透明質酸衍生物及含有其的藥劑的製作方法

2023-05-25 00:57:16

專利名稱：透明質酸衍生物及含有其的藥劑的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種通過在生物體內可以分解的間隔物導入了非留類抗炎症化合物 及改善病情抗風溼化合物的透明質酸衍生物及其製造方法。
背景技術：
作為變形性膝關節症(OA)及風溼性膝關節炎(RA)等關節炎的治療劑，使用透明 質酸鈉溶液。透明質酸鈉溶液，通常作為注射劑被使用，對作為患部的膝、肩等的關節直接 給藥，為了改善由關節炎引起的機能障礙及抑制疼痛而被頻繁使用著。作為由這樣的關節炎引起的疼痛的抑制、緩和劑，也正在使用非甾類的抗炎症劑 (也叫作NSAIDs或NSAID)及矯正關節風溼病等病態的改善病情抗風溼化合物(下面，也叫 作DMARD)。一般來講，這些NSAIDs，經口給藥的情況多，且並用上述透明質酸鈉溶液注射劑 的注入給藥和NSAIDs的經口給藥並用的情況也多。在由經口給藥使用這些NSAIDs的過程 中，存在這樣的問題NSAIDs被吸收，在血液中循環，到達患部以前其幾乎完全消失。因此， 要使血中維持有效的量，NSAIDs到達患部，必須服用大量的NSAIDs。這種大量的NSAIDs經 口服用，有稱為消化器官障礙這樣的很大的副作用，正在成為問題。另外，作為DMARD，可以列舉與被認為是炎症原因的免疫異常等的控制有關的免疫 療法藥(免疫調整劑或免疫抑制劑)。另一方面，已知透明質酸是由以N-乙醯基-D-葡萄糖胺和D-葡糖醛酸的二糖單 元為基本骨架的重複結構構成的多糖，因為在各個二糖單元中含有羧基及多個羥基，親水 性極高。作為透明質酸親水性即與水分子的水和性高的一例，透明質酸可以保持自身體重 的約1000倍的水。但是以往，已知在這樣具有高的親水性的透明質酸中導入NSAIDs這樣 的疏水性高的藥劑時，由於透明質酸分子自身的疏水性增大，故在水中形成半不溶的膠狀 或不溶物的形態，作為注射劑的使用是困難或不可能的。而且，以長期緩釋為目的，隨著藥 劑的導入率的增加，不溶化程度也增大，形成不適合作為注射劑的形態。不限於NSAIDs，作為將藥劑導入透明質酸中的實例，報導了(專利文獻1)不通過 間隔物或通過間隔物使作為關節炎治療藥的基質蛋白酶抑制劑(MMP抑制劑)和透明質酸 結合成的結合體。但是在該報導中，作為MMP抑制劑和透明質酸的適當結合方式，列舉了更 強的共價鍵，暗示以在給藥部位中結合體不解離、分解為MMP抑制劑和透明質酸為前提，可 以期待MMP抑制劑的作用和透明質酸的效果的協同藥效。另外，作為與透明質酸的結合部 位，列舉了羧基，但是該羧基上藥劑的導入率非常低，另外，沒有進行作為注射劑適當的形 態(溶液)的處理。此外，也有將透明質酸用不溶性碳化二亞胺活化，使其與親核藥劑反應的報導
4(專利文獻2)，但這些藥劑不是NSAIDs，最終劑形是不溶性薄膜。另外，也有使用二低級烷 基硫膦基滷化物(Rpt-X)作為縮合劑，在透明質酸中導入各種藥劑的實例(專利文獻3)，但 未提及與配製的衍生物有關的劑形，在其配製中可以作為溶液使用的這樣的處理也未被加 入工序中。專利文獻1 :W099/59603專利文獻2 特表平3-502704專利文獻3 特開平9-18870
發明內容
通過在患部直接注入NSAIDs，避免通過NSAIDs的經口給藥引起的消化器官障礙 的問題的方法儘管理論上也可以考慮，但例如在膝關節腔內直接注入NSAIDs時，由於吸收 快，故NSAIDs效果持續時間短，這樣的方法一直沒被採用。另外，由於NSAIDs自身以疼痛 的緩和、抑制為目的，故這種方法不能作為關節症的根本治療。因此，本發明的目的在於，提供一種藥劑，通過製成在作為關節症治療劑的透明質 酸鈉上化學導入了 NSAIDs或DMARD而得到的新衍生物，並將其注入到患部，可以大大有助 於關節症伴隨疼痛的緩和、抑制及關節症的根本治療；以及提供一種通過控制NSAIDs或 DMARD的釋放而具有持續效果的藥劑。本發明者考慮上述目的，為了開發可以作為能注入到關節炎患者的患部的注射劑 使用，而且不僅對關節炎的根本治療，而且對疼痛、炎症的緩和、抑制也都具有高的效果的 NSAIDs導入的透明質酸衍生物及DMARD導入的透明質酸衍生物，進行了專心研究。結果發現，通過具有在生物體內可以分解的部位的間隔物在透明質酸中導入了 NSAIDs或DMARD的衍生物適於上述目的；而且優選在製造過程中，通過給予鹼處理，使溶解 性提高，可以得到作為注入劑(注射劑)可以注入的溶液可以利用的可溶性NSAIDs導入的 透明質酸衍生物及可溶性DMARD導入的透明質酸衍生物，完成了本發明。即本發明如下所述。1. 一種透明質酸衍生物，其中，通過具有在生物體內可以分解的部位的間隔物，抗 炎症化合物利用共價鍵結合在透明質酸上。2.如上述1所述的透明質酸衍生物，其中，抗炎症化合物選自非留類抗炎症化合 物及改善病情抗風溼化合物。3.如上述1或2所述的透明質酸衍生物，其中，抗炎症化合物具有羧基。4.如上述3所述的衍生物，其中，抗炎症化合物是選自由水楊酸、阿司匹林、甲芬 那酸、託芬那酸、氟滅酸、雙氯芬酸、舒林酸、聯苯丁酮酸、吲哚美辛、阿西美辛、氨芬酸、依託 度酸、聯苯乙酸、布洛芬、氟比洛芬、酮洛芬、萘普生、普拉洛芬、非諾洛芬、噻洛芬酸、奧沙普 嗪、洛索洛芬、阿明洛芬、扎託洛芬、吡羅昔康、替諾昔康、氯諾昔康、美洛昔康、噻拉米特、託 美汀、二氟尼柳、醋氨酚、氟喹氨苯酯、替諾立定和阿克他利組成的組中的化合物的殘基。5.如上述1 4中任一項所述的透明質酸衍生物，其中，間隔物是分別至少具有1 個以上的與透明質酸鍵合的官能團及與抗炎症化合物鍵合的官能團的化合物。6.如上述1 5中任一項所述的透明質酸衍生物，其中，間隔物選自碳數2 18 的二氨基烷烴、可以具有取代基的碳數2 12的氨基烷基醇及胺基酸。
7.如上述1 6中任一項所述的透明質酸衍生物，其中，透明質酸的重均分子量為 500，000 3，000，000。8.如上述1 7中任一項所述的透明質酸衍生物，其中，每個透明質酸的重複2糖 單元導入了 5 50摩爾％的抗炎症化合物。9. 一種透明質酸衍生物，通過非留類抗炎症化合物用共價鍵結合在透明質酸上 而得到，其中，導入了該抗炎症化合物的透明質酸組成二糖單元每個的部分結構，用下述式 ⑴表示Y-CO-NH-R-^-R2)^!)Y-C0-表示透明質酸的組成二糖單元1殘基，R2表示用Z-C0-表示的非留類抗炎 症化合物殘基或氫原子(其中，不包括全部為氫原子的情況)、-HN-R1-^-、表示用含有n 個羥基的！！力-！^-⑴！！^表示的間隔物化合物的間隔物殘基，R1表示可以具有取代基的碳數 2 12的直鏈或具有分支的烴基，-C0-NH-表示作為透明質酸的組成糖的葡糖醛酸的羧基 和間隔物化合物具有的氨基的醯胺鍵，-0-C0-表示間隔物化合物具有的羥基和非留類抗炎 症化合物殘基具有的羧基的酯鍵；n表示1 3的整數；另外，該透明質酸衍生物中的非甾 類抗炎症化合物的導入率為每個透明質酸的重複二糖單元5 50摩爾％，構成透明質酸衍 生物的透明質酸殘基中的羰基，根據非類固醇抗炎症化合物殘基的導入率，作為參與與該 間隔物結合的抗炎症化合物殘基的鍵合的醯胺鍵或者作為不參與與該間隔物結合的抗炎 症化合物殘基的鍵合的游離的羧基存在。10.如上述9所述的透明質酸衍生物，其中，非留類抗炎症化合物是用下述式(2)
表示的化合物。
,3
R、
^V^COOH
(2)R3表示選自低級烷基及低級烷氧基的取代基或氫原子；R4、R5及R6分別獨立地表 示選自由低級烷基、低級烷氧基及羥基組成的組中的取代基、滷原子或氫原子；X分別獨立 地相同或不同，表示選自低級烷基及三氟甲基的取代基或滷原子，至少X的任一個是滷原 子。11.如上述10所述的透明質酸衍生物，其中，非留類抗炎症化合物是雙氯芬酸或 其衍生物。12.如上述9 11中任一項所述的透明質酸衍生物，其中，所述式(1)中的R1是
可以具有取代基的亞乙基、三亞甲基或亞丙基。13.如上述1 12中任一項所述的透明質酸衍生物，其通過包括使透明質酸和間 隔物結合的抗炎症化合物反應或者使間隔物結合的透明質酸與抗炎症化合物反應，然後使
6該反應液成為鹼性條件的工序的方法可以得到。14.如上述1 13中任一項所述的透明質酸衍生物，其特徵在於，將所述透明質酸 衍生物以1. 0重量％溶解在水性介質中得到的溶液，在溫度為24°C的條件下，在5. Okg/cm2 的加壓下，可以1分鐘通過多孔過濾器(孔徑(孔隙大小)0. 4511111、直徑25111111)21^以上。15.如上述1 13中任一項所述的透明質酸衍生物，其特徵在於，將所述透明質 酸衍生物以1. 0重量％溶解在水性介質中得到的溶液，在溫度24°C的條件下，在5. Okg/cm2 的加壓下，可以1分鐘通過多孔過濾器(孔徑(孔隙大小)0. 2211111、直徑25111111)21^以上。16. 一種利用注入裝置可以推出的透明質酸衍生物溶液，通過上述1 15中任一 項所述的透明質酸衍生物溶解在水性介質中而得到。17.如上述16所述的透明質酸衍生物溶液，其中，水性介質是選自磷酸緩衝生理 鹽水、生理鹽水及注射用水的水性介質。18.如上述17所述的透明質酸衍生物溶液，其被過濾滅菌。19. 一種藥劑，其含有上述1 15中任一項所述的透明質酸衍生物作為有效成分。20.如上述19所述的藥劑，其是關節炎處置劑、抗炎症劑或鎮痛劑。21.如上述19或20所述的藥劑，其是非經口給藥用。22.如上述21所述的藥劑，其是局部給藥用的注入劑。23.如上述21或22所述的藥劑，其是關節給藥用的注入劑。24. 一種利用注入裝置可以推出的藥劑，其含有上述1 15中任一項所述的透明 質酸衍生物作為有效成分，並且由在水性介質中溶解了該透明質酸衍生物的溶液構成。25. 一種透明質酸衍生物注入用試劑盒，通過上述16 18中任一項所述的透明質 酸衍生物溶液填充在可以推出該溶液的注入裝置中而得到。26.如上述25所述的試劑盒，其中，填充的溶液是權利要求19 24中任一項所述 的藥劑。27. 一種醫療用注射劑試劑盒，通過將在藥學上容許的磷酸緩衝生理鹽水、生理鹽 水或注射用水中溶解有上述1 15中任一項所述的透明質酸衍生物的溶液填充在注射筒 中，並用藥劑推出用柱塞可以滑動地密封而得到。28. 一種由具有在生物體內可以分解的部位的間隔物和抗炎症化合物共價鍵合而 成的衍生物。29.如上述28所述的衍生物，其中，具有在生物體內可以分解的部位的間隔物是
二氨基烷烴、氨基烷基醇或胺基酸的殘基。30.如上述28或29所述的衍生物，其中，具有在生物體內可以分解的部位的間隔 物是對1分子該間隔物可以鍵合2個以上抗炎症化合物的化合物的殘基。31.如上述28 30中任一項所述的透明質酸衍生物，其中，抗炎症化合物是選自 由水楊酸、阿司匹林、甲芬那酸、託芬那酸、氟滅酸、雙氯芬酸、舒林酸、聯苯丁酮酸、噴哚美 辛、阿西美辛、氨芬酸、依託度酸、聯苯乙酸、布洛芬、氟比洛芬、酮洛芬、萘普生、普拉洛芬、 非諾洛芬、噻洛芬酸、奧沙普嗪、洛索洛芬、阿明洛芬、扎託洛芬、吡羅昔康、替諾昔康、氯諾 昔康、美洛昔康、噻拉米特、託美汀、二氟尼柳、醋氨酚、氟喹氨苯酯、替諾立定和阿克他利組 成的組中的化合物的殘基。32.如上述28 31中任一項所述的衍生物，其中，共價鍵是酯鍵或醯胺鍵。
33.如上述32所述的衍生物，其用下述式(3)表示^N-Ri-^-R2、 (3)其中，R2表示用Z-C0-表示的非留類抗炎症化合物殘基或氫原子(其中，不包 括全部是氫原子的情況)，^N-R1-^-、表示用含有n個羥基的Hp-R^OH、表示的間隔 物化合物的間隔物殘基，R1表示可以具有取代基的碳數2 12的直鏈或具有分支的烴 基，-o-co-表示間隔物化合物具有的羥基和非留類抗炎症化合物殘基具有的羧基的酯鍵； n表示1 3的整數。34. 一種透明質酸衍生物製造方法，所述透明質酸衍生物是通過具有在生物體內 可以分解的部位的間隔物，抗炎症化合物用共價鍵結合在透明質酸上而得到的，該方法的 特徵在於，使透明質酸和間隔物結合的抗炎症化合物反應，或者使間隔物結合的透明質酸 和抗炎症化合物反應。35.如上述34所述的透明質酸衍生物製造方法，其特徵在於，包括在鹼性條件下 處理透明質酸和間隔物結合的抗炎症化合物的反應生成物或間隔物結合的透明質酸和抗 炎症化合物的反應生成物的溶液的工序。通過本發明，提供一種透明質酸衍生物，通過具有在生物體內可以分解的部位的 間隔物，抗炎症化合物通過共價鍵結合在透明質酸上而得到，特別是非留類抗炎症化合物 通過共價鍵結合的非留類抗炎症化合物導入的透明質酸衍生物(下面，也叫作本發明的物 質1)；同樣提供改善病情抗風溼化合物用共價鍵結合的改善病情抗風溼化合物導入的透 明質酸衍生物(下面，也叫作本發明物質2，另外，前述的本發明物質1和本發明物質2加在 一起，叫做本發明物質)，以及含有這些衍生物作為有效成分的藥劑(下面，也叫本發明藥 劑)。本發明的物質，由於易於溶解在作為注射劑等的溶劑使用的緩衝液、生理鹽水、注射用 水等中，故可以作為可以在患部直接給藥的注射劑使用。另外，本發明藥劑，可以用於關節 炎的治療、炎症的抑制及疼痛的抑制，也可以作為注入劑非經口給藥或局部給藥(例如關 節內給藥)。


[圖1]是表示對大鼠緩激肽引起疼痛模型的疼痛評分圖。[圖2]是表示對大鼠硝酸銀溶液引起疼痛模型的疼痛評分圖。[圖3]是表示對大鼠硝酸銀溶液引起疼痛模型的荷重加載率(％)的圖。[圖4]是表示通過對兔膝關節進行氨基丙醇酮洛芬導入的透明質酸鈉(KP-HA)、 酮洛芬和HA混合及酮洛芬的給藥兔膝關節內的歷時殘存率的圖。[圖5]是表示導入率(DS)不同的氨基丙醇雙氯芬酸導入的透明質酸鈉對大鼠 1 %硝酸銀溶液引起疼痛模型的效果圖。[圖6]是表示對大鼠硝酸銀溶液引起疼痛模型的雙氯芬酸鈉經口給藥產生的 效果圖。[圖7]是表示雙氯芬酸單劑、透明質酸對大鼠硝酸銀溶液引起疼痛模型的效 果圖。[圖8]是表示氨基丙醇雙氯芬酸導入的透明質酸(65kDa)鈉、二氨基丙烷-雙氯 芬酸導入的透明質酸鈉及氨基乙醇-雙氯芬酸導入的透明質酸鈉對大鼠硝酸銀溶液引起疼痛模型的效果比較圖。[圖9(a)]是表示雙氯芬酸鈉單劑及雙氯芬酸導入的透明質酸衍生物對C0X-2的 作用(體外)圖。[圖9(b)]是表示透明質酸鈉單劑及雙氯芬酸導入的透明質酸衍生物對C0X-2的 作用(體外)圖。[圖10(a)]是表示對大鼠佐劑性關節炎(AIA)模型的佐劑給藥足中通過雙氯芬酸 導入的透明質酸衍生物的給藥引起的效果圖。[圖10(b)]是表示相對大鼠佐劑性關節炎(AIA)模型的佐劑非給藥足中通過雙氯 芬酸導入的透明質酸衍生物的給藥引起的效果圖。
具體實施例方式下面，通過發明的實施方式詳細地說明本發明。本發明物質是通過具有在生物體內可以分解的部位的間隔物，抗炎症化合物用共 價鍵結合在透明質酸上的透明質酸衍生物。在本發明中，所謂抗炎症化合物，選自非留類抗 炎症化合物(NSAID或NSAIDs)及改善病情抗風溼化合物。需要說明的是，「NSAIDs」用於總稱多種化合物分類的非甾類抗炎症化合物的情 況，「NSAIDs」也有時指各自的非甾類抗炎症化合物的情況，在本發明書中不是特別嚴格地 分開使用。本發明物質1是非留類抗炎症化合物用共價鍵結合著的透明質酸衍生物，示意結 構用如下的通式(4)表示。HA-SP-NSAID (4)(HA表示透明質酸鏈，SP表示間隔物殘基，NSAID表示非留類抗炎症化合物殘基， 並且，_表示共價鍵)另外，本發明物質2是改善病情抗風溼化合物用共價鍵結合著的透明質酸衍生 物，示意結構用如下通式(5)表示。HA-SP-DMARD (5)(HA表示透明質酸鏈，SP表示間隔物殘基，DMARD表示改善病情抗風溼化合物殘 基，並且，-表示共價鍵。)本發明物質在水性溶劑中可以溶解，其溶液是具有粘性的溶液。在此，所謂「水性溶劑」，是指水、含有水的緩衝液、藥學上容許的金屬鹽、pH調節劑 等的水溶液、緩衝液等，具體地例如有注射用水、磷酸緩衝生理鹽水、生理鹽水等。在本發明物質中使用的透明質酸，只要是以N-乙醯基-D-葡糖胺和D-葡糖醛酸 用日1，3鍵結合的二糖單元為基本骨架，該二糖單元重複並通過日1，4鍵結合而構成的葡 萄糖胺基葡聚糖，即通常使用的透明質酸，就沒有特別限定。另外，通過來自動物、微生物及 化學合成等任意方式得到的透明質酸都可以使用。透明質酸的重均分子量沒有特別限定，例如可以列舉10，000 5，000, 000。優選 500, 000 3，000，000、更優選為作為關節炎治療劑使用的規格600，000 1，500，000及 1，500，000 3，000，000。另外，本發明中使用的透明質酸可以是不形成鹽的游離的狀態，還可以是藥學上(6)進一步特別優選使用用下述式(2)表示的化合物。
R3
(2)R3表示選自低級烷基及低級烷氧基的取代基或氫原子。R4、R5及R6分別獨立地表
示選自由低級烷基、低級烷氧基及羥基組成的組中的取代基、滷原子或氫原子。X分別獨立
地相同或不同，表示選自低級烷基及三氟甲基的取代基或滷原子，至少X的任何一個是商 原子。另外，上述的低級烷基及低級烷氧基優選可以具有分支的碳數1 12的低級烷基及 低級烷氧基，更優選可以具有分支的碳數1 6的低級烷基及低級烷氧基。另外，在R3鍵合的苯環中將羧甲基設定為第1位，將氨基殘基設定為2位時，R3優
能容許的鹽的狀態。所謂透明質酸藥學上能容許的鹽的狀態，例如有鈉鹽、鉀鹽之類的鹼金 屬離子鹽及鎂鹽、鈣鹽之類的鹼土金屬離子鹽等。在適用於生物體的藥劑等中使用透明質 酸衍生物時，由於對生物體的親和性特別高，故使用的透明質酸鹽優選藥學上容許的鹼金 屬離子鹽，其中特別優選鈉離子鹽。作為本發明中的抗炎症化合物之一的NSAIDs，通常指被稱為非甾類抗炎症劑的全 部化合物，沒有特別限定，但其中特別優選適用於關節炎的化合物。目前作為NSAIDs的分 類法，有根據化學結構中的骨架的不同進行的分類。如果本發明中適用的NSAIDs按每種分 類舉例，則作為水楊酸類NSAIDs有水楊酸、阿司匹林等，作為芬那酸類NSAIDs有甲芬那酸、 託芬那酸、氟芬那酸等，作為芳基醋酸類NSAIDs有雙氯芬酸、舒林酸、聯苯丁酮酸、吲哚美 辛、阿西美辛、氨芬酸、依託度酸、聯苯乙酸等，作為丙酸類NSAIDs有布洛芬、氟比洛芬、酮 洛芬、萘普生、普拉洛芬、非諾洛芬、噻洛芬酸、奧沙普嗪、洛索洛芬、阿明洛芬、扎託洛芬等， 作為昔康類NSAIDs有吡羅昔康、替諾昔康、氯諾昔康、美洛昔康等，作為其它的NSAIDs有噻 拉米特、託美汀、二氟尼柳、醋氨酚、氟喹氨苯酯、替諾立定等。作為在本發明中使用的NSAIDs，優選在其化學結構中具有羧基、羥基、氨基等的官 能團的NSAIDs。本發明物質1，由於可以根據這些NSAIDs具有的官能團選擇間隔物的官能 團，故沒有特別限定，但特別優選使用至少具有羧基的NSAIDs。其中，更優選適用具有用下述式(6)表示的骨架的化合物。
(T^^COOH
10選在5位的位置上鍵合。作為用上述式⑵表示的化合物，例如可以列舉W099/11605中所述的化合物，該 公報的記載內容通過弓I用併入本說明書。另外，NSAID具有的羧基可以是游離型，也可以形成鹽。本發明中抗炎症化合物之一的DMARD，通常指作為抗風溼病劑被使用的全部藥劑， 沒有特別限定，但優選在其化學結構中含有羧基、羥基、氨基、巰基等官能團的DMARD。作為 DMARD，例如可以列舉阿克他特、甲氨喋呤、柳氮磺胺嘧啶、布西拉明等。另外，作為本發明中的抗炎症化合物，例如有上述說明的NSAID及DMARD，但其中 優選具有羧基的化合物。另外，通過根據上述的NSAIDs及DMARD含有的官能團選擇間隔物的官能團，可以 用希望的結合方式導入透明質酸。另外，本發明物質，不一定必須導入1種NSAIDs或DMARD， 也包含導入2種以上的NSAIDs或DMARD的透明質酸衍生物。用前述的SP表示的間隔物，是具有在生物體內可以分解的部位的間隔物，是分別 至少具有1個以上與透明質酸鍵合的官能團及與NSAIDs及DMARD鍵合的官能團的化合物 (下面，也叫作間隔物化合物)的殘基。間隔物的在生物體內可以分解的部位，只要是由該 透明質酸衍生物游離的NSAIDs及DMARD具有效果就沒有限定，但優選在NSAIDs及DMARD 和間隔物的鍵合部位被分解。間隔物化合物的官能團，通過與各個透明質酸及NSAIDs或DMARD的結合方式可 以有種種選擇。例如通過與透明質酸的羧基的醯胺鍵導入間隔物時，可以選擇具有氨基的 間隔物化合物；通過與透明質酸的羧基的酯鍵導入時，可以選擇具有羥基的間隔物化合物； 通過與透明質酸的羥基的酯鍵導入時，可以選擇具有羧基的間隔物化合物。此時，根據導入透明質酸的難易程度及在生物體內的穩定性，具有可以通過醯胺 鍵導入透明質酸的羧基上的氨基的間隔物化合物作為優選的方式之一。同樣，與NSAIDs或DMARD鍵合的間隔物化合物的官能團，也可以根據NSAIDs或 DMARD具有的官能團進行選擇。例如，在具有羥基的NSAIDs或DMARD的情況下，如果選擇具 有羧基的間隔物化合物，則可以利用酯鍵結合；在具有羧基的NSAIDs或DMARD的情況下，如 果選擇具有羥基的間隔物化合物，則可以利用酯鍵結合，如果選擇具有氨基的間隔物化合 物，則可以利用醯胺鍵結合；在具有巰基的NSAIDs或DMARD的情況下，如果選擇具有羧基的 間隔物化合物，則可以利用硫酯鍵結合。這種情況下，考慮在生物體內分解的難易程度，優選具有可以用酯鍵與NSAIDs或 DMARD鍵合的官能團的間隔物化合物，進一步特別優選用酯鍵與NSAIDs或DMARD的羧基和 間隔物化合物的羥基鍵合。間隔物化合物，如上所述，可以根據透明質酸及NSAIDs或DMARD的特性進行適當 選擇，例如可以列舉碳數2 18的二氨基烷烴、可以具有取代基的碳數2 12的氨基烷 基醇、胺基酸等。作為胺基酸，可以是天然、非天然的胺基酸，沒有特別限定，但優選甘氨酸、
丙氨酸、氨基丁酸。如上所述，在考慮了與透明質酸及NSAIDs的結合方式的情況下，作為間隔物化合 物的優選例之一，例如可以列舉可以具有取代基的碳數2 12的氨基烷基醇。另外，在1分子中具有2個以上與NSAIDs或DMARD鍵合的這些官能團的間隔物化
11合物(下面，也叫作多價間隔物化合物)也可以。選擇多價間隔物化合物時，在1個間隔物中可以同時結合多個NSAIDs或DMARD。 因此，對於導入NSAIDs或DMARD的透明質酸的官能團，例如1個羧基，可以同時導入多個 NSAIDs或DMARD。作為這些多價間隔物化合物的例子，例如有絲氨醇及其衍生物、絲氨酸 衍生物、蘇氨酸衍生物、2-氨基-1，5-戊二醇及其衍生物、3-氨基-1，2-丙二醇及其衍生 物、三(羥甲基)氨基甲烷及其衍生物，Bis-Homotris及其衍生物。使用該多價間隔物化合物的優點在於不使多個有助於透明質酸親水性的羧基及 羥基參與取代反應，可以導入更多的NSAIDs或DMARD，故雖然導入很多NSAIDs或DMARD，但 仍可以更加保持親水性即對水性介質的可溶性。本發明物質的合成方法，只要是可以得到如上所述的本發明物質的方法就沒有特 別限定。另外，一般來講，在透明質酸上導入了化合物的透明質酸衍生物中，由於透明質酸 具有的羧基及羥基參與化合物的結合，故伴隨物質的導入率的上升，透明質酸衍生物的親 水性降低。作為本發明物質1的合成方法之一例，例如可以列舉有如下特徵的方法通過具 有在生物體內可以分解的部位的間隔物在透明質酸上導入NSAIDs的導入反應後，進行鹼處理。將上述導入反應後的反應溶液作成鹼性的鹼處理，只要是該溶液成為鹼性的處理 就沒有特別限定。具體地來講，例如有將有機鹼或無機鹼的任何一種添加到該溶液中的方 法，但如果考慮以後的處理等，優選無機鹼。而且，即使在無機鹼中，與氫氧化鈉之類的強鹼 相比，從對透明質酸及NSAIDs產生影響的可能性低的方面考慮，更優選碳酸氫鈉及碳酸鈉 這樣的弱鹼。在此的鹼處理的PH條件例如為7. 2 11，優選7. 5 10。鹼處理的處理時間，只要對透明質酸的低分子化不產生影響就沒有特別限定，例 如2 12小時，優選2 6小時，如果進行該時間的處理，則可以得到對透明質酸不產生影 響的可溶性的透明質酸衍生物。作為具體的一例，將導入了間隔物的NSAIDs衍生物與透明質酸反應後，在反應液 中加入例如碳酸氫鈉等的弱鹼，進行幾小時攪拌處理，然後通過中和、乙醇沉澱、乾燥等的 後處理，可以得到目的物可溶性的透明質酸衍生物。上述的方法，也可以適用於本發明物質2的合成，可以得到可溶性的本發明物質 2。另外，對於在透明質酸上導入間隔物及NSAIDs或DMARD的方法，在透明質酸上導 入間隔物後，在該間隔物鍵合的透明質酸上導入NSAIDs或DMARD的方法，或預先在NSAIDs 或DMARD上導入間隔物後，在透明質酸上導入該間隔物鍵合的NSAIDs或該間隔物鍵合的 DMARD的方法的任一種都可以，但優選後者的方法。分別使NSAIDs或DMARD、透明質酸及間隔物鍵合的方法沒有特別限定，例如，只要 是可以完成酯鍵合、醯胺鍵合及硫酯鍵合等的方法，則作為進行該鍵合反應的手段，可以使 用一般使用的常規方法，即使與反應條件有關，本領域的技術人員也可以適宜地判斷選擇。另外，透明質酸和間隔物鍵合的NSAIDs或間隔物鍵合的DMARD，或與間隔物化合 物的鍵合，利用透明質酸的羧基或羥基的任一個都可以完成。但從官能團具有的反應性的
12高低來看，羧基可以容易地完成。作為實現這種鍵合的方法，例如使用水溶性碳化二亞胺等 (例如，1-乙基-3- (3- 二甲基氨基丙基)-碳化二亞胺鹽酸鹽(EDC1 -HC1)、1-乙基-3 (3- 二 甲基氨基丙基)碳化二亞胺甲碘化物等)等的水溶性的縮合劑的方法，使用N-羥基琥珀醯 亞胺(HOSu)及N-羥基苯並三唑(HOBt)等的縮合輔助劑和上述的縮合劑的方法，活性酯 法，酸酐法等。在這些當中，作為水性溶劑存在下的反應，優選使用水溶性的縮合劑的方法、 或使用縮合輔助劑和水溶性的縮合劑的方法，特別是從副反應的抑制這種觀點來看，更優 選使用縮合輔助劑和水溶性的縮合劑的方法。這種透明質酸的羧基與間隔物鍵合的NSAIDs 或間隔物鍵合的DMARD、或與間隔物化合物的鍵合，優選用酯鍵或醯胺鍵進行，更優選用醯 胺鍵進行。本發明物質中的對透明質酸的NSAIDs或DMARD的導入率，在本發明物質的合成工 藝中，通過改變縮合劑、縮合輔助劑、間隔物鍵合的NSAIDs或間隔物鍵合的DMARD的投入量 可以調整。另外，導入率用使用吸光度的測定及HPLC、NMR等的方法可以測定。在本發明中，只要能保持該衍生物在水性介質中的可溶性，NSAIDs或DMARD的導 入率沒有特別限定，但優選每個透明質酸的重複二糖單元為0. 1 80摩爾％，更優選5 50摩爾％。另外，以本發明物質作為醫藥品的有效成分使用時，考慮在患部的NSAIDs或 DMARD的有效濃度或緩釋效率確定適合的導入率。如上所述，在透明質酸的羧基上導入間隔物鍵合的NSAIDs或間隔物鍵合的DMARD 時，羧基通過形成醯胺鍵或酯鍵就會降低、喪失其親水性。作為解決該問題的手段之一，通過利用多價間隔物化合物，可以更加仍舊維持親 水性，導入較多的NSAIDs或DMARD。例如，在間隔物化合物中使用具有3個羥基和1個氨基 的氨基三醇衍生物時，如果3個羥基上完全導入NSAIDs，則1分子間隔物就會導入3個分子 的NSAIDs。該氨基三醇鍵合的NSAIDs相對於透明質酸的羧基以例如20%的取代率(每個 透明質酸二糖單元的取代率)導入時，NSAIDs的導入率就成為所謂3倍的60%。而且，如上所述，作為本發明物質的合成方法之一例，例如，使用在用於合成抗炎 症化合物導入的透明質酸衍生物的導入反應後進行鹼處理的方法時，保持得到的透明質酸 衍生物在水性介質中的溶解性。該溶解性的保持效果不需要過於考慮間隔物化合物的種類 及藥劑的導入率等，另外，由於是簡單的處理，故非常有用。概括上述的說明，例如作為具體的本發明物質1的適合的形態，例如有具有通過 下述式(1)表示的透明質酸組成二糖單元的透明質酸衍生物。另外，下述式(1)表示導入 了抗炎症化合物的N-乙醯基-D-葡萄糖胺和D-葡糖醛酸進行0 -1，3鍵合的透明質酸組 成二糖單元每個的部分結構。Y-C0-NH-R-(0-R2)n (1)Y-C0-表示透明質酸的組成二糖單元1殘基，R2表示用Z-C0-表示的NSAIDS 基或氫原子(其中，不包括全部為氫原子的情況)、-HN-R1-^-、表示用含有n個羥基的 邸-！^-⑴！^表示的間隔物化合物的間隔物殘基，R1表示可以具有取代基的碳數2 12的 直鏈或具有分支的烴基，-C0-NH-表示作為透明質酸的組成糖的葡糖醛酸的羧基和間隔物 化合物具有的氨基的醯胺鍵，-0-C0-表示間隔物化合物具有的羥基和NSAID具有的羧基的 酯鍵。n表示1 3的整數。需要說明的是，構成透明質酸衍生物的透明質酸殘基中的羰 基，根據NSAID殘基導入率，作為參與同該間隔物鍵合的抗炎症化合物殘基的鍵合的醯胺鍵，或作為不參與的游離的羧基而存在。作為R1中的取代基，列舉有烷基、烯基、芳基、烷氧基、醯基、羧基、滷素等，烷基、 烯基、烷氧基、醯基中的碳數優選為1 11，更優選為1 4，作為芳基優選苯基。例如作為 具有羧基取代基的間隔物化合物，例如有絲氨酸；作為具有羧基和甲基的間隔物化合物，例 如有蘇氨酸。另外，根據上述式(1)，Y-C00H表示反應前的一個透明質酸組成二糖單元， ！！力-！^-⑴！！^表示反應前的間隔物化合物，H00C-Z表示反應前的NSAID。作為合成用上述式(1)表示的透明質酸組成二糖單元最適合的方法，例如有使間 隔物化合物和NSAID結合後，接著，使其與透明質酸反應的方法。概念性表示該反應如下所 述R^N-R1-(OH) n+HOOC-Z —(酯形成)—(脫保護)—HJ-R1-(0-R2) n
HA-R1- (0-R2) n+Y-COOH —Y-C0-NH-R1-(0-R2) nR7表示氨基保護基，作為保護基，可以使用作為氨基的保護基通常使用的保護基， 沒有特別限定，例如有叔丁氧羰基、苄氧羰基、9-芴甲氧羰基之類的尿烷型保護基及甲醯 基、苯二甲醯基類的醯基型保護基，優選尿烷型保護基。另外，R1、R2及Z與前述意義相同。但是，上述是概念性表示反應途徑的內容，如果是本領域技術人員，能考慮的有效 地進行反應的辦法等省略。在上述式(1)中，R1更優選可以具有取代基的碳數2 5的直鏈或具有分支的烴 基，其中優選碳數為2或3的烴基，例如有亞乙基、三亞甲基或亞丙基等。另外，作為在上述式(1)中使用的NSAID，可以從如上所述的NSAID中選擇。例如 進一步優選用下述式(7)表示的化合物。 R8表示選自低級烷基及低級烷氧基的取代基或氫原子，更優選可以具有分支的碳 數1 12的低級烷基或氫原子，其中更優選碳數1 4的低級烷基或氫原子。X\X2分別獨立地表示選自低級烷基及三氟甲基的取代基或滷原子，至少任何一個 為滷原子，x\x2更優選相同或不同的滷原子，其中更優選選自氟原子或氯原子。另外，在R8鍵合著的苯環中，將羥基甲基設定為1位，將氨基殘基設定為2位的情 況下，R8優選在5位的位置上鍵合。作為用上述式(7)表示的化合物的典型的例子，例如有用下述式⑶及(9)表示 的化合物。 例如，在合成使用式(9)表示的雙氯芬酸的雙氯芬酸導入的透明質酸衍生物時， 上述式(1)中的-C0-Z用下述式(10)表示。
(10)需要說明的是，雙氯芬酸導入的透明質酸衍生物，具有非常強的鎮痛作用、抗炎症 作用。作為具有用上述式(1)表示的透明質酸組成二糖單元的本發明物質中可以使用 的透明質酸，優選具有重均分子量50，000 3，000, 000的透明質酸，更優選具有重均分子 量50，000 2，000, 000的透明質酸。具有用上述式(1)表示的透明質酸組成二糖單元的本發明的物質中的NSAIDs的 導入率(DS)，每個透明質酸的重複二糖單元優選5 50摩爾％，更優選10 50 %。作為本發明物質的大的特徵，例如有本發明物質在水性溶劑中是可以溶解的，即 是易水溶性的，當在本發明物質中添加水性溶劑時，不進行加溫及增溶處理等而溶解。另 外，即使導入率高，例如5%以上，甚至為10%以上，也可以溶解。因此，在水性介質中使本 發明物質溶解的溶液是可以注入的液體狀，並且，對過濾用過濾器具有通過性。順便說一 下，如上所述，已知在具有高的親水性的透明質酸上導入NSAIDs或DMARD那樣的疏水性高 的藥劑時，由於透明質酸分子自身的疏水性增大，故成為在水中半不溶的粘彈性高的膠狀 或不溶物的形態，作為由注入裝置推出的注入劑不合適。但是，本發明物質，例如，如上所述，通過在製造過程中進行鹼處理，保持透明質酸 衍生物的溶解性，因此，可以形成對過濾用過濾器具有通過性的透明溶液。因此，本發明物質的溶液可以進行過濾器過濾，通過過濾器過濾可以除塵、除菌、
15滅菌。即，通過使其通過5 μ m或0. 45 μ m的過濾器，可以除塵、除菌，也可以更優選通過使 其濾過0. 22 μ m的過濾器進行滅菌。更具體地來講，在水性介質中以1.0重量％溶解本發明物質得到的溶液，優選在 溫度24°C的條件下，在5. Okg/cm2的加壓下，可以1分鐘通過多孔過濾器(孔徑(孔隙大 小)0· 45口111、直徑25謹)21^以上。另外，在水性介質中以1.0重量％溶解本發明物質得到的溶液，進一步優選在與 上述同樣的條件下，在5. Okg/cm2的加壓下，可以1分鐘通過多孔過濾器(孔徑(孔隙大 小)0. 22ym,l;@25mm) 2mL 以上。如後所述，作為將本發明物質應用於生物體(哺乳動物、特別優選人)的藥劑使用 時，由於除塵及殺菌、滅菌為必需項目，故本發明物質的這種特徵是非常有用的。另外，在通 過加熱及紫外線照射等的滅菌中，擔心透明質酸衍生物的分解及低分子化等，但在過濾滅 菌中，可以避免出現那樣的問題。所謂本發明藥劑，是含有本發明物質即透明質酸衍生物作為有效成分的藥劑。本 發明藥劑有效地利用如上所述的本發明物質的特性，可以得到利用注射裝置(注入裝置) 等可以推出的形態，也可以作為在水性介質中溶解了本發明物質的溶液利用。例如，以生物 體內可以給藥的生理鹽水、磷酸緩衝生理鹽水或注射用水作為溶劑，含有0. 1重量％ 10 重量％的本發明物質濃度的溶液。該溶液優選不混濁、並且是透明的。如上所述，本發明藥劑，可以通過過濾器過濾進行除塵、除菌、滅菌，通過使其進行 5 μ m或4. 5 μ m的過濾器過濾也可以除塵滅菌，也可以通過使其進行0. 22 μ m的過濾器過濾 進行滅菌。而且，本發明藥劑，在不影響本發明藥劑具有的可以過濾滅菌這樣的優點的範圍 內，本發明物質也可以與製藥上能容許的載體組合在一起使用。這樣製備的本發明藥劑，可以應用過濾滅菌，並且，優選為某種程度上具有粘彈性 的狀態。本發明藥劑，可以作為非經口給藥用藥劑及局部給藥用藥劑使用。作為在非經口 給藥及局部給藥中使用的形態，例如優選在水性溶劑中溶解了上述的本發明物質的溶液， 優選注射及注入等給藥方法(在說明書中，「注入」也有包含「注射」的情況)。通過注入， 進行局部給藥，由此可以避免在消化器官中的副作用。另外，由於也可以避免消化器官引起 的代謝，故可以通過經口給藥使給藥量減少，進一步也可以避免由大量的經口給藥引起的 全身性中毒的問題。在注射及注入等中使用的推出裝置，可以使用通過推出填充的藥劑達到給藥目的 的通常使用的注射器及注入裝置等器具。另外，也可以提供本發明藥劑及本發明物質的溶液填充在具備有藥劑推出用柱塞 等的可以推出的注入裝置內的試劑盒。另外，該試劑盒可以將在醫學上容許的磷酸緩衝生 理鹽水、生理鹽水或注射用水中溶解了本發明物質的溶液填充到注射筒內，做成用藥劑推 出用柱塞可以滑動地密封而成的醫用注射劑試劑盒。需要說明的是，藥劑推出用柱塞可以 使用通常使用的柱塞，但要通過橡膠或合成橡膠等形成，且可以滑動的以密合狀態插入注 射器中。另外，在試劑盒中，也可以含有用於推進柱塞、推出藥劑用的柱塞棒。本發明藥劑的所對疾患、給藥途徑沒有特別限定，優選可以用作以關節炎的處置、 炎症的抑制及疼痛的抑制等為目的的處理劑(下面，也叫做本發明處理劑)。需要說明的是，在本說明書中，所謂「處理劑」」不僅是僅用於治療的「治療劑」，也包含為了預防及緩和 炎症的目的而使用的藥劑。本發明處理劑，如下所述，不僅具有NSAIDs等的抗炎症化合物的緩釋作用及藥物 輸送系統(Drug Delivery System)作用，而且在關節炎的處置中，除由抗炎症化合物產生 的治療效果以外，同時也可以期待由目前在臨床中使用的透明質酸製劑產生的對關節炎的 效果。另外，本發明處置劑的給藥量，應是按照給藥途徑、給藥形態、使用目的、成為給藥 對象的動物的具體的症狀、年齡、體重等，要達到最適當地發揮治療效果來分別決定的項 目，沒有特別限定。例如，人用的注射劑的情況下，作為透明質酸衍生物，成人1人1次約 Img 約1，OOOmg,優選約5mg 約500mg，更優選約IOmg 約lOOmg。但是對於本發明處置 劑的藥效強度，由於通常認為作為有效成分的本發明物質中所使用的NSAIDs或DMARD本身 具有的藥效強度影響較大，因此，不一定限於上述範圍是合適，必須考慮換算為NSAIDs或 DMARD單一物質的用量進行設定。另外，如後述的實施例中例示的那樣，本發明藥劑與給藥 NSAIDs單一物質的情況不同，由於在給藥部位穩定地、而且持續地存在，故也需要考慮這一 點而設定。本發明處置劑的適用部位只要是通過非經口給藥可以給藥的部位就沒有特別限 定，但其中優選關節，特別優選膝關節、肩關節、股關節、顎關節等。特別優選適用於變形性 膝關節症(OA)及風溼性膝關節炎(RA)。另外，將本發明藥劑作為處置劑使用時，如上所述，作為對關節的注入(注射)齊U， 可以適宜地選擇適合的濃度，但作為溶液的濃度，優選0. 3 3. 0重量％，更優選0. 5 1. 5
重量％。作為本發明藥劑的最優選的1個形態例如有以下的構成。NSAID 用上述式⑵表示的化合物間隔物及結合形態氨基烷基醇與NSAIDs通過酯鍵鍵合、與透明質酸通過醯胺鍵 鍵合。透明質酸的分子量重均分子量500，000 3，000, 000NSAIDs的導入率每個透明質酸2糖單元5 50摩爾％濃度及溶劑0. 3 3. 0重量％濃度的磷酸緩衝生理鹽水溶液提供狀態以滅菌狀態填充在注射器中。而且，作為NSAID，更優選用上述式(7)表示的化合物，進一步優選用上述式(8)及 上述式(9)表示的化合物，其中雙氯芬酸或其衍生物更優選。作為間隔物更優選選自氨基
丙基醇或氨基乙基醇。作為導入率，更優選每個透明質酸二糖單元10 50摩爾％。另外可以進行5μπι或0.45μπι的過濾器過濾，進一步來講，最優選可以進行 0. 22 μ m的過濾器過濾。如在後述的實施例中例示的那樣，本發明藥劑特別適合作為關節炎的處置劑，特 別是作為關節炎處置用的關節注入劑而使用。例如，在關節腔內直接注入NSAIDs等的低分 子化合物時，由於這些化合物直接通過滑膜向血中轉移，不能期待很大的效果。另一方面，在將作為本發明的物質的用共價鍵導入了 NSAIDs的NSAIDs導入的透明質酸衍生物的溶液給藥至關節腔內時，如上所述，雖然低分子化合物單一物質在滑膜中 代謝快，但如後述的實施例所例示的那樣，在滑膜組織中NSAIDs仍持續存在。推測出如通 常所知由於透明質酸對滑膜具有親和性，故本發明藥劑以透明質酸和NSAIDs結合著的狀 態程度滯留在滑膜內，緩慢地進入組織或細胞後，NSAIDs從透明質酸脫離、起作用。也就是 推測為在本發明藥劑的給藥中，由於NSAIDs不立即轉移至血中，在關節液及滑膜組織中 NSAIDs持續地存在，故顯示持續的效果。由此，本發明藥劑優選透明質酸與間隔物化合物的鍵合比NSAIDs和間隔物的鍵 合對在生物體內的分解顯示耐性。另外，優選的形態為，NSAIDs和間隔物化合物的鍵合部 分在關節腔內不被分解，被移入到滑膜後，在滑膜組織中被分解。通過改變NSAIDs和間隔 物化合物及透明質酸和間隔物化合物的鍵合方式，可以改變對生物分解的耐性，由此也可 以控制脫離難易度及脫離速度。例如，考慮在生物體內引起的水解情況，酯鍵比醯胺鍵易受 分解。因此，選擇與透明質酸通過醯胺鍵鍵合、與NSAIDs通過酯鍵鍵合的間隔物時，酯鍵易 受水解，受到水解的本發明物質脫離NSAIDs，產生作用。本發明藥劑，也可以是緩釋藥劑。另外，在後述的實施例中，將透明質酸和間隔物化合物用醯胺鍵鍵合，NSAIDs和間 隔物化合物通過醯胺鍵或酯鍵鍵合的本發明物質2種進行各種給藥後，NSAIDs和間隔物化 合物進行酯鍵合的本發明物質的一方顯示更顯著的疼痛抑制效果。對伴隨NSAIDs引起的關節炎的炎症及疼痛的抑制，已知由目標細胞內的環加氧 酶(COX)阻礙活性引起的前列腺素的生成抑制為機理。使用作為用於C0X-2阻礙作用評價 的通用方法的 Chemiluminescent COX Inhibitor screening Assay Kit (Cayman 社制)進 行了本發明物質的評價。其結果，即使在NSAIDs單一物質明顯地顯示C0X-2阻礙作用的給 藥量和含有與以NSAIDs換算的單一物質給藥量相當的量的NSAIDs的本發明物質1的給藥 量中，本發明物質1也沒有確認有C0X-2阻礙作用。通過該體外的評價，明確地推測各種條件及狀態對參與的生物體內給藥中的行 為不能一概適用，但本發明藥劑，在作用部位中脫離NSAIDs的一方更適合。另外，本發明物質由於是低分子化合物，故在單獨給藥時在生物體內代謝快，作為 已知難以有效地向目標部位(細胞)輸送的NSAIDs或DMARD的藥物運載輸送系統(DDS) 基材也是有用的。以本發明的NSAIDs或DMARD導入的透明質酸衍生物的形態，將NSAIDs 或DMARD輸送到目標物細胞，進一步使其以該形態移入到細胞內，在目標部位使其持續地 存在，這對降低代謝的影響，得到效率良好的效果是非常重要的。通過使用本發明物質，由於與藥劑的單獨給藥相比，在給藥部位中會有效地保持 對治療有效的藥劑量，故可期待用比經口給藥更微的量而得到更強的治療效果。另外，由於 效果的緩釋性及持續性的提高也可以追求，故在臨床中減少給藥次數等也可以期待。
實施例下面，通過實施例具體地說明本發明。但是，不由此限定本發明的技術範圍。另外，在下面的實施例中，透明質酸及透明質酸鈉全部使用生化學工業株式會社 制的製品。下面，只要是不特別說明，在下面的實施例中作為磷酸緩衝生理鹽水(PBS)，是使 用 5mM 的 PBS。
過濾器通過性試驗以1. 0重量％配製溶解有被檢物質的PBS。在24°C條件下、在5. Okg/cm2的加壓 下、使由下述實施例配製成的被檢物質的溶液通過0. 45 μ m多孔過濾器(直徑25mm)，測定 每分鐘的通過量(mL)。在通過2mL以上時用「Α」表示，在通過不足2mL時用「B」表示，在不 通過時用「C」表示。〈製造例〉(參考例1)叔丁氧羰基-氨基丙醇(Boc-NH(CH2) 30H) (Boc-氨基丙醇)的合成將氨基丙醇1. 542g(20. 5mmol)溶解在IOmL 二氯甲烷中，在冰冷卻下將二 -叔丁 基_ 二碳酸酯(Boc2O) 4. 484g(20. 5mmol) / 二氯甲烷溶液IOmL緩慢滴下。然後將反應液返 回到室溫，攪拌2小時40分種，用薄層色譜法(TLC)確認原料消失後，減壓蒸餾二氯甲烷。 反應定量地進行，以回收量3. 92g得到油狀物質。結構通過1H-NMR(⑶Cl3)鑑定。1H-NMR (500MHz , CDCl3) δ (ppm) = 1 · 4 6 (9H，s，B ο c)，1 · 6 6 (2 H， quant, -NHCH2CHaCH2O-)，3. 27 (3H, m, -NHCH2CH2CH2O-)，3. 66 (2H, m, -NHCH2CH2CHiO-)， 4. 91 (1H, br, CH2OH)(實施例1)氨基丙醇_酮洛芬鹽酸鹽的合成(I)Boc-氨基丙醇_酮洛芬的合成將Boc-氨基丙醇 2. 371g(13. 5mmol)和酮洛芬 3. 441g(13. 5mmol)(東京化成 工業株式會社制)溶解在14mL 二氯甲烷中，在冰冷卻下依次加入4-二甲基氨基吡啶 (DMAP) 323mg(2. 6mmol)、水溶性碳化二亞胺鹽酸鹽(WSC1 'HCl) 2. 833g(14. 8mmol)/ 二氯甲 烷14mL。返回到室溫，攪拌一晝夜後，減壓蒸餾二氯甲烷，加入醋酸乙酯，依次用5%檸檬酸 2次，水、5%碳酸氫鈉2次，水、飽和食鹽水分液洗滌。用硫酸鈉脫水乾燥後，減壓蒸餾醋酸 乙酯，以5. 430g(收率98% )得到標題化合物。結構通過1H-NMR(CDCl3)鑑定。1H-WR(SOC)MHz, CDCl3) δ (ppm) = 1. 43 (9H, s, Boc)，1. 54 (3H, d, -OCOCh(CH3)-)， 1. 77 (2H, quant, -NHCH2CH2CH2O-)，3. 09 (2H, m, -NHCHaCH2CH2O-)，3. 82 (1H, q, -OCOCH(CH3)-)， 4. 15 (2H, m, -NHCH2CH2CH2O-)，4. 69 (1H, br, -MiCH2-)，7. 42-7. 83 (9H, m,芳族 H)2)氨基丙醇_酮洛芬鹽酸鹽的合成在由上述得到的Boc-氨基丙醇-酮洛芬5. 330g(12.95mmol)中，在冰冷卻下加入 4M鹽酸/醋酸乙酯20mL，在冰冷卻下攪拌15分鐘，且在室溫下攪拌2小時。用TLC確認 Boc-氨基丙醇-酮洛芬消失後，減壓蒸餾溶劑，用二乙醚傾析殘渣2次。然後進行減壓幹 燥，以回收量4. 569g定量得到標題物質。結構通過1H-NMR(⑶Cl3)鑑定。1H-NMR (500MHz, CDCl3) δ (ppm) = 1. 50 (5H, d, -OCOCH (CH1) -) , 2. 08 (2Η, m, -NHCH2CH2CH2O-), 3. 04 (2Η, br, -NHCHaCH2CH2O-), 3. 82 (1Η, q, -OCOCH(CH3) -) ,4. 16 (2Η, m, -NHCH2CH2CHaO-)，7. 36-7. 80 (9Η, m,芳族 H)，8. 20 (br, H3N1CH2-)(實施例2)氨基丙醇_酮洛芬導入的透明質酸鈉的合成使重均分子量90萬的透明質酸鈉200mg(0. 5mmol/ 二糖單元)在水22. 5mL/ 二嗯 烷22. 5mL中溶解後，依次加入2M羥基琥珀酸亞胺(HOSu)水溶液0. 25mL、lmol/L WSCl -HCl 水溶液0. 25mL,由實施例1得到的0. 5M氨基丙醇-酮洛芬鹽酸鹽水溶液0. 5mL,攪拌一晝 夜。在反應液中加入5%碳酸氫鈉水溶液3mL，攪拌3小時20分鐘。在反應液中加入50% 醋酸86 μ L中和後，加入SOOmg氯化鈉且攪拌。加入到200mL乙醇中且使其沉澱，將沉澱物
19用80%乙醇洗滌2次、乙醇洗滌2次、二乙醚洗滌2次，且在室溫下減壓乾燥一晚上。得到 198mg的白色固體。利用HPLC算出的酮洛芬的導入率為15. 5%。將得到的物質使其以濃度 1. 0重量％溶解在PBS中，製成溶液，該溶液是無色透明的液體，過濾器通過性試驗為「A」。(實施例3)氨基丙醇_酮洛芬導入的透明質酸鈉的合成使重均分子量90萬的透明質酸400mg(l. Ommol/ 二糖單元)在水45mL/ 二嗯焼 45mL 中溶解後，依次加入 HOSu 1. 66mmol/ 水 lmL、WSCl · HCl 0. 83mmol/ 水 lmL，由實施例 1得到的氨基丙醇_酮洛芬鹽酸鹽0. 83mmol/4mL,攪拌一晝夜。在反應液中加入碳酸氫鈉 300mg/水lmL，攪拌3小時10分鐘。在反應液中加入醋酸86 μ L中和後，加入400mg氯化 鈉且攪拌。加入300mL乙醇且使其沉澱，將沉澱物用80%乙醇、乙醇、二乙醚各洗滌2次，且 在室溫下減壓乾燥一晚上。得到246mg的白色固體。利用HPLC算出的酮洛芬的導入率為 26. 3%。將得到的物質使其以濃度1. 0重量％溶解在PBS中，製成溶液，該溶液是無色透明 的液體，過濾器通過性試驗為「A」。(實施例4)氨基丙醇_萘普生鹽酸鹽的合成1) Boc-氨基丙醇_萘普生的合成將Boc-氨基丙醇350mg (2mmol)和萘普生462g (2mmol)(和光純藥工業株式 會社制)溶解在2mL 二氯甲烷中，在冰冷卻下依次加入DMAP48mg(0. 4mmol)、WSCl · HCl 422g (2. 2mmol) / 二氯甲烷2mL。返回到室溫，攪拌4小時50分鐘後，減壓蒸餾二氯甲烷，加 入醋酸乙酯，依次用5%檸檬酸2次，水、5%碳酸氫鈉2次，水、飽和食鹽水分液洗滌。用硫 酸鈉脫水乾燥後，減壓蒸餾醋酸乙酯，以720mg(收率93% )的白色結晶得到標題化合物。 結構通過1H-NMR (CDCl3)鑑定。1H-WR(SOC)MHz, CDCl3) δ (ppm) = 1. 42 (9H, s, Boc)，1. 58 (3H, d, -OCOCh(CH3)-)， 1. 75 (2H, quant, -NHCH2CH2CH2O-)，3. 07 (2H, m, -NHCH2CHaCH2O-)，3. 85 (1H, q, -OCOCH(CH3)-)， 3. 91 (3H, s, -OCH3)，4. 13 (2H, m, -NHCH2CH2CHaO-)，4. 63 (1H, br, -MiCH2-)，7. 09-7. 75 (6H, m, 芳族H)2)氨基丙醇_萘普生鹽酸鹽的合成將由上述得到的Boc-氨基丙醇-萘普生684mg(l. 76mmol)溶解在ImL 二氯甲烷 中，在冰冷卻下加入4M鹽酸/醋酸乙酯2mL，在冰冷卻下攪拌20分鐘，且在室溫下攪拌1小 時。用TLC確認Boc-氨基丙醇-萘普生消失後，加入二乙醚，傾析3次。然後進行減壓幹 燥，以回收量564mg定量得到標題物質。結構通過1H-NMR(⑶Cl3)鑑定。1H-WR(SOC)MHz, CDCl3+CD30D) δ (ppm) = 1.57(3H, d, -OCOCH (CH3)-), 2. 02 (2H, quant, -NHCH2CHaCH2O-)，2. 88 (2H, m, -NHCH2CH2CH2O-)，3. 87 (1H, q, -OCOCH(CH3) -)，3. 90 (3H, s, -OCH3)，4. 17 (2H, m, -NHCH2CH2CHaO-)，7. 08-7. 73 (6H, m,芳族 H)，8. 10 (br, H3N1CH2-)(實施例5)氨基丙醇_萘普生導入的透明質酸鈉的合成使重均分子量90萬的透明質酸鈉IOOmg(0. 25mmol/二糖單元)在水11. 5mL/二職 烷 11. 5mL 中溶解後，依次加入 HOSu (0. 2mmol)/水 0. lmL、WSCl · HCl (0. Immol)/水 0. ImL, 由實施例4得到的氨基丙醇-萘普生鹽酸鹽(0. Immol)/水0. 3mL，攪拌一晝夜。在反應液 中加入5%碳酸氫鈉水溶液1. 5mL，攪拌3小時35分鐘。在反應液中加入50%醋酸43 μ L 中和後，加入500mg氯化鈉且攪拌。加入50mL乙醇使其沉澱，將沉澱物用80%乙醇洗滌2 次，用乙醇洗滌2次，用二乙醚洗滌，且在室溫下減壓乾燥一晚上。得到95mg的白色固體。利用HPLC算出的萘普生的導入率為13. 1%。將得到的物質使其以濃度1.0重量％溶解在 PBS中，製成溶液，該溶液是無色透明的液體，過濾器通過性試驗為「A」。(實施例6)氨基丙醇_布洛芬鹽酸鹽的合成DBoc-氨基丙醇_布洛芬的合成將Boc-氨基丙醇352mg(2mmol)和布洛芬412g(2mmol)(和光純藥工業株式 會社制)溶解在2mL 二氯甲烷中，在冰冷卻下依次加入DMAP48mg(0. 4mmol)、WSCl · HCl 423g (2. 2mmol) / 二氯甲烷2mL。返回到室溫，攪拌一晝夜後，加入醋酸乙酯，依次用5%檸檬 酸2次，水、5%碳酸氫鈉2次，水、飽和食鹽水分液洗滌。用硫酸鈉脫水乾燥後，減壓蒸餾醋 酸乙酯，以665mg (收率91% )得到標題化合物。結構通過1H-NMR (⑶Cl3)鑑定。1H-NMR(500MHz, CDCl3) δ (ppm) = 0. 88 (6H, d, -CH(CH3I3) ,1. 44(9H, s, Boc)，
1.49 (3H, d, -OCOCH (CH1) -)，1. 75 (2H, m, -NHCH2CHaCH2O-)，1. 85 (1H，m, -CH2CH(CH3)2)，
2.45 (2H, d, -CH2CH(CH3)2) ,3. 05 (2H, m, -NHCH2CH2CH2O-), 3. 69 (1H, q, _0C0￡H(CH3)-)， 4. 13 (2H, t, -NHCH2CH2CH2O-)，4. 63 (1H, br, -MICH2-)，7. 07-7. 21 (4H, m,芳族 H)2)氨基丙醇_布洛芬鹽酸鹽的合成將由上述得到的Boc-氨基丙醇-布洛芬636mg(1.75mmol)溶解在ImL 二氯甲烷 中，在冰冷卻下加入4M鹽酸/醋酸乙酯4mL，在冰冷卻下攪拌10分鐘，且在室溫下攪拌3小 時。用TLC確認Boc-氨基丙醇-布洛芬消失後，加入二乙醚，傾析3次。然後進行減壓幹 燥，以回收量406mg(77% )得到標題物質。結構通過1H-NMR(⑶Cl3)鑑定。1H-NMR (500MHz, CDCl3) δ (ppm) = 0. 89 (6H, d, -CH (CH1 「)，1 · 47 (3H， d, -OCOCH(CHg)-)，1. 83 (1H, m, -CH2CH(CH3) 2), 2. 08 (2H, quant, -NHCH2CHaCH2O-), 2. 44 (2H, d, -CH2HCH(CH3)2)，3. 01 (2H, t, -NHCH2CH2CH2O-)，3. 71 (1H, q, -OCOCH(CH3) -)，4. 11-4. 27 (2H, m, -NHCH2CH2CHaO-)，7. 06-7. 20 (4H, m,芳族 H)，8. 25 (br, H3N1CH2-)(實施例7)氨基丙醇_布洛芬導入的透明質酸鈉的合成使重均分子量90萬的透明質酸鈉IOOmg(0. 25mmol/二糖單元)在水11. 5mL/二噁 烷 11. 5mL 中溶解後，依次加入 HOSu (0. 2mmol)/水 0. ImL, WSCl · HCl (0. Immol)/水 0. lmL、 由實施例6得到的氨基丙醇-布洛芬鹽酸鹽(0. Immol) /水0. 3mL,攪拌一晝夜。在反應液 中加入5%碳酸氫鈉水溶液1. 5mL，攪拌3小時35分鐘。在反應液中加入50%醋酸43 μ L 中和後，加入500mg氯化鈉且攪拌。加入50mL乙醇使其沉澱，將沉澱物用80%乙醇洗滌2 次，用乙醇洗滌2次，用二乙醚洗滌，且在室溫下減壓乾燥一晚上。得到93mg的白色固體。 利用HPLC算出的布洛芬的導入率為16.4%。將得到的物質使其以濃度1.0重量％溶解在 PBS中，製成溶液，該溶液是無色透明的液體，過濾器通過性試驗為「A」。(實施例8)氨基丙醇-氟比洛芬鹽酸鹽的合成1) Boc-氨基丙醇_氟比洛芬的合成將Boc-氨基丙醇352mg(2mmol)和氟比洛芬489g(2mmol)(和光純藥工業株式 會社制)溶解在2mL 二氯甲烷中，在冰冷卻下依次加入DMAP 48mg(0. 4mmol)、WSCl · HCl 423g (2. 2mmol) / 二氯甲烷2mL。返回到室溫，攪拌一晝夜後，加入醋酸乙酯，依次用5%檸檬 酸2次，水、5%碳酸氫鈉2次，水、飽和食鹽水分液洗滌。用硫酸鈉脫水乾燥後，減壓蒸餾醋 酸乙酯，以753mg (收率94% )得到標題化合物。結構通過1H-NMR (⑶Cl3)鑑定。
1H-WR(SOC)MHz, CDCl3) δ (ppm) = 1. 26 (9H, s, Boc)，1. 54 (3H, d, -OCOCh(CH3)-)， 1. 80 (2H, quant, -NHCH2CH2CH2O-)，3. 13 (2H, m, -NHCE,CH2CH20-)，3. 76 (1H, q, -OCOCH(CH3)-)， 4. 15 (2H, m, -NHCH2CH2CH2O-)，4. 66 (1H, br, -MICH2-)，7. 10-7. 55 (9H, m,芳族 H)2)氨基丙醇-氟比洛芬鹽酸鹽的合成將由上述得到的Boc-氨基丙醇-氟比洛芬720mg(l. 79mmol)溶解在ImL 二氯甲 烷中，在冰冷卻下加入4M鹽酸/醋酸乙酯4mL，在冰冷卻下攪拌3分鐘，且在室溫下攪拌3 小時10分鐘。用TLC確認Boc-氨基丙醇-氟比洛芬消失後，加入二乙醚，傾析2次。然後 進行減壓乾燥，以回收量352mg(94%)得到標題物質。結構通過1H-NMR(⑶Cl3)鑑定。1H-NMR (500MHz, CDCl3) δ (ppm) = 1. 51 (3H, d, -OCOCH(CH1) -) , 2. 10 (2Η, quant, -NHCH2CHaCH2O-) , 3. 05 (2H, t, -NHCHiCH2CH2O-) , 3. 76 (1Η, q, -OCOCH(CH3)-), 4. 13-4. 29 (2Η, m, -NHCH2CH2CH2O-)，7. 07-7. 53 (9Η, m,芳族 H)，8. 27 (br, H3N1CH2-)(實施例9)氨基丙醇_氟比洛芬導入的透明質酸鈉的合成使重均分子量90萬的透明質酸鈉IOOmg(0. 25mmol/二糖單元)在水11. 5ml. .d惡 烷 11. 5mL 中溶解後，依次加入 HOSu (0. 2mmol)/水 0. ImL, WSCl · HCl (0. Immol)/水 0. lmL、 由上述實施例8得到的氨基丙醇-氟比洛芬鹽酸鹽(0. Immol)/水0. 3mL，攪拌一晝夜。在 反應液中加入5%碳酸氫鈉水溶液1. 5mL，攪拌3小時35分鐘。在反應液中加入50%醋酸 43 μ L中和後，加入500mg氯化鈉且攪拌。加入50mL乙醇使其沉澱，將沉澱物用80%乙醇洗 滌2次，用乙醇洗滌2次，用二乙醚洗滌，且在室溫下減壓乾燥一晚上。得到94mg的白色固 體。利用HPLC算出的氟比洛芬的導入率為21. 1%。將得到的物質使其以濃度1.0重量％ 溶解在PBS中，製成溶液，該溶液是無色透明的液體，過濾器通過性試驗為「A」。(實施例10)氨基丙醇_乙醯水楊酸鹽酸鹽的合成1) Boc-氨基丙醇_乙醯水楊酸的合成將Boc-氨基丙醇(2. Ilmmol)、乙醯水楊酸(2. Ilmmol)(和光純藥工業 株式會社制)、DMAP(0.42mmol)溶解在二氯甲烷(2 l、6mL)中，在冰冷卻下加入 WSCl · HCl (2. 35mmol)。返回到室溫，攪拌一晝夜後，加入醋酸乙酯，依次用5%檸檬酸水溶 液、5%碳酸氫鈉水溶液、飽和食鹽水分液洗滌。用硫酸鈉脫水乾燥後，減壓蒸餾醋酸乙酯。 將得到的殘渣用矽膠柱色譜法(己烷醋酸乙酯=3 1,0. 5%三乙胺)純化，得到標題化 合物(298. Omg、收率48% ) ο結構通過1H-NMR(CDCl3)鑑定。1H-NMR (500MHz, CDCl3) δ (ppm) = 1. 44 (9H, s, Boc) , 1. 90-1. 96 (2Η, m, BocHNCH2CHaCH2O-)，235 (3H, s, -COCHa)，3. 24-3. 28 (2H, m, BocHNCHaCH2CH2O-), 4. 35 (2H, t, BocHNCH2CH2CHaO-), 4. 78 (1H, s, NH)，7. 11 (1H, dd,芳族),7. 32 (1H, td,芳族)， 7. 55-7. 59 (1H，m，芳族)，8. 01 (1H，dd,芳族)2)氨基丙醇_乙醯水楊酸鹽酸鹽的合成將由上述得到的Boc-氨基丙醇-乙醯水楊酸(0. 814mmol)溶解在二氯甲烷(Iml) 中，在冰冷卻下加入4N鹽酸/醋酸乙酯(3ml)，攪拌2小時，用TLC確認Boc-氨基丙醇-乙 醯水楊酸消失後，加入二乙醚。將生成的沉澱進行離心分離，傾析上清液。得到的沉澱經減 壓蒸餾得到標題化合物213. 9mg(96% )。結構通過1H-NMR(⑶Cl3)鑑定。1H-NMR (500MHz, CDCl3) δ (ppm) = 2. 22 (2H, t, H2NCH2CHaCH2O-) , 2. 35 (3Η, s, -COCH3)，3. 13 (2Η, t, H2NCH2CH2CH2O-)，4. 41 (2H, t, H2NCH2CH2CH2O-)，7. 09 (1H, dd,芳族)，7. 31 (1H，dt，芳族)，7. 56 (1H，dt，芳族)，7. 99 (1H，dd，芳族)(實施例11)氨基丙醇_乙醯水楊酸導入的透明質酸的合成將重均分子量90萬的透明質酸(IOOmg)O. 25mmol/二糖單元在水-二H惡烷(1 1) 中溶解，依次加入2mol/L的HOSu (0. lml) Umol/L的WSCl · HCl (0. Iml)、由上述實施例10 得到的氨基丙醇-乙醯水楊酸鹽酸鹽(0. IOmmol)水-二嗯烷(1 1)溶液(2ml)，攪拌 一晝夜。在反應液中加入5%碳酸氫鈉水溶液(1.5ml)，攪拌3小時。加入50%醋酸水溶 液(43μ1)中和後，加入氯化鈉(0.4g)進行攪拌。加入乙醇(IOOml)使其沉澱，將沉澱物 用80%乙醇水溶液、乙醇、二乙醚依次各洗滌2次。然後進行減壓乾燥，得到標題化合物 (97.7mg)。利用吸光光度法算出的乙醯水楊酸的導入率為13.5%。將得到的物質使其以 濃度1. 0重量％溶解在PBS中，製成溶液。該溶液是無色透明的液體，過濾器通過性試驗為 「K」。(實施例12)氨基丙醇_聯苯乙酸鹽酸鹽的合成DBoc-氨基丙醇_聯苯乙酸的合成使Boc-氨基丙醇(2. 04mmol)、聯苯乙酸(2. 04mmol) (Aldrich Chem. Co.制)、 DMAP (0. 41mmol)在二卩惡烷(7mL)中溶解後，在冰冷卻下加入WSCl 'HCl (2. 35mmol)的二P惡 烷-二氯甲烷(3 4)溶液(7ml)。在反應液中加入二甲基甲醯胺(DMF) (3ml)變為澄清後， 返回到室溫，攪拌一晝夜。加入醋酸乙酯，依次用5%檸檬酸水溶液，5%碳酸氫鈉水溶液，飽 和食鹽水分液洗滌。用硫酸鈉脫水乾燥後，減壓蒸餾溶劑。將得到的殘渣用矽膠柱色譜法 (己烷醋酸乙酯=3 1、0. 5%三乙胺)純化，得到標題化合物(623. Omg、收率83% )。 結構通過1H-NMR (CDCl3)鑑定。1H-NMR (500MHz, CDCl3) δ (ppm) = 1. 44 (9H, s, Boc) , 1. 80-1. 85 (2Η, m, BocHNCH2CHaCH2O-)，3. 15-3. 19 (2H, m, BocHNCH2CH2CH2O-)，3. 67 (2H, s, PhCH2-)，4. 18 (2H, t, BocHNCH2CH2CH2O-)，4. 67 (1H, s, NH)，7. 34-7. 59 (9H, m,芳族)2)氨基丙醇_聯苯乙酸鹽酸鹽的合成將由上述得到的Boc-氨基丙醇-聯苯乙酸(1.69mm0l)溶解在二氯甲烷(Iml) 中，在冰冷卻下加入4N鹽酸/醋酸乙酯(3ml)，返回到室溫，攪拌2小時，用TLC確認 Boc-氨基丙醇-聯苯乙酸消失後，加入二乙醚，將生成的沉澱進行離心分離，將得到的沉澱 用二乙醚傾析3次後，進行減壓乾燥，得到標題化合物(511.7mg、收率99%)。結構通過 1H-WR(O)Cl3 CD3OD3= 1 1)鑑定。1H-NMR (500MHz, CDCl3 CD3OD = 1 1) δ (ppm) = 1. 98-2. 04(2H, m, H2NCH2CHaCH2O-)，2. 95 (2H, t, H2NCHaCH2CH2O-)，3. 73 (2H, s, -PhCHa-)，4. 23 (2H, t, H2NCH2CH2CH2O-)，7. 33-7. 59 (9H, m,芳族)(實施例13)氨基丙醇_聯苯乙酸導入的透明質酸的合成將重均分子量90萬的透明質酸(200mg) 0. 5mmol/二糖單元在水-二嗯烷(1:1、 45ml)中溶解，依次加入 2mol/LHOSu (0. 25ml)、lmol/LWSCl .HCl (0. 25ml)、由上述實施例 12 得到的0. 5M氨基丙醇-聯苯乙酸鹽酸鹽水溶液(0. 5ml)，攪拌一晝夜。在反應液中加入5% 碳酸氫鈉水溶液(3ml)，攪拌3小時。在反應液中加入50%醋酸水溶液(86 μ 1)中和後，加 入氯化鈉(0.8g)進行攪拌。加入乙醇(200ml)進行攪拌，將生成的沉澱進行離心分離，將 得到的沉澱用80%的乙醇水溶液、乙醇、二乙醚依次各洗滌2次。將其在室溫下減壓乾燥一晚上，得到標題化合物(205. Img)。利用HPLC法算出的聯苯乙酸的導入率為27.8%。將得 到的物質使其以濃度1. 0重量％溶解在PBS中，製成溶液。該溶液是無色透明的液體，過濾 器通過性試驗為「A」。(實施例14)氨基丙醇_聯苯丁酮酸鹽酸鹽的合成1) Boc-氨基丙醇_聯苯丁酮酸的合成將Boc-氨基丙醇(2. 18mmol)、聯苯 丁酮酸(2. 18mmol) (ICNBiochemicals. Inc.制)、DMAP (0. 44mmol)在DMF- 二氯甲烷(5 3、8mL)中溶解，在冰冷卻下加入 WSCl -HCl (2. 48mmol)的二氯甲烷溶液(5ml)。緩慢地將反應溫度返回到室溫，攪拌一 晝夜。加入醋酸乙酯，依次用5%檸檬酸水溶液、5%碳酸氫鈉水溶液、飽和食鹽水分液洗 滌。用硫酸鈉脫水乾燥後，減壓蒸餾溶劑。將得到的殘渣用矽膠柱色譜法(己烷醋酸 乙酯=40 1、0. 5%三乙胺)純化，得到標題化合物(747.8mg、收率83% )。結構通過 1H-WR(CDCl3)鑑定。1H-NMR (500MHz, CDCl3) δ (ppm) = 1. 44 (9H, s, Boc) , 1. 82-1. 87 (2Η, m, BocHNCH2CHiCH2O-)，2. 79 (2H, t, -COCiH4CO-)，3. 20-3. 24 (2H, m, BocHNCHiCH2CH2O-)， 3. 36 (2H, t, -COCaHiCO-) 4. 19 (2H, t, BocHNCH2CH2CH2O-)，4. 76 (1H, s，NH)，7. 39-7. 64 (5H, m, 芳族)，7. 70 (2H，td，芳族)，8. 06 (2H，td，芳族)2)氨基丙醇_聯苯丁酮酸鹽酸鹽的合成將由上述得到的Boc-氨基丙醇-聯苯丁酮酸(1. 82mmol)溶解在二氯甲烷(4ml) 中，在冰冷卻下加入4N鹽酸·醋酸乙酯溶液(4ml)，然後緩慢地達到室溫，攪拌90分鐘，反 應開始後可見白色沉澱析出。用TLC確認Boc-氨基丙醇-聯苯丁酮酸消失後，在反應液中 加入二乙醚，將白色沉澱進行離心分離。將沉澱用二乙醚洗滌3次後，進行減壓乾燥，得到 標題化合物(621.4mg、收率98% )。結構通過1H-NMR(CDCl3 CD3OD=I 1)鑑定。1H-NMR (500MHz, CDCl3 CD3OD = 1 1) δ (ppm) = 2. 01-2. 07 (2H, m, H2NCH2CHaCH2O-)，2. 79 (2H, t, -COCaH4CO-)，3. 05 (2H, t, H2NCHaCH2CH2O-)，3. 44 (2H, t, -COC2HiCO-)，4. 26 (2H, t, H2NCH2CH2CHaO-)，7. 41-7. 50 (3H, m,芳族)，7. 66 (dd, 2H,芳族)， 7. 75 (d，2H，芳族)，8. 08 (d，2H，芳族)(實施例15)氨基丙醇_聯苯丁酮酸導入的透明質酸的合成使重均分子量90萬的透明質酸(200mg)0. 5mmol/ 二糖單元溶解在水-二卩惡烷 (1 l、45ml)中後，加入 2mol/L HOSu (0. 25ml)、lmol/LWSCl .HCl (0. 25ml)、由上述實施例 14得到的氨基丙醇-聯苯丁酮酸鹽酸鹽(0. 25mmol)的水-二卩惡烷(25 8)溶液(0. 66ml)， 攪拌一晝夜。在反應液中加入5%碳酸氫鈉水溶液(3ml)，攪拌3小時。加入50%醋酸水溶 液(86μ 1)中和後，加入氯化鈉(0.8g)進行攪拌。加入乙醇(200ml)進行攪拌。將生成的 沉澱進行離心分離，將得到的沉澱用80%的乙醇水溶液、乙醇、二乙醚各洗滌2次。進行減 壓乾燥，得到標題化合物(214. Img)。利用HLPC算出的聯苯乙酸的導入率為23.8%。將得 到的物質使其以濃度1. 0重量％溶解在PBS中，製成溶液。該溶液是無色透明的液體，過濾 器通過性試驗為「A」。(實施例16)氨基丙醇_甲芬那酸鹽酸鹽的合成l)Boc-氨基丙醇-甲芬那酸的合成將Boc-氨基丙醇(0. 616mmol)、甲芬那酸(0. 620mmol)(和光純藥工業株式會社
24制)、DMAP(0. 126mmol)在二氯甲烷(3mL)中溶解，在冰冷卻下加入WSCl · HCl (0. 758mmol) 的二氯甲烷溶液(1.5ml)。緩慢地將反應溫度返回到室溫，攪拌一晝夜。再次將反應液進 行冰冷卻，加入WSCl · HCl (0. 207mmol)的二氯甲烷溶液(Iml)，一邊緩慢地升到室溫，一邊 攪拌5小時。在反應液中加入醋酸乙酯，依次用5%檸檬酸水溶液、5%碳酸氫鈉水溶液、飽 和食鹽水洗滌。用硫酸鈉脫水乾燥後，減壓蒸餾溶劑。將得到的殘渣用矽膠柱色譜法(己 烷醋酸乙酯=6 1,0. 5%三乙胺)純化，得到標題化合物(190. 4mg、收率78% )。結構 通過1H-NMR (CDCl3)鑑定。1H-NMR (500MHz, CDCl3) δ (ppm) = 1. 45 (9H, s, Boc) , 1. 96-2. 01 (2Η, m, BocHNCH2CHaCH2O-)，2. 18 (3H, s, PhCH1)，2. 33 (3H, s, PhCH1)，3. 31-3. 32 (2H, m, BocHNCH2CH2CH2O-) , 4. 38 (2H, t, BocHNCH2CH2CH2O-) , 4. 78 (1H, s, NH)，6. 64-6. 67 (1H, m, 芳族)，6. 74 (1H，dd，芳族)，7. 02-7. 26 (4H，m，芳族)，7. 94 (1H，dd，芳族)，9. 24 (1H， s, -PhMiPh-)2)氨基丙醇_甲芬那酸鹽酸鹽的合成將由上述得到的Boc-氨基丙醇-甲芬那酸(0. 462mmol)溶解在二氯甲烷(0. 5ml) 中，在冰冷卻下加入4N鹽酸/醋酸乙酯溶液(1.5ml)，攪拌3小時。用TLC確認Boc-氨基丙 醇-甲芬那酸消失後，在反應液中加入二乙醚，將生成的沉澱進行離心分離。將得到的沉澱 用二乙醚洗滌後，進行減壓乾燥，得到標題化合物(154. 4mg、qU.)。結構通過1H-NMR(⑶Cl3) 鑑定。1H-NMR (500MHz, CDCl3) δ (ppm) = 2. 16 (3H, s, PhCH1) , 2. 25-2. 30 (2Η, m, H2NCH2CHaCH2O-)，2. 31 (3H, s, PhCH1)，3. 20 (2H, t, H2NCHiCH2CH2O-)，4. 44 (2H, t, H2NCH2CH2CH2O-), 6. 63-6. 66 (1H, m,芳族),6. 70-6. 72 (1H, dd,芳族)，7. 02 (1H, d,芳族)， 7. 09 (1H，t，芳族)，7. 14 (1H，d，芳族)，7. 22-7. 25 (1H，m，芳族)，7. 92 (1H，dd,芳族)， 9. 17 (1H, s, -PhMiPh-)(實施例17)氨基丙醇_甲芬那酸導入的透明質酸的合成將重均分子量90萬的透明質酸(IOOmg)O. 25mmol/二糖單元在水-二嗯烷 (1 1、22. 5ml)中溶解，依次加入 2mol/L HOSu(0. lml)、lmol/LWSCl · HCl (0. lml)、由上 述實施例16得到的氨基丙醇-甲芬那酸鹽酸鹽(0. IOmmol)的水_ 二嗯烷(1 1)溶液 (2ml)，攪拌一晝夜。在反應液中加入5%碳酸氫鈉水溶液(1.5ml)，攪拌4小時。加入50% 醋酸水溶液(43μ 1)中和後，加入氯化鈉(0.4g)進行攪拌。加入乙醇(IOOml)進行攪拌， 將生成的沉澱進行離心分離。將得到的沉澱用80%的乙醇水溶液、乙醇、二乙醚依次各洗滌 2次。進行減壓乾燥，得到標題化合物(101. 7mg)。利用吸光光度法算出的甲芬那酸的導入 率為17.5%。將得到的物質使其以濃度1.0重量％溶解在PBS中，製成溶液。該溶液是無 色透明的液體，過濾器通過性試驗為「A」。(實施例18)氨基丙醇_雙氯芬酸鹽酸鹽的合成1) Boc-氨基丙醇_雙氯芬酸的合成將Boc-氨基丙醇135. 8mg (0. 775mmol)溶解在二氯甲烷中，依次加入雙氯 芬酸229. 6mg (0. 775mmol)(和光純藥工業株式會社制)的二氯甲烷溶液4mL、DMAP 18. 9mg (0. 155mmol)的二氯甲烷溶液lmL、DMFO. 5mL,在冰冷卻下加入WSCl · HCl 191. 4mg(0. 998mmol)的二氯甲烷溶液(2ml)，一邊緩慢地升到室溫一邊攪拌7小時。再使反應液冰冷卻，作為追加操作依次加入雙氯芬酸91. 9mg(0. 310mmol)的二氯甲烷溶液1ml、 DMAP 7. 5mg (0. 061mmol)、WSCl · HCl 170. 9mg (0. 370mmol)的二氯甲烷溶液 lmL，一邊慢慢 地回到室溫一邊攪拌。進行該追加操作共5次。加入醋酸乙酯，依次用5%檸檬酸水溶液2 次，5%碳酸氫鈉水溶液2次，飽和食鹽水分液洗滌。用硫酸鈉脫水後，減壓蒸餾醋酸乙酯。 用矽膠柱色譜法純化殘渣，得到標題化合物280. 2mg(收率80% )。結構通過1H-NMR鑑定。1H-NMR (500MHz , CDCl3) δ (ppm) = 1 · 4 4 (9H，s，B ο c)，1 · 8 5 (2 H， quant, -NHCH2CE,CH20-), 3. 16 (2H, q, -NHCE,CH2CH20-), 3. 82 (2Η, s, Ph-CH2-CO), 4. 22 (2Η, t, -NHCH2CH2CE^o-)，4. 68 (1Η, s，NH)，6. 54-7. 35 (8H, m,芳族 H, NH)2)氨基丙醇-雙氯芬酸鹽酸鹽的合成將由上述得到的Boc-氨基丙醇-雙氯芬酸1019mg溶解在2mL 二氯甲烷中，在冰 冷卻下加入4M鹽酸/醋酸乙酯8ml，攪拌3小時。加入150mL 二乙醚使其沉澱，將沉澱進行 減壓乾燥，得到標題化合物791mg(90% )。結構通過1H-NMR鑑定。1H-WR(SOi)MHz, CDCl3) δ (ppm) = 2. 13 (2H, quant, -NHCH2CH2CH2O-) , 3. 08 (2Η, t, -NHCe^CH2CH2O-)，3. 84 (2H, s, Ph-CH2-CO)，4. 25 (2H, t, -NHCH2CH2CH2O-)，6. 52-7. 33 (8H, m, 芳族H，NH)(實施例19)氨基丙醇_雙氯芬酸導入的透明質酸的合成使重均分子量80萬的透明質酸500mg(l. 25mmol/ 二糖單元)在水56. 3mL/ 二嗯 烷 56. 3mL 中溶解後，依次加入 HOSu (Immol) / 水 0. 5mL、WSCl · HCl (0. 5mmol) / 水 0. 5mL、由 上述實施例18得到的氨基丙醇-雙氯芬酸鹽酸鹽(0.5mmol)/(水二卩惡烷=1 l、5mL)， 攪拌一晝夜。在反應液中加入5%碳酸氫鈉水溶液7. 5mL，攪拌3小時40分鐘。在反應液 中加入50%醋酸215 μ L中和後，加入氯化鈉2. 5g進行攪拌。加入乙醇400ml使其沉澱，將 沉澱物用80%的乙醇、乙醇、二乙醚各洗滌2次，且在室溫下減壓乾燥一晚上。得到541mg 的白色固體。利用分光光度計求出的雙氯芬酸的導入率為18.2%。(實施例20)氨基丙醇_依託度酸鹽酸鹽的合成1) Boc-氨基丙醇_依託度酸的合成將Boc-氨基丙醇 178. 8mg(l. 02mmol)、依託度酸 293. 8mg(l. 02mmol)(和光純 藥工業株式會社制)、DMAP 23. 8mg(0. 20mmol)溶解在4mL 二氯甲烷中，在冰冷卻下加入 WSCl · HCl 233. 8mg (1. 22mmol)的二氯甲烷溶液2mL，一邊緩慢地升到室溫一邊攪拌一晝 夜。進一步在冰冷卻下加入WSCl · HCl 68. 8mg(0. 36mmol)的二氯甲烷溶液2mL，一邊緩慢 地升到室溫一邊攪拌80分鐘。加入醋酸乙酯，依次用5%檸檬酸水溶液2次，5%碳酸氫鈉 水溶液2次，飽和食鹽水分液洗滌。用硫酸鈉脫水後，減壓蒸餾醋酸乙酯。用矽膠柱色譜法 純化殘渣，得到標題化合物436. 3mg(收率96% )。結構通過1H-NMR鑑定。1H-NMR (500MHz, CDCl3) δ (ppm) = 0. 83 (3H, t, -CH2CH3), 1. 37 (3Η, t, -CH2CHa), 1. 43 (9Η, s, Boc)，1. 79 (2Η, quant, -NHCH2CHiCH2O-)，3. 14 (2H, q, -NHCHaCH2CH2O-)， 4. 10-4. 22 (2H, m, -NHCH2CH2CHaO-)，4. 63 (1H, s，NH)，7. 00-7. 37 (3H, m,芳族 H)，8. 97 (1H, s, NH)2)氨基丙醇_依託度酸鹽酸鹽的合成將由上述得到的Boc-氨基丙醇依託度酸421. 5mg(0. 948mmol)溶解在ImL 二氯甲 烷中，在冰冷卻下加入4M鹽酸/醋酸乙酯3mL，攪拌3小時。加入二乙醚、己烷使其沉澱，將沉澱進行減壓乾燥。用矽膠柱色譜法純化沉澱，得到標題化合物197. 6mg(55%)。結構通 過1H-NMR鑑定。1H-NMR (500MHz, CDCl3) δ (ppm) = 0. 81 (3H, t, -CH2CH3), 1. 35 (3Η, t, -CH2CHa), 1. 92-2. 17 (4Η, m, -CE^CH3, -NHCH2CH2CH2O-), 4. 12 (1Η, quant, -NHCH2CH2CE,0-), 4. 20 (1Η, quant, -NHCH2CH2CE,0-)，6. 99-7. 35 (3Η, m,芳族 H)，8. 99 (1H, s, NH)(實施例21)氨基丙醇_依託度酸導入的透明質酸鈉的合成使重均分子量80萬的透明質酸114mg(0. 285mmol/ 二糖單元)在水12. 8mL/ 二 β惡焼 12. 8mL 中溶解後，依次加入 HOSu (0. 228mmol) / 水 0. lmL、WSCl · HCl (0. 114mmol) / 水 0. lmL、由上述實施例20得到的氨基丙醇-依託度酸鹽酸鹽(0. IHmmol)/(水二聰烷= 1 l、2mL)，攪拌一晝夜。在反應液中加入5%碳酸氫鈉水溶液1. 71mL，攪拌4小時30分 鍾。在反應液中加入50%醋酸49 μ L中和後，加入氯化鈉456mg進行攪拌。加入乙醇IlOml 使其沉澱，將沉澱物用80%的乙醇、乙醇、二乙醚各洗滌2次，且在室溫下減壓乾燥一晚上。 得到Illmg的白色固體。利用HPLC求出的依託度酸的導入率為14. 4%。(實施例22)氨基丙醇_阿克他利鹽酸鹽的合成DBoc-氨基丙醇_阿克他利的合成將參考例1得到的Boc-氨基丙醇123. lmg(0. 703mmol)溶解在2mL 二氯甲烷 中，加入阿克他利136. Omg (0. 704mmol)的DME溶液(ImL)，在冰冷卻下依次加入DMAP 17. Img(0. 140mmol)、WSCl · HCl 175. 4mg(0. 915mmol)，一邊緩慢地升到室溫一邊攪拌一 晝夜。加入醋酸乙酯，依次用5%檸檬酸水溶液、5%碳酸氫鈉水溶液、飽和食鹽水分液洗 滌。用硫酸鈉脫水後，減壓蒸餾醋酸乙酯。用矽膠柱色譜法純化殘渣，得到標題化合物 203. Img (83% ) 結構通過 1H-NMR 鑑定。1H-NMR (500MHz , CDCl3) δ (ppm) = 1 · 4 4 (9H，s，B ο c)，1 · 8 0 (2 H， quant, -NHCH2CHaCH2O-), 2. 18 (3H, s, NAc), 3. 14 (2H, q, -NHCHaCH2CH2O-), 3. 59 (2Η, s, Ph-CH2-CO)，4. 15 (2H, t, -NHCH2CH2CHaO-)，4. 66 (1H, s，NH)，7. 13 (1H, s，NH)，7. 23 (2H, d,芳 族 H)，7. 46 (2H，d，芳族 H)另外，阿克他利用下述合成法製備。將對氨基苯基醋酸(和光純藥工業株式會社制)(1. 02mmol)溶解在二氯甲烷-甲 醇-水(1 3 l、50ml)中，在冰冷卻下加入無水醋酸(2. 12mmol)，一邊緩慢地升到室溫 一邊攪拌一晝夜。減壓蒸餾溶劑，得到標題化合物(196. 4mg、收率99%)。結構通過1H-NMR鑑定。1H-NMR (500MHz, CD3OD) d (ppm) = 2. 11 (3H, s, Ac) ,3. 55 (2H, s, Ph-CHi")『 7.21-7. 49 (4H，m，芳族 H)2)氨基丙醇_阿克他利鹽酸鹽的合成將由上述得到的Boc-氨基丙醇-阿克他利201. 3mg(0. 574mmol)溶解在2mL 二氯 甲烷中，在冰冷卻下加入4M鹽酸/醋酸乙酯3mL，攪拌3小時。加入二乙醚使其沉澱，用二 乙醚洗滌2次沉澱後，進行減壓乾燥，得到標題化合物161. 3mg(98% )。結構通過1H-NMR鑑定。1H-WR(SOi)MHz, CD3OD) δ (ppm) = 1. 94-1. 99 (2H, m, -NHCH2CHaCH2O-)，2. 11 (3H, s, NAc)，2. 94 (2H, t, -NHCH2CH2CH2O-)，3. 63 (2H, s, Ph-CH2-CO)，4. 19 (2H, t, -NHCH2CH2CH2O-)，7. 22-7. 51(4H，m，芳族 H)(實施例23)氨基丙醇_阿克他利導入的透明質酸鈉的合成使重均分子量80萬的透明質酸IOOmg (0. 25mmol/二糖單元)在水11. 25mL/二嗯 燒 11. 25mL 中溶解後，依次加入 HOSu (0. 2mmol)/水 0. ImL,WSCl 'HCl (0. Immol)/水 0. lmL、 由實施例22得到的氨基丙醇-阿克他利鹽酸鹽(0. Immol)/(水二嗯烷=1 l、2mL)， 攪拌一晝夜。在反應液中加入5%碳酸氫鈉水溶液1.5mL，攪拌3小時。在反應液中加入 50%醋酸43 μ L中和後，加入氯化鈉400mg進行攪拌。加入乙醇IOOml使其沉澱，將沉澱物 用80%的乙醇洗滌2次、用乙醇洗滌2次、用二乙醚洗滌，且在室溫下減壓乾燥一晚上。得 到97mg的白色固體。利用HPLC求出的阿克他利的導入率為13. 2%。(實施例24)氨基丙醇-酮洛芬導入的透明質酸鈉的合成使重均分子量90萬的透明質酸鈉200mg (0. 5mmol/ 二糖單元)在水23mL/ 二卩惡烷 23mL中溶解後，依次加入HOSu水溶液0. 3mmol/2mL、WSCl 'HCl水溶液0. 15mmol/2mL、由實 施例1得到的氨基丙醇_酮洛芬鹽酸鹽水溶液1. 5mmol/2mL，攪拌一晝夜。取11. 5mL反應 液，加入氯化鈉IOOmg且攪拌。加入50mL乙醇使其沉澱，將沉澱物用80%乙醇、乙醇、二乙 醚各洗滌2次，且在室溫下減壓乾燥一晚上。得到35mg的白色固體。利用HPLC算出的酮 洛芬的導入率為7. 2%。將得到的物質使其以濃度1. 0重量％溶解在PBS中，製成溶液，該 溶液是無色透明的液體，過濾器通過性試驗為「 C」。(參考例2)Boc-絲氨醇的合成將絲氨醇(10.lmmol) (Aldrich Chem. Co.制)溶解在水-二卩惡烷(1 l、20ml) 中，在冰冷卻下加入Boc2O (10. 8mmol)的二卩惡烷溶液(15ml)，返回到室溫，攪拌一晝夜。減 壓蒸餾溶劑。用己烷洗滌殘渣後進行減壓乾燥，得到標題化合物(1847mg、收率95%)。結 構通過1H-NMR鑑定。1H-WR(SOi)MHz, CD3OD) δ (ppm) = 1. 44 (9H, s, Boc)，3. 57-3. 58 (5H, m，絲氨醇)(實施例25)絲氨醇-酮洛芬鹽酸鹽的合成DBoc-絲氨醇_酮洛芬的合成將酮洛芬(1. llmmol)(東京化成工業株式會社制)在二氯甲烷(3ml)中溶解， 依次加入三乙胺(1. llmmol)、二甲基硫膦基氯化物(Mpt-Cl) (1. llmmol)的二氯甲烷溶液 (2ml)，攪拌25分鐘。進一步加入三乙胺(0. 36mmol)，攪拌20分鐘。將反應液冰冷卻，依次 加入三乙胺(1. llmmol)、DMAP (0. 19mmol)、由參考例2得到的Boc-絲氨醇(0. 50mmol)，返 回到室溫，攪拌一晝夜。再將反應液冰冷卻，依次加入25%的氨水(2ml)、二卩惡烷(10ml)， 攪拌20分鐘。將反應液濃縮至5ml，加入醋酸乙酯。依次用水、5%檸檬酸水溶液、5%碳酸 氫鈉水溶液、飽和食鹽水分液洗滌，用硫酸鈉脫水乾燥後，減壓蒸餾溶劑，將得到的殘渣用 矽膠柱色譜法(己烷醋酸乙酯=2 1,0. 5%三乙胺)純化，得到標題化合物(287. 3mg、 收率87% )。結構通過1H-NMR(⑶Cl3)鑑定。1H-NMR (500MHz, CDCl3) δ (ppm) = 1. 38-1. 40 (9H, m, Boc) , 1. 51-1. 53 (6Η, m, -OCOCH (CH3) -)，3. 76-3. 81 (2H, m, -0C0CH (CH3) -)，3. 96-4. 11 (4H, m, -CHaCH (NHBoc) CH2-)， 4. 61 (1H, btd, -CH2CH(NHBoc) CH2-)，7. 40-7. 80 (18H, m,芳族)2)絲氨醇_酮洛芬鹽酸鹽的合成將Boc-絲氨醇-酮洛芬(0. 428mmol)在二氯甲烷(Iml)中溶解，在冰冷卻下加入4N鹽酸/醋酸乙酯(4ml)，然後緩慢地升到室溫，攪拌2小時。用TLC確認絲氨醇-酮洛芬 的消失後，加入二甲醚、己烷，將析出的沉澱進行離心分離。將得到的沉澱進行減壓乾燥，得 到標題化合物(203. 6mg、qu.)。結構通過1H-NMR(CDCl3)鑑定。1H-NMR (500MHz, CDCl3) δ (ppm) = 1. 49 (6H, t, -OCOCH(CH1)-) ,3. 79 (1H, m, -CH2CH(NHBoc) CH2-)，4. 00-4. 53 (6H, m, Serinol, Ketoprofen)，7. 31-7. 80 (18H, m,芳族)(實施例26)絲氨醇_酮洛芬導入的透明質酸鈉的合成將重均分子量90萬的透明質酸(IOOmg)O. 25mmol/二糖單元在水/二噁烷(1 1、 22. 5ml)中溶解，加入 2mol/L HOSu (0. 1ml)、lmol/LWSCl 'HCl (0. 1ml)、由實施例 25 得到的 絲氨醇-酮洛芬鹽酸鹽(0. IOmmol)的二卩惡烷溶液(2ml)，攪拌一晝夜。在反應液中加入5% 碳酸氫鈉水溶液(1.5ml)，攪拌4小時。加入50%醋酸水溶液(43 μ 1)進行中和，加入氯化 鈉(0.4g)進行攪拌。加入乙醇(IOOml)進行攪拌，將產生的沉澱進行離心分離。將得到的 沉澱用80%的乙醇水溶液、乙醇、二乙醚依次各洗滌2次。進行減壓乾燥，得到標題化合物 (92.3mg)。利用HPLC算出的酮洛芬的導入率為11.2%。將得到的物質使其以濃度1. 0重 量％溶解在PBS中，製成溶液，該溶液是無色透明的液體，過濾器通過性試驗為「A」。(實施例27) 2-氨基-1，5-戊二醇-酮洛芬鹽酸鹽的合成1) Boc-氨基-1，5-戊二醇-酮洛芬的合成將Boc-氨基-1，5-戊二醇(Boc-NHCH(CH2OH) CH2CH2CH2OH^Aldrich Chem. Co.制) (1. 98mmol)在二氯甲烷(2ml)中溶解，依次加入酮洛芬(3. 96mmol)(東京化成工業株式會 社制)的二氯甲烷溶液(4ml)、DMAP(0.791mmol)的二氯甲烷溶液(1ml)，且進行攪拌。將 反應液進行冰冷卻，加入WSCl · HCl (4. 93mmol)的二氯甲烷溶液(5ml)，一邊緩慢地升到室 溫一邊攪拌一晝夜。將反應液用醋酸乙酯稀釋，依次用5%檸檬酸水溶液、5%碳酸氫鈉水 溶液、飽和食鹽水洗滌。用硫酸鈉脫水乾燥後，減壓蒸餾溶劑。將得到的殘渣用矽膠柱色譜 法(己烷醋酸乙酯=5 2、0.5%三乙胺)純化，得到標題化合物(1.361g、收率99%)。 結構通過1H-NMR(CDCl3)鑑定。1H-NMR (500MHz, CDCl3) δ (ppm) = 1. 39-1. 40 (9H, m, Boc) , 1. 51-1. 55 (6Η, m, -OCOCH (CH3) -) , 3. 75-4. 55 (8Η, m, Ketoprofen, 2-amino-l, 5-pentanediol), 7. 40-7. 80(18H, m，芳族)2) 2-氨基-1，5-戊二醇-酮洛芬鹽酸鹽的合成將由上述得到的Boc-氨基-1，5-戊二醇-酮洛芬(1.95mm0l)在二氯甲烷(Iml) 中溶解，在冰冷卻下加入4N鹽酸/醋酸乙酯(4ml)，然後緩慢地升到室溫，攪拌3小時。在 反應液中加入己烷，將析出的白色沉澱進行離心分離，將得到的沉澱進行減壓乾燥，得到標 題化合物(1.20g、收率98% )。結構通過1H-NMR(CDCl3)鑑定。1H-NMR (500MHz, CDCl3) δ (ppm) = 1. 50 (3H, d, -OCOCH(CH1)-) , 1. 51 (3Η, d，-OCOCH(CH3) -),3. 47 (1H，bd，2-氨基-1，5-戊二醇)，3. 44-4. 48 (6H，m，酮洛芬，2-氨 基-1，5-戊二醇)，7. 33-7. 84 (18H, m,芳族)(實施例28)2-氨基-1，5-戊二醇-酮洛芬導入的透明質酸的合成使重均分子量90萬的透明質酸(137mg)0. 34mmol/二糖單元在水/二{I惡烷(1 1、 30.8ml)中溶解後，依次加入 2mol/L HOSu (0. 137ml)、lmol/L WSCl .HCl (0. 137ml)、由實施 例27得到的2-氨基-1，5-戊二醇-酮洛芬鹽酸鹽(0. 137mmol)的水-二 惡烷(1 1)溶液(4ml)，攪拌一晝夜。在反應液中加入5%碳酸氫鈉水溶液(2. Iml)，攪拌5小時。加入 50%醋酸水溶液(59μ1)進行中和後，加入氯化鈉(0.548g)進行攪拌。加入乙醇(140ml) 進行攪拌，將產生的沉澱進行離心分離。 將得到的沉澱用80%的乙醇水溶液、乙醇、二乙醚洗滌。進行減壓乾燥，得到標題 化合物(135. Img)。利用HPLC算出的酮洛芬的導入率為18. 5%。將得到的物質使其以濃度 1.0重量％溶解在PBS中，製成溶液。該溶液是無色透明的液體，過濾器通過性試驗為「A」。
(實施例29) 3-氨基-1，2-丙二醇-酮洛芬鹽酸鹽的合成DBoc-氨基-1，2-丙二醇-酮洛芬的合成將Boc-氨基-1，2-丙二醇(Boc-NHCH2CH (OH) CH2OH、Aldrich Chem. Co.制) (2. 05mmol)在二氯甲烷(2ml)中溶解，依次加入酮洛芬(4. llmmol)(東京化成工業株式會 社制)的二氯甲烷溶液(4ml)、DMAP(0.803mmol)的二氯甲烷溶液(1ml)，且進行攪拌。將反 應液進行冰冷卻，加入WSCl · HCl (4. 94mmol)的二氯甲烷溶液(5ml)，一邊緩慢地升到室溫 一邊攪拌一晝夜。將反應液進行冰冷卻，加入WSCl -HCl (1. 24mmol)的二氯甲烷溶液(Iml)， 在室溫下攪拌1小時，在35°C下攪拌2小時。加入醋酸乙酯，依次用5%檸檬酸水溶液、5% 碳酸氫鈉水溶液、飽和食鹽水洗滌。用硫酸鈉脫水乾燥後，減壓蒸餾溶劑。將得到的殘渣用 矽膠柱色譜法(己烷醋酸乙酯=2 1,0. 5%三乙胺)純化，得到標題化合物(1. 175g、 收率87% )。結構通過1H-NMR(⑶Cl3)鑑定。1H-NMR (500MHz, CDCl3) δ (ppm) = 1. 36-1. 40 (9H, m, Boc) , 1. 42-1. 53 (6Η, m, -OCOCH(CHa) -) , 3. 10-3. 30 (2Η, m, BocNHCHi-) , 3. 65-3. 82 (2Η, m, -OCOCH(CH3)-)， 3. 99-4. 36 (2Η, m, BocNHCH2 (CH0-) CH2O-), 4. 49-4. 76 (1Η, m, BocNH"), 5. 04-5. 09 (1Η, m, BocNHCH2 (CH0-) CH2O-)，7. 38-7. 80 (18Η, m,芳族)2) 3-氨基-1，2-丙二醇-酮洛芬鹽酸鹽的合成將由上述得到的Boc-氨基-1，2-丙二醇-酮洛芬(1. 76mmol)在二氯甲烷 (Iml)中溶解，在冰冷卻下加入4N鹽酸/醋酸乙酯(4ml)，攪拌3小時。在反應液中加入 己烷，將析出的白色沉澱進行減壓乾燥，得到標題化合物(1.029g、收率97%)。結構通過 1H-WR(CDCl3)鑑定。1H-Wr(SoomHzADCI3) δ (ppm) = 1. 33-1. 49 (6H, m, -OCOCH (CH3) -), 3. 02-3. 20 (m, 2H, H2NCHa (CH0-) CH2O-)，3. 56-3. 82 (1H, m, -OCOCH(CH3) -)，3. 90-4. 15 (2H, m, H2NCH2 (CH0-) CHaO-, -OCOCH(CH3)-) ,4. 18-4. 50 (1H, m, H2NCH2CH (0-) CHaO-) , 5. 35-5. 37 (1H, m, H2NCH2CH (0-) CH2O-)，7. 30-7. 80 (18H, m,芳族)(實施例30)3-氨基-1，2-丙二醇-酮洛芬導入的透明質酸的合成使重均分子量90萬的透明質酸(200mg)0. 5mmol/二糖單元在水/ 二嗯烷(1 1、 45ml)中溶解，依次加入 2mol/L HOSu (0. 25ml) Umol/L WSCl (0. 25ml)、由實施例 29 得到的 3_氨基-1，2-丙二醇-酮洛芬鹽酸鹽(0.20mmol)的水-二卩惡燒(1 1)溶液(4ml)，攪拌 一晝夜。在反應液中加入5%碳酸氫鈉水溶液(3ml)，攪拌4小時。加入50%醋酸水溶液 (86 μ 1)進行中和，加入氯化鈉(0. Sg)進行攪拌。加入乙醇(200ml)進行攪拌，將產生的沉 澱進行離心分離。將得到的沉澱用80%的乙醇水溶液、乙醇、二乙醚洗滌。將沉澱進行減壓 乾燥。得到標題化合物(217. 4mg)。利用HPLC算出的酮洛芬的導入率為40.3%。將得到 的物質使其以濃度1.0重量％溶解在PBS中，製成溶液，該溶液是無色透明的液體，過濾器通過性試驗為「A」。(參考例3)Boc-三(羥甲基)氨基甲烷的合成將三(羥甲基)氨基甲烷(10. Immol)溶解在水-二聰燒(1 l、20ml)中，加入 Boc20(10. 8mmol)的水-二卩惡烷(1 9、IOml)，在室溫下攪拌45分鐘，在40°C下攪拌70分 鍾。加入BOc20(5.41mmOl)的二卩惡烷溶液(3ml)，一邊緩慢地升到室溫一邊攪拌一晝夜。減 壓蒸餾溶劑。用己烷洗滌殘渣後進行減壓乾燥，得到標題化合物(2. 21g、收率99% )。結構 通過1H-NMR鑑定。1H-WR(SOC)MHz, CD3OD) d(ppm) = 1. 44 (9H, s, Boc)，3. 68 (6H, s, -C (CH2OH) 3)(實施例31)三(羥甲基)氨基甲烷-酮洛芬鹽酸鹽的合成l)Boc-三(羥甲基)氨基甲烷-酮洛芬的合成將酮洛芬419mg (1. 65mmol)(東京化成工業株式會社制)溶解在3mL 二氯甲烷中， 在冰冷卻下依次加入三乙胺230 μ L(1. 65mmol)、Mpt-Cl 213mg(l. 65mmol)/ 二氯甲烷溶液 2mL，攪拌10分鐘。依次加入三乙胺230 μ L(l. 65mmol) ,DMAP 33mg(0. 27mmol)、由參考例3 得到的Boc-三(羥甲基)氨基甲烷(Boc-NHC(CH2OH)3)IIOmg(0. 5mmol)，返回到室溫，攪拌 一晝夜。加入2mL氨水，並加入二嗯烷至二氯甲烷和氨水變得均勻，攪拌40分鐘。減壓蒸 餾二氯甲烷，加入醋酸乙酯，依次用5%檸檬酸水溶液2次、水、5%碳酸氫鈉2次、水、飽和食 鹽水分液洗滌。用硫酸鈉脫水乾燥後，減壓蒸餾醋酸乙酯。用矽膠柱色譜法(二氯甲烷 甲醇=100 1 — 75 1)純化，定量地得到標題化合物467mg。結構通過1H-NMR(⑶Cl3) 鑑定，確認對1分子Boc-三(羥甲基)氨基甲烷導入了三分子酮洛芬。1H-NMR (500MHz, CDCl3) δ (ppm) = 1. 29 (9H, s, Boc) , 1. 44-1. 54(3ΗΧ3, m, -OCOCH(CHg) -) ,3. 76(1ΗΧ3, q, -OCOCH(CH3) -) ,4. 04-4. 27 (6Η, m, -NHC (CHaO-KP) 3), 4. 81 (1Η, br, _腿_)，7. 37-7. 85 (9ΗΧ 3，m,芳族 H)2)三(羥甲基)氨基甲烷-酮洛芬鹽酸鹽的合成將有上述得到的Boc-三(羥甲基)氨基甲烷-酮洛芬453mg(0.49mmol)在二氯 甲烷(Iml)中溶解，在冰冷卻下加入4M鹽酸/醋酸乙酯3mL，在冰冷卻下攪拌30分鐘，在室 溫下攪拌1小時30分鐘。用TLC確認Boc-三(羥甲基)氨基甲烷-酮洛芬消失後，加入 二乙醚、己烷，進行傾析。之後，進行減壓乾燥，以回收量411mg(97%)得到標題物質。結構 通過1H-NMR (CDCl3)鑑定。1H-NMR (500MHz, CDCl3) δ (ppm) = 1. 39-1. 50 (3HX3, m, -OCOCH(CH1)-), 3· 96 (1ΗΧ 3，q，-OCOCH(CH3) _)，4. 09-4. 46 (6H, m, -NHC (CHaO-KP) 3)，7. 25-7. 80 (9HX 3，m，芳 族 H)，9. 31 (br, H3NiCH2-)(實施例32)甘氨酸-三(羥甲基)氨基甲烷-酮洛芬鹽酸鹽的合成l)Boc-甘氨酸-三(羥甲基)氨基甲烷-酮洛芬的合成將甘氨酸133mg(0. 76mmol)溶解在ImL氯仿中，在冰冷卻下依次加入三乙胺 106 μ L(0. 76mmol)、Mpt-Cl 98mg(0. 76mmol)/ 氯仿 ImL,攪 10 分鐘。之後，分 4 次緩慢地 加入由實施例31得到的三(羥甲基)氨基甲烷-酮洛芬鹽酸鹽433mg(0. 5mmol)/三乙胺 70μ 1(0. 5mmol)/氯仿2mL、三乙胺106 μ L(0. 76mmol)。在室溫下攪拌1小時後，進一步在 冰冷卻下加入三乙胺106 μ L (0. 76mmol)，將Boc-甘氨酸131mg(0. 75mmol)用ImL氯仿溶 解，在冰冷卻下加入三乙胺105 μ L (0. 75mmol)、Mpt_C195mg (0. 75mmol)/氯仿lmL，且加入活化的Boc-甘氨酸的混合酸酐，在室溫下攪拌一晝夜。加入醋酸乙酯，依次用5%檸檬酸2 次、水、5%碳酸氫鈉2次、水、飽和食鹽水分液洗滌。用硫酸鈉脫水乾燥後，減壓蒸餾醋酸乙 酯，用矽膠柱色譜法(己烷醋酸乙酯=3 2)純化，得到標題化合物411mg(收率55%)。 結構通過1H-NMR (CDCl3)鑑定。1H-NMR (500MHz, CDCl3) δ (ppm) = 1.43(9H, s, Boc) , 1. 45-1. 52 (3HX 3, m, -OCOCH(CHa) -)，3. 56 (2Η, br, -N職C0-)，3. 76 (1HX 3，q, -OCOCH(CH3) -)，3. 98-4. 28 (6H, m, -NHC(CHaO-KP) 3) , 5. 51 (1Η, br,-皿CH2CO-) , 6. 63 (1Η, br, -MiC(CH2O-KP)3)，
7.34-7. 83 (9HX 3，m,芳族 H)2)甘氨酸-三(羥甲基)氨基甲烷-酮洛芬鹽酸鹽的合成向上述得到的Boc-甘氨酸-三(羥甲基)氨基甲烷-酮洛芬361mg(0.37mmol) 中，在冰冷卻下加入4M鹽酸/醋酸乙酯2mL，在室溫下攪拌2小時。用TLC確認Boc-甘氨 酸-三(羥甲基)氨基甲烷-酮洛芬消失後，加入二乙醚、己烷，進行傾析。之後，進行減壓 乾燥，以回收量336mg定量地得到標題物質。結構通過1H-NMR(⑶Cl3)鑑定。1H-Wr(SoomHzJDCI3) δ (ppm) = 1. 40 (3HX 3,m,-OCOCh(CH3)-), 3. 68-4. 24(11H, m，2H ；-N職CO-，IHX 3 ；-OCOCH(CH3)-, 6H ；-NHC (CH2O-KP) 3), 7. 27-7. 82 (9ΗΧ 3，m，芳族 H)，
8.31 (br, H3N1CH2-)(實施例33)甘氨酸-三(羥甲基)氨基甲烷-酮洛芬導入的透明質酸的合成使重均分子量90萬的透明質酸鈉100mg(0. 25mmol/ 二糖單元)在水11. 5mL/ 二 嗯烷 11. 5mL 中溶解後，依次加入 2mol/L HOSu/水 0. lmLUmol/L WSCl · HCl/水 0. ImL、由 實施例32得到的甘氨酸-三(羥甲基)氨基甲烷_酮洛芬鹽酸鹽93mg(0. lmmol)/ 二嗯烷 3mL，攪拌一晝夜。在反應液中加入5%碳酸氫鈉水溶液1.5mL，攪拌4小時45分鐘。在反 應液中加入50%醋酸水溶液43 μ L中和後，加入氯化鈉400mg進行攪拌。加入乙醇100ml 使其沉澱，將產生的沉澱物用80%的乙醇洗滌2次、用乙醇洗滌2次、用二乙醚洗滌。在室 溫下減壓乾燥一晚上。得到白色的固體95mg。利用HPLC算出的酮洛芬的導入率為39%。 將得到的物質使其以濃度1.0重量％溶解在PBS中，製成溶液，該溶液是無色透明的液體， 過濾器通過性試驗為「A」。(參考例4)Boc-氨基丙基溴化物的合成將3-溴丙胺氫溴酸鹽1. 222g (5. 58mmol)溶解在20mL 二氯甲烷中，在冰冷卻下加 入三乙胺0. 778mL(5. 58mmol)，進一步用10分鐘滴下Boc2Ol. 214mg(5. 56mmol)的二氯甲烷 溶液50mL並攪拌，在室溫下攪拌50分鐘後，加入醋酸乙酯，依次用5%檸檬酸水溶液、水、飽 和食鹽水分液洗滌。用硫酸鈉脫水後，減壓蒸餾溶劑。得到標題化合物1.304(98%)。結 構通過1H-NMR鑑定。1H-NMR (500MHz , CDCl3) δ (ppm) = 1. 44 (9H, s, Boc) , 2. 05 (2Η, quant, -NHCH2CHaCH2Br) , 3. 28 (2H, q, -NHCHaCH2CH2Br) , 3. 44 (2H, t, -NHCH2CH2CHiBr), 4. 64 (1Η, s, NH)(實施例34)氨基丙醇_雙氯芬酸鹽酸鹽的合成(I)Boc-氨基丙醇-雙氯芬酸將雙氯芬酸鈉1. 476g(4. 64mmol)溶解在3mL DMF中，在冰冷卻下滴下由參考例6 得到的Boc-氨基丙基溴化物1. 105g(4. 64mmol)的DMF溶液7mL，在室溫下攪拌一晚上後，在60°C下攪拌10小時。在室溫下攪拌一晚上後，在60°C下攪拌9小時，進一步在室溫下攪 拌3天。加入醋酸乙酯，依次用5%碳酸氫鈉水、水、飽和食鹽水分液洗滌。用硫酸鈉脫水 後，減壓蒸餾醋酸乙酯，將殘渣用矽膠柱色譜法(己烷醋酸乙酯=7 1、0.5%三乙胺) 純化，得到標題化合物1. 702g (收率81% )。(2)氨基丙醇_雙氯芬酸鹽酸鹽將由上述得到的Boc-氨基丙醇-雙氯芬酸1019mg(2. 25mmol)溶解在2mL 二氯甲 烷中，在冰冷卻下加入4M鹽酸/醋酸乙酯8mL，攪拌3小時。加入150mL 二乙醚使其沉澱， 將沉澱進行減壓乾燥，得到標題化合物791mg(90% )。結構通過1H-NMR鑑定。1H-WR(SOi)MHz, CDCl3) δ (ppm) = 2. 13 (2H, quant, -NHCH2CH2CH2O-) , 3. 08 (2Η, t, -NHCe^CH2CH2O-)，3. 84 (2H, s, Ph-CH2-CO)，4. 25 (2H, t, -NHCH2CH2CH2O-)，6. 52-7. 33 (8H, m, 芳族H，NH)(實施例35)氨基丙醇-雙氯芬酸導入的透明質酸鈉(DS4.3% )的合成使重均分子量80萬的透明質酸500mg(l. 25mmol/ 二糖單元)在水57. 5mL/ 二P惡 烷 57. 5mL 中溶解後，依次加入 0. 33M · HOSu/ 水 0. 75mL、0. 16M · WSCl · HCl/ 水 0. 75mL、由 實施例34得到的0. 16M氨基丙醇-雙氯芬酸鹽酸鹽/水0. 75mL，攪拌一晝夜。在反應液中 加入碳酸氫鈉375mg/水3mL，攪拌4小時。在反應液中加入醋酸108 μ L中和後，加入氯化 鈉3. Og進行攪拌。加入乙醇200ml使其沉澱，將沉澱物用80%的乙醇、乙醇、二乙醚各洗滌 2次。在室溫下減壓乾燥一晚上。得到505mg白色的固體。利用分光光度計算出的雙氯芬 酸的導入率為4.3%。(實施例36)氨基丙醇-雙氯芬酸導入的透明質酸鈉(DS9.7% )的合成使重均分子量80萬的透明質酸500mg(l. 25mmol/二糖單元)在水57. 5mL/二卩惡烷 57. 5mL 中溶解後，依次加入 0. 5M .HOSu/(水二聰烷=1 1) 1. 0mL、0. 25M · WSCl 'HCl/ (水二碟烷=1 1)1.0!^、由上述實施例34得到的0.2511氨基丙醇-雙氯芬酸鹽酸鹽/ (水二嗯烷=1 1)1. OmL，攪拌一晝夜。在反應液中加入碳酸氫鈉380mg/水5mL，攪拌 4小時。在反應液中加入醋酸108 μ L中和後，加入氯化鈉3. Og進行攪拌。加入乙醇200ml 使其沉澱，將沉澱物用80%的乙醇洗滌3次，用乙醇、二乙醚各洗滌2次。在室溫下減壓幹 燥一晚上。得到503mg白色的固體。利用分光光度計算出的雙氯芬酸的導入率為9.7%。(實施例37)使用平均分子量65kDa的透明質酸的氨基丙醇-雙氯芬酸導入的透 明質酸(65kDa)鈉(DS7. 1% )的合成使平均分子量65kDa的透明質酸200. 8mg(0. 5mmol/ 二糖單元)在水22. 5mL/ 二 P惡烷22. 5mL中溶解後，依次加入IM · HOSu 0. 4mL、0. 5M · WSCl · HCl 0. 4mL、由上述實施例 34得到的0. IM氨基丙醇-雙氯芬酸鹽酸鹽/(水二螺烷=1 l)2.0mL，攪拌一晝夜。 在反應液中加入5%碳酸氫鈉水溶液3mL，攪拌3小時。在反應液中加入50%醋酸86 μ L中 和後，加入氯化鈉1. Og進行攪拌。加入乙醇200ml使其沉澱，將沉澱物用85%的乙醇洗滌 2次，用乙醇洗滌2次，用二乙醚洗滌。在室溫下減壓乾燥一晚上。得到190. 5mg白色的固 體。利用分光光度計算出的雙氯芬酸的導入率為17.1%。(參考例5)Boc-氨基乙基溴化物將3-溴乙胺氫溴酸鹽2. 155g(10. 5mmol)溶解在20mL 二氯甲烷中，在冰冷卻下加 入三乙胺 1. 463mL(10. 5mmol)，進一步加入 Boc202. 299mg(10. 5mmol)的二氯甲烷溶液 5mL
33且攪拌。在室溫下攪拌90分鐘後，加入醋酸乙酯，依次用5%檸檬酸水溶液、水、飽和食鹽 水分液洗滌。用硫酸鈉脫水後，減壓蒸餾溶劑。得到標題化合物2.287g(97%)。結構通過 1H-WR鑑定。1H-NMR (500MHz, CDCl3) δ (ppm) = 1. 45 (9H, s, Boc) , 3. 45-3. 55 (4Η, m, -NHCE^CH2Br)，4. 93 (1H, s, NH)(實施例38)氨基乙醇_雙氯芬酸鹽酸鹽的合成(I)Boc-氨基乙醇-雙氯芬酸將由參考例5得到的Boc-氨基乙基溴化物2. 287g(10. 2mmol)的DMF溶液5mL 進行冰冷卻，加入雙氯芬酸鈉3. 255 (10. 2mmol)的DMF溶液6mL，在室溫下攪拌一晚上。在 60°C下攪拌11小時。在室溫下攪拌一晚上。加入醋酸乙酯，依次用5%碳酸氫鈉水溶液、水、 飽和食鹽水分液洗滌。用硫酸鈉脫水後，減壓蒸餾醋酸乙酯，將殘渣用矽膠柱色譜法(甲 苯醋酸乙酯=20 1、0.5%三乙胺)純化，得到標題化合物2.6758(60%)。結構通過 1H-WR鑑定。1H-WR(SOC)MHz, CDCl3) δ (ppm) = 1. 42 (9H, s, Boc)，3. 41 (2H，d, -NHCE^CH2O-), 3. 83 (2H, s, Ph-OirCO)，4. 21 (2H, t, -NHCH2CH2O-)，4. 72 (1H, s, NH)，6. 54-7. 47 (8H, m,芳族 H, NH)(2)氨基乙醇_雙氯芬酸鹽酸鹽將由上述得到的Boc-氨基乙醇-雙氯芬酸2. 108mg(4. 80mmol)溶解在5mL 二氯 甲烷中，在冰冷卻下加入4M鹽酸/醋酸乙酯20mL，攪拌2. 5小時。加入二乙醚、己烷使其沉 澱，將沉澱進行減壓乾燥，得到標題化合物1. 775g(98% )。結構通過IH-NMR鑑定。1H-NMR(500MHz, CDCl3) δ (ppm) = 3. 18 (2H, t, NH2CHiCH2O-) , 3. 94 (2Η, s, Ph-CH2-CO)，4. 37 (2H, t, NH2CH2CHaO-)，6. 47-7. 31 (8H, m,芳族 H, NH)(實施例39)氨基乙醇-雙氯芬酸導入的透明質酸鈉(DS14.7% )的合成使重均分子量80萬的透明質酸500mg(l. 25mmol/ 二糖單元)在水57. 5mL/ 二嗯 烷57. 5mL中溶解後，依次加入2M 'HOSu 0. 5mLUM 'WSCl 'HCl 0. 5mL、由上述實施例38得 到的氨基乙醇-雙氯芬酸鹽酸鹽188.6mg(0. 5mmol)的溶液(水二卩惡烷=1 l)3mL，攪 拌一晝夜。加入碳酸氫鈉水溶液7. 5mL，攪拌4小時。在反應液中加入50%醋酸215μ L中 和後，加入氯化鈉2. 5g進行攪拌。加入乙醇500ml使其沉澱，將沉澱物用85%的乙醇、乙 醇、二乙醚各洗滌2次。在室溫下減壓乾燥一晚上。得到473. 7mg白色的固體。利用分光 光度計算出的雙氯芬酸的導入率為14.7%。(實施例40)二氨基丙烷_雙氯芬酸鹽酸鹽的合成(1) Boc-丙基醯胺_雙氯芬酸將N-(2_氨基丙基)氨基甲酸叔丁酯338.4mg(1.94mm0l、東京化成工業株式 會社制)、雙氯芬酸694. 4mg (2. 34mmol)溶解在3mL 二氯甲烷中，在冰冷卻下加入DMAP 59. Omg (0. 483mmol)、WSCl · HCl 505. 3mg(2. 64mmol)，攪拌 70 分鐘，一邊升到室溫一邊攪 拌90分鐘。加入醋酸乙酯，依次用5%檸檬酸水溶液、5%碳酸氫鈉水溶液、飽和食鹽水分液 洗滌。用硫酸鈉脫水後，減壓蒸餾醋酸乙酯。將殘渣用矽膠柱色譜法(己烷醋酸乙酯= 2 1)純化，得到標題化合物835. 5g(95% )。結構通過1H-NMR(CDCl3)鑑定。1H-NMR (500MHz , CDCl3) δ (ppm) = 1. 45 (9H, s, Boc) , 1. 60 (2Η,quant, -NHCH9CH二CH9NHBoc) , 3. 14 (2H, q, -NHCH9CH,CH1NHBoc) ,3.31 (2H, q, -Nhch2CH2CH2NHBoc)，3. 69 (2H, s, Ph-OirCO)，4. 93 (1H, s，NH)，6. 50-7. 60 (9H, m,芳族 H, NH)(2) 二氨基丙烷_雙氯芬酸鹽酸鹽向由上述得到的Boc-丙基醯胺-雙氯芬酸825. Omg(1.82mm0l)的二氯甲烷溶液 ImL中，在冰冷卻下加入4M鹽酸/醋酸乙酯20mL，攪拌2小時。加入二乙醚使其沉澱，將沉 澱進行減壓乾燥。得到標題化合物714. 5mg(101% )。結構通過1H-NMR鑑定。1H-NMR (500MHz, CDCl3) δ (ppm) = 1. 90 (2H, t, -NHCH2CHaCH2NH2) , 2. 99 (2Η, t, -NHCH2CH2a^NH2)，3. 26 (2H, d, -NHcH2CH2CH2NH2) ,3. 71 (2H, s, Ph-CH2-CO)，6. 40-7. 49 (8H, m，芳族 H，NH)(實施例41)二氨基丙烷-雙氯芬酸導入的透明質酸(DS18. 1% )的合成使重均分子量80萬的透明質酸200mg(0. 5mmol/ 二糖單元)在水22. 5mL/ 二卩惡烷 22. 5mL中溶解後，依次加入2M · HOSu 0. 2mL、IM · WSCl · HCl 0. 2mL、由上述實施例40得到 的二氨基丙烷-雙氯芬酸鹽酸鹽78.4mg(0. 2mmol)的溶液(水二卩惡烷=1 l)lmL，攪 拌一晝夜。加入5%碳酸氫鈉水溶液3mL，攪拌4小時。在反應液中加入50%醋酸86μ L中 和後，加入氯化鈉Ig進行攪拌。加入乙醇200ml使其沉澱，將沉澱物用85%的乙醇洗滌2 次、乙醇洗滌2次、二乙醚洗滌，在室溫下減壓乾燥一晚上。得到206. 2mg的白色固體。利 用分光光度計算出的雙氯芬酸的導入率為18. 1%。(實施例42)生物試驗用氨基丙醇_酮洛芬導入的透明質酸鈉溶液的製備在由實施例3得到的氨基丙醇_酮洛芬導入的透明質酸鈉(導入率26. 3% ) 22mg 中，加入5mM磷酸緩衝生理鹽水使總量為2. 19g，攪拌一晚上，配製1 %溶液。將溶液用 0. 45 μ m過濾器過濾，作為標題溶液。將該溶液的內毒素含量用作為日本藥典刊載的一般試 驗法的內毒素試驗法(比色法)測定，內毒素值為0. 0073EU/M1。(實施例4幻氨基丙醇_酮洛芬導入的透明質酸鈉對大鼠緩激肽引起疼痛模型的效果1)被檢物質的給藥作為全身麻醉劑，使用在小動物用麻醉器(TK-4、K ^才* f >J 一制)中填充的 異氟烷(7才一 > > (註冊商標)、大日本製藥株式會社制)的吸入麻醉(濃度3.0%、流 量 2. OL/ 分)。作為被檢物質，使用PBS、1%的透明質酸鈉溶液(HA)、在PBS中溶解了酮洛芬的 3. 7mg/mL酮洛芬鈉溶液(KP)、及由實施例42製備的1 %氨基丙醇-酮洛芬導入的透明質酸 鈉的PBS溶液(KP-HA)。將大鼠(Crj :SD系(SPF)、雄性、7周大)在乙醚麻醉下背位固定，用理髮器將左後 肢膝關節周圍大面積地剃毛。用70%乙醇將關節周圍噴霧消毒，使用29G胰島素用的帶針 注射器(f 制)，將上述各被檢物質以20μιν關節的用量在左後肢膝關節腔內給藥。 各被檢物質按每組5例(η = 5)實施。2)致痛物質(BK+PGE2溶液)的給藥在各被檢物質給藥1天後，在無麻醉下，將大鼠背位固定，用70%乙醇將關節周圍噴霧消毒後，使用29G胰島素用的帶針注射器(，> 制、注射針的粗度0. 33mm)，在左後肢 膝關節腔內將作為致痛物質的緩激肽(BK)和前列腺素E2 (PGE2)的混合溶液按50 μ L/關節 的用量給藥。另外，將該致痛物質溶液配製成BK及PGE2各自終濃度4yg/mL、2yg/mL。自 致痛物質給藥之後肉眼觀察疼痛反應。3)疼痛觀察自致痛物質給藥之後，約2分鐘，用肉眼觀察有無提腿、三腿行走、跛行程度約2分 鍾，對行走狀態進行評化。將疼痛評分在0 2分的階段進行評價，提腿加1分，跛行或三 腿行走加1分。另外，評價在遮光狀態下實施。在圖1中顯示對各個體的疼痛反應評分後 的圖。在圖1中，通過平均疼痛評分士標準偏差表示結果。結果，與給藥組相比，按KP-HA > KP > HA的順序確認疼痛抑制效果。(實施例44)對大鼠硝酸銀引起疼痛模型的氨基丙醇-酮洛芬導入的透明質酸鈉的關節腔 內給藥引起的效果1)引起疼痛物質的給藥作為全身麻醉劑，使用填充在小動物用麻醉器(TK-4、K ^才*少1J 一制)中的 異氟烷(7才一> > (註冊商標)、大日本製藥株式會社制)的吸入麻醉(濃度3.0%、流 量 2. OL/ 分)。將大鼠(Crj :SD系(SPF)、雄性、6周大)在乙醚麻醉下背位固定，用理髮器將左後 肢膝關節周圍大面積地剃毛。用70%乙醇將關節周圍噴霧消毒，使用29G胰島素用的帶針 注射器(制)，將1%硝酸銀溶液以50 μ l/關節的用量在左後肢膝關節腔內給藥。2)被檢物質的給藥作為被檢物質，製備了以各自PBS為溶劑的透明質酸鈉溶液(HA)及由實施例 42製備的氨基丙醇-酮洛芬導入的透明質酸鈉溶液(KP-HA)。在硝酸銀溶液給藥 24小時後，將大鼠按5隻1組分成2組，在各組中給藥被檢物質。給藥方法與疼痛引起物質 一樣，在異氟烷的吸入麻醉下，用70%乙醇將關節周圍進行噴霧消毒，使用29G胰島素用的 帶針注射器按40 μ L/關節的用量在左後肢膝關節腔內進行給藥。2)評價方法使用在遮光狀態下將行走狀態評分的下述疼痛評分表，肉眼觀察各組的行走狀 態。結果在圖2中表示。在圖2中，通過平均疼痛評分士標準偏差表示結果。評分0 正常(含大致正常)1:輕度的跛行2:重度的跛行3:三腿行走另外，使用四肢負荷裝置(有)卜7 * >社制)測定施加在硝酸銀給藥腿(左後 肢)中的負荷，用體重除的結果作為荷重加載率(需要說明的是，荷重加載率正常時約為 32%)。至被檢物質給藥後2天每天測定一次。結果在圖3中表示。由圖2來看，HA給藥組與KP-HA給藥組均是疼痛評分緩慢地減少，但KP-HA給藥
36組比HA給藥組疼痛減輕的程度(由疼痛的恢復度)快。另外，在荷重加載率測定中，通常 越是由疼痛恢復，荷重加載率越升高，但由圖3的結果看，KP-HA給藥組比HA給藥組荷重加 載率的值用更短的時間實現了明顯地升高。圖2和圖3結果中的KP-HA給藥組和HA給藥 組的相關關係相同。(實施例45)兔膝關節中NSAIDs導入的透明質酸的緩釋性的研究1)被檢物質的給藥方法作為被檢物質，使用實施例42得到的氨基丙醇_酮洛芬導入的透明質酸鈉溶 液(KP-HA)、在ImL的PBS中溶解了 1. 42mg的酮洛芬的酮洛芬溶液(KP)、及在ImL的
HA溶液中溶解了 1. 4Img的酮洛芬的酮洛芬與HA的混合溶液(KP+HA)。對各被檢物質使用兔子各5隻，在氯胺酮全身麻醉下(ImL/頭、靜脈注射)背位固 定，用理髮器將左膝關節周圍大面積地剃毛，用裝載了 25G的注射針(子> 制、注射針的 粗度為0. 5mm)的f > ImL注射器從兔膝關節外側在關節腔內各自投入300 μ L上述被檢 物質。在從被檢物質給藥6小時、12小時、24小時、2天、4天後實施解剖。2)關節液中的游離型KP量及結合型KP量的測定方法將兔子在氯胺酮全身麻醉下放血殺死，全部回收關節液後，在分離的膝關節部的 關節腔內使用25G注射針注入生理鹽水2mL，洗滌關節腔內，該洗滌液也回收。該洗滌進行 2次。用下述步驟測定合併了回收的洗滌液的關節液中的KP量及HA-KP量。在關節液(4ml vol.)中加入IN HCl (2ml)，確認鹽酸酸性後，加入與溶液同體積的 醋酸乙酯，劇烈地攪拌，回收上部的有機層。共進行3次該提取操作。在回收的有機層中添 加乙腈溶液成為乙腈溶液，使用HPLC，測定游離KP量。(關節液中的游離型KP量)其次，在用上述的提取操作得到的水層中加入IN NaOH使其為強鹼性，在室溫下攪 拌1小時。接著，將水層冰冷卻，一邊緩慢地加入4N HCl—邊攪拌，成為鹽酸酸性後，加入 與溶液同體積的醋酸乙酯，進行劇烈地攪拌，回收上部的有機層。共進行3次該提取操作。 在回收的有機層中添加乙腈溶液作為乙腈溶液，使用HPLC，測定HA-KP量(結合型KP量)。 (關節液中的結合體HA-KP量)3)滑膜組織的消化液中的KP量的測定方法從回收了上述(2)的關節液後的膝關節分離收集滑膜組織。收集的滑膜組織用生 理鹽水IOOmL仔細地洗滌，完全除去附著的關節液。滑膜組織在去掉膝蓋骨以後，放入管 中，添加用IOmM醋酸鈉溶液(pH7. 5)調製成2mg/mL濃度的蛋白酶K(批號102K8633、SIGMA 制)5mL，一邊以適當渦流攪拌，一邊在55°C下進行酶消化41小時。消化後，在100°C下、用 5分鐘使酶失活，用下述步驟測定得到的消化液中的KP量。在得到的消化液中加入1/4量的4N NaOH，在室溫下攪拌1小時。接著，將該溶液冰 冷卻，加入4N HCl成為鹽酸酸性後，加入與溶液同體積的二乙醚，劇烈地進行攪拌，除去上 部有機層。該脫脂操作共進行3次。在冰冷卻下，在脫脂操作後的溶液中加入4N HCl並進 行攪拌，確認鹽酸酸性後，加入與溶液同體積的醋酸乙酯，進行劇烈地攪拌，回收上部的有 機層。共進行3次該提取操作。在回收的有機層中添加乙腈溶液作為乙腈溶液，使用HPLC， 測定游離KP量。(滑膜組織消化液中的游離型KP量)算出在關節液中、滑膜組織消化液中相繼的KP及HA-KP的殘存率。(表1、圖4)
表 1
被檢物質回收部位存在方式6小時 (%)12小時 (%)24小時 (%)2 天(％)4 天(％)KP (單劑)關節液游離型KP0滑膜組織0KP+ HA (混合物)關節液游離型KP0.070滑膜組織00KP-HA (結合體)關節液游離型KP0.130.140.220.160結合體型KP46.5634.9418.958.110.63滑膜組織11.35.2032.9012.107.4 作為被檢物質，在給藥KP (單劑)或KP+HA (混合物)的情況下，在6小時、12小時 後，KP從關節液及滑膜組織消失。但是，在給藥作為本發明物質的KP-HA(結合體)的情況 下，確認4天後關節液及滑膜組織也與KP共存，推測在給藥部位中KP持續地存在，顯示持 續效果。在關節引起的疼痛據推測不是通過作為非神經組織的軟骨，而是通過滑膜組織產 生，另外認為，當在關節腔內給藥NSAIDs時，NSAIDs快速地向滑膜轉移，轉移到滑膜顯示作 用。因此認為滑膜中的NSAIDs濃度的維持與疼痛抑制的持續效果及緩釋效果有很大關係。 由上述表來看，KP(單劑)的給藥，在6小時後利用滑膜的通過及代謝從滑膜組織消失，但 在給藥KP-HA (結合體)時，即使在滑膜組織中也持續地保持KP，作為NSAIDs的緩釋性製劑 更有效。(實施例46)對大鼠硝酸銀引起疼痛模型的導入率(DS)不同的氨基丙醇-二 氯苯胺乙酸導入的透明質酸鈉的關節腔內給藥引起的效果按照上述實施例44的實驗順序進行試驗，對與下述被檢驗物質有關的關節腔內 給藥進行評價。被檢物質(i)由實施例19得到的氨基丙醇-雙氯芬酸導入的透明質酸鈉(DS18.2% ) 的PBS溶液(ii)由實施例36得到的氨基丙醇-雙氯芬酸導入的透明質酸鈉(DS9. 7%) 的PBS溶液(iii)由實施例35得到的氨基丙醇-雙氯芬酸導入的透明質酸鈉(DS4. 3% ) 的PBS溶液(iv) PBS與上述實施例44 一樣，使用在遮光狀態下將行走狀態評分的疼痛評分表，肉眼觀 察各組的行走狀態。結果在圖5中表示。結果通過平均疼痛評分士標準偏差顯示，DS18%、 DS10%及DS4%分別與DS18. 2%,DS9. 7%及DS4. 3%相對應。另外，在圖5中，*表示風險率0. 01 < P < 0. 05，對PBS存在有顯著差異，**表示風險率P < 0. 01，對PBS存在有顯著差異。從結果來看，作為被檢物質的DS18. 2%, DS9. 7%及DS4. 3%的雙氯芬酸導入的透 明質酸鈉衍生物，都顯示鎮痛效果。其中，DS18. 2%及DS9. 7%的被檢物質與PBS相比，顯 示劇烈的鎮痛效果。另外，鎮痛效果隨雙氯芬酸的導入率(DS)的增加而提高。(參考例6)對大鼠硝酸銀引起疼痛模型的雙氯芬酸鈉的經口給藥引起的效果按照上述實施例44進行實驗，關於被檢物質的給藥方法實行下述被檢物質的經 口給藥進行評價。但是，被檢物質的給藥使用大鼠用經口給藥探棒P千方$器械店)按 ImL/頭的用量經口給藥。被檢物質(i)l%雙氯芬酸鈉懸濁液(10%阿拉伯樹膠)(ii)0. 02%雙氯芬酸鈉懸濁液(10%阿拉伯樹膠)另外，⑴(高用量組)作為雙氯芬酸鈉相當於給藥50mg/kg，(ii)(低用量組)作 為雙氯芬酸鈉相當於大體上與臨床給藥量相同的lmg/kg的給藥。與上述實施例46 —樣，使用在遮光狀態下將行走狀態評分的疼痛評分表，肉眼觀 察各組的行走狀態。結果在圖6中表示。在圖6中，「雙氯芬酸Na(ρ. ο. )50mg/kg」與上述⑴ (高用量組)相對應，「雙氯芬酸Na (ρ. ο.) lmg/kg」與上述(ii)(低用量組)相對應。另外， 在圖6中，作為參考，由上述實施例46測定的雙氯芬酸導入的透明質酸衍生物(DS18. 2% ) 及PBS的關節腔內注入引起的疼痛評分的結果也一起分別作為「雙氯芬酸-HA」、「PBS」記 載。從結果來看，在雙氯芬酸鈉的高用量組(50mg/kg)的經口給藥中，可以看出疼痛 抑制效果，但從第二天看到便潛血反應陽性、黃疸樣症狀、體重減少。高用量組的用量，是臨 床給藥量的數十倍的用量，在副作用、毒性方面不是現實的用量。大體上為臨床給藥量的低用量組(lmg/kg)的經口給藥組，即使與PBS的關節注入 組相比也未看到效果。另一方面，在雙氯芬酸導入的透明質酸衍生物的關節腔內給藥中，發現自給藥後 疼痛抑制。另外，被認為雙氯芬酸鈉的高用量組(50mg/kg)的經口給藥這樣的副作用的症 狀也沒觀察到，確認有高的有效性。(參考例7)對大鼠硝酸銀引起疼痛模型的雙氯芬酸單劑、透明質酸的關節腔 內給藥引起的效果按照上述實施例44進行實驗，關於被檢物質的給藥方法，實行與下述被檢物質有 關的關節腔內給藥進行評價。被檢物質(i)0. 雙氯芬酸溶液(ii)0. 雙氯芬酸/1%透明質酸混合溶液(iii)PBS與上述實施例46 —樣，使用在遮光狀態下將行走狀態評分的疼痛評分表，肉眼觀 察各組(η = 9)的行走狀態。結果在圖7中表示。在圖7中，結果通過平均疼痛評分士標準偏差顯示，0. 雙氯芬酸Na與上述(i)0. 雙氯芬酸溶液相對應，「0. Diclo+HA」 與上述(ii)0. 雙氯芬酸/1%透明質酸混合溶液相對應。另外，在圖7中，作為參考， 由上述實施例46測定的雙氯芬酸導入的透明質酸衍生物(DS18.2%)的結果也一起作為 「Dic-HA(結合體)」進行了記載。從結果來看，雙氯芬酸單劑及雙氯芬酸和透明質酸的混合物，與作為對照組的PBS 相比，未顯示顯著的效果。(實施例47)對大鼠硝酸銀引起疼痛模型的氨基丙醇-雙氯芬酸導入透明質 酸(65kDa)鈉、二氨基丙烷-雙氯芬酸導入透明質酸鈉及氨基乙醇-雙氯芬酸導入透明質 酸鈉的關節腔內給藥引起的效果按照實施例44進行實施，對與下述被檢物質有關的關節腔內給藥進行評價被檢物質(i)由實施例37得到的氨基丙醇-雙氯芬酸鈉導入的透明質酸(65kDa)鈉的 PBS溶液(ii)由實施例41得到的二氨基丙烷-雙氯芬酸鈉導入的透明質酸鈉的PBS 溶液(iii)由實施例39得到的氨基乙醇-雙氯芬酸鈉導入的透明質酸鈉的PBS溶 液(iv) PBS與上述施實例44 一樣，使用在遮光狀態下將行走狀態評分的疼痛評分表，肉眼 觀察各組(η = 7)的行走狀態。結果在圖8中表示。在圖8中，結果通過平均疼痛顯示， 「65kDa」與上述(i)l%氨基丙醇-雙氯芬酸鈉導入的透明質酸(65kDa)鈉的PBS溶液相對 應，「二氨化物」與上述(ii) 1 %二氨基丙烷_雙氯芬酸導入的透明質酸鈉的PBS溶液相對 應，「C2」與上述(iii)l%氨基乙醇-雙氯芬酸導入的透明質酸鈉的PBS溶液相對應。另外， 在圖8中，D表示風險率為0. 05 < P < 0. 1，對PBS存在有顯著差異，*表示風險率為0. 01 < P < 0. 05，對PBS存在有顯著差異，**表示P < 0.01 JfPBS存在有顯著差異。由結果來看，間隔物碳數使用比氨基丙醇少一個的氨基乙醇的氨基乙醇_雙氯芬 酸導入的透明質酸鈉溶液也顯示高的鎮痛效果，但雙氯芬酸通過醯胺鍵導入的二氨基丙 烷-雙氯芬酸導入的透明質酸鈉溶液，在本實施例的實驗體系中完全不顯示效果。另外，使 用分子量65kDa的透明質酸的雙氯芬酸導入的透明質酸衍生物，與分子量80萬的相比，鎮 痛效果降低了。由此來看，顯然鎮痛效果依賴於與雙氯芬酸的結合方式或透明質酸的分子量。(實施例48)雙氯芬酸鈉單劑及雙氯芬酸導入的透明質酸衍生物對C0X-2的作用 (體外)使用 Chemiluminescent COX Inhibitor Screening Assay kit (Cayman)(以來自 羊的C0X-2引起的過氧化物酶活性為指標，篩選抑制劑的試劑盒)，對下述被檢物質評價了 C0X-2抑制作用。被檢物質(i)由實施例19得到的氨基丙醇-雙氯芬酸導入的透明質酸鈉水溶液 (Dic-C3-HA)(相當於200 μ g/ml HA，相當於80 μ M雙氯芬酸)
(ii)用與實施例39同樣的步驟得到的氨基乙醇_雙氯芬酸導入的透明質酸鈉水 溶液(DIC-C2-HA、DS 18. 5% )(相當於200 μ g/ml HA，相當於80 μ M雙氯芬酸)(iii) 80 μ M雙氯芬酸鈉水溶液(iv) 200 μ g/ml透明質酸鈉(HA)水溶液製作上述被檢物質的原液及用蒸餾水稀釋了 10倍、100倍、1000倍的被檢物質，用 COX Inhibitor Screening Assay kit測定了 C0X-2抑制活性(無處理組η = 6、被檢物質 組η = 3)。結果，將未處理組的C0X-2酶活性設定為100%，通過下述式用相對％表示各處 理組的酶活性值。結果在圖9(a)及圖9(b)中表示。在圖9(a)中，「雙氯芬酸Na」與上述 雙氯芬酸鈉水溶液相對應，"Dic-C3-HA"與上述氨基丙醇-雙氯芬酸導入的透明質酸鈉水 溶液相對應，「Dic-C2-HA」與上述氨基乙醇-雙氯芬酸導入的透明質酸鈉水溶液相對應。在 圖9 (b)中，「HA」與上述200 μ g/ml透明質酸鈉水溶液相對應。酶活性值(％ )=被檢物質處理群+未處理組X 100結果，在雙氯芬酸鈉單劑顯示明顯的C0X-2抑制活性的濃度中，含有相當濃度的 雙氯芬酸的雙氯芬酸導入的透明質酸衍生物(Dic-C3-HA及DIC-C2-HA)沒有顯示出C0X-2 抑制活性。HA單劑也沒有顯示出C0X-2抑制活性。從該結果來看，體外試驗中的雙氯芬酸 導入的透明質酸衍生物的效果，不是雙氯芬酸衍生物本身的作用，顯示了起因於由HA脫離 的雙氯芬酸的可能性。體外(實施例46、47)中的雙氯芬酸導入的透明質酸衍生物的效果，作為比雙氯芬 酸單一物質更好的理由之一，可以認為是由於HA利用對該細胞的親和性，運送更多量的雙 氯芬酸至目的細胞內的緣故。(實施例49)雙氯芬酸導入的透明質酸衍生物對大鼠佐劑性關節炎(AIA)模型的 作用1)佐劑的誘導將 Mycobacterium butyricum( fth ^ 2115687、Difco)6mg/mL 用高壓滅菌器在 121°C下熱處理20分鐘後，使用29G胰島素用的帶針注射器(f > )按50 μ L/關節的用 量注射在左後肢趾皮下。2)試驗物質的給藥被檢物質(i)由實施例19得到的氨基丙醇-雙氯芬酸導入的透明質酸(DS18% )鈉的 水溶液(雙氯芬酸-HA)(ii)PBS上述被檢物質與佐劑注射時一樣，在無麻醉條件下使用29G胰島素用的帶針注射 器按50 yL/關節的用量在兩腿的脛骨-腳跟骨關節腔內佐劑注射之後，在注射 後1、2、3周進行給藥(共4次)(η = 14)4)評價在佐劑誘導前、引起後3、5、7、10、12、14、21、28日進行評價。·體重·兩後肢腳體積(大鼠·小鼠後肢腳墊浮腫體積測定裝置(TK-101CMP、(有)二 二 二 A社制)
5)結果通過下述式測定佐劑給藥足及非給藥足的膨脹率。佐劑給藥足膨脹率的結果在圖 10(a)中表示，佐劑非給藥足的結果在圖10(b)中表示。在圖10中，「雙氯芬酸-HA」表示 上述(i)l%氨基丙醇-雙氯芬酸導入的透明質酸(DS18%)鈉的PBS溶液，「正常」表示佐 劑及被檢物質給藥組。在圖10中，D表示風險率為0. 05 < P < 0. IJ^PBS存在有顯著差 異，*表示風險率為0. 01 < P < 0. 05，對PBS存在有顯著差異，**表示風險率P < 0. 01，對 PBS存在有顯著差異。膨脹率=(測定日的足體積_佐劑誘導前的足體積)/佐劑誘導前體積X 100自佐劑誘導後3天開始看到在給藥足(R)內浮腫，雙氯芬酸-HA在引起後3、5、21 日內與PBS組相比，統計學上顯著，在7、26、28日內雖然不顯著，但顯示抑制足浮腫體積的 作用。儘管在其他的時刻也是非顯著的，但在任何時刻雙氯芬酸-HA組都顯示低值。非給藥足(L)自誘導後14日看到明顯的腫脹(二次炎症)。雙氯芬酸-HA在誘導 後14、26日內統計學上顯著地抑制了該浮腫。另外，在21、28日內雖然不顯著，但顯示出抑 制傾向。另外，該大鼠佐劑性關節炎(AIA)模型，一般來講作為自身免疫疾患引起的關節 炎的風溼性關節炎的模型使用，從上述結果來看，本發明物質也期待對風溼性關節炎有效^ ο詳細地或參照特定實施方式說明本發明，但在不脫離本發明的精神和範圍的情況 下，可以添加各種變更及修正，這對本領域的技術人員來說是一目了然的。本申請是基於2004年1月7日申請的日本專利申請(特願2004-2478)的文本， 其內容在此作為參照被引用。在此引用的全部的參照作為整體被引用。工業上利用的可能性利用本發明，提供通過具有在生物體內可以分解的部位的間隔物NSAIDs以共價 鍵結合在透明質酸上的NSAIDs導入的透明質酸衍生物、同樣地DMARD共價鍵結合的DMARD 導入的透明質酸衍生物、及含有這些衍生物作為有效成分的藥劑。NSAIDs導入的透明質酸 衍生物及DMARD導入的透明質酸衍生物由於良好地溶解在作為注射劑等溶劑使用的緩衝 液中，故作為在患部可以直接給藥的注射劑可以使用。另外，本發明藥劑可以在關節炎的治 療、炎症的抑制及疼痛的抑制中使用，作為注射劑也可以非經口給藥或局部給藥(例如，關 節內給藥)。
權利要求
一種透明質酸衍生物，通過由下述式(2)表示的非甾類抗炎症化合物用共價鍵結合在透明質酸上而得到，其中，導入了該抗炎症化合物的透明質酸組成二糖單元的部分結構，用下述式(1)表示，Y CO NH R1 (O R2)n(1)Y CO 表示透明質酸的組成二糖單元的一個殘基，R2表示非甾類抗炎症化合物殘基或氫原子，其中不包括全部為氫原子的情況， HN R1 (O R2)n表示用含有n個羥基的H2N R1 (OH)n表示的間隔物化合物的間隔物殘基，R1表示具有或不具有取代基的碳數2～12的直鏈或具有分支的烴基， CO NH 表示作為透明質酸的組成糖的葡糖醛酸的羧基和間隔物化合物具有的氨基的醯胺鍵，n表示1～3的整數；另外，間隔物化合物的殘基和非甾類抗炎症化合物的殘基之間的鍵是間隔物化合物具有的羥基和非甾類抗炎症化合物具有的羧基的酯鍵；該透明質酸衍生物中的非甾類抗炎症化合物的導入率為每個透明質酸的重複二糖單元5～50摩爾％，構成透明質酸衍生物的透明質酸殘基中的羰基，根據非甾類抗炎症化合物殘基的導入率，作為參與與該間隔物結合的抗炎症化合物殘基的鍵合的醯胺鍵或者作為不參與與該間隔物結合的抗炎症化合物殘基的鍵合的游離的羧基存在，R3表示選自低級烷基及低級烷氧基的取代基或氫原子；R4、R5及R6分別獨立地表示選自由低級烷基、低級烷氧基及羥基組成的組中的取代基、滷原子或氫原子；X分別獨立地相同或不同，表示選自低級烷基及三氟甲基的取代基或滷原子，至少X的任一個是滷原子。FSA00000214650300011.tif
2. 一種透明質酸衍生物，通過非留類抗炎症化合物用共價鍵結合在透明質酸上而得 到，其中，導入了該抗炎症化合物的透明質酸組成二糖單元的部分結構，用下述式(1)表Y-CO-NH-R1-(O-R2)n(I)Y-CO-表示透明質酸的組成二糖單元的一個殘基，R2表示非留類抗炎症化合物殘 基或氫原子，其中不包括全部為氫原子的情況，-HN-R1-(O-R2)n表示用含有η個羥基的 !！力-！^-⑴！！^表示的間隔物化合物的間隔物殘基，R1表示具有或不具有取代基的碳數2 12的直鏈或具有分支的烴基，-CO-NH-表示作為透明質酸的組成糖的葡糖醛酸的羧基和間 隔物化合物具有的氨基的醯胺鍵，η表示1 3的整數；另外，間隔物化合物的殘基和非甾 類抗炎症化合物的殘基之間的鍵是間隔物化合物具有的羥基和非留類抗炎症化合物具有 的羧基的酯鍵；該透明質酸衍生物中的非留類抗炎症化合物的導入率為每個透明質酸的重 復二糖單元5 50摩爾％，構成透明質酸衍生物的透明質酸殘基中的羰基，根據非留類抗 炎症化合物殘基的導入率，作為參與與該間隔物結合的抗炎症化合物殘基的鍵合的醯胺鍵 或者作為不參與與該間隔物結合的抗炎症化合物殘基的鍵合的游離的羧基存在， 所述非留類抗炎症化合物從如下組中選擇酮洛芬、萘普生、布洛芬、氟比洛芬、乙醯水 楊酸、聯苯乙酸、聯苯丁酮酸、甲芬那酸、雙氯芬酸和依託度酸。
3.如權利要求1或2所述的透明質酸衍生物，其中，所述式(1)中的R1是具有或不具 有取代基的亞乙基、三亞甲基或亞丙基。
4.一種利用注入裝置能夠推出的透明質酸衍生物溶液，通過權利要求1或2所述的透 明質酸衍生物溶解在水性介質中而得到。
5.一種藥劑，其含有權利要求1或2所述的透明質酸衍生物作為有效成分。
6.一種酸衍生物，用下述式(3)表示，其通過間隔物化合物共價結合在由下述式(2)表 示的非留類抗炎症化合物上而得到， (3)R2表示用下述式(2)表示的非留類抗炎症化合物殘基或氫原子，其中不包括全部是氫 原子的情況，H2N-R1-(0-) n表示用含有η個羥基的H2N-R1- (OH) η表示的間隔物化合物的間隔 物殘基，R1表示具有或不具有取代基的碳數2 12的直鏈或具有分支的烴基，η表示1 3的整數，另外，間隔物化合物的殘基和非甾類抗炎症化合物的殘基之間的鍵是間隔物化合 物具有的羥基和非留類抗炎症化合物具有的羧基的酯鍵，R3表示選自低級烷基及低級烷氧基的取代基或氫原子；R4、R5及R6分別獨立地表示選 自由低級烷基、低級烷氧基及羥基組成的組中的取代基、滷原子或氫原子；X分別獨立地相 同或不同，表示選自低級烷基及三氟甲基的取代基或滷原子，至少X的任一個是滷原子。
7. 一種酸衍生物，用下述式(3)表示，其通過間隔物化合物共價結合在非留類抗炎症 化合物上而得到，H2N-R1-(O-R2)n (3)R2表示用下述式(2)表示的非留類抗炎症化合物殘基或氫原子，其中不包括全部是氫 原子的情況，H2N-R1-(0-) η表示用含有η個羥基的H2N-R1- (OH) η表示的間隔物化合物的間隔 物殘基，R1表示具有或不具有取代基的碳數2 12的直鏈或具有分支的烴基，η表示1 3的整數，另外，間隔物化合物的殘基和非甾類抗炎症化合物的殘基之間的鍵是間隔物化合 物具有的羥基和非留類抗炎症化合物具有的羧基的酯鍵，所述非留類抗炎症化合物從如下組中選擇酮洛芬、萘普生、布洛芬、氟比洛芬、乙醯水 楊酸、聯苯乙酸、聯苯丁酮酸、甲芬那酸、雙氯芬酸和依託度酸。
全文摘要
通過具有在生物體內可以分解的部位的間隔物，抗炎症化合物用共價鍵結合在透明質酸上的透明質酸衍生物及其製造方法。
文檔編號A61K45/00GK101921347SQ20101024329
公開日2010年12月22日 申請日期2005年1月7日 優先權日2004年1月7日
發明者吉岡敬二, 安田洋祐, 宮本建司 申請人:生化學工業株式會社