實體瘤被動靶向性抗癌前藥及其製備方法

2023-05-24 10:25:26 3

專利名稱：實體瘤被動靶向性抗癌前藥及其製備方法
技術領域：
本發明涉及一種實體瘤被動靶向性抗癌前藥及其製備方法，屬於抗腫瘤藥物領域。

背景技術：
正常組織中的微血管內皮間隙緻密、結構完整，大分子和脂質顆粒不易透過血管壁。與正常組織中的微血管相比，實體瘤組織血管豐富，微血管形狀構造不規則、膨脹、管壁缺失、內皮細胞排列疏鬆、結構完整性差，內皮細胞連接間隙寬大，淋巴回流缺失，造成大分子類物質和脂質顆粒具有選擇性高通透性和滯留性，這種現象被稱作實體瘤組織的高通透性和滯留效應，簡稱EPR效應(en-hanced permeability and retention effect)。掃描電鏡顯示人結腸腺癌微血管內皮細胞連接間隙達400nm，而正常組織中微血管內皮細胞連接間隙平均不到100nm。實體瘤組織的病理結構特點，使得大分子抗癌藥對實體瘤具有被動的靶向性或者選擇性的特徵，全身給藥後在腫瘤組織中有較多的分布，又稱為實體瘤的被動靶向性；而小分子抗癌藥能夠自由通過正常組織和腫瘤組織的血管壁，在正常組織和腫瘤組織中的藥物分布一致，是造成抗癌效應選擇性差、毒副作用較強的重要原因之一，不具備被動靶向作用。Greish K等報導，相對分子量＞40000的大分子物質可以克服腎臟的濾過清除，具有較長的血漿半衰期，大分子物質體循環時間延長利於實現EPR效應，同時減少給藥頻率。
果膠常是天然的大分子多糖聚合物，廣泛存在於植物的細胞壁中，是由α(1→4)-D-吡喃半乳糖醛酸單位組成的酸性大分子多糖(Hyunjo Kim，et al.International Journalof Pharmaceutics，1998，161149-159)。果膠可通過增強單核巨噬細胞系統，激活巨噬細胞、T細胞和B細胞、NK細胞和補體系統，促進細胞因子分泌，增強紅細胞免疫等提高宿主免疫功能；通過改變實體癌細胞膜的生長特性、影響實體癌細胞內信號傳遞途徑、抗自由基作用、誘導分化與凋亡、抑制實體癌細胞的核酸與蛋白質合成、影響實體癌細胞超微結構、影響癌基因、抗突變作用、抑制實體癌血管形成而發揮直接的抗癌作用(中國中醫藥信息雜誌，1999，564)。本發明的發明人從2005年開始研究以果膠為載體的大分子抗癌前藥，並申請了3件中國發明專利申請，申請號分別為200610020596.7、200710201724.2、200810306463.5。採用小分子果膠，抗癌藥能夠自由通過正常組織和腫瘤組織的血管壁，也容易排洩。但是由於其在正常組織和腫瘤組織中的藥物分布一致，抗癌效應選擇性差，藥物在體內停留時間短，需給藥頻率較高。採用大分子果膠作為載體製備得到的抗癌前藥，能夠產生基於EPR的腫瘤被動靶向性，在腫瘤組織有顯著的蓄積作用，而且多次給藥並不影響它的分布。由於果膠在體內不容易降解，只能通過腎臟排洩，過多的大分子果膠聚集體內會造成有可能沉積到肺、腎臟等組織臟器對其功能產生影響，具體後果目前還沒見有相關報導。


發明內容
本發明所要解決的技術問題是果膠抗癌前藥基於EPR效應的腫瘤被動靶向性，同時能夠在進入實體瘤組織後，釋放藥物並將載體分解為小分子，利於排洩。
為了實現本發明的目的，本發明的技術方案是這樣實現的 先將大分子果膠切斷為Mw 0.5-4.5萬的小分子的果膠，優選Mw 1-3萬，由Mw 0.5～4.5萬的小分子的果膠與阿黴素反應得到的Mw為10～100萬的果膠-阿黴素偶聯物(優選20萬～80萬，進一步優選40萬-60萬)，果膠-阿黴素偶聯物製成混懸劑(果膠-阿黴素偶聯物加入水中，再加入PVP和甘油混勻)後然後通過納米超高壓均質機處理，得到粒徑100nm～200nm，優選130nm-180nm，熔點220℃～245℃實體瘤被動靶向性抗癌前藥。其中所述果膠-阿黴素偶聯物中，果膠與阿黴素通過醯胺鍵連接，果膠與果膠之間通過果膠分子的羧基與羥基縮合成的酯鍵連接。該抗癌前藥能夠在進入實體瘤組織後，能夠產生基於EPR的腫瘤被動靶向性，在腫瘤組織有顯著的蓄積作用，具有較長的血漿半衰期，體循環時間延長；同時釋放藥物並將載體分解為小分子，利於排洩。本發明所述分子量為均為重均分子量Mw。
所述實體瘤被動靶向性抗癌前藥的水溶解度為42mg/L。
製備實體瘤被動靶向性抗癌前藥的方法由以下步驟完成 a、Mw 0.5～4.5萬(優選Mw 1～3萬)的小分子果膠溶解於水，加入鹽酸阿黴素，混合均勻後與EDC·HCl反應，透析，乾燥得到Mw10萬～100萬的果膠-阿黴素偶聯物； b、果膠-阿黴素偶聯物加入水中，再加入PVP和甘油(也可以加入一定量的卵磷脂或DMSO，加入量不超過果膠-阿黴素偶聯物的2％)，混合均勻製成混懸劑，經納米超高壓勻質儀處理，即得粒徑100nm-200nm的實體瘤被動靶向性抗癌前藥。
所述果膠-阿黴素偶聯物是由小分子的果膠與阿黴素於pH為5～7，EDC·HCl作用下，40～60℃反應得到。
進一步地，b步驟中，PVP的用量為果膠-阿黴素偶聯物質量的1倍～6倍，甘油的用量為果膠-阿黴素偶聯物質量的0.1％-0.8％。
優選的處理方法是混懸劑分3次進納米超高壓勻質儀處理，第一次壓力120mpa，第二次壓力180mpa，第三次壓力190mpa。
其中，所述小分子果膠是將果膠溶於水，與NaOH溶液在pH＝13條的條件下反應，然後用濃鹽酸調pH到中性，截留分子量得到。
本發明實體瘤被動靶向性抗癌前藥在溶酶中的水解，醯胺鍵斷裂，釋放阿黴素。水解、超濾後截留下的濾餅，用95％乙醇反覆洗滌濾餅直至液體無紅色以去除殘留的阿黴素，蒸乾溶劑，加入蒸餾水溶解沉澱，凝膠滲透色譜測定分子量為1萬～3萬。
在相同的阿黴素濃度下(2mg/ml)，本發明實體瘤被動靶向性抗癌前藥(果膠-阿黴素偶聯物)注射劑對人源性肺癌細胞NCI-H446和A549的細胞抑制率分別為65.23％和68.52％，與鹽酸阿黴素的相當(63.33％和67.62％)。在黑色素瘤B16肺轉移模型小鼠的療效研究中，果膠-阿黴素偶聯物組小鼠的荷瘤生存期為42.3±12.4天，明顯高於鹽酸阿黴素組(23.1±10.2天)。



圖1、紫外光譜； 圖2、紅外光譜圖；a、阿黴素；b、果膠-阿黴素軛合物；c、果膠；d、阿黴素和果膠的物理混合物； 圖3、本發明實體瘤被動靶向性抗癌前藥粒徑分布圖； 圖4、本發明實體瘤被動靶向性抗癌前藥溶酶體水解試驗；系列1為實驗組，系列2為空白組；橫坐標時間(小時，h)，縱坐標是藥物釋放百分率(％)； 圖5、本發明實體瘤被動靶向性抗癌前藥對肺癌荷瘤小鼠生存時間的影響。

具體實施例方式 先將大分子果膠切斷為MW 0.5-4.5萬的小分子的果膠，優選MW 1～3萬，然後合成小分子果膠-阿黴素(通過醯胺鍵連接)，同時通過果膠分子之間中的羧基與羥基縮合聯成大分子。然後通過納米超高壓均質機處理，得到100nm～200nm，分子量為10萬～100萬實體瘤被動靶向性抗癌前藥。
具體製備方法 1、小分子果膠的準備採用果膠溶解於蒸餾水後用NaOH反應，然後用濃鹽酸調pH到中性，截留得到分子量為Mw 0.5～4.5萬(優選1～3萬)的小分子果膠。
一個
具體實施例方式稱量13.3g果膠，加蒸餾水1L攪拌溶解後，用5M NaOH調pH，使pH值＝13，於65℃反應10h，停止反應。用鹽酸將反應液調到中性，使用截留分子量為3萬的millipore過濾，濾液再通過截留分子量為1萬的millipore過濾，收集沒有透過的截留分子量為1萬的固體，減壓濃縮幹，真空乾燥得到分子量為1～3萬的小分子果膠。

果膠β-切斷 2、阿黴素的員載及小分子果膠的交聯 2.1反應式
其中，
2.2實驗步驟 分子量為1-3萬的小分子果膠溶解，與鹽酸阿黴素溶液在pH為5～7，EDC·HCl(1-乙基-3-(3-二甲胺基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽)作用下，40-60℃反應，透析，乾燥，即得紅褐色固體(果膠-阿黴素偶聯物)，紅褐色固體難溶於水，溶解度為42mg/L，熔點220℃-245℃。
測得載藥量為15-35％，分子量為Mw10萬～100萬，優選20萬～80萬，進一步優選40萬-60萬。
紫外可見分光光度反分析，果膠無吸收，阿黴素在479.5nm處有最大吸收峰，果膠與阿黴素混合物在488.5nm處有最大吸收峰，果膠-阿黴素偶聯物P(A)n在498nm處有最大吸收峰，吸收發生紅移，這說明阿黴素與果膠發生化學鍵偶聯。
紅外光譜上掃描，與果膠相比，P(A)n在1620cm-1處出現醯胺I帶和醯胺II帶的混合吸收峰，與1750cm-1的酯鍵峰相比峰面積比值顯著增加，說明果膠之間是以酯鍵交聯。且在1100cm-1和1017cm-1處出現明顯的阿黴素的蒽環特徵吸收峰，1411.23處出現伯醯胺的吸收峰，說明果膠與阿黴素是以醯胺鍵的形式結合。
上述紅褐色固體研磨處理後加入一定量的PVP，納米超高壓勻質儀(T-200D型河北廊坊通用機器製造有限公司)處理，得到分子量10～100萬，粒徑100nm-200nm的實體瘤被動靶向性抗癌前藥。
3、大分子難溶性果膠-阿黴素偶聯物經研磨處理後加入一定量的PVP，納米超高壓勻質儀處理，得到分子量10萬～100萬，粒徑100nm-200nm的實體瘤被動靶向性抗癌前藥。
以下通過具體實施例對本發明作進一步詳述，但不應理解為是對本發明的限制。
實施例1本發明實體瘤被動靶向性抗癌前藥P(A)n的製備 1、小分子果膠的準備 稱量13.3g果膠，加蒸餾水1L攪拌溶解後，用5M NaOH調pH，使pH值＝13，於65℃反應10h，停止反應。用濃鹽酸將反應液調到中性，使用截留分子量為3萬的millipore過濾，濾液再通過截留分子量為1萬的millipore過濾，收集沒有透過的截留分子量為1萬的固體，減壓濃縮幹，真空乾燥得到分子量為1～3萬的小分子果膠。
2、阿黴素的負載及小分子果膠的交聯 稱量分子量為1～3萬的小分子果膠阿黴素1g加到反應瓶中，加100ml水，攪拌溶解，稱鹽酸阿黴素0.5g，加50ml蒸餾水超聲溶解，將鹽酸阿黴素溶液加到反應瓶中，另用50ml蒸餾水洗滌瓶上附著的阿黴素。稱1g EDC·HCl加入到反應瓶中後升溫50℃反應6.5h，反應完畢後，裝入截留分子量(MW)為3500的透析袋中透析1d，每3h換一次蒸餾水。蒸乾溶劑，真空乾燥12h，得紅褐色固體，大分子難溶果膠-阿黴素偶聯物1.1g，難溶於水，溶解度為42mg/L，熔點220℃-245℃。
採用分光光度法測定載藥量 標準曲線的建立準確配製鹽酸阿黴素標準溶液，濃度分別為10.00、20.00、30.00、40.00、50.00μg/mL標準液，於479.5nm(紫外可見分光光度計光譜掃描確定)處測定吸光度。
樣品載藥量的測定準確稱取一定量的P(A)n，溶於二次水中配成待測溶液，測定吸光度，測得載藥量為21.4％。
結構表徵 為了避免P(A)n中羧酸鹽對酯鍵和醯胺鍵的影響，通過調節pH值，將P(A)n非鹽處理，製備成前藥樣品。用二次水溶解阿黴素、果膠、本發明樣品、果膠與阿黴素混合物，紫外光譜和紅外光譜分別如圖1，圖2所示。
圖1中，阿黴素在479.5nm處有最大吸收峰，果膠與阿黴素混合物在488.5nm處有最大吸收峰，P(A)n在498nm處有最大吸收峰，果膠無吸收。P(A)n在498nm處吸收發生紅移，這說明阿黴素與果膠發生化學鍵偶聯。
圖2中，與果膠相比，果膠-阿黴素在1620cm-1處出現醯胺I帶和醯胺II帶的混合吸收峰與1750cm-1的酯鍵峰相比峰面積比值顯著增加，說明果膠與果膠之間以酯鍵交聯。且在1100cm-1和1017cm-1處出現明顯的阿黴素的蒽環特徵吸收峰，1411.23處出現伯醯胺的吸收峰，說明果膠與阿黴素是以醯胺鍵的形式結合的。
3、實體瘤被動靶向性抗癌前藥的製備 0.468g大分子難溶性果膠-阿黴素偶聯物(載藥量21.4％)加入1g PVP，3ml甘油和50ml水，研磨處理製成混懸劑，經納米超高壓勻質儀(T-200D型河北廊坊通用機器製造有限公司)處理。分3次分別進納米超高壓勻質儀處理，第一次壓力120mpa，第二次壓力180mpa，第三次壓力190mpa。經過納米超高壓勻質儀處理後的粒徑分布圖如圖3。
納米超高壓勻質儀處理後是懸浮液，得到分子量10-100萬，粒徑100nm-200nm的實體瘤被動靶向性抗癌前藥。
實施例2本發明實體瘤被動靶向性抗癌前藥P(A)n的製備 1、小分子果膠的準備 稱量13.3g果膠，加蒸餾水1L攪拌溶解後，用5M NaOH調pH，使pH值＝13，於65℃反應10h，停止反應。用濃鹽酸將反應液調到中性，使用截留分子量為1萬的millipore過濾，濾液再通過截留分子量為7000的透析袋透析，收集透析液，減壓濃縮幹，真空乾燥得到分子量為7000-10000的小分子果膠。
2、阿黴素的負載及小分子果膠的交聯 稱量分子量為7000～10000的小分子果膠阿黴素1g加到反應瓶中，加100ml水，攪拌溶解，稱鹽酸阿黴素0.5g，加50ml蒸餾水超聲溶解，將鹽酸阿黴素溶液加到反應瓶中，另用50ml蒸餾水洗滌瓶上附著的阿黴素。稱1g EDC·HCl加入到反應瓶中後升溫50℃反應6.5h，反應完畢後，裝入截留分子量(Mw)為3500的透析袋中透析1d，每3h換一次蒸餾水。蒸乾溶劑，真空乾燥12h，得紅褐色固體，大分子難溶果膠-阿黴素偶聯物1.2g，載藥量24.2％。
0.468g大分子難溶性果膠-阿黴素偶聯物，加入1g PVP，3ml甘油和2％的卵磷脂溶液50ml做溶劑，研磨處理製成混懸劑，經納米超高壓勻質儀(T-200D型河北廊坊通用機器製造有限公司)處理。分3次分別進納米超高壓勻質儀處理，第一次壓力120mpa，第二次壓力180mpa，第三次壓力190mpa。
得到分子量10-100萬，粒徑100nm-200nm的實體瘤被動靶向性抗癌前藥。
實施例3本發明實體瘤被動靶向性抗癌前藥P(A)n的製備 1、小分子果膠的準備 稱量13.3g果膠，加蒸餾水1L攪拌溶解後，用5M NaOH調pH，使pH值＝13，於65℃反應10h，停止反應。用濃鹽酸將反應液調到中性，使用截留分子量為5萬的millipore過濾，濾液使用截留分子量為2萬的透析袋透析48h，每3h換一次蒸餾水。透析液減壓濃縮幹，真空乾燥得到分子量為2萬-5萬的小分子果膠。
2、阿黴素的負載及小分子果膠的交聯 稱量分子量為2-5萬的小分子果膠1g加到反應瓶中，加100ml水，攪拌溶解，稱鹽酸阿黴素0.5g，加50ml蒸餾水超聲溶解，將鹽酸阿黴素溶液加到反應瓶中，另用50ml蒸餾水洗滌瓶上附著的阿黴素。稱1g EDC·HCl加入到反應瓶中後升溫50℃反應6.5h，反應完畢後，裝入截留分子量(Mw)為3500的透析袋中透析1d，每3h換一次蒸餾水。蒸乾溶劑，真空乾燥12h，得紅褐色固體，大分子難溶果膠-阿黴素偶聯物1.2g，載藥量25.2％。
0.468g大分子難溶性果膠-阿黴素偶聯物，加入1g PVP，50ml水和DMSO的混合溶劑(水∶DMSO＝0.75∶0.25)，製成混懸劑，經納米超高壓勻質儀(T-200D型河北廊坊通用機器製造有限公司)處理。分3次分別進納米超高壓勻質儀處理，第一次壓力120mpa，第二次壓力180mpa，第三次壓力190mpa。
得到分子量10-100萬，粒徑100nm-200nm的實體瘤被動靶向性抗癌前藥。
試驗例1本發明實體瘤被動靶向性抗癌前藥溶酶體水解試驗 溶酶體來源參照《細胞生物學實驗方法與技術》提取得到純化的溶酶體。
實驗組25mL的錐形瓶中加入10mL磷酸鹽緩衝液(PBS)(pH＝5)溶液，1mg/mL實施例2製備的實體瘤被動靶向性抗癌前藥10mg，再加入0.4mL溶酶體的蔗糖(0.25mol/L)混懸液，置於37℃恆溫箱中搖床避光孵育。
對照組不加入溶酶體，其他條件相同。
分別於保溫0.25h，0.5h，1h，2.5h和18h取樣，每次取樣0.5mL，取樣後依次加入0.5mL超純水，0.2mL 1mol/L的Na2CO3/NaHCO3(pH 9.8)緩衝液，2.5mL CHCl3-MeOH(3∶1)，混合均勻，3,500rpm離心20min，阿黴素分布在有機相。
高效液相色譜檢測阿黴素含量。色譜柱Phenomenex Luna C18(250×4.6mm，5μm)；流動相為甲醇∶乙腈∶磷酸緩衝鹽＝7∶4∶6；檢測波長480nm；流速0.8mL/min。
實驗結果如圖4實驗組最大釋放為35％，在6h後達到30％，並且在6-30h範圍內基本穩定在30％，對照組最大釋放為7％，在整個釋放過程中的始終釋放很低。說明本發明實體瘤被動靶向性抗癌前藥在溶酶中水解，醯胺鍵斷裂，釋放阿黴素。
鹼法降脂並且超濾後的小分子果膠分子量測定 收集超濾後截留下的濾餅，用95％乙醇反覆洗滌濾餅直至液體無紅色，蒸乾溶劑，加入蒸餾水溶解沉澱，凝膠滲透色譜測定分子量。
色譜條件Aglient1100系列HPLC，1362A視差檢測器和G1310A單元泵；色譜柱UltrahydrogelTM linear column(7.8×300mm，Waters)；柱溫40℃；流通池溫度35℃；流動相0.005M KNO3；流速0.5mL/min；樣品濃度5mg/mL，用0.05％疊氮化鈉溶解；進樣量20μL。
標準曲線的製備用葡聚糖作用標準品Dextrans(Mw＝5000，25000，50000，80000，270000) 測得其分子量為1-3萬。
同等條件下對市售柑橘高酯果膠分子量測定測得其絕對分子量為30000～600000。
試驗例2應用MTT法觀察本發明實體瘤被動靶向性抗癌前藥對體外腫瘤細胞系生長活性的抑制 1、受試藥物 鹽酸阿黴素，購自浙江海正藥業股份有限公司，用生理鹽水溶解配製成含阿黴素2mg/ml， 本試驗採用的實體瘤被動靶向性抗癌前藥為實施例1製備(相當於阿黴素2mg/ml)。
2、方法將用RPMI 1640培養基培養的對數生長期生長的細胞溶液(濃度為50000個/ml)接種於96孔板上，0.1ml/孔。孵育24小時後給予相應藥物的處理。待藥物處理24小時後，加入0.02ml的3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)(5mg/ml)處理4小時，移去培養液加入0.15ml的二甲亞碸(DMSO)，用酶標儀在570nm處測定其光吸收值。
抑制率(％)＝(1-吸收值吸收值/空白對照組吸收值)×100％，各組不同藥物的細胞抑制率見表1。
表1不同藥物對各種腫瘤細胞的抑制率
試驗例3本發明實體瘤被動靶向性抗癌前藥對肺轉移瘤的實驗研究 1.主要材料 鹽酸阿黴素，購自浙江海正藥業股份有限公司； 果膠-阿黴素偶聯物為本發明實體瘤被動靶向性抗癌前藥為實施例2樣品(相當於阿黴素2mg/ml)。
細胞和動物清潔級近交系C57BL/6小鼠購自四川大學華西實驗動物中心，雌性，6-7周齡，體重20±3g。實驗過程中自由飲水及進食。每日光照12小時，小鼠(5隻/籠)籠均採用中央換氣系統通氣。小鼠黑色素瘤細胞株B16購於上海細胞生物研究所，由本實驗室保種。
2.方法 細胞培養常規培養於RPMI 1640 100mL/L胎牛血清加雙抗(青黴素100U/mL，鏈黴素100mg/L)的培養液內，置於37℃，50mL/L二氧化碳培養箱中培養.穩定傳代3，4代後，取對數生長期細胞，經2.5g/L胰酶消化後用無血清培養液重懸收集細胞，用無血清的1640培養基調整細胞密度備用。
小鼠肺部轉移腫瘤模型的建立取C57BL/6小鼠，隨機分為數個組，用750mL/L質量濃度的乙醇消毒小鼠尾部皮膚，取B16黑色素瘤細胞溶液於小鼠尾靜脈注射，接種劑量為0.1mL。
於小鼠接種腫瘤細胞後4～5天開始給藥，每隻小鼠每周給藥2次，40～50μl/只/次。觀察小鼠的荷瘤生存期。
本發明實體瘤被動靶向性抗癌前藥對肺癌荷瘤小鼠生存時間的影響見圖5。由圖5可見在黑色素瘤B16肺轉移模型小鼠的療效研究中，果膠-阿黴素偶聯物組小鼠的荷瘤生存期為42.3±12.4天，明顯高於鹽酸阿黴素組(23.1±10.2天)。
權利要求
1.實體瘤被動靶向性抗癌前藥，由果膠與阿黴素鍵合而成，其特徵在於它是由Mw 0.5～4.5萬的小分子的果膠與阿黴素反應得到的Mw為10～100萬的果膠阿黴素偶聯物，製成混懸劑後通過納米超高壓均質機處理得到粒徑100nm-200nm，熔點220℃～245℃實體瘤被動靶向性抗癌前藥；其中，果膠與阿黴素通過醯胺鍵連接，果膠與果膠之間通過果膠分子的羧基與羥基縮合成的酯鍵連接。
2.根據權利要求1所述的實體瘤被動靶向性抗癌前藥，其特徵在於所述實體瘤被動靶向性抗癌前藥的粒徑130nm-180nm。
3.根據權利要求1或2所述的實體瘤被動靶向性抗癌前藥，其特徵在於所述實體瘤被動靶向性抗癌前藥的水溶解度為42mg/L。
4.根據權利要求1所述的實體瘤被動靶向性抗癌前藥，其特徵在於所述果膠阿黴素偶聯物是由小分子的果膠與阿黴素於pH為5～7，EDC·HCl作用下，40～60℃反應得到。
5.根據權利要求4所述的實體瘤被動靶向性抗癌前藥，其特徵在於所述小分子的果膠Mw 1～3萬。
6.根據權利要求1～5任一項所述的實體瘤被動靶向性抗癌前藥，其特徵在於果膠阿黴素偶聯物加入水中，再加入PVP和甘油，混合均勻製成混懸劑後進行納米超高壓均質機處理。
7.根據權利要求6所述的製備實體瘤被動靶向性抗癌前藥的方法，其特徵在於混懸劑分3次進納米超高壓勻質儀處理，第一次壓力120mpa，第二次壓力180mpa，第三次壓力190mpa。
8.根據權利要求7所述的實體瘤被動靶向性抗癌前藥，其特徵在於PVP的用量為果膠-阿黴素偶聯物質量的1倍～6倍，甘油的用量為果膠-阿黴素偶聯物質量的0.1％-0.8％。
9.製備實體瘤被動靶向性抗癌前藥的方法，其特徵在於由以下步驟完成
a、Mw 0.5～4.5萬的小分子果膠溶解於水，加入鹽酸阿黴素，混合均勻後與EDC·HCl反應3～8h，透析，乾燥得到Mw10萬～100萬的果膠阿黴素偶聯物；
b、果膠阿黴素偶聯物加入水中，再加入PVP和甘油，混合均勻製成混懸劑，經納米超高壓勻質儀處理，即得粒徑100nm-200nm的實體瘤被動靶向性抗癌前藥。
10.根據權利要求9所述的製備實體瘤被動靶向性抗癌前藥的方法，其特徵在於所述小分子果膠是將果膠溶於水，與NaOH溶液在pH＝13條的條件下反應，然後用濃鹽酸調pH到中性，截留分子量得到。
全文摘要
本發明涉及一種實體瘤被動靶向性抗癌前藥及其製備方法，屬於抗腫瘤藥物領域。它是由Mw 0.5～4.5萬的小分子的果膠與阿黴素反應得到的Mw為10～100萬的果膠阿黴素偶聯物，製成混懸劑後通過納米超高壓均質機處理得到粒徑100nm-200nm，熔點220℃～245℃實體瘤被動靶向性抗癌前藥；其中，果膠與阿黴素通過醯胺鍵連接，果膠與果膠之間通過果膠分子的羧基與羥基縮合成的酯鍵連接。該抗癌前藥對人源性肺癌細胞NCI-H446和A549的細胞抑制率與鹽酸阿黴素的相當。在黑色素瘤B16肺轉移模型小鼠的療效研究中，荷瘤生存期為42.3±12.4天，明顯高於鹽酸阿黴素組(23.1±10.2天)。
文檔編號A61K31/704GK101721714SQ20091031185
公開日2010年6月9日 申請日期2009年12月18日 優先權日2009年12月18日
發明者唐小海, 邱宇, 宋鑫 申請人:重慶萊美藥業股份有限公司