增加植物β-胡蘿蔔素含量的β-胡蘿蔔素羥化酶基因及其用途的製作方法

2023-05-24 07:48:16

專利名稱：增加植物β-胡蘿蔔素含量的β-胡蘿蔔素羥化酶基因及其用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及來源於具有高含量類胡蘿蔔素的新黃美甘薯品種的β-胡蘿蔔素羥 化酶(β-carotene hydroxylase)基因，具體地涉及通過抑制β -胡蘿蔔素的分解酶，即
胡蘿蔔素羥化酶的表達(expression)，進而提高植物體內β -胡蘿蔔素含量的方法。
背景技術：
經濟水平提高後，人們的飲食生活變得多樣化且飲食生活水平逐漸提高，隨著消 費者對健康食品需求的增大，抗氧化物質、胡蘿蔔素及膳食纖維的優點被廣泛普及，人 們對作為健康食品的甘薯有了新的認識。甘薯的塊莖狀根的營養除水分之外，大部分為作為熱量供給源的碳水化合物，是 高熱量的食品，特別是胡蘿蔔素和各種無機物質、維生素及膳食纖維的含量並不遜色 於其他作物，並且甘薯的葉與葉柄作為蔬菜的利用價值很高。並且含有大量維生素B、維生素C、鈣、鐵等成分，並且含有花青素等類黃酮類或綠 原酸(chlorogenic acid)等數種多酚類物質。(Bovell_Benjamin2007，Adv Food Nutr Res 52 :1-59)。肉質為黃色的甘薯品種含有高含量的類胡蘿蔔素成分，全世界範圍內在克服維 生素A缺乏方面(vitaminA deficiency, VAD)起到了重要的作用。在發展中國家，VAD會導致一時性或永久性失明，特別是對於兒童、孕婦、哺乳期 女性來說更加致命。全世界很多人因為VAD而受苦，這可以通過攝取維他命原Α( β -胡 蘿蔔素或其他類胡蘿蔔素)來克服(Stephenson et al. 2000, Parasitology 121 Suppl S5-22)。早在90年前就已知甘薯可以克服老鼠的VAD現象(Steenbock 1919，Science 50 352-35 ，在肯亞將黃色甘薯定為每年可以攝取的最經濟的β-胡蘿蔔素的原料，並將 其進行廣泛宣傳(Solomons and Buluxl997, Eur J Clin Nutr 51 Suppl 4 :S39_45)。甘薯是由類胡蘿蔔素的大部分轉換為維生素A的轉換活性最高的β-胡蘿蔔素 而構成，是比其他植物更優秀的維生素A攝取源。並且Van Jaarsveld(2005, Am J Clin Nutr 81 :1080-1087)等指出在發展中國家加大黃色甘薯的消費是最有效的通過飲食消除 維生素A缺乏的戰略方法。表現為紅色，黃色，朱黃色的類胡蘿蔔素在植物體中通過類異 戊二烯的生物合成而得到，被廣泛地認為在去除脂質氧化自由基及活性氧上起到重要作用 (Ben-Amotz and Fishier 1998，RadiatEnviron Biophys 37:187-193)。植物中的類胡蘿蔔素是光合作用系的必要成分，並且是水果及花的揮發性成分， 作為植物荷爾蒙ABA的前體物和provitaminA的前體物，不僅對植物體本身，對包括人類在 內的動物也是非常有用的物質。如胡蘿蔔素、番茄紅素、葉黃素等類胡蘿蔔素類成分具 有很強的抗氧化功效，不僅作為營養素，在癌症、心臟疾患、眼疾病方面也是被廣泛利用的 重要物質。

發明內容
(一)要解決的技術問題本發明是由如上所述的要求而導出，本發明的完成實現於對來源於甘薯的新型 β-胡蘿蔔素羥化酶的片段基因進行解析，通過調節上述基因的表達(expression)，選擇 性地提高胡蘿蔔素的含量，進而增大機能性活性物質的生產，致使開發抗氧化活性增 強的植物體。(二)技術方案為解決上述問題，本發明提供一種來源於甘薯的β-胡蘿蔔素羥化酶 (β -carotene hydroxylase)蛋白質。並且，本發明還提供編碼上述蛋白質的基因。並且，本發明還提供含有上述基因的重組載體。並且，本發明還提供轉化上述重組載體的宿主細胞。並且，本發明還提供含有上述基因的重組植物RNAi載體並且，本發明還提供利用上述重組植物RNAi載體，提高植物β -胡蘿蔔素含量的 方法。並且，本發明還提供轉化上述重組植物RNAi載體的，β -胡蘿蔔素含量增加的植 物體及其種子。(三)有益效果根據本發明，抑制編碼本發明中的新黃美甘薯的胡蘿蔔素羥化酶蛋白質的基 因表達的轉化體(transformant)，不僅能夠選擇性地增加作為生理活性物質的β -胡蘿蔔 素的含量，並且已確定其具有很強的抗氧化活性，因此本發明中的轉化愈傷組織可以應用 於開發對如高鹽等環境，具有強耐受性的植物。


圖1為本發明中來源於甘薯(品種為新黃美)的β -胡蘿蔔素羥化酶基因的部分 序列。圖2為由本發明中甘薯β-胡蘿蔔素羥化酶基因推測得到的蛋白質的胺基酸序列 表與各種植物(牽牛花、番茄、葡萄、豆子、楊樹、咖啡豆、胡蘿蔔、土豆、柑橘、水芹菜、甘藍、 玉米、水稻外9種)的β -胡蘿蔔素羥化酶基因胺基酸序列的比對圖。圖3為在圖2中進行比較的β -胡蘿蔔素羥化酶基因之間的親緣關係的示意圖。圖4為在甘薯植物體中，通過RT-PCR對本發明中的β -胡蘿蔔素羥化酶基因按組 織形態分類表達所得到的電泳照片。L，葉子；S，莖；FR，鬚根；SR，貯藏根。圖5為在植物體內抑制β -胡蘿蔔素羥化酶基因的表達而構建轉化載體(RNAi) 的相關圖。圖6為通過基因組DNA PCR選出β -胡蘿蔔素羥化酶基因的RNAi載體轉化愈傷 組織的圖。圖7為轉化愈傷組織由於β -胡蘿蔔素含量的增加表現為黃色的圖。圖8為以轉化愈傷組織為對象，通過RT-PCR調查β -胡蘿蔔素羥化酶基因表達的 結果圖。
4
圖9為以轉化愈傷組織為對象，通過HPLC分析，進而分析β -胡蘿蔔素生產的結 果圖。圖10為以轉化愈傷組織為對象，通過DPPH自由基消除活性調查分析低分子抗氧 化活性的結果圖。圖11為在轉化愈傷組織分別進行150mM和200mM的NaCl處理後，觀察表型(A) 再分析氧化的DAB含量(B)的結果圖。
具體實施例方式為達到本發明的目的，本發明提供一種來源於甘薯(Ipomoeabatatas)的β-胡蘿 卜素輕化酶(β -carotene hydroxylase)蛋白質。本發明中β -胡蘿蔔素羥化酶蛋白質的範圍包括具有用從甘薯(Ipomoea batatas) 分離的SEQ ID No. 2所示的胺基酸序列的蛋白質及同等活性的上述蛋白質的衍生物。所謂「同等活性衍生物」是指經過胺基酸的添加、置換或缺失，與上述SEQ ID No. 2 表示的胺基酸序列至少有70%以上的序列同源性，優選為80%以上，更優選為90%以上， 最優選為95%以上。與用SEQ ID No. 2表示的蛋白質實質性地具有同質的生理活性的蛋白 質。並且本發明還提供編碼上述胡蘿蔔素羥化酶蛋白質的基因。本發明中的基因 是與甘薯胡蘿蔔素含量的增加有關，編碼胡蘿蔔素羥化酶蛋白質的基因組DNA和 cDNA都包括在內。優選地，本發明中上述鹼基序列的突變包括在本發明的範圍之內。具體 地，上述基因可包括與SEQ ID No. 1的鹼基序列分別具有70%以上的相同性的鹼基序列。 優選為80%以上，更優選為90 %以上，最優選為95%以上。對於多核苷酸的「序列相同性 的％，，通過兩個最優排列的序列和比對區域進行比對而確定，在比對區域中的多核苷酸序 列的一部分與對於兩個序列的最優排列的參考序列(不包括添加或刪除)相比可以包括添 加或刪除(即，缺隙(gap))。並且，本發明提供含有本發明中的β -胡蘿蔔素羥化酶基因的重組載體。術語「重組」是指細胞複製不同種類的核酸或表達上述核酸或表達肽、不同種類的 肽或表達不同種類的核酸進行編碼的蛋白質的細胞。重組細胞可以將在上述細胞的天然形 態中沒有被發現的基因或基因片段，可以用正義或反義形態表達。並且重組細胞能夠表達 從天然狀態的細胞中發現的基因，但上述基因是經過變形的，是通過人為手段重新導入到 細胞內部的。術語「載體」是指向細胞內傳遞的DNA片段，指核酸分子時使用。載體對DNA進行 複製，能夠獨立地在宿主細胞中再生產。術語「傳達體」通常與「載體」互換使用。術語「表 達載體」是指包括能夠在目標編碼序列和特定宿主植物中可動性地進行連接的，對表達編 碼序列所必需的適合的核酸序列重組DNA分子。在真核細胞中可利用的信號有啟動子(啟 動子、增強子、終止子及多腺苷酸化信號。這是公知的。重組載體的優選的例子有如土壤桿菌屬一樣的，存在於適當的宿主時，能將本身 的一部分，所謂T-區轉移到植物細胞中的Ti-質粒載體。其他類型的Ti-質粒載體(參照 EP 0116718Β1號)是將現有植物細胞或雜種DNA適當地嵌入到植物的基因組內的作為能夠 產生新的植物的原生質體，應用於轉移雜種DNA序列。
5
Ti-質粒載體最優選的形態為如EP 012051681號及美國專利第4，940，838號所申 請的所謂二元載體。能夠將本發明涉及的DNA導入到植物宿主中的另一適合的載體有來自 於雙鏈植物病毒(例如，CaMV)及單鏈病毒及雙生病毒等的病毒載體，例如可選自非完全性 植物病毒載體。在難以將植物宿主進行適當地轉化時使用這種載體特別有利。表達載體優選地包括一個以上的選擇性標記。上述標記通常情況下作為具有用化 學方法可以選擇的特性的核酸序列，所有可以區別被轉化的細胞和沒有被轉化的細胞的基 因都能與之對應。例如有像草甘膦(glyphosate)或草胺膦(phosphinothricin)等除草劑 抗性基因，像卡那黴素(kanamycin)、G418、伯萊黴素(Bleomycin)、潮黴素(hygromycin)、 氯黴素(chloramphenicol)等抗生素抗性基因，但並不僅限於這些。本發明中的重組載體中，啟動子可以為CaMV 35S、肌動蛋白、泛蛋白、pEUM、MAS或 組蛋白啟動子等，但並不僅限於此。術語「啟動子」意味著結構基因的DNA上遊區域，是指為了開始轉錄，與RNA聚合 酶結合的DNA分子。「植物啟動子」是指在植物細胞中能夠開始轉錄的啟動子。「組成型啟 動子」是在大部分環境條件及發育狀態或細胞分化條件下具有活性的啟動子。轉化體的選擇可根據各階段的各種組織而構成，因此本發明中的啟動子可以優選 為組成型啟動子。並且組成型啟動子不限制選擇可能性。在本發明中的重組載體中，可使用常規的終止子，例如有一氧化氮合成酶 (NOS)、水稻α-澱粉酶RAmyl A終止子、菜豆鹼終止子(Phaseoline)、根癌土壤桿菌 (Agrobacterium tumefaciens)的章魚鹼(Octopine)基因的終止子等，但並不僅限於此。有關終止子的必要性，其領域是為了增加植物細胞中的轉錄的確定性及效率，這 是一般所公知的。因此終止子的使用在本發明的內容中是非常優選的。並且，本發明還提供轉化上述重組載體的宿主細胞。將本發明中的重組載體安定 於原核細胞上，能夠連續無性繁殖及表達的宿主細胞可以使用業界公知的任意一種宿主細 胞，例如有，如E. coli J1109、E. coli BL21、E. coli RR1、E. coli LE392、E. coli Β、Ε· coli X 1776、Ε. coli W3110、枯草芽胞桿菌、蘇雲金桿菌等桿菌屬菌株，還有，如鼠傷寒沙門(氏) 菌、粘質沙雷菌及多樣的假單胞菌屬等腸內菌科菌株等。並且，將本發明中的載體轉化到真核細胞中的情況下，作為宿主細胞可以利用酵 母((Saccharomyce cerevisiae)、昆蟲細胞、人細胞(例如，CHO細胞株(中華倉鼠卵巢 (Chinese hamster ovary))、W138、BHK、C0S_7、293、H印G2、3T3、RIN 及 MDCK 細胞株)及植 物細胞等。宿主細胞優選為植物細胞。將本發明中的載體向宿主細胞內運輸的方法，當宿主細胞是原核細胞時，可採用 CaCl2 方法、哈納漢方法(Hanahan, D.，J. Mol. Biol.，166 :557-580(1983))及電穿孔方法 等。並且宿主細胞為真核細胞時，可採用顯微注射法、磷酸鈣沉澱法、電穿孔法、脂質體-介 導的形質感染法、DEAE-右旋糖苷處理法及基因槍法等方法將載體注入進宿主細胞內。並且，本發明還提供含有本發明涉及的β -胡蘿蔔素羥化酶基因的重組植物RNAi 載體。RNA幹擾(RNA interfernce)是指將具有與靶基因mRNA相同的序列的正義RNA和 與之對應的具有互補序列的反義RNA構成的雙鏈RNA (double strand RNA, dsRNA)注入到 細胞中，進而誘導靶基因mRNA的降解來抑制蛋白質表達的現象。
利用RNAi的基因抑制方法不僅簡便，對基因表達的抑制效果也很優秀，是最近非 常受歡迎的方法。上述重組植物RNAi載體優選為圖5中所記載的載體，但並不僅限於此。並且，本發明還提供利用含本發明涉及的胡蘿蔔素羥化酶基因的重組植物 RNAi載體對植物進行轉化，提供一種包括抑制β-胡蘿蔔素羥化酶的表達階段的植物的， 增加胡蘿蔔素含量的方法。上述植物優選為甘薯。植物的轉化表示將DNA轉移到植物中的任意的方法。這樣的轉化方法不一定 必需再生及(或)組織培養時間。植物的轉化現在不僅是針對雙子葉植物的，而對包括 單子葉植物的植物種也都是普遍的。原則上，任意的轉化方法可利用於將有關本發明的 雜種DNA導入到適當的初始細胞中。採用的方法可從對原生質體的鈣/聚乙二醇方法 (Krens,F. A. et al. , 1982, Nature 296,72-74 ；Negrutiu Let al. , Junel987, Plant Mol. Biol. 8,363-373)、原生質體的電穿孔法(Shillito R. D. et al.，1985 Bio/Technol. 3, 1099-1102)、作為植物要素的顯微注射法(Crossway A. et al.，1986,Mol. Gen. Genet. 202， 179-185)、各種植物要素的(被編譯了 DNA或RNA)粒子衝擊法、或依靠植物的浸潤或成熟 的花粉或小孢子的轉化的，以根癌農桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)為介導的基因轉 移(非完全性)，由病毒引起的感染(EP0301316號)等方法中做適當的選擇。關於本發明 優選的方法為包括以農桿菌為介導的DNA傳遞。特別優選的方法為如EP A 120516號及美 國專利第4，940，838號所記載的利用所謂二元載體的技術。用於植物的轉化的「植物細胞」可採用任意一種植物細胞。植物細胞為培養細胞、 培養組織、培養器官或整個植物體。「植物組織」可為分化的或未分化的植物組織，例如，包括根、莖、葉、花粉、種子、瘤 組織及用於培養的多樣形態的細胞，即單一細胞，原生質體(protoplast)、種子及愈傷組 織，但並不限於此。植物組織可為植物體(in planta)或器官培養，組織培養或細胞培養狀 態。並且，本發明還提供轉化含β-胡蘿蔔素羥化酶基因的重組植物RNAi載體的， 胡蘿蔔素含量增加的植物。上述植物優選為甘薯。並且，本發明還提供由β -胡蘿蔔素含量增加的植物得到的種子。下面，將對本發明進行詳細說明。本發明提供來源於甘薯的β -胡蘿蔔素羥化酶的cDNA片段。本發明中的β -胡 蘿蔔素羥化酶基因片段長度為371bp，編碼123個胺基酸(圖1)。將基因在資料庫中進行 Blast比對，結果表明其與各個植物中的胡蘿蔔素羥化酶高度同源(圖2)。並且，用 Blast(BlastX)對本發明中的β _胡蘿蔔素羥化酶的編碼片段的胺基酸序列進行比對調查 時，與牽牛花的putative基因有99%的最高同源性，對柿子、龍膽、咖啡、蜜桔等也有80% 以上的很高的同源性。(圖3)本發明所涉及的胡蘿蔔素羥化酶基因確認為除了莖以外的，尤其在葉子和根 部強表達的基因(圖4)。構建了旨在抑制本發明中β-胡蘿蔔素羥化酶基因表達的RNAi載體。(圖5)從本發明所涉及的旨在抑制β -胡蘿蔔素羥化酶基因表達的RNAi載體轉化的愈 傷組織中提取出基因組DNA，並進行PCR分析。在β-胡蘿蔔素羥化酶基因RNAi轉化體中， 從3、5、6、7、10、23、38愈傷組織中確認了 PCR產物(圖6)。
7
將本發明中的β -胡蘿蔔素羥化酶RNAi轉化愈傷組織與對照的『慄米』(甘薯品 種)愈傷組織進行比較的結果為，確認出轉化的愈傷組織因生產胡蘿蔔素顯示為深黃 色的表現形態(圖7)。並且，由於在本發明中導入通過克隆而得的β -胡蘿蔔素羥化酶基 因的RNAi載體，使β -胡蘿蔔素的生物合成增加，因此確認為愈傷組織呈黃色。將本發明中的β -胡蘿蔔素羥化酶基因的轉化愈傷組織作為對象，通過RT-PCR實 際確認了 胡蘿蔔素羥化酶基因的表達是否被抑制。為β -胡蘿蔔素羥化酶轉化愈傷組織的情況下，確認了所有的愈傷組織(5，7，38) 中基因的表達被完全抑制。(圖8)將本發明中的β-胡蘿蔔素羥化酶基因的轉化愈傷組織作為對象，利用HPLC對 β -胡蘿蔔素的生產進行了分析。對照慄米愈傷組織中在保留時間12. 5min時沒有出現特 徵峰，並且通過與β-胡蘿蔔素的標準品的比較分析，確認了新出現的特徵峰為胡蘿蔔 素。因此可以確認抑制胡蘿蔔素羥化酶基因表達的轉化愈傷組織胡蘿蔔素含量的 增加(圖9)。以本發明中的β -胡蘿蔔素羥化酶基因的轉化愈傷組織為對象，對表現出低分子 抗氧化活性的DPPH自由基(radical)消除活性進行調查的結果為，確認了比對照慄米的活 性高出2 4倍以上，可知相當於β-胡蘿蔔素含量很高的新黃美品種的活性水準。並且， 確認了本發明中胡蘿蔔素含量增加的轉化體實際上其低分子抗氧化活性也一起增加 了(圖 10)。對本發明中的β -胡蘿蔔素羥化酶基因的轉化愈傷組織分別用150mM和200mM的 NaCl進行處理後，通過DAB染色測定了細胞內氧化程度。結果為，對照慄米愈傷組織由活性 氧的增加引起的DAB褐變的進行多於轉化愈傷組織。(圖11A)。具體地說，對氧化的DAB 的量進行測定的結果，總體上，200mM的NaCl的處理中，由細胞內氧化壓力引起的DAB氧化 程度要高於150mM的NaCl處理。並且，對氧化的DAB的量進行測定的結果，確認出，與對照 相比，由減少1/2變成減少到1/5以上(圖11B)。並且抑制β -胡蘿蔔素羥化酶基因表達 的轉化愈傷組織，隨著胡蘿蔔素的含量增加其抗氧化活性也隨之增加，可確認細胞內 去除活性氧的能力也增加了。並且，本發明中，通過調節基因的表達，提高胡蘿蔔素含量，不僅提高了機能 性，也可以有效應用於開發具有高耐受性的植物體。下面，通過實施例對本發明進行詳細地說明。下述實施例只是對本發明的例示，本 發明的內容並不僅限於下列實施例。實施例1甘薯β -胡蘿蔔素羥化酶基因的克隆，鹼基序列分析及親緣關係分析利用QIAGEN 公司的 RNeasy Mini Kit，從甘薯(Ipomoea batatas (L.) Lam)新黃 美品種植物體的葉子中分離出了總RNA。利用hvitrogen的RT-PCR用SuperScript III First-Strand Synthesis System合成了第一鏈cDNA。為分離β -胡蘿蔔素羥化酶基因， ^t TIGR PlantTranscript Assemblies ^ Φ (http//plantta. tigr. org/) M (Lycopersicon esculentum)的β -胡蘿蔔素羥化酶基因進行了 Blast比對。結果為，從 與甘薯接近的牽牛花(Ipomoea nil)的EST克隆(clone)中，找到了與β-胡蘿蔔素羥 化酶基因具有相似的鹼基序列的克隆，並根據這些基因設計了從甘薯中克隆的PCR引物 (primer)。
為了利用^witrogen的gateway表達系統，在引物的鹼基序列5』末端各追 加了銜接(adapter)序列(用大寫表示)。鹼基序列為胡蘿蔔素羥化酶正向引物 (5 『 -CAAAAAAGCAGGCTNNaagttccgtatactgagatgttc-3 『 ；SEQ ID No. 3)和反向引物 (5' -CAAGAAAGCTGGGTN cactctcctaaaataaggcacgtc-3『 ； SEQ ID No. 4)。利用Clonetech公司的advantage〗聚合酶進行了 PCR，並利用pGEMeasy克隆載體 (promega)將具有目的片段大小的PCR產物進行轉化後進行測序，確認了鹼基序列。β-胡蘿蔔素羥化酶基因的cDNA片段長度為371bp，編碼123個胺基酸(圖1)。 將基因在資料庫中進行Blast比對，其與各個植物中的胡蘿蔔素羥化酶表現出了高度 同源(圖2)。並且，對本發明中的β-胡蘿蔔素羥化酶的編碼片段的胺基酸序列進行 Blast(BlastX)比對調查後，與牽牛花的putative基因有99 %之高的同源性，對柿子、龍 膽、咖啡、蜜桔等也有80%以上的很高的同源性。(圖3)實施例2按組織分類分析甘薯β -胡蘿蔔素羥化酶基因的表達為了分析本發明中的甘薯胡蘿蔔素羥化酶基因的按組織分類的表達模式，進 行了 RT-PCR。利用QIAGEN 公司的 RNeasy Mini Kit，分離了總 RNA，利用 RT-PCR用 Superscript III First-Strand Synthesis System合成了第一鏈cDNA。引物的鹼基序列為β -胡蘿蔔素 羥化酶正向引物(5' -CAAAAAAGCAGGCTNN aagttccgtatactgagatgttc-3『 ；SEQ ID No. 5) 和反向引物(5' -CAAGAAAGCTGGGTN cactctcctaaaataaggcacgtc-3『 ；SEQ ID No. 6)。結果為，本發明所涉及的胡蘿蔔素羥化酶基因確認為除了莖以外，尤其在葉 子和根部表達很強的基因。(圖4)實施例3甘薯β -胡蘿蔔素羥化酶基因的植物表達載體的構建及轉化體的獲得構建了目的在於抑制本發明中的胡蘿蔔素羥化酶基因表達的RNAi載體(圖 5)。先將克隆有胡蘿蔔素羥化酶基因的PD0NR207載體進行BP反應，將基因克隆到 PD0NR207載體上。之後通過pD0NR207和作為RNAi載體的pH7GWIWG2(I)的LR反應構建出 了克隆的β -胡蘿蔔素羥化酶基因的RNAi載體。將RNAi載體以農桿菌(Agrobacterium) 為介導轉化到慄米愈傷組織(Ym)，並且選取了抗生素。利用htronBIOtechnology株式會 社的G-spin IIp基因組提取試劑盒(植物用)，將轉化的愈傷細胞作為對象提取出基因 組DNA後，用基因特異性引物進行了 PCR分析。β -胡蘿蔔素羥化酶RNAi轉化體中，從3、 5、6、7、10、23、38的轉化愈傷組織中確認了 PCR產物(圖6)。並且已確認轉化的愈傷細胞 中導入β -胡蘿蔔素羥化酶RNAi載體。實施例4由β -胡蘿蔔素羥化酶基因抑制表達引起的β -胡蘿蔔素含量增加為了確認本發明中的胡蘿蔔素羥化酶基因的表達抑制後，是否實際上引起了 胡蘿蔔素含量的增加，在表型方面，與作為對照愈傷組織的慄米進行了比較，結果為，通
過基因組DNA PCR確認的轉化愈傷細胞的顏色呈現深黃色(圖7)。並且，為確認β -胡蘿 卜素羥化酶基因是否得到了實際抑制，用上述實施例1的方法從轉化的愈傷細胞中提取出 RNA，進行了 RT-PCR。結果為，在β-胡蘿蔔素羥化酶轉化愈傷組織的情況下，確認出在所有 的愈傷細胞(5、7、38)中基因的表達被完全抑制(圖8)。因此，可以確認由於本發明中的 β -胡蘿蔔素羥化酶RNAi載體的導入，β -胡蘿蔔素羥化酶基因的表達被抑制。
9
並且，為了確認轉化愈傷細胞顏色的變化是否是由於β -胡蘿蔔素含量的增加所 引起的，利用HPLC對愈傷組織的類胡蘿蔔素進行了分析。用100%的丙酮對作為對照的 慄米愈傷組織和轉化愈傷組織進行萃取後，在包括5% THF的氰化甲烷的移動相上注入到 C18 柱(Alltech，Apollo C18 5u column，250mmX 4. 6mm)，在 450nm 處測定吸光度，用利用 β-胡蘿蔔素的標準曲線進行了比較分析。結果，作為對照的慄米愈傷組織中未在保留時間 12. 5min處出現特徵峰，而在轉化的愈傷組織萃取液中出現了該特徵峰，再與β -胡蘿蔔素 標準品進行比較後，確認了這個新特徵峰為β -胡蘿蔔素(圖9)。實施例5由轉化愈傷細胞的β -胡蘿蔔素含量增加引起的抗氧化活性增加以本發明中的β -胡蘿蔔素羥化酶基因轉化愈傷組織為對象，對表現出低分子抗 氧化活性的DPPH自由基消除活性進行了調查。著眼於β-胡蘿蔔素的抗氧化活性高這一 特點，為了確認轉化愈傷組織實際上是否由胡蘿蔔素含量增加引起了抗氧化活性的提 高，以慄米愈傷組織和轉化愈傷組織作為對象測定了 DPPH自由基消除活性，對低分子抗氧 化活性進行了分析，分別進行150mM和200mM的NaCl處理後，做了抗氧化活性比較。將慄 米和轉化愈傷組織用100%甲醇萃取後，在IOmM的DPPH溶液中反應30分鐘後，計算剩餘 的DPPH量，測定了低分子抗氧化活性，活性表現為與抗壞血酸具有相應的值。其結果確認 為，比對照的慄米活性高出2 4倍以上，可知達到了相似於β-胡蘿蔔素含量很高的新黃 美品種(Hm)的活性水準(圖10)。並且，可以確認本發明中胡蘿蔔素含量增加的轉化 體，實際上其低分子抗氧化活性也一同增加了。並且，以進行了 NaCl處理的愈傷組織作為對象，與活性氧進行反應而被氧化後， 再用褐變的DAB進行染色，對表型進行了比較。結果為對照的慄米愈傷組織內的由活性氧 的增加引起的DAB的褐變多於轉化愈傷組織中(圖11Α)。具體地，對氧化的DAB的量進行 測定的結果，總體上，200mM的NaCl的處理中由細胞內氧化壓力引起的DAB氧化程度要高於 在150mM的NaCl處理中的DAB的氧化度。並且對氧化的DAB的量進行測定的結果為，與對 照相比，可以確認由減少1/2變成減少1/5以上(圖11B)。並且，抑制β-胡蘿蔔素氧化酶 基因表達的轉化愈傷組織，隨著胡蘿蔔素含量的增加，抗氧化活性也增加，並能夠確認 細胞內去除活性氧的能力也得到了增加。
權利要求
1.甘薯(Ipomoeabatatas)的β-胡蘿蔔素羥化酶蛋白質，其由SEQID No. 2所示的氨 基酸序列構成。
2.編碼權利要求1中所述的胡蘿蔔素羥化酶蛋白質的基因。
3.如權利要求2中所述的基因，其特徵在於，所述基因由SEQIDNo. 1所示的鹼基序列 構成。
4.含有權利要求2所述基因的重組載體。
5.轉化權利要求4所述的重組載體的宿主細胞。
6.含有權利要求2所述基因的重組植物RNAi載體。
7.用重組植物RNAi載體轉化植物，抑制β-胡蘿蔔素羥化酶基因的表達，增加植物中 β-胡蘿蔔素含量的方法。
8.如權利要求7所述的方法，其特徵在於，所述植物為甘薯。
9.轉化權利要求6中所述的重組植物RNAi載體的，β-胡蘿蔔素含量增加的植物體。
10.如權利要求9所述的植物體，其特徵在於，所述植物體為甘薯。
11.權利要求9中所述的植物體的種子。
全文摘要
本發明提供甘薯的β-胡蘿蔔素羥化酶(β-carotene hydroxylase)蛋白質，編碼上述蛋白質的基因，含上述基因的重組載體，轉化上述重組載體的宿主細胞，含上述基因的重組植物RNAi載體，並且提供利用上述重組植物RNAi載體來增加植物β-胡蘿蔔素含量的方法，還提供轉化上述重組植物RNAi載體的、β-胡蘿蔔素含量增加的植物體及其種子。
文檔編號C12N5/10GK102061289SQ20101054803
公開日2011年5月18日 申請日期2010年11月15日 優先權日2009年11月13日
發明者安榮玉, 李幸順, 鄭在哲, 郭尚洙, 金善荷 申請人:韓國生命工學研究院