鴨A肝病毒3型vp1蛋白和ltb的融合蛋白抗原及其應用的製作方法

2023-05-24 14:45:26 2

鴨A肝病毒3型vp1蛋白和ltb的融合蛋白抗原及其應用的製作方法
【專利摘要】本發明提供一種鴨A肝病毒VP1蛋白和LTB的融合蛋白LTB-VP1，其編碼蛋白的胺基酸序列為SEQ ID NO:1；上述的蛋白用於製備基因工程重組亞單位疫苗。本發明利用pET30a(+)表達性載體構建了能表達鴨A肝病毒結構蛋白VP1的大腸桿菌BL21(DE3)宿主菌。經SDS-PAGE分析，表達出了30kD重組目的蛋白。將重組蛋白純化後製備成基因工程亞單位疫苗，免疫4月齡麻鴨(產蛋種)，免疫後可以使孵化的雛鴨獲得免疫保護。
【專利說明】鴨A肝病毒3型VP1蛋白和LTB的融合蛋白抗原及其應用

【技術領域】
[0001] 本發明屬於生物【技術領域】，具體涉及一種鴨A肝病毒VP1蛋白和LTB的融合蛋白 及其應用。

【背景技術】
[0002] 我國是世界養鴨大國，鴨肉年生產總量約佔世界總量的70%，自2000年的186. 6 萬噸增長到2008年的258. 1萬噸，年均增長率約3. 8%，大大高於世界平均水平。20世紀 W來，鴨病毒性肝炎已經成為危害中國養鴨業最為嚴重的疫病之一，其主要感染1-3周齡 的維鴨，死亡率高達90% W上。該病的發生與流行對我國養鴨業的發展造成嚴重威脅。
[0003] 鴨A肝病毒是造成鴨病毒性肝炎的主要病毒，主要分為H個血清型DHAV-1、 DHAV-2和DHAV-3。其中DHAV-1最早是在1950年從美國分離得到的，是經典毒株，目前分 布於世界各地，也是中國目前流行的主要毒株。DHAV-2是分離自臺灣的新型毒株，主要在臺 灣地區流行。DHAV-3為最早分離自韓國的新型毒株，近年來我國DHAV-3導致的鴨病毒性肝 炎頻繁爆發，且在一些地區與DHAV-1的共流行，而使用現有DHAV-1型的疫苗株或者卵黃抗 體均起不到有效的保護作用。因此開發DHAV-3的新型疫苗株對養鴨業的健康發展無疑具 有重要意義。


【發明內容】

[0004] 本發明的目的是提供一種鴨A肝病毒VP1蛋白和LTB的融合蛋白，即通過篩選鴨 A肝病毒3型結構蛋白VP1獲得含優勢抗原表位的截短的VP1蛋白，並通過Lingker (GGG巧 與腸毒素LTB組成新型融合蛋白LTB-VP1，並W該融合蛋白作為抗原來製備鴨A肝病毒基 因工程亞單位疫苗。
[0005] 本發明首先提供一種鴨A肝病毒VP1蛋白和LTB的融合蛋白LTB-VP1，其編碼蛋白 的胺基酸序列為SEQ ID N0:1 ;
[0006] 上述蛋白的一種核巧酸序列為SEQ ID NO:2 ;
[0007] 本發明還提供一種鴨A肝病毒基因工程重組亞單位疫苗，其中的抗原為上述的截 短的鴨A肝病毒VP1蛋白和LTB的融合蛋白LTB-VP1，其濃度為0. 1-lmg/ml之間；
[0008] 本發明的鴨A肝病毒基因工程亞單位疫苗，其製備步驟如下：
[0009] 1)將新型融合蛋白LTB-VP1基因插入表達載體中，構建成表達重組質粒；
[0010] 2)將構建的表達重組質粒轉化宿主菌，構建了能表達LTB-VP1的重組基因工程 菌；用該重組基因工程菌表達出新型融合蛋白LTB-VP1 ;
[0011] 3)對重組表達的LTB-VP1蛋白進行純化後，加入白油佐劑製成疫苗。
[0012] 本發明利用祀T30a(+)表達性載體構建了能表達鴨A肝病毒結構蛋白VP1的大腸 桿菌化21 〇)E3)宿主菌。經SDS-PAGE分析，表達出了 30kD重組目的蛋白。將重組蛋白純 化後製備成基因工程亞單位疫苗，免疫4月齡麻鴨（產蛋種），免疫後可W使賠化的維鴨獲 得免疫保護。

【具體實施方式】
[0013] 申請人:在獲得一個具有免疫特性的鴨A肝病毒VP1蛋白和LTB的融合蛋白 LTB-VP1，並進一步通過大腸桿菌稀有密碼子優化獲得其基因，然後通過祀T30a(+)原核表 達載體構建出能表達蛋白LTB-VP1的大腸桿菌化21 〇)E3)重組基因工程菌，通過對工程菌 的誘導、超聲破碎、蛋白純化、定量、與佐劑配比等製備和生產方法製備出了鴨A肝病毒基 因工程重組亞單位疫苗。
[0014] 下面結合【具體實施方式】來進一步描述本發明，但本領域技術人員應該理解的是， 在不偏離本發明的技術方案的情況下可W對本發明的技術方案的細節和形式進行修改或 替換，該些修改和替換均落入本發明保護範圍內。
[0015] 實施例1截短的鴨A肝病毒VP1蛋白和LTB的融合蛋白的獲得
[0016] 1、利用生物軟體DNAStar對DHAV-3代表毒株（GenBank登錄號；EU289393. 1) 的VP1蛋白進行抗原表位分析，嘗試了抗原表位隨機拼接、抗原表位連接整合等多種技 術手段，最終選定VP1蛋白抗原性較強部分巧〇-225aa)與LTB序列進行拼接，中間設 計LingkeHGGG巧進行連接，獲得一種截短的鴨A肝病毒VP1蛋白和LTB的融合蛋白 LTB-VP1，其編碼蛋白的胺基酸序列為SEQ ID N0:1，並利用在線生物軟體DNAWorks進行大 腸桿菌稀有密碼子優化，獲得融合蛋白LTB-VP1的核巧酸序列SEQ ID N0:2。
[0017] 將新獲得的融合蛋白LTB-VPl的核巧酸序列進行全基因合成，同時兩端分別加上 BamH I和Hind III酶切位點。
[0018] 實施例2基因工程蛋白表達載體的構建與工程菌的獲得
[0019] 1、上述全基因合成的融合蛋白LTB-VP1基因用BamH I和化nd III雙酶切後連入 祀T30a載體相應的酶切位點，構建祀T30a/VPl表達載體。
[0020] 2、用CaCl2法將祀T30a/VP 1表達載體轉化入大腸桿菌化21 0E3)，塗布於含 50 y g/ml卡那黴素的瓊脂平板，37C過夜培養。選取10個單菌落提取質粒，BamH I和化nd III雙酶切驗證陽性的菌落進一步測序鑑定。將測序驗證後的陽性克隆在LB培養基中發酵 培養至0. 6?0. 8時加入0. 3mMIPTG誘導4?5小時，離也收集菌體跑SDS-PAGE電泳，同 時設立未誘導菌體作為對照。結果誘導後陽性克隆比對照菌在30kD處多出一條蛋白條帶， 與重組蛋白理論分子量一致，表達量約為30% W上。經DHAV-3抗體免疫印跡檢定，顯示陽 性反應。證明獲得的陽性克隆為高效表達基因工程蛋白的工程菌，命名為ZH株。
[0021] 實施例3發酵、純化與鴨A肝病毒基因工程亞單位疫苗的製備
[0022] 1、發酵工藝
[0023] 1)LB培養基作為種子培養基，含5g/L葡萄糖和5g/L M拆〇4 ? 7&0的LB培養基 作為發酵培養基，補料為葡萄糖400g/L、蛋白腺24g/L、酵母提取物lOg/L、化C1 5g/L、 M拆〇4 ? 7&0 5g/L。
[0024] 。發酵過程
[00巧]挑取鑑定過的工程菌接種於含卡那黴素的濃度為50y g/ml的LB培養基，37C振 蕩培養8小時，作為種子液。將種子液按2%接種量接種於發酵罐中，調節好各參數，37C， 200轉，溶氧控制在20% W上。發酵4小時後開始流加補料，發酵6小時後加入0. 3mmol/L IPTG進行誘導表達，表達後6小時發酵結束。
[002引如媒柱純化、脫鹽
[0027] 4)親和層析
[0028] 採用媒離子金屬馨合層析柱，重組蛋白可W用含400mmol/L咪哇的洗脫液洗下 來，純度達到91 % W上
[002引 W脫鹽
[0030] 收集的重組蛋白洗脫液放入透析袋，PBS液作為透析外液，透析脫鹽後用甲酵滅活 後測蛋白濃度，用PBS液稀釋至0. 5mg/ml，0. 22 y m過濾除菌，即得重組蛋白液。
[0031] 2、鴨A肝病毒基因工程亞單位疫苗的製備
[0032] 將製備的重組蛋白96份與滅菌的4份吐溫-80充分攬拌混合作為水相。同時注 射用白油94份，加6份的司本80、硬脂酸鉛2份，混合均勻，高壓滅菌後作為油相。按水相 和油相1:3比例混合乳化即可製備鴨A肝病毒基因工程亞單位疫苗。將製備的疫苗按獸用 生物製品規程的檢驗方法進行性狀、無菌檢驗、安全檢驗，檢測結果表明疫苗各項指標均合 格。
[003引具體操作如下：
[0034] 1菌毒種
[00巧]1. 1製造用菌種為鴨A肝病毒基因工程亞單位疫苗生產菌株ZH株；檢測用的強毒 株為DHAV-3強毒株VF-3。
[0036] 1. 2生產用菌種標準
[0037] 1. 2. 1形態和生化特性
[0038] 含有卡那黴素的LB瓊脂平板上過夜培養，在培養板上呈現圓形、邊緣整齊、突起、 乳白色有光澤的光滑菌落，革蘭氏染色後，鏡下顯示為革蘭氏陰性短桿菌；生化試驗結果均 為葡萄糖發酵+，剛巧試驗+，甲基紅試驗+，VP-，構稼酸利用試驗-。
[0039] 1.2. 2培養特性可在含有卡那黴素的培養基中生長。
[0040] 1. 2. 3鑑別檢驗
[0041] 1. 2. 3. 1PCR檢測將本菌的LB液體培養物3 y 1做模板，用W下PCR引物進行PCR 擴增，應能擴增出380bp左右的片段。
[0042] Pl:5' -ACAACGGCACCACCCCTT-3'
[0043] P2;5' -CGGCAGATTTCGCACAGA-3'
[0044] 擴增的條件如下；94°C 5min 變性，94°C 30S，6(TC 30S，72°C lmin，30 個循環，72°C 延伸lOmin。
[0045] 1. 2. 3. 2Western-blot檢測將LB固體培養平板上的重組菌單菌落接種於5ml含 有卡那黴素的LB液體培養基中，培養至ODe。。值在0. 6?1. 0之間時加入0. 8mM的IPTG誘 導，持續培養4小時，收集菌體，用PBS重息後高壓勻質破碎，80(K)r/min離也去沉澱，上清液 與抗鴨A肝病毒3型陽性血清進行Western-blot試驗，應出現特異性條帶。
[0046] 1.2. 4純粹用適宜培養基檢查，應純粹。
[0047] 1. 2. 6基礎種子代次F4?F10代。
[0048] 1. 2. 7保存凍幹菌種，-2(TC，保存期為2年。
[0049] 2疫苗製造及半成品檢驗
[0050] 2. 1生產用種子製備
[0051] 2. 1. 1 -級種子繁殖和鑑定將凍幹菌種分別接種於含卡那黴素的LB液體培養基 中，37C振蕩培養8?10小時，然後劃線接種於含卡那黴素的LB固體培養基上37C培養 16?18小時，作為一級種子。在2?8C保存，不超過14天；在培養基上傳代，應不超過2 代。
[0052] 2. 1. 2二級種子繁殖在一級種子中選取符合1. 2. 1項標準的典型菌落10個混合 於少量LB培養液中，接種於含卡那黴素的LB培養液中，37C培養8?10小時，進行純粹檢 驗，應純粹。置2?8C保存，應不超過3天。
[0053] 2.2制苗用培養基為改良LB培養基，每1000ml培養基中含膜蛋白腺lOg，酵母浸 粉5g，氯化軸lOg，葡萄糖5g，M拆〇4 ? 7&0 5g。
[0054] 2. 3巧瞄用抗原液製備
[00巧]2. 3. 1菌液培養用培養罐通氣培養，按培養罐容積裝入適量培養基（70%左右） 及消泡劑，滅菌後按培養基量的2%接種二級種子菌液，37C通氣培養，待菌液的0化。。值達 到7. 0時，加入8g/L的a -乳糖誘導，再繼續培養6?8小時。使用20%化0H調節抑在 7. 0,通過轉速關聯控制溶氧在20% W上。當溶氧迅速上升時，流加補料。
[0056] 2. 3. 2破菌培養結束後，離也收集菌體。收集的菌體用PBS清洗2次，將收集的菌 體用PBS製成10%的息液，在4°C下用高壓勻漿機破碎細菌。破碎後的菌液，80(K)r/min，離 也15分鐘，收集上清液。
[0057] 2. 3. 3媒柱層析純化收集的重組蛋白洗脫液放入透析袋，PBS液作為透析外液， 透析脫鹽後即得重組蛋白液。
[0058] 2. 3. 4滅活將純化的上清液中按比例加入10%的甲酵溶液，甲酵溶液的最終濃 度為0.2%，37°C滅活12小時，W滅活殘存的大腸桿菌。取少量樣品進行半成品檢驗。2? 8°C保存，不超過7天；-15°C W下保存，不超過60天。
[005引 2. 4半成品檢驗
[0060] 2. 4. 1VP1含量檢測用BCA法檢測上清液蛋白濃度，稀釋至終濃度0. 5mg/ml，無菌 過濾，待用。
[0061] 2. 4. 2無菌檢驗按現行《中國獸藥典》進行檢驗，應無菌生長。
[0062] 2.4.3內毒素含量檢測按當試劑方法進行內毒素檢測，內毒素含量不高於 1000抓/ml者方可用於制苗。
[0063] 2. 5疫苗製備
[0064] 2.5.1油相製備取優質注射用白油94份，硬脂酸鉛2份。在油相罐中混合均勻， 加熱融化至半透明狀，再加司本-80 6份，至溫度達到125?13CTC時維持30分鐘，冷卻至 室溫備用。
[0065] 2. 5. 2水相製備取滅菌的吐溫-804份，加檢驗合格的半成品96份，充分攬拌至吐 溫-80完全溶解。
[0066] 2. 5. 3乳化取油相3份置於高速剪切機內，開動電機低速攬拌，同時緩緩加入水相 1份，再W 3600r/min乳化40分鐘，在終止攬拌前加入1 %硫柳隸溶液，終濃度達到0. 01 %。 乳化後，取樣10ml加入離也管，W 3000r/min離也15分鐘，管底析出水相應不超過0. 5ml。
[0067] 2. 5. 4分裝定量分裝，密封瓶口。
[006引 3成品檢驗
[006引 3. 1物理性狀
[0070] 外觀為乳白色乳劑。
[0071] 劑型為油包水型。取一清潔吸管，吸取少量疫苗滴於冷水中，除第1滴外，均應不 擴散。
[0072] 穩定性吸取疫苗10ml加入離也管中，經3000r/min離也15分鐘，管底析出的水 相應不超過0. 5ml。
[0073] 黏度按現行《中國獸藥典》進行，符合規定。
[0074] 裝量檢查按現行《中國獸藥典》進行，符合規定。
[00巧]3. 2無菌檢驗按現行《中國獸藥典》進行，無菌生長。
[0076] 3. 3安全檢驗取1日齡維鴨10隻，肌肉或頸部皮下注射疫苗0. 5ml/只，觀察14 天，不出現由疫苗引起的局部和全身不良反應。
[0077] 3. 4效力檢驗下列方法任擇其一。
[0078] 3.4. 1抗體檢測將4月齡麻鴨（產蛋種）10隻平均分為兩組，第一組為免疫組，用 製備的鴨A肝病毒基因工程亞單位疫苗進行二次免疫（第一次免疫21天後進行第二次免 疫，每次每隻0. 5ml，皮下注射），第二次免疫14天後測對DHAV-3的血清中和抗體效價。第 二組為對照組，注射同等體積的無菌生理鹽水。免疫組的血清中和抗體效價均應> 1:152， 而對照組中和抗體效價均應《1:4。
[0079] 3. 4. 2攻毒保護將4月齡麻鴨（產蛋種）10隻平均分為二組，每組5隻。第一組 為免疫組，用本發明製備的鴨A肝病毒基因工程亞單位疫苗進行二次免疫（第一次免疫21 天后進行第二次免疫，每次每隻0. 5ml，皮下注射），第二組為生理鹽水對照組，注射同等體 積的無菌生理鹽水。第二次免疫後21-28天收集各組鴨所產的鴨蛋進行賠化，分別與維鴨 出殼後的14天各隨機取10隻，用DHAV-3強毒株VF-3(100LDg。）注射攻毒，攻毒14天後統 計攻毒保護率（未死亡的只數佔總只數的百分率）。免疫組應至少保護8隻，對照組全部死 亡。
[0080] 3. 5甲酵、隸類防腐劑殘留量測定按現行《中國獸藥典》進行，均符合規定。
[0081] 實施例4鴨A肝病毒基因工程亞單位疫苗免疫後的抗體效價
[0082] 將4月齡麻鴨（產蛋種）10隻平均分為兩組，第一組為本發明免疫組，用製備的鴨 A肝病毒基因工程亞單位疫苗進行二次免疫（第一次免疫21天後進行第二次免疫，每次每 只0. 5ml，皮下注射），第二次免疫14天後測對DHAV-3的血清中和抗體效價。第二組為生 理鹽水對照組，注射同等體積的無菌生理鹽水。結果表明本發明免疫組的血清中和抗體效 價均> 1:128,而生理鹽水對照組中和抗體效價均為陰性。
[0083] 表1 ;鴨A肝病毒基因工程亞單位疫苗免疫後的抗體效價
[0084]

【權利要求】
1. 一種鴨A肝病毒VP1和LTB的融合蛋白，其特徵在於，所述的鴨A肝病毒VP1和LTB 的融合蛋白的胺基酸序列為SEQ ID N0:1。
2. -種基因，其特徵在於，所述的基因編碼權利要求1所述的鴨A肝病毒VP1和LTB的 融合蛋白。
3. 如權利要求2所述的基因，其特徵在於，所述的基因的核苷酸序列為SEQ ID N0:2。
4. 權利要求1所述鴨A肝病毒VP1和LTB的融合蛋白在製備疫苗中的應用。
5. -種基因工程重組亞單位疫苗，其特徵在於，所述的疫苗其中的抗原為權利要求1 所述的鴨A肝病毒VP1和LTB的融合蛋白。
6. 如權利要求5所述的疫苗，其特徵在於，所述的疫苗中鴨A肝病毒VP1和LTB的融合 蛋白的濃度為〇? l-lmg/ml。
7. 權利要求5所述的疫苗的製備方法，其特徵在於，包括有如下的步驟： 1) 將權利要求2所述的基因連入表達載體中，構建成表達重組質粒； 2) 將構建的表達重組質粒轉化宿主菌，構建了能表達鴨A肝病毒VP1蛋白和LTB的融 合蛋白的重組基因工程菌；用該重組基因工程菌表達出鴨A肝病毒VP1蛋白和LTB的融合 蛋白； 3) 對重組表達的蛋白進行純化後，加入白油佐劑製成疫苗。
【文檔編號】C07K19/00GK104448005SQ201410771449
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年12月13日 優先權日:2014年12月13日
【發明者】王宏華 申請人:青島宏昊生物科技有限公司