基於苝醯亞胺多臂聚合物的蛋白質生物發光成像傳感器的製作方法

2023-04-23 03:51:11 1

本發明屬於分析化學技術領域，涉及基於苝醯亞胺多臂聚合物的蛋白質生物發光成像傳感器。

背景技術：

蛋白質檢測是分析化學中的一個重要課題，其在醫藥學中的應用也已得到廣泛重視，特別是在疾病標誌物的診斷、藥物篩查、疾病的預後監測等方面具有重要意義。然而，由於目標分析物結構的多樣性和複雜性，蛋白質的檢測成為一個極具挑戰性的難題。陣列傳感器，也稱為「化學鼻/舌」，利用多個傳感單元與被分析物之間的交叉響應形成的指紋圖譜，實現對多種物質及複雜混合物的識別，具有快速簡便、選擇性高、靈敏度高、穩定性好等優點，為蛋白質的檢測提供了一個理想策略。在過去幾年中，幾種基於不同光學策略的蛋白質檢測陣列傳感器已經被開發出來，例如螢光和螢光共振能量轉移(FRET)。然而，這些系統普遍需要激發光源，不可避免地收到背景基質的幹擾且不具備發展成為可攜式設備的可能性，不利於實現傳感器的器件化。因此，開發一種具有高準確性、高靈敏度且簡單便攜的新型蛋白檢測陣列傳感器仍然是極具挑戰性的。

近幾年，生物發光共振能量轉移技術，簡稱BRET技術，備受關注，廣泛應用於蛋白質相互作用的研究。BRET是指當兩個蛋白分子相互作用時，一個蛋白融合表達的供體螢光素酶蛋白酶學反應產生的發光信號光譜與另一個蛋白標記的受體螢光基團的激發光譜相重疊，誘發受體分子發出螢光。BRET技術可克服螢光和FRET技術存在的問題，具有無需激發光，背景更低，便於實現傳感器的器件化；真實反映待測蛋白表面性質，對樣品破壞性小；避免自發螢光的幹擾；數據窗口更寬等優點，在蛋白質的檢測中有很大應用前景。常見BRET供體主要有螢火蟲螢光素酶、細菌螢光素酶和海腎螢光素酶等，受體通常選擇與供體生物發光光譜相匹配的螢光蛋白、量子點或螢光基團。

苝醯亞胺是一種具有強烈螢光的稠環芳香烴化合物，具有很好的光、熱、化學穩定性以及較高的螢光量子產率。近年來，苝醯亞胺衍生物已經開始應用在生物成像、生物標記以及基因載體等領域。所以亟需一種利用胺基酸修飾的苝醯亞胺多臂聚合物作BRET受體與蛋白質結合來鑑別蛋白的方法。

技術實現要素：

有鑑於此，本發明的目的之一在於提供一種基於苝醯亞胺多臂聚合物的蛋白質生物發光成像傳感器，本發明的目的之二提供利用蛋白質生物發光成像傳感器來檢測蛋白的方法。

為達到上述目的，本發明提供如下技術方案：

1.一種基於苝醯亞胺多臂聚合物的蛋白質生物發光成像傳感器，其特徵在於，所述蛋白質生物發光成像傳感器為BRET受體、BRET供體螢光素酶及螢光素酶底物，所述BRET受體為苝醯亞胺多臂聚合物。

進一步，所述BRET供體螢光素酶是螢火蟲螢光素酶，螢光素酶底物是D-螢光素。

進一步，所述苝醯亞胺多臂聚合物結構如通式I所示，n為10-20的整數；R獨立為其中當R為時將苝醯亞胺多臂聚合物命名為P1，其中當R為將苝醯亞胺多臂聚合物命名為P2，其中當R為時將苝醯亞胺多臂聚合物命名為P3，其中當R為時將苝醯亞胺多臂聚合物命名為P4，其中當R為時將苝醯亞胺多臂聚合物命名為P5，其中當R為時將苝醯亞胺多臂聚合物命名為P6；

進一步，所述苝醯亞胺多臂聚合物P1至P6的製備方法為如下步驟：1當量誘發劑N，N'-二(2,6-二異丙基苯基)-1,6,7,12-四[4-(2-溴異丁酸乙酯)苯氧基]苝-3,4,9,10-四羧酸二醯亞胺中加入400當量對應胺基酸修飾的單體，2000當量丁酮，1000當量甲醇和1000當量水；反應容器用冷凍解凍泵循環法脫氣3次，加入80當量五甲基二乙烯基三胺和28當量溴化亞銅；氮氣保護，18-25℃下攪拌10分鐘後，60℃聚合反應過夜後用液氮猝熄反應，溶液倒入過量乙醚中沉澱聚合物，除去乙醚液，將沉澱溶於水中並透析3天後冷凍乾燥，得苝醯亞胺多臂聚合物P1至P6，所述胺基酸修飾的單體分別為苯丙氨酸單體、絲氨酸單體、天冬氨酸單體、亮氨酸單體、組氨酸單體、或組氨酸甲酯單體。

進一步，螢光素酶的終濃度為500nM，苝醯亞胺多臂聚合物P1,P2,P3,P4,P5和P6的終濃度分別為500nM,50nM,50nM,250nM,167nM和100nM，螢光素酶底物濃度為0.04M。

2.利用基於苝醯亞胺多臂聚合物的蛋白質生物發光成像傳感器檢測蛋白的方法，所述方法包括如下步驟：

(1)構建傳感單元，所述傳感單元為BRET受體苝醯亞胺多臂聚合物和BRET供體螢光素酶，採用滴定法確定BRET受體與BRET供體螢光素酶的化學計量比例，使螢光素酶濃度一定，逐漸增大聚合物濃度，記錄BRET效率變化情況，當曲線趨於平穩不再上升時，取BRET效率最大值時BRET受體與BRET供體螢光素酶的化學計量比例構建傳感單元，按檢測所需構建傳感單元數量；不同苝醯亞胺多臂聚合物構成不同種類的傳感單元；

(2)將已知蛋白和未知蛋白都稀釋至同一水平，分別各加入到不同傳感單元中孵育20～40min，加入已知蛋白的構建為訓練集，加入未知蛋白的構建為測試集；

(3)分別在訓練集和測試集中加入終濃度為0.04M的螢光素酶底物，通過小動物生物發光成像儀檢測BRET信號變化，其檢測波長為555nm和610nm；

(4)採用統計軟體選擇分析方法對步驟(3)得到BRET信號變化數據進行分析，計算測試集未知蛋白與訓練集已知蛋白的馬氏距離的平方值，未知蛋白歸類為與已知蛋白馬氏距離的平方值最小的那種蛋白。

進一步，還包括檢測步驟(5)由稀釋水平計算得未知蛋白的初始濃度。

進一步，步驟(1)中所述BRET供體螢光素酶是螢火蟲螢光素酶，所述BRET受體苝醯亞胺多臂聚合物為P1-P6中的任意一種，所述傳感單元中螢光素酶的終濃度為500nM，所述苝醯亞胺多臂聚合物P1,P2,P3,P4,P5和P6對應的終濃度分別為500nM,50nM,50nM,250nM,167nM和100nM。

進一步，所述BRET信號變化，簡稱BR，計算方式如下：

其中，R為加入蛋白質時受體發光強度與供體發光強度的比值，R0為未加入蛋白質時受體發光強度與供體發光強度的比值。

進一步，所述傳感單元體系為pH 7.8的0.01M磷酸鈉緩衝液，所述同一水平是蛋白在280nm下的紫外吸收值均為0.005。

本發明的有益效果在於：採用胺基酸修飾的苝醯亞胺多臂聚合物模擬蛋白質，與螢火蟲螢光素酶相互作用，構建基於BRET技術的傳感器，成功區分了不同種蛋白質，正確率達到100％，在蛋白質樣品的檢測中具體高度吻合性，正確率高達95％。本技術方案方法具有以下優點：1、光源來源於生物發光，無需激發光，簡單便攜；2、以胺基酸修飾的苝醯亞胺多臂聚合物模擬蛋白質，既可以模擬蛋白質的尺寸又可以模擬蛋白質的相互作用，對蛋白樣品無破壞性，更真實反映每種蛋白的特性；3、檢測波長在610nm，可避免生物基質幹擾；4、僅需簡單加樣、拍照，再經數理統計方法分析就能得到判別結果，快速方便，成本低廉；5、在檢測未知蛋白樣品的應用中，最低檢測濃度達到110nM(細胞色素C)，正確率高達95％，說明本方法靈敏度高、特異性強、穩定性好。

附圖說明

為了使本發明的目的、技術方案和有益效果更加清楚，本發明提供如下附圖進行說明：

圖1為本發明提供的基於苝醯亞胺多臂聚合物的蛋白質生物發光成像傳感器檢測蛋白示意圖；

圖2為苝醯亞胺多臂聚合物P1合成路線圖；

圖3為苝醯亞胺多臂聚合物P1核磁表徵譜圖；

圖4為苝醯亞胺多臂聚合物P2核磁表徵譜圖；

圖5為苝醯亞胺多臂聚合物P3核磁表徵譜圖；

圖6為苝醯亞胺多臂聚合物P4核磁表徵譜圖；

圖7為苝醯亞胺多臂聚合物P5核磁表徵譜圖；

圖8為苝醯亞胺多臂聚合物P6核磁表徵譜圖；

圖9A為本發明實施例提供的螢光素酶發射光譜與聚合物激P1-P6發光譜重疊情況譜圖，圖9B為檢測波長為500-700nm波段檢測BRET信號的結果圖；

圖10為本發明實施例3提供的6種聚合物的滴定曲線圖；

圖11為本發明實施例3提供的96孔板生物發光成像結果圖；

圖12A為本發明實施例4提供的使用基於苝醯亞胺多臂聚合物的蛋白質生物發光成像傳感器檢測蛋白質的BRET響應模式圖，圖12B為本發明實施例4提供的使用基於苝醯亞胺多臂聚合物的蛋白質生物發光成像傳感器檢測蛋白質的LDA得分圖；

圖13A為本發明實施例5提供的使用基於苝醯亞胺多臂聚合物的蛋白質生物發光成像傳感器檢測未知蛋白樣品的BRET響應模式圖，圖13B為本發明實施例5提供的使用基於苝醯亞胺多臂聚合物的蛋白質生物發光成像傳感器檢測未知蛋白樣品的LDA得分圖；

圖14為實施例4加樣設計表。

具體實施方式

下面將結合附圖，對本發明的優選實施例進行詳細的描述。實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件或按照製造廠商所建議的條件。

本發明提供的基於苝醯亞胺多臂聚合物的蛋白質生物發光成像傳感器檢測蛋白示意圖如圖1所示。

實施例1：苝醯亞胺聚合單體的製備。

(1)N-丙烯醯-L-苯丙氨酸(NALP)的製備：將3.3038g苯丙氨酸(0.02mol)，0.01g 2,6-二叔丁基對甲酚，0.8g NaOH(0.02mol)和20mL蒸餾水置於100ml圓底燒瓶中，得到澄清溶液(pH12)，冰浴攪拌，向該溶液中滴加1.63ml丙烯醯氯(0.02mol)。滴加完畢後，使混合液升溫至室溫，並在室溫下攪拌1小時。然後將澄清的水溶液用濃鹽酸酸化至pH 1-2。將沉澱物過濾並重結晶，產率：62％。

(2)N-丙烯醯-L-絲氨酸(NALS),N-丙烯醯-L-天冬氨酸(NALA),N-丙烯醯-L-亮氨酸(NALL)和N-丙烯醯-L-組氨酸(NALH)的製備均使用0.02mol相應的胺基酸為原料，遵循與NALP相同的製備步驟。需要特別說明的是，NALA的製備額外多加一點NaOH來中和天冬氨酸的β羧基，使初始pH為12，產率分別為：28％，37％，38％和54％。

(3)N-丙烯醯-L-組氨酸甲酯(NALHH)的製備：氮氣保護，在冰浴下向3.3836g組氨酸甲酯鹽酸鹽(0.02mol)溶液中加入50mL新蒸二氯甲烷和12.46mL三乙胺(90mmol，4.5當量)。在1小時內滴加1.63ml丙烯醯氯(0.02mol)。滴加完畢後，將混合物升至室溫，再攪拌4小時。反應液用鹽酸酸化，並用3.5％的鹽酸洗滌。分離有機層，用飽和Na2CO3溶液洗滌三次。將分離的有機相用無水MgSO4乾燥並減壓除去溶劑，產率：37％。

實施例2：苝醯亞胺多臂聚合物P1-P6的製備。

6種苝醯亞胺多臂聚合物，即P1、P2、P3、P4、P5和P6，其製備方法如下：

P1的製備：聚合反應在嚴格乾燥的Schlenk管中進行，向其中加入引發劑4Br-PDI(10mg，5.4×10-3mmol，1當量)，NALP(508mg，2.16mmol，4×100當量)和丁酮/甲醇/水(2:1:1，總計2.0mL)。反應管經過三次冷凍-泵-解凍循環脫氣，然後加入五甲基二乙烯基三胺(77.8mg，0.45mmol，4×21當量)和CuBr(21.4mg，0.15mmol，4×7當量)。在室溫下攪拌10分鐘以確保催化劑完全形成絡合物後，氮氣保護在60℃下進行聚合。反應5小時後，用液氮猝熄反應，將反應混合物倒入過量乙醚中沉澱，沉澱溶於水中並透析3天。減壓除去溶劑，產物真空乾燥，得P1苝醯亞胺多臂聚合物，產率：63％；圖2為苝醯亞胺多臂聚合物P1合成路線圖。

P2以2.16mmolNALS為原料，其它試劑和步驟同P1。

P3以2.16mmolNALA為原料，其它試劑和步驟同P1。

P4以2.16mmolNALL為原料，其它試劑和步驟同P1。

P5以2.16mmolNALH為原料，其它試劑和步驟同P1。

P6以2.16mmolNALHH為原料，其它試劑和步驟同P1。

P1-P6結構如通式I所示，分別對應R為不同胺基酸取代基的苝醯亞胺多臂聚合物，n為10-20的整數，各聚合物的基本結構和物理性質見表一所示。

表一聚合物基本結構和物理性質

本發明實施例提供的聚合物P1的核磁表徵譜圖見附圖3，聚合物P2的核磁表徵譜圖見附圖4，聚合物P3的核磁表徵譜圖見附圖5，聚合物P4的核磁表徵譜圖見附圖6，聚合物P5的核磁表徵譜圖見附圖7，聚合物P6的核磁表徵譜圖見附圖8。

實施例3：基於苝醯亞胺多臂聚合物的蛋白質生物發光成像傳感器

螢光素酶發射光譜與聚合物P1-P6激發光譜重疊情況譜圖見附圖9A，檢測波長為500-700nm波段檢測BRET信號的結果圖如圖9B所示。

構建傳感單元，所述傳感單元為BRET受體苝醯亞胺多臂聚合物和BRET供體螢光素酶，採用滴定法確定BRET受體苝醯亞胺多臂聚合物與供體螢光素酶的化學計量比例，使螢光素酶濃度一定，逐漸增大聚合物濃度，記錄BRET效率變化情況，當曲線趨於平穩不再上升時，該點的BRET效率即為最大BRET效率，取BRET效率最大值時BRET受體與BRET供體螢光素酶的化學計量比例構建傳感單元，按檢測所需構建傳感單元數量。

96孔板中，每孔加2mM螢火蟲螢光素酶50μL，再分別加入不同濃度梯度的苝醯亞胺多臂聚合物P1-P6，孵育15min，加入0.2M螢光素酶底物D-螢光素50μL，1分鐘後，用酶標儀檢測555nm處的生物發光信號，記錄聚合物和螢火蟲螢光素酶不同濃度比下的BRET效率，其結果如表二所示。

表二苝醯亞胺多臂聚合物P1-P6和螢火蟲螢光素酶滴定數據

6種聚合物的滴定曲線見附圖10，根據表二結果得出P1-P6聚合物最大BRET效率及化學計量比，如表三所示：

表三聚合物最大BRET效率及化學計量比

最後根據實驗所用螢光分光光度計的靈敏度確定每孔螢光素酶終濃度為500nM，再分別加入苝醯亞胺多臂聚合物P1-P6中的一個為一種傳感單元，取1-6種聚合物對應的傳感單元為一組，依據上述化學計量比，P1,P2,P3,P4,P5和P6的終濃度分別為500nM,50nM,50nM,250nM,167nM和100nM，所用緩衝液為pH為7.8(螢光素酶最適pH)的0.01M磷酸鈉緩衝液，共同孵育15min，每組傳感單元加入同一待測蛋白孵育30min，後再加入終濃度為0.04M的螢光素酶底物D-螢光素。每種蛋白對不同1-6種傳感單元的響應信號共同組成了其獨特的響應模式，類似於指紋圖譜，用以進行鑑別。

實施例4：訓練集的建立

待測蛋白通過氫鍵、疏水、π–π堆疊和靜電作用等非共價作用競爭性地與受體結合，將供體螢光素酶置換下來，從而導致BRET信號發生變化。再通過小動物生物發光成像儀檢測BRET信號變化(BR)，採用統計軟體選擇合適的分析方法對數據進行分析。

基於苝醯亞胺多臂聚合物的蛋白質生物發光成像傳感器檢測已知蛋白樣品，本實施例選用表四中所示10種蛋白進行實驗，實驗蛋白終濃度均為500nM，但不應將此理解為本發明應用範圍僅限於以下的實例：

表四本實施例檢測蛋白品種及蛋白基本性質

基於苝醯亞胺多臂聚合物的蛋白質生物發光成像傳感器檢測已知蛋白樣品，步驟如下：

(1)向96孔板中加入2000nM的螢光素酶50μL，再分別按圖14所示加樣設計表各孔加入2000nM的聚合物P1，200nM的P2、200nM的P3、1000nM的P4、668nM的P5或400nM的P6，各50μL，孵育15min；實際加樣可以根據實驗自行設計加樣順序，取1-6種聚合物都可以組合為一組傳感單元，再根據所得數據進行線性判別分析；

(2)向上述孔內加入各種對應的1000nM待測蛋白溶液100μL，共同孵育30min，此時孔內螢光素酶的終濃度為500nM，P1,P2,P3,P4,P5和P6的終濃度分別為500nM，50nM,50nM,250nM,167nM和100nM，待測蛋白終濃度為500nM；

(3)加入0.2M螢光素酶底物D-螢光素50μL，1分鐘後，用小動物活體光學成像儀進行96孔板成像，拍攝波長為555nm和610nm，所得結果見附圖11；

(4)用Living Image軟體對成像圖進行分析，得到每個孔的平均輻射強度用於計算BR，BR計算方法為：

其中，R為加入蛋白質時受體在610nm平均輻射發光強度與供體在555nm平均輻射發光強度的比值，R0為未加入蛋白質時受體在610nm平均輻射發光強度與供體在555nm平均輻射發光強度的比值。進行6次平行實驗，得到10種蛋白的響應模式，如附圖12A所示；

(5)表五為本實施例中10種蛋白質的BRET響應模式及LDA判別得分，對上述數據進行線性判別分析，得到附圖12B所示判別得分圖，成功鑑別了10種蛋白質。

表五本實施例中10種蛋白質的BRET響應模式及LDA判別得分

實施例5：測試集的建立和計算

基於苝醯亞胺多臂聚合物的蛋白質生物發光成像傳感器檢測未知蛋白樣品，本實施例選用表四中所示10種蛋白進行實驗，但不應理解為本發明應用範圍僅限於此。

基於苝醯亞胺多臂聚合物的蛋白質生物發光成像傳感器檢測未知蛋白樣品，步驟如下：

(1)將已知蛋白標準品稀釋至同一水平，使其在280nm下的紫外吸收值均為0.005，按實施例4所述使用基於苝醯亞胺多臂聚合物的蛋白質生物發光成像傳感器檢測已知蛋白質的方法構建訓練集；

(2)隨機配製表四所示的10種蛋白不同濃度的80個蛋白樣品，作為未知蛋白樣品進行盲實驗；

(3)將上述80個未知蛋白樣品稀釋至同一水平，使其在280nm下的紫外吸收值均為0.005，按實施例4所述使用基於苝醯亞胺多臂聚合物的蛋白質生物發光成像傳感器檢測已知蛋白質的方法得到測試集，計算測試集與本實施例訓練集中每種已知蛋白的馬氏距離的平方，待測樣本將歸類為馬氏距離的平方值最小的那類蛋白；

(4)由稀釋水平結合郎伯比爾定律，通過簡單計算反推出未知蛋白質的初始濃度，80個未知樣品中有76個得到正確鑑別，正確率達95％，濃度偏差均在±10％以內，其檢測數據如表六所示。

計算方法：C＝nA/εl

n為蛋白溶液稀釋倍數，ε為該蛋白的摩爾吸光係數，A為紫外280吸光度(此處取0.005)，l為吸收層厚度(通常為1cm)。

圖13A為本實施例提供的使用基於苝醯亞胺多臂聚合物的蛋白質生物發光成像傳感器檢測未知蛋白樣品的BRET響應模式圖，圖13B為本實施例提供的使用基於苝醯亞胺多臂聚合物的蛋白質生物發光成像傳感器檢測未知蛋白樣品的LDA得分圖；

表六80個樣品參數及測試數據

最後說明的是，以上優選實施例僅用以說明本發明的技術方案而非限制，儘管通過上述優選實施例已經對本發明進行了詳細的描述，但本領域技術人員應當理解，可以在形式上和細節上對其作出各種各樣的改變，而不偏離本發明權利要求書所限定的範圍。