實時定量pcr體外檢測單鹼基損傷修複試劑盒的製作方法
2023-04-22 23:25:21 2
專利名稱：實時定量pcr體外檢測單鹼基損傷修複試劑盒的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種DNA單鹼基損傷修復檢測技術，具體地說是一種實時定量PCR體外檢測單鹼基損傷修復技術。
背景技術：
由活性氧，烷基化及電離輻射誘導哺乳動物細胞DNA損傷的修復通常通過單鹼基切除修復(base excision r印air，BER)途徑，因此BER在維持基因組完整性方面發揮重要作用。體外研究細胞BER的能力對於我們了解衰老，腫瘤及退行性疾病等機制具有非常重要的意義。BER包括DNA單鏈斷裂的修復(SSBR)過程，鹼基丟失後AP位點切除，置換損傷核苷酸並再連接。DNA BER不同階段的修復酶如APEl，OGGl，UNG，DNA聚合酶和連接酶的活性應當能夠被準確的檢測到。之前大多數BER體外研究都運用32P放射性同位素標記寡核苷酸做底物，但此方法只能給出半定量結果，而且放射標記方法限制了其在禁止放射性同位素的一般實驗室研究 (以免造成環境汙染及人體傷害)。這裡，我們開發了一個全新的有關BER體外檢測的實時定量PCR(qPCR)技術，並已經開發出相應的試劑盒。它完全可以量化檢測BER所需酶的活性。SSBR試驗，DNA連接酶和糖苷酶活力實驗證實，在此檢測BER模型，qPCR結果的確與其酶活力有很好的線性相關性。這些研究結果確立了 qPCR作為體外BER檢測技術的可行性，並且具備比現行其它BER 檢測技術更多的優點。
發明內容
本發明目的在於提供一種全新可定量的以PCR為基礎的單鹼基損傷修復檢測試劑盒。本發明的另一目的在於提供上述定量PCR體外檢測單鹼基損傷修復的引物。本發明的再一目的在於提供上述定量PCR體外檢測單鹼基損傷修復的探針。本發明的發明思路基於下述兩方面的考慮。第一，在生命進程中，DNA損傷尤其是DNA氧化損傷與腫瘤發生，人體衰老和各種疾病的發展密切相關。因此，研究DNA的鹼基損傷及修復能力的變化具有重要的意義，是當今科學研究的重點；第二，至今為止，體外研究DNA損傷修復能力的方法仍以含有特定損傷鹼基的同位素標記的寡核苷酸為主，然而此方法只能給出半定量結果，而且放射標記方法限制了其在禁止放射性同位素的一般實驗室研究(以免造成環境汙染及人體傷害)。開發一種新的非同位素的體外分析單鹼基損傷修復能力的方法變得非常重要。為實現這一目標，我們利用兩年時間建立起了以實時定量PCR (qPCR)為基礎的檢測DNA單鹼基損傷修復的技術。它的主要技術特點是以內參為基礎的絕對定量和獨特的引物設計，可實現DNA損傷修復的超敏定量。本發明提供了四種用以實時定量PCR檢測含損傷鹼基的DNA寡核苷酸模板。它可檢測的損傷鹼基包括DNA單鏈斷裂損傷、DNA單鹼基缺失損傷和尿嘧啶-DNA糖基化酶活性。
為了達成本發明上述目的，本發明採用如下具體技術方案
一種實時定量PCR體外檢測單鹼基損傷修複試劑盒，所述試劑盒的組成如下 標準品
IOX檢測緩衝液
5X低鹽細胞裂解液
2X細胞核蛋白或線粒體蛋白提取液
20X檢測底物
2X qPCR損傷修復緩衝液
所述qPCR損傷修復緩衝液包括taq酶、dNTP探針和引物。所述檢測底物為DNA單鏈斷裂損傷修復能力檢測底物，該底物包括模板A和模板 D ；所述模板A包括SEQ ID No. 1、SEQ ID No. 2及SEQ ID No. 5 ；所述模板D包括SEQ ID No. 6 及 SEQ ID No. 7。 所述檢測底物為單鹼基缺失損傷修復能力檢測底物，該底物包括模板B和模板D ； 所述模板 B 包括 SEQ ID No. 3,SEQ ID No. 2 及 SEQ ID No. 5 ；所述模板 D 包括 SEQ ID No. 6 及 SEQ ID No. 7。所述檢測底物為尿嘧啶-DNA糖基化酶活性檢測檢測底物，該底物包括模板C和模板D，所述模板C包括SEQ ID No. 4及SEQ ID No. 5 ；所述模板D包括SEQ ID No. 6及SEQ ID No. 7。所述引物為SEQ ID No. 8 Forward-S CGGGGCTCTCCAGAACATC SEQ ID No. 9 Reverse-AS ATGACCTTGCCCACAGCCT
所述探針為 SEQ ID No. 10 Probe 1 FAM-CAATTCCCGGACGTCTAAACCAAACCACTTTC-TAMRA SEQ ID No. 11 Probe 2 !"et-CCGGGACCTGACTGACTACCTCATGA-FAMRA。一種實時定量PCR體外檢測單鹼基損傷修復用引物，所述引物序列為SEQ ID No. 8 及 SEQ ID No. 9 所示。一種實時定量PCR體外檢測單鹼基損傷修復用探針，所述探針序列為SEQ ID No. 10 及 SEQ ID No. 11 所示。一種實時定量PCR體外檢測單鹼基損傷修復用檢測底物，所述底物包括序列表 SEQ ID No. 1 至 SEQ ID No. 4 中的至少一個寡核苷酸，及 SEQ ID No. 5、SEQ ID No. 6 和 SEQ ID No. 7。所述檢測底物為SEQ ID No. 1、2、5 或 SEQ ID No. 3、2、5 或 SEQ ID No. 4、5，及 SEQ ID NO. 6、7。本發明為標準品，根據底物的不同可以製備成DNA單鏈斷裂損傷修復能力檢測試劑盒、單鹼基缺失損傷修復能力檢測試劑盒及尿嘧啶-DNA糖基化酶活性檢測檢測試劑盒。 本發明主要用於科學實驗研究。本發明的有益效果
本發明所述體外損傷修復模板如圖1 A、B、C、D所示。從圖1可以看出，本發明的四大特點決定了該技術的優勢及實用性
第一由於擴增內參和損傷鹼基qPCR模板的引物相同，因此可由內參的量算出損傷鹼基修復的量。
第二 由於互補模板僅有14個鹼基與引物2互補，因此在qPCR過程中不能與引物 2產生退火，保證了損傷修復檢測的特異性。第三互補模板的3 『_末端為雙脫氧寡核苷酸，防止了自身的延伸。第四檢測損傷模板的探針和檢測內參模板的探針標有不同的螢光基團，因此可在同一個qPCR體系中檢測來實現損傷模板修復的絕對定量。
圖1為qPCR單鹼基損傷修復檢測模式圖。圖2為qPCR檢測單鹼基損傷修復連接酶和聚合酶活性的分析結果。圖3為qPCR檢測單鹼基損傷修復敏感性和特異性分析結果。圖4為qPCR檢測單鹼基損傷修復尿嘧啶糖苷酶活性的特異性和敏感性分析結^ ο圖5為qPCR檢測細胞核提取蛋白的單鹼基損傷修復連接酶的活性。圖6為利用細胞蛋白提取物對傳統同位素法與qPCR法所得DNA單鏈斷裂修復結果進行比較分析。圖7為利用細胞蛋白提取物對傳統同位素法與qPCR法所得尿嘧啶單鹼基損傷復活結果進行比較分析。
具體實施例方式本發明實時定量PCR體外檢測單鹼基損傷修複試劑盒的具體實驗方法步驟為 實施例1
第一模板退火
分別取200 pmol SEQ ID No. 1至SEQ ID No. 7所示的寡核苷酸(Primerl-7)，依據表1組合併分別加入到四個EP管中。表1為模板A、B、C、D。模板A由I^rimerl (SEQ ID No. l)、Primer2 (SEQ ID No. 2)及 Primer5 (SEQ ID No. 5)組成；模板 B 由 Primer3 (SEQ ID No. 3)、Primer2 (SEQ ID No. 2)及 Primer5 (SEQ ID No. 5)組成；模板 C 由 Primer4 (SEQ ID No. 4)及 Primer5 (SEQ ID No. 5)組成；模板 D 由 Primer6 (SEQ ID No. 6)及 Primer7 (SEQ ID No. 7)組成。在四個EP管中加入20ul IOx退火緩衝液(250mM NaCl ；20 mM Tris-Cl,pH=8. 0 ;10mM EDTA)，用水補到200ul後72°C退火10分鐘，然後逐漸降到室溫。 儲存_20°C備用。表1模板A、B、C、D組合
權利要求
1.一種實時定量PCR體外檢測單鹼基損傷修複試劑盒，其特徵在於，所述試劑盒的組成如下標準品IOX檢測緩衝液5X低鹽細胞裂解液2X細胞核蛋白或線粒體蛋白提取液20X檢測底物2X qPCR損傷修復緩衝液所述qPCR損傷修復緩衝液包括taq酶、dNTP探針和引物。
2.根據權利要求1所述的試劑盒，其特徵在於，所述檢測底物為DNA單鏈斷裂損傷修復能力檢測底物，該底物包括模板A和模板D ；所述模板A包括SEQ ID No. 1、SEQ ID No. 2 及 SEQ ID No. 5 ；所述模板 D 包括 SEQ ID No. 6 及 SEQ ID No. 7。
3.根據權利要求1所述的試劑盒，其特徵在於，所述檢測底物為單鹼基缺失損傷修復能力檢測底物，該底物包括模板B和模板D ；所述模板B包括SEQ ID No. 3,SEQ ID No. 2及 SEQ ID No. 5 ；所述模板 D 包括 SEQ ID No. 6 及 SEQ ID No. 7。
4.根據權利要求1所述的試劑盒，其特徵在於，所述檢測底物為尿嘧啶-DNA糖基化酶活性檢測檢測底物，該底物包括模板C和模板D，所述模板C包括SEQ ID No. 4及SEQ ID No. 5 ；所述模板 D 包括 SEQ ID No. 6 及 SEQ ID No. 7。
5.根據權利要求1至4中任意一項所述的試劑盒，其特徵在於，所述引物為SEQID No. 8 及 SEQ ID No. 9 所示。
6.根據權利要求5所述的試劑盒，其特徵在於，所述探針為SEQID No. 10及SEQ ID No. 11所示。
7.一種實時定量PCR體外檢測單鹼基損傷修復用引物，其特徵在於，所述引物序列為 SEQ ID No. 8 及 SEQ ID No. 9 所示。
8.一種實時定量PCR體外檢測單鹼基損傷修復用探針，其特徵在於，所述探針序列為 SEQ ID No. 10 及 SEQ ID No. 11 所示。
9.一種實時定量PCR體外檢測單鹼基損傷修復用檢測底物，其特徵在於，所述底物包括序列表SEQ ID No. 1至SEQ ID No. 4中的至少一個寡核苷酸，及SEQ ID No. 5、SEQ ID No. 6 和 SEQ ID No. 7。
10.根據權利要求9所述的檢測底物，其特徵在於，所述檢測底物為SEQID No. 1,2,5 或 SEQ ID No. 3、2、5 或 SEQ ID No. 4、5，及 SEQ ID NO. 6、7。
全文摘要
一種實時定量PCR體外檢測單鹼基損傷修複試劑盒，所述試劑盒的組成如下10X檢測緩衝液、5X低鹽細胞裂解液、2X細胞核蛋白或線粒體蛋白提取液、20X檢測底物、2XqPCR損傷修復緩衝液，所述修復緩衝液包括taq酶、dNTP、探針和引物。本發明由於擴增內參和損傷鹼基qPCR模板的引物相同，因此可由內參的量算出損傷鹼基修復的量。由於互補模板僅有14個鹼基與引物2互補，因此在qPCR過程中不能與引物2產生退火，保證了損傷修復檢測的特異性。互補模板的3′末端為雙脫氧寡核苷酸，防止了自身的延伸。檢測損傷模板的探針和檢測內參模板的探針標有不同的螢光基團，因此可在同一個qPCR體系中檢測來實現損傷模板修復的絕對定量。
文檔編號C12Q1/68GK102181528SQ201110064338
公開日2011年9月14日 申請日期2011年3月17日 優先權日2010年6月9日
發明者孫玉, 張洪海, 張玉林, 李寧, 石英, 金榮華, 陳德喜, 魏飛力 申請人:首都醫科大學附屬北京佑安醫院