泳槽底部的制膠夾板取下，擦淨電泳槽玻璃外側，將其垂直固定於底座上，上槽和下槽分別加0.5×TBE緩衝液1000ml和500ml，將梳子拔出後立即衝洗點樣孔，接通電源120W電泳預熱30min，電泳所用儀器為Sequi-Gensequencing cell(Bio-Rad，USA)。選擇性擴增產物加入等體積的上樣緩衝液(98％去離子甲醯胺，10mmol/L EDTA，0.005％二甲苯青FF，0.005％溴酚藍)，95℃變性5min後立即冰浴冷卻，點樣2.2μl。85W左右電泳，當二甲苯青FF跑過2/3膠板時中止電泳(約需2hrs)。
電泳完畢，小心剝下膠板，將其浸入到2L固定液(10％冰乙酸)中，輕輕搖動30min或至指示劑消失為止，然後用去離子水漂洗膠板2次，每次5min。洗畢，轉至2L染色液中(0.1％AgNO3，0.056％HCHO)中輕輕搖動染色30min。取出膠板，在雙蒸水中迅速漂洗10s，馬上轉入到2L預冷(10℃)顯影液(3％Na2CO3，0.056％HCHO，2mg/L Na2S2O3·5H2O)中，輕輕搖動至條帶清晰可見，後取出放回固定液(10％冰乙酸)中停止顯影，再用第二次漂洗的雙蒸水漂洗5min，室溫下自然晾乾，拍照保存。
4、目標片段回收擴增的目標片段從1％的瓊脂糖膠上用UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒(上海生物工程公司)進行回收。操作程序按試劑盒提供的方法用刀片挖出目標片段放入1.5ml的離心管，加入Bing Buffer，置於50-60℃水浴中加熱10min，每隔2min混勻一次；將融化的膠轉移至套在收集管內的UNIQ-10柱中，室溫放置2min，8,000rmp離心1min；倒掉收集管中的廢液，加入500μl Wash Solution，8,000rmp室溫離心1min，次步驟重複一次；倒掉收集管中的廢液，將UNIQ-10柱放入同一個收集管中，12,000rmp離心15sec；將UNIQ-10柱放入一根新的1.5ml的離心管中，在柱子膜中央加30μl Elution Buffer或水(pH＞7.0)，室溫或37℃放置2min；12,000rmp離心1min，離心管中的液體即為回收的DNA片段，可立即使用或保存於-20℃備用。
5、回收片段克隆和測序取上述回收的目標片段3μl作模板，用相應的引物進行PCR擴增，在1％的瓊脂糖膠檢測擴增片段是否為所需的目標片段。如果不是則需要重新擴增回收；如果是所需目標片段則進行下一步TA-克隆操作。回收的目標片段連接在pGEMT-easy載體(購自美國Promega公司，北京原平皓生物公司代理)。操作程序按試劑盒提供的方法；試劑盒中試劑在使用前先短暫離心將其收集在管底部；在0.5ml的離心管中建立如下連接反應體系表4目標片段連接在pGEMT-easy載體的反應體系
用移液管來回吸幾次混勻，放在4℃冰箱進行過夜連接反應；準備SOC培養基(該培養基成分及用量參見文獻)和LB培養基(含有ampli，IPTG和X-Gal)；從-70℃冰箱中取出感受態細胞放在冰上待它慢慢解凍(大約5min)；離心收集連接反應液，取2μl反應液加入到一個已經滅菌的1.5ml離心管(放在冰上預冷)；用手指輕彈裝有感受態細胞的管底混勻，取50μl感受態細胞加入裝有2μl連接反應液的1.5ml離心管，用手指輕彈混勻，放在冰上20min；在42℃水浴中熱激90sec(勿搖動)，然後在冰上放置2min；加950μl的SOC培養基後在37℃振蕩培養1.5hrs(150rmp/min)；吸取振蕩培養後的轉化液100μl塗在無菌的LB培養基(含ampli，IPTG和X-Gal)上，在37℃放置16-24hrs；藍、白斑篩選，挑選陽性克隆在無菌的液體LB培養基(含ampli)振蕩培養16-24hrs；在超淨工作檯上吸取400μl變渾濁的菌液，其中200μl菌液加200μl 50％無菌的甘油在1.5ml無菌的離心管中於-70℃編號保存，剩餘200μl菌液離心收集沉澱，加200μl無菌水混勻，吸3μl菌液作pCR模板，用相應的引物擴增，在1％的瓊脂糖膠上檢測目標片段是否轉化成功。如果轉化成功，取相應的編號送給測序公司進行序列測定。
6、SCAR標記的轉化SCAR引物設計根據全部序列的信息，在網際網路上用Primer3引物設計軟體(http://redb.croplab.org/modules/redbtools/primer3.php)設計不同引物，要求GC含量為40％-70％，Tm值為60□-70□，引物內無二級結構，引物間不能相互配對，候選SCAR引物的正反兩個方向(Forward，Reverse)長度20bp-25bp，由上海生物工程公司合成。
SCAR標記分析PCR反應體系1×PCR buffer，1.35mmol/L MgCl2，0.08mmol/L dNTPs，1.0U Taqpolymerase(四者均為MBI Fermentas，Lithuania)，50ng DNA，0.45μmol/L正反向引物(Forward，Reverse)，ddH2O補充至終體積20μl。熱循環參數為94℃3min；94℃30s，最優復性溫度45s(用兩個親本作DNA模板作預備試驗，優化復性溫度)，72℃60s，38個循環；72℃10min，1個循環4℃保存，反應在PTC-225PCR儀上完成。擴增產物在水平電泳槽上1.2％瓊脂凝膠(含EB)分離，使用1×TAE緩衝液，電壓3V/cm，電泳1.5hrs左右。電泳完畢，凝膠成像系統(UVP)拍照保存，記錄多態性結果。
7、CAPS標記的發展當候選的SCAR引物不能擴增出多態性，則進行CAPS酶切分析，體系為10μlSCAR-PCR擴增產物，1.5μl 10×digested buffer(MBI Fermentas，Lithuania)，1.5U識別4鹼基的限制性內切酶(Bsh1236I，HaeIII，RsaI，Sau3AI，AluI，MseI，MBI Fermentas，Lithuania)，37℃酶切3hrs-6hrs。酶切產物電泳分離同SCAR分析8、標記的群體分析和連鎖遺傳分析用RAPD標記，AFLP標記，SCAR標記和CAPS標記對DH分離群體中的DNA樣品逐個進行PCR擴增和電泳檢測，計算遺傳圖距和分析連鎖關係。種皮顏色在本研究中表現為單基因差異，按照MAPMAKER軟體要求，將黃籽性狀賦值為「A」，黑籽賦值為「B」，參與連鎖圖的構建。理論上，分子標記在DH群體後代只能出現2種帶型，即雙親之一帶型，對應雙親的帶型分別記錄為「A」和「B」，難以判讀或缺失的帶型記為「-」。數據分析用MAPMAKER/EXP Version 3.0(Lander et al，1987；Lincoln et al，1992)軟體進行，種皮基因和分子標記間重組值和遺傳圖距用兩點測驗計算，標記和基因的連鎖圖和順序用三點或多點測驗進行(LOD＝4.0，r＝0.3)，遺傳圖距用Kosambi函數加以轉換(Kosambi，1944)。結果表明標記與基因間呈緊密連鎖關係，各標記與基因間的重組值在2.4％-9.4％。連鎖圖覆蓋基因組的大小為53.8cM，平均距離為5.4Cm。標記與基因間的順序和距離詳見附圖29、田間雜交和分子標記輔助選擇以分子標記技術為基礎，通過MAS與傳統表型選擇相結合，輔之以田間表型觀察和品質分析，通過雜交—回交—自交的方法，將No.2127-17的黃籽基因導入到恢5148-2，選育出黃籽恢復系。具體過程按附圖3所示的分子標記輔助選擇回交育種方案進行，進行三次前景選擇和三次背景選擇。整個過程包括3次雜交，2次回交和1次自交。首先以1141A(該品繫於2006年1月18日保藏在中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC-P200603)與恢5148-2雜交，再以其F1雜種為母本，與由恢5148-2×No.2127-17經小孢子培養而來的黃色種皮DH系(經MAS選擇背景偏恢5148-2)作父本雜交，配製三交組合，保證每一代中中選單株均有恢復基因。三交F1與恢5148-2進行兩次回交，並自交一次。在此程序中，各個回交世代的每一個單株均進行PCR分析和收穫期的考種分析，選出黃籽單株種植下去。
配製三交組合時，還未找到與黃籽基因連鎖的分子標記，故只能在田間選擇農藝性狀優良，表現與恢5148-2最相似的DH系配製比較多的三交組合。成熟收穫後，對DH系逐個進行粒色考種和品質分析，選擇12個優質黃籽DH系進行背景選擇，從中選擇兩個優良DH系，相應地將其配製三交組合種植下去，其餘組合被淘汰。BC1F1中用黃籽基因特異標記S1129和S1130，BC2F1中用SCS1130、S1130和S1129對每一單株進行黃籽基因選擇(前景選擇)，每一代結合田間考察，淘汰大約一半非目標單株(黑籽單株)。對中選單株採用兩步法進行背景選擇，其中BC1F1用RAPD標記，BC2F1用AFLP標記進行分析，最後每代中選3個單株，同時套袋自交，對這些中選單株和雜交當代種子進行品質分析，根據各個組合的田間表現，選擇其中一個組合進行MAS分析。BC2F2中存在著黃籽性狀分離，用共顯性標記SCA1進行純合黃籽單株的選擇。中選單株與1141A配製組合，進行比較試驗本發明的積極效果本發明尋找到與黃籽性狀緊密連鎖的RAPD和AFLP分子標記，並將其中的兩個轉化成穩定的顯性SCAR標記和共顯性的CAPS標記，利用該分子標記進行黃籽油菜的輔助育種，可以克服黃籽油菜育種過程中根據表型選擇的缺點，大大的減少工作量，縮短育種年限，快速的培育新品種。
圖1油菜籽粒種皮顏色劃分為6個級別，圖中括號內的值為色度值圖2甘藍型黃籽油菜種皮基因的RAPD，AFLP，SCAR和CAPS標記的遺傳連鎖圖。左邊為圖距，用cM表示，右邊為標記圖3黃籽性狀回交導入到恢5148-2的分子標記輔助選擇選育方案圖4 S1130(RAPD，A)和EA07MC13(AFLP，B)在構成基因池的各個DH系上的擴增效果圖。泳道1為No2127-17，泳道2為黃籽基因池，泳道3為黑籽基因池，泳道4為恢5148-2，泳道5-14分別為構成黃籽基因池的各個DH系，泳道15-24分別為構成黑籽基因池的各個DH系，M示分子量大小，箭頭所示為分子標記，*示交換DH系圖5 SCS1130(SCAR，A)和SAC1(CAPS，B)標記在構成基因池的各個DH系上的擴增效果圖。泳道1為No.2127-17，泳道2為黃籽基因池，泳道3為黑籽基因池，泳道4為恢5148-2，泳道5-14分別為構成黃籽基因池的各個DH系，泳道15-24分別為構成黑籽基因池的各個DH系，M示分子量大小圖6 RAPD引物S86在BC1F1群體中的背景選擇效果圖。P1為黃籽親本No.2127-17，P2為黑籽親本恢5148-2，其餘為不同的單株，箭頭所示為多態帶圖7 SCS1130的在部分BC2F1群體的單株前景選擇的效果圖。P1為黃籽親本No.2127-17，P2為黑籽親本恢5148-2，其餘為不同的單株，箭頭所示為黃籽單株的特異帶圖8 SCA1在BC2F2群體中的部分單株選擇結果。P1為黃籽親本No.2127-17，P2為黑籽親本恢5148-2，其餘為不同的單株，箭頭所示為純合的黃籽單株。
具體實施例方式
實施例11)建立雙單倍體(DH)群體在本實施例中，以恢5148-2作母本，甘藍型黃籽油菜No.2127-17作父本進行雜交，得到F1，利用F1植株的花粉經小孢子培養(小孢子培養方法參見文獻，餘風群等，提高甘藍型油菜小孢子胚狀體成苗率的某些培養因素研究，作物學報，1997，23(2)165-168)得到127個雙單倍體(簡稱DH)群體。
2)DNA的提取和基因池的建立從步驟1得到的群體中的小苗中提取和純化DNA，具體製備方法參照李佳等(李佳等，一種有效提取油菜葉片總DNA的方法，華中農業大學學報，1994，13(5)521-523)報導的方法進行。黃籽基因池和黑籽基因池的構建方法參見上述詳盡的技術方案中的2中所述。
3)集團分析法(BSA)與RPAD和AFLP技術相結合篩選與油菜黃籽基因緊密連鎖的分子標記在810條RAPD引物(S1-S410，S1000-S1400，購自上海生物工程有限公司)中有240(29.6％)條表現出多態性，240條RAPD引物和512對AFLP引物組合(EA/MC和EA/MG組合，AFLP接頭和引物序列設計均按Vos等(Vos et al.AFLPa new technique for DNA fingerprinting.Nucleic Acids Res，1995，234407-4414)報導方法進行，由上海生物工程有限公司合成)在雙親及基因池間進行篩選表明，4個RAPD和16個AFLP組合在兩個基因池間表現出多態性。進一步分析表明，2個RAPD和8個AFLP標記與黃籽基因緊密連鎖，在構成基因池的20個DH系上重組值小於15％(見圖4)。10個標記在127個DH系的群體上連鎖分析表明，10個標記在同一連鎖群上，其中2個RAPD和5個AFLP與黃籽基因呈相引連鎖，另外3個AFLP標記與其呈相斥連鎖(附圖2)，各標記的特徵見表5。
表5與黃籽基因連鎖的RAPD、AFLP標記的引物序列，相位，大小和遺傳圖距
E＝EcoRI primer，5』-GACTGCGTACCAATTC-3』；M＝MseI primer，5』-GATGAGTCCTGAGTAA-34)將上述步驟3)篩選到的與黃籽基因緊密連鎖的RAPD，AFLP標記轉化為SCAR標記和CAPS標記將AFLP差異片段先從PAGE膠上在各自的親本帶中回收。S1129和S1130的特異片段和8個AFLP標記重擴增產物在瓊脂糖膠上分離，SK1131試劑盒(購自上海生物工程有限公司)進回收純化。直接將純化回收產物與pGEMT-Easy載體(Promega Corp，#A1360 Madison，Wis)連接轉化大腸桿菌，塗布於LB(含amp)固體培養基平板上，37℃培養過夜。每個片段用牙鑑挑6-10個白色單菌落，接種在LB(含amp)液體培養上過夜，取5μl培養液作DNA模板，SP6/T7引物(購自上海生物工程有限公司)進行PCR檢測，結果表明，10個標記片段均有90％左右的陽性克隆，獲得了陽性重組子。每個片段選擇兩份陽性克隆的菌樣送到上海生物工程有限公司測序。測序結果表明，各個AFLP標記序列5＇末端和3＇末端分別包含有Mse I和EcoR I酶切位點以及完整的AFLP引物序列；兩個RAPD標記序列的兩端含有相應的引物序列或互補序列。
根據它們序列測序結果，在整個序列信息基礎上，用Primer3軟體(http://redb.croplab.org/modules/redbtools/primer3.php)各設計一對最優引物。各引物先在親本No.2127-17和恢5148-2之間擴增，優化PCR反應條件，確定退火溫度，建立最優的反應體系。再在兩親本和兩基因池間，並在各自最優條件下PCR擴增，尋找多態性，結果顯示，S1130的SCAR引物在兩親本和兩基因池表現出多態性(附圖5)，表明S1130標記發展成了一個顯性SCAR標記，命名為SCS1130。
未發展成SCAR標記的引物的PCR產物分別用相應的內切酶(MBI Fermentas，Lithuania)在兩親本和兩基因池進行酶切，尋找差異。酶切結果顯示，只有EA05MC12/Bsh1236I引物酶組合的產物揭示出多態性(附圖5)，EA05MC12標記被發展成一個共顯性的CAPS標記，命名為SCA1。SCS1130和SCA1的特徵見表6所示。
表6 SCAR和CAPS標記的特徵
上述分子標記SCS1130的DNA序列如序列表SEQ ID NO1所示；標記SCA1的DNA序列如序列表SEQ ID NO2所示。
用SCS1130和SCA1在定位群體上作連鎖分析表明，它們仍處在黃籽基因兩側，遺傳距離分別為3.2cM和3.9cM。MAPMAKER/EXP 3.0程序將這兩個標記和原來10個RAPD和AFLP標記定位到同一連鎖群，在連鎖群上的順序和距離見附圖2選用一個有353個單株(169株黃籽和184株黑籽)的BC1F1回交群體對SCS1130和SCA1進行評價。表明這兩個標記在甘藍型黃籽油菜基因型的鑑定上有較強能力，能夠準確選出黃籽基因型(表7)。
表7 SCS1130和SCA1標記在BCF1的分析結果表
注+/-，特異帶的有無實施例2親本材料分別為甘藍型油菜恢5148-2、No.2127-17、Pol cms不育系1141A(來源如前所示)。各個單株DNA採用小量法提取。
在黃籽基因回交轉育過程中，用SCS1130、SCA1進行前景選擇(黃籽基因的跟蹤)，遺傳背景的選擇選用RAPD和AFLP標記。具體過程按附圖3所示的分子標記輔助選擇回交育種方案進行，進行三次前景選擇和三次背景選擇。整個生育期內進行各組合和單株農藝性狀觀察，主要考察長勢長相、株葉形態、整齊度、生育期等，對幾個重要株系進行室內考種，比較中選株與恢5148-2的異同以及其配製組合與恢5148-2組合的異同。品質分析由華中農業大學油菜研究室品質分析分室完成，採用近紅外分析方法。
每個單株根據帶型有無分別賦值為1和0。按Nei和Li(Nei et al.Mathematical model for studying geneticvariation interms of restriction endonucleases.Proc Natl Acad Sci USA，1979，76269-573)的方法計算各材料與輪迴親本恢5148-2的相似係數和遺傳距離。相似性分析採用UPGMA(Unweighted pair group witharithmetric average，算術平均數非加權類平均法)方法進行聚類分析。
具體步驟如下1)制三交組合以1141A為母本，恢5148-2為父本雜交得F1，選擇DH(恢5148-2×No.2127-17)群體中的65個DH系做父本與F1雜交，得到三交組合。
2)RAPD引物對上述1中配製三交組合的DH系進行背景選擇選用多態性最好的142條多態性RAPD引物，對12個品質較好、種子飽滿、粒大並配製三交組合的黃色DH系進行遺傳背景與恢5148-2的相似性分析。結果顯示，共擴增出830條帶，多態性帶314條，並進行聚類分析，篩選出兩個與恢5148-2遺傳距離最小的DH系DH21和DH146，田間觀察發現這兩個DH系表現與恢5148-2最相似，與背景選擇結果相一致。
3)上述2中中選的兩個DH系配製的三交組合進行回交和自交將這兩個DH系(DH21和DH146)配製的三交組合種植到田間，在花蕾期，選取可育單株，用恢5148-2與之回交，獲得兩個回交BC1F1(BC1-21F1，BC1-146F1)群體，並將三交組合自交獲得三交組合F2(F2-21和F2-146)。
4)用SCS1130和SCA1對上述3中的組合進行前景選擇用RAPD引物對上述3中的組合進行背景選擇收穫上述3中的組合，考種結果表明，三交組合F2(F2-21、F2-146)種皮顏色均為黃色，品質分析表明二者品質較好，含油量高，兩個回交當代種子(BC1-21F0、BC1-146F0)品質分析較好，根據品質分析結果，結合田間兩個BC1F1組合長勢長相、葉片顏色和形狀、整齊度等性狀表現，選擇其中一個與恢5148-2最相似的組合BC1-146F1進行MAS選擇。用SCS1130和SCA1對BC1-146F1的單株進行黃籽性狀的選擇，檢測結果S1129共檢測到175個陽性黃籽單株，S1130共檢測到170個陽性株黃籽單株，二者均檢測到的陽性單株0 共169株(見表10)。
5)用RAPD引物對上述3中的組合進行背景選擇結合田間單株生長情況，在上述4選擇的169個單株中選擇生長健壯，生長勢旺盛的142株陽性單株作背景分析。先用多態性最好的30條RAPD引物對這142個陽性單株進行背景選擇(附圖6)，以此為資料進行聚類分析，篩選出46個與恢5148-2遺傳距離最近的單株。另增加58條RAPD引物進行下一步背景選擇。結合田間生長情況，最後選擇生長健壯，與恢5148-2距離最小的3個單株25#，85#，49#(表8)。
6)上述4中選擇的單株回交和自交將上述4中中選單株25#，85#，49#與恢5148-2回交，獲得BC2F1群體(BC2-25F1，BC2-85F1，BC2-49F1)，同時將三株自交獲得BC1F2(BC1F2-25，BC1F2-85，BC1F2-49)。3個BC1F2和回交當代(BC2F0)的種子顏色為黃色，與標記選擇結果相一致，說明所選組合含有黃籽基因。
7)對上述5中收穫的6份種子進行前景選擇對上述5中收穫的6份種子進行品質分析，結合田間3個BC2F1群體的生長情況、整齊度、株葉形態等表現，選取BC2-85F1群體，用SCS1130和SCA1進行新一輪MAS前景選擇(附圖7)，篩選含有黃籽基因的單株，選擇結果表明SCS1130選擇到107株陽性黃籽單株，S1130檢測到108株，S1129檢測到109株，三者之間無雙交換發生，共同檢測到107株單株。SCS1130由S1130發展而來，選擇結果與S1130有較大同一性，特異性高，錯選率低(表10)。並結合田間各單株生長情況，選擇生長健壯的94株黃籽陽性單株作MAS背景分析。
8)用AFLP引物對上述6中選擇的單株進行背景選擇選用20對AFLP引物對上述6中中選的94個單株進行背景分析，篩選出與恢5148-2遺傳距離最近的46個單株。另外增加40對AFLP引物，對這46個單株進行下一步背景選擇，結合田間生長情況，選出3株與恢5148-2遺傳距離最小的單株278#、248#、243#(表8)。
9)上述7中中選的單株進行自交和雜交對上述7中中選的3個單株278#、248#、243#套袋自交獲得BC2F2(BC2F2-278，BC2F2-248，BC2F2-243)，並與1141A配製雜交組合，進行初步比較實驗。
表8 BC1F1和BC2F1中與恢5148-2遺傳距離最小的10個單株
10)對上述步驟9)中的自交和雜交組合進行前景選擇對上述步驟9)中的3個BC2F2的種子進行品質分析和種皮顏色比較後，根據3個BC2F2群體的整齊度，生長勢，株葉形態等田間表現，用共顯性標記SCA1對其中一個整齊一致、生長勢旺盛、品質較優的BC2F2-248群體進行MAS分析(見附圖8)。用共顯性標記SCA1對BC2F2-248群體的49個單株進行分析結果表明顯性純合(黃籽)∶雜合(黃籽)∶隱性純合(黑籽)比例為9∶23∶17，卡平方值為2.79(x20.05，2＝5.99)，符合1∶2∶1的預期分離比，與BC2F2後代的表型鑑定結果基本一致，錯選機率為6.12％(表10)結果表明顯性純合(黃籽)共有9株，其中2株後期不抗病、性狀差予以淘汰。
11)對上述步驟10)中選擇的單株進行自交和雜交對上述9中中選的7個純合單株(402#，405#，422#，433#，440#，445#，447#)套袋自交，並與1141A配製雜交組合(包括恢5148-2)，進行下一步比較實驗。收穫7個純合單株的BC2F2∶3，及其相應雜交組合進行品質分析和種皮顏色分析結果表明，7個單株種皮顏色均比親本No.2127-17深，而所配雜交組合顏色比中選單株顏色深，含油量較恢5148-2均得到提高，與No.2127-17相當，芥酸降到零芥水平，硫苷含量較輪迴親本增加，約為兩親本均值，中硫水平，表明已經成功將No.2127-17的黃籽基因導入到恢5148-2中，硫苷水平需要作進一步的改良(品質性狀分析見表9)。7個雜交組合正在一年多點比較實驗，將最終決定當選單株。
表9不同材料的品質性狀分析表
各個標記前景選擇準確性比較各種分子標記選擇結果與田間根據表型鑑定結果進行比較發現隨著世代增加，每一個標記選擇準確率降低，而且錯選率均比標記重組值大，極不一致。多個單側標記並未能較大提高準確率，標記與目標基因遺傳圖距越小，其選擇準確率越高；雙側標記選擇準確率比單側標記的準確率要高得多。前景選擇的準確性主要取決於標記與目標基因的連鎖程度，標記與基因連鎖的愈緊密，依據標記進行選擇的可靠性愈高。因此在實際應用中，優先考慮選擇2個位於基因兩側最近的分子標記，這樣不僅可以提高準確率，而且可以增加中選個體與受體親本遺傳背景同質性(見表10)。
表10本發明的各標記對各世代的選擇準確性比較表
注1)2)數據來自於分子標記評價實驗；+/-，特異帶的有無Note1)2)the data are from the two makers』validation experiment；+/-，presence/absence of the specific fragmen上述測試分子標記均為本發明所克隆的。
序列表110華中農業大學120人工合成的甘藍型黃籽油菜的分子標記及其應用130
1412006-01-191602170PatentIn version 3.12101211338212DNA213甘藍型油菜(Brassica napus)220
221gene222(1)..(338)223
220
221primer_bind222(319)..(338)223
220
221primer_bind222(1)..(21)223
4001gtggcgatgt ctttcctaaa tcctacattg attggtgatt ttgaccgacc taaaagtaaa 60atataaaaca acattattct gattatgata tatatgggta atgtattgtt aggaatttga120ttagcacact cgaggtcggt ttaatatttt tttatggatt tgggatattt ttttccctaa180acttttaaaa tttatatttt aaaatggcta ctaatttttt aagcaatatt ataggtttaa240tctaatctat taaagtttaa atttttgtat agtatatata actaaatttt aataattaag300acattgaaac ataaggtcag gttttggtcg tgagcaca3382102211465212DNA213甘藍型油菜(Brassica napus)
220
221gene222(1)..(465)223
220
221primer_bind222(443)..(465)223
220
221primer_bind222(1)..(22)223
4002ttgctcaatg tgactcttgc tcccctcgag accccaaaac caagattgcc tcttttgtca 60agatctatag acctttccaa aatcttcaag gagcaaatgt tttttgggtt ctccgggagc120acgggtacga ccagaagtca tcaatatatt cttggttggt cactggctat aggcggaaaa180gcgcaaagcc ttgacatttc tcaggtaatg gatctccctc gaccgccacc tgatcactta240ccgcttatac tcgcggttgc atcagtagtt gctttcctga taatagcagg cggaatagcg300tacctttacc aacggaatag gtatgcggaa gtgtttgaac aatgggaatt acaatacagc360ccccagagat tctccttcag aaccctgtat aaagcaacca aaggtttcaa ggagaataga420gtgcttggag ctggaggttt cggcaaggtt tacagaggag agctt46權利要求
1.一種人工合成的甘藍型黃籽油菜的分子標記SCS1130，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO1所示；標記SCA1的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO2所示。
2.權利要求1所述的人工合成的甘藍型黃籽油菜的分子標記的製備方法，它包括下列步驟1)以甘藍型油菜品系恢5148-2為母本，以黃籽油菜品系No.2127-17為父本雜交，得到F1種子，將所述的F1種子播種得到F1油菜植株，取該植株花粉進行小孢子培養，獲得雙單倍體(DH)分離群體；2)採用集團分析法構建油菜黃籽集團和黑籽集團兩個基因池；3)設計兩親本間有差異的引物對上述步驟2)構建的兩個基因池進行PCR擴增，選表現有差異的引物再對基因池間各單株的DNA樣品進行PCR擴增和電泳檢測，確定為其性狀為連鎖標記後，再對DH群體的各單株的DNA樣品進行PCR擴增和電泳檢測；4)回收、克隆、測序步驟3)篩選得到的與甘藍型油菜的黃籽基因緊密連鎖的RAPD和AFLP標記的片段；5)根據步驟4)的測序結果設計特異引物，將篩選到的與甘藍型油菜黃籽基因緊密連鎖的RAPD和AFLP標記轉化為SCAR標記；6)將步驟5)中未成功轉化的SCAR標記發展為CAPS標記；7)將步驟3)、5)和6中的RAPD標記、AFLP標記、SCAR標記和CAPS標記進行群體分析和連鎖遺傳分析；8)利用步驟7)的分子標記及輔助選擇將油菜黃籽基因導入到甘藍型油菜波裡馬細胞質雄性不育恢復系中，選育得到黃籽型油菜恢復系。
3.權利要求1所述的分子標記在油菜育種中的應用。
全文摘要
本發明屬於油菜育種技術領域，具體地說屬於利用分子標記輔助選育甘藍型黃籽油菜新品種技術領域。本發明通過選擇合適的親本進行雜交得到F1植株，通過小孢子培養得到雙單倍體(DH)分離群體，通過構建油菜黃籽集團和黑籽集團兩個基因池、設計特異引物、PCR以及回收、克隆、測序等步驟篩選得到與甘藍型油菜的黃籽基因緊密連鎖的RAPD和AFLP標記的片段；該DNA片段命名為SCS1130和SCA1兩個分子標記，它們的核苷酸序列分別如SEQ ID NO1或2所示。已將上述分子標記成功地應用於甘藍型黃籽油菜群體和連鎖遺傳分析。本發明還公開了該分子標記的製備及其用於輔助育種的方法。本發明為油菜的分子育種提供了新的實用標記基因和新的利用方法。
文檔編號A01H5/12GK1840710SQ20061001825
公開日2006年10月4日 申請日期2006年1月19日 優先權日2006年1月19日
發明者塗金星, 傅廷棟, 陳寶元, 馬朝芝, 李興華 申請人:華中農業大學