一種基於γ-Fe₂O₃@Au複合納米粒子間接富集的NMR食源性致病菌快速檢測方法

2023-05-25 00:16:26

專利名稱：一種基於γ-Fe2O3@Au複合納米粒子間接富集的NMR食源性致病菌快速檢測方法
技術領域：
本發明涉及一種致病菌的快速檢測方法，尤其涉及一種基於r-Fe2O3OAu複合納米粒子間接富集的NMR食源性致病菌快速檢測方法。
背景技術：
基本原理:單克隆抗體或抗原分子與酶分子通過共價鍵結合，這種結合不會改變單克隆抗體、抗原和酶的免疫學特性及生物活性，特異性的單克隆抗體只會與特異性的抗原結合。其主要的原理步驟:1.向待檢樣本中加入目標菌的第I抗體，若存在目標菌，則與I抗結合形成I抗複合物；2.利用種子生長法製備了磁性r- Fe203iAu核殼納米粒子，通過修飾抗體實現表面功能化，將I抗的抗體即2抗偶聯在磁珠表面，形成特異性免疫磁珠，並將多餘活性位點封閉。2.將另一部分目標菌的特異性I抗單克隆抗體採用一定的方法固定在固相載體表面，並將多餘活性位點封閉。3.將第2步製備的2抗特異性免疫磁珠加入到第I步的待檢樣本中，用於抓取富集目標菌,通過外加磁場將磁珠分離出來,此時，結合了目標菌的I抗複合物和沒有結合目標菌的過量I抗都會與磁珠表面的2抗結合，還是混在一起。4.將上述混在一起的磁珠，加到第2步的固相載體表面，則抓取了目標菌的磁珠將與固相載體表面I抗發生特異性結合，形成雙抗夾心，用無菌的去離子水清洗可以將未發生結合的磁珠洗脫。5.再採用洗脫劑將固定載體上的結合的特異性納米免疫磁珠洗下來，磁分離清洗掉離子、溶劑。此部分磁珠如果存在，就是抓取了目標菌的磁珠。由於r -Fe2O3OAu複合納米粒子具有順磁和超順磁特性，對於共振儀器非常敏感，相對於其他分子而言，微量的r -Fe2O3OAu複合納米粒子能夠大幅降低無菌的去離子水的自旋-晶格馳豫參數Tl和自旋-自旋弛豫時間T2，而無菌的去離子水在一定的均勻場強下，T1/T2是固定的。將洗脫液置於核磁共振儀中，與無菌的去離子水對照組進行對照。顯著發生T1/T2值降低的說明有磁珠存在，從而間接說明食品樣品中有致病菌檢出。磁珠含量與T1/T2值降低呈正比。通過加標，可以定量檢測目標菌。該方法中F-Fe2O3OAu複合納米粒子磁珠既是分離富集的手段，同時r-Fe2O3OAu複合納米粒子具有的順磁和超順磁特性，又可作為定量檢測的探針。該方法的主要優點就是快速、靈敏度高。相對於致病菌的微生物培養2-3天甚至幾天的時間，此方法主要取決於樣品的預處理時間，核磁共振檢測只需幾分鐘。因此，用該方法可做大規模待檢樣本的陽性篩選，檢出的陽性樣還需用微生物培養進行確證。目前，國內外還沒有文獻報導這種方法，但是採用免疫磁珠進行致病菌的富集、目標物的富集等的報導還是很多的，但都沒有採用核磁共振做進一步的檢測。

發明內容
本發明的目的是提供一種基於r-Fe2O3OAu複合納米粒子間接富集的NMR食源性致病菌快速檢測方法，用於對各種不同的食品樣品進行評價，該方法是一種客觀有效的檢出食品中有害致病菌的方法，從而在某種程度上大大縮減了食品樣品有害致病菌的篩選時間。—種基於r-Fe2O3OAu複合納米粒子間接富集的核磁共振技術快速檢測出食品中的有害致病菌的方法，利用核磁共振儀對順磁、超順磁物質的響應敏感性，提出核磁共振弛豫參數變化與r-Fe2O3OAu複合納米粒子超順磁免疫磁珠含量的相關性指標。不同的致病菌檢出下限不同。該方法依賴於建立的可用於食品樣品中有害致病菌特徵性免疫磁珠富集、分離，從核磁共振弛豫信號參數變化的角度，檢測出樣品中的有害致病菌；採用目標菌的I抗標記形成I抗複合物；採用偶聯I抗抗體即2抗的超順磁免疫磁珠，可以將樣品中的特異性致病菌進行富集並分離；由於核磁共振儀自旋-晶格弛豫效率和自旋-自旋弛豫效率對r-Fe2O3OAu複合納米粒子非常敏感，即在去離子水中,存在微量的超順磁r-Fe2O3OAu複合納米粒子，則水的自旋-晶格弛豫時間(Tl)和/自旋-自旋弛豫(T2)就會顯著下降。在一定條件下，超順磁免疫磁珠的順磁特性使核磁共振的弛豫衰減信號T2/T1產生線性減小。通過定量檢測出樣品中的免疫磁珠含量，從而可以間接定量出食品樣品中的有害致病菌含量。檢測出的致病菌含量與磁珠含量線性相關，擬合度較好。最終以超順磁免疫磁珠與致病菌間的對應關係為紐帶，確定食品樣本中的致病菌菌落數。本發明是這樣實現的，步驟如下:
O向待檢樣本中加入目標菌的第I抗體，若存在目標菌，則與I抗結合形成I抗複合
物；
2)2抗即第I抗體的抗體免疫磁珠的製備；
3)將目標菌特異性I抗單克隆抗體固定在固相載體表面；
4)免疫磁珠富集目標菌株，並分離:將第2步製得的2抗免疫磁珠加入第I步的待檢樣品，充分混合震蕩，抓取目標菌後通過施加外加磁場，則磁珠就匯集到磁場一邊，吸走上清液則可以分離出磁珠若待檢樣本中有目標菌，則被磁珠所富集，加少量無菌的去離子水則形成目標菌的磁珠懸濁液；此時，結合了目標菌的I抗複合物和沒有結合目標菌的過量I抗都會與磁珠表面的2抗結合,還是混在一起。4)將富集的磁珠懸濁液加到第3步製作的固定了 I抗單克隆抗體的固相載體上，若存在目標菌則形成雙抗夾心；用無菌的去離子水清洗，則沒有抓取到目標菌的磁珠就被洗掉，若不存在目標菌，則所有磁珠都被洗掉；
5)之後，用洗脫劑將固定板上的雙抗夾心的磁珠洗下來，用外加磁場分離磁珠的方法用無菌的去離子水清洗掉離子和溶劑，如果還存在磁珠就是抓到目標菌的磁珠；
6)這部分磁珠，加入無菌的去離子水形成磁珠的懸濁液，進行核磁共振的弛豫時間測定，以無菌的去離子水為空白，測得的懸濁液的弛豫時間T1/T2相比無菌的去離子水有顯著降低，則說明含有磁珠，從而間接證明樣本中有目標緻病菌，磁珠的量與T1/T2的下降呈正比，可以通過定量磁珠而間接定量出目標菌的量。所述NMR納米探針r -Fe2O3OAu複合納米粒子，即以金為殼層材料的磁性核殼複合納米粒子材料，納米粒徑小於1000納米。所述的目標菌的最終檢出評價方法基於核磁共振技術的弛豫時間特性參數的變化。所述弛豫時間特性，是指自旋-晶格弛豫時間(Tl)和自旋-自旋弛豫時間(T2)。
所述弛豫時間特性，Tl採用180° - τ -90°脈衝方法測定，Τ2採用CPMG序列方法測定。所述的I抗指目標菌的單克隆抗體，2抗指第I抗體的抗體，可以是單抗也可以是多抗。本發明的有益效果:本發明提供一種客觀的快速檢測出食品中的有害致病菌的方法，其特徵是依賴於建立的可用於檢測超順磁免疫磁珠的核磁共振檢測方法。該方法可以客觀有效地對食品中有害致病菌進行檢測，相比於致病菌的生物培養確認，該方法具有快速檢測的優勢，可以用於大規模樣本的快速篩選。
具體實施例方式實例I
檢驗食品樣本中測定其是否含有有害致病菌——李斯特菌。1.2抗免疫磁珠製備:1抗米用李斯特囷的兔抗IgG單克隆抗體，2抗為李斯特囷的羊抗兔IgG，可以是單抗也可以是多抗。r_ Fe2O3納米粒子可以採用化學共沉澱法製備，也可採用其他方法製備。如將ImL稀釋後的r_ Fe2O3與同體積0.1 mo I/L檸檬酸鈉混合，稀釋到20mL，攪拌下加入過量80 mmol/L NH2OH -HCl溶液後再滴加0.1% (重量比)HAuCl4溶液2mL，反應I h後經洗滌分離即得到r_ Fe203@Au。免疫r -Fe2O3OAu製備:r -Fe2O3OAu濃縮後加入過量的羊抗兔IgG抗體，孵育、洗滌後，加過量的BSA封閉表面活性空位，洗滌、重懸浮，保存在4 °C待用。也可採用以下方法:採用200微升2 mmol 二硫基-琥珀醯亞胺-丙酸酯(DSP)對納米金進行修飾(DMS0，二甲基亞碸稀釋DSP)。加入李斯特菌羊抗兔IgG抗體，即將100
μ LlOO μ g/mL羊抗兔IgG抗體通過共價偶聯法固定在Au上並37 °C孵育45 min。加入1%牛血清蛋白(BSA)，22°C，I小時，將剩餘的活性位點進行封閉並乾燥。2.1抗單克隆抗體固定:可以採用常規的酶標板固定方法，也可以採用以下方法。用乾淨的蓋玻片5X5_2正方形，鍍膜機先噴一層Cr (2-4 nm)用以幫助固定金。再用在表面濺射噴上一層納米金，再採用200微升2 mmol 二硫基-琥珀醯亞胺-丙酸酯(DSP)對納米金進行修飾(DMS0，二甲基亞碸稀釋DSP)。加入李斯特菌的兔抗IgG單克隆單抗，即將100 μ LlOO μ g/mL單克隆抗體通過共價偶聯法固定在玻璃板上並37 °C孵育45 min。加入1%牛血清蛋白(BSA)，22°C，I小時，將板上剩餘的活性位點進行封閉並乾燥。3.將食品樣本進行預處理，必要時採用FDA增菌法，對樣品進行過濾、增菌活化等預處理，得到待檢樣本。將待檢樣本中加入第I抗體，李斯特菌的兔抗IgG。若待檢樣本中存在李斯特菌，將與I抗形成I抗複合物。將第I步製得的第2抗體李斯特菌的羊抗兔IgG磁珠加入後進行充分震蕩。上磁力架分離磁珠，加少量無菌的去離子水得到磁珠的懸濁液。此時，如果待檢樣本中有目標李斯特菌，則通過第2抗體與第I抗體的相互作用，從而捕獲該複合物，達到了目標菌富集的目的。此時，結合了目標菌的I抗複合物和沒有結合目標菌的過量I抗都會與磁珠表面的2抗結合,還是混在一起。將此富集的磁珠懸池液加到第2步所製備的I抗固定板上，則磁珠乳液中結合了李斯特菌的磁珠會進一步與固定板上的單克隆抗體發生特異性結合，形成雙抗夾心結構。此時用無菌的去離子水清洗，就可以將沒有結合李斯特菌的磁珠洗去。在固定板上剩下的就只有結合了李斯特菌的磁珠。4.用洗脫液(甲醇等)將固定板上的結合了李斯特菌的磁珠洗脫下來。上磁力架，分離磁珠並清洗1-2次，將離子、溶劑洗去。得到的溶液，用核磁共振儀(NMR20，紐邁公司)測定溶液的Tl和T2。以無菌的去離子水為空白，溶液測得的T1/T2與空白相比較，有顯著差異，說明溶液中有磁珠存在，從而說明樣本中有李斯特菌，磁珠的量與T1/T2的下降值呈正比。下降的越多說明磁珠越多，從而間接說明李斯特菌越多，通過加標驗證可以定量檢測樣本中目標菌的數目。
具體實施例方式實例2
測定食品樣品是否含有有害致病菌大腸桿菌0157:H7。1.2抗免疫磁珠製備:I抗採用0157:H7的兔抗IgG單克隆抗體，2抗為0157:H7的羊抗兔IgG，可以是單抗也可以是多抗。r_ Fe2O3納米粒子可以採用化學共沉澱法製備，也可採用其他方法製備。如將ImL稀釋後的r_ Fe2O3與同體積0.1 mo I/L檸檬酸鈉混合，稀釋到20mL，攪拌下加入過量80 mmol/L NH2OH -HCl溶液後再滴加0.1% (重量比)HAuCl4溶液2mL，反應I h後經洗滌分離即得到r_ Fe203@Au。免疫r-Fe2O3OAu製備:r-Fe2O3OAu濃縮後加入過量的0157:H7羊抗兔IgG抗體，孵育、洗滌後，加過量的BSA封閉表面活性空位，洗滌、重懸浮，保存在4°C待用。也可採用以下方法:採用200微升2 mmol 二硫基-琥珀醯亞胺-丙酸酯(DSP)對納米金進行修飾(DMS0，二甲基亞碸稀釋DSP)。加入0157:H7羊抗兔IgG抗體，即將100 μ LlOO μ g/mL羊抗兔IgG抗體通過共價偶聯法固定在Au上並37 °C孵育45 min。加入1%牛血清蛋白(BSA)，22°C，I小時，將板上剩餘的活性位點進行封閉並乾燥。2.1抗單克隆抗體固定:可以採用常規的酶標板固定方法，也可以採用以下方法。用乾淨的蓋玻片5 X 5_2正方形，鍍膜機先噴一層Cr (2-4 nm)用以幫助固定金。再用在表面濺射噴上一層納米金，再採用200微升2 mmol 二硫基-琥珀醯亞胺-丙酸酯(DSP)對納米金進行修飾(DMS0，二甲基亞碸稀釋DSP)。加入0157:H7兔抗IgG單克隆抗體，即將100 μ LlOO μ g/mL單克隆抗體通過共價偶聯法固定在玻璃板上並37 °C孵育45 min。加入牛血清蛋白將板上剩餘的活性位點進行封閉並乾燥。3.將食品樣本進行預處理，對樣品進行過濾、增菌活化等預處理，得到待檢樣本。將待檢樣本中加入第I抗體，0157:H7的兔抗IgG。若待檢樣本中存在0157:H7，將與I抗形成I抗複合物。將第I步製得的第2抗體0157:H7的羊抗兔IgG抗體磁珠加入後進行充分震蕩。上磁力架分離磁珠，加少量水得到磁珠的乳液。此時，如果待檢樣本中有目標大腸桿菌0157:H7，則通過第2抗體與第I抗體的相互作用，從而捕獲該複合物，達到了目標菌富集的目的。此時，結合了目標菌的I抗複合物和沒有結合目標菌的過量I抗都會與磁珠表面的2抗結合，還是混在一起。將此富集的磁珠懸濁液加到第2步所製備的I抗固定板上，則磁珠懸濁液中結合了大腸桿菌0157:H7的磁珠會進一步與固定板上的單克隆抗體發生特異性結合，形成雙抗夾心結構。此時用無菌的去離子水清洗，就可以將未結合大腸桿菌0157:H7的磁珠洗去。在固定板上剩下的就只有結合了大腸桿菌0157:H7的磁珠。
4.用洗脫液(甲醇等)將固定板上的結合了大腸桿菌0157:H7的磁珠洗脫下來。上磁力架，分離磁珠並用無菌的去離子水清洗1-2次，將離子、溶劑洗去。得到的溶液，用核磁共振儀(NMR20，紐邁公司)測定溶液的Tl和T2，以去離子水為空白，溶液測得的T1/T2與空白比較，有顯著差異，說明溶液中有磁珠存在，從而說明樣本中有大腸桿菌0157:H7,磁珠的量與T1/T2的下降值呈正比。下降的越多說明磁珠越多，從而間接說明大腸桿菌0157:H7越多，通過加標驗證可以定量檢測樣本中目標菌的數目。
權利要求
1.一種基於r-Fe2O3OAu複合納米粒子間接富集的NMR食源性致病菌快速檢測方法，其特徵步驟如下: 1)將檢測目標菌與目標菌的I抗結合形成I抗複合物； 2)檢測目標菌的I抗抗體，即2抗特異性免疫磁珠的製備； 3)將目標菌I抗特異性單克隆抗體在固相載體上的固定； 4)免疫磁珠富集目標菌株，並分離:將第2步製得的2抗免疫磁珠加入到第I步結合了 I抗的待檢樣品，充分混合震蕩，抓取目標菌後通過施加外加磁場，則磁珠就匯集到磁場一邊，吸走上清液則可以分離出磁珠，若待檢樣本中有目標菌，目標菌首先與I抗結合形成複合物，在加入2抗磁珠後，通過2抗與I抗的相互作用，從而捕獲I抗複合物，被磁珠所富集，加少量無菌的去離子水則形成目標菌的磁珠懸濁液； 4)將富集的磁珠懸濁液加到第3步固定了I抗的單克隆抗體的固相載體上，若存在目標菌則形成雙抗夾心，用無菌的去離子水清洗，則沒有抓取到目標菌的磁珠就被洗掉，若不存在目標菌，則所有磁珠都被洗掉； 5)之後，用洗脫劑將固定板上的雙抗夾心的磁珠洗下來，用外加磁場分離磁珠的方法，用無菌的去離子水清洗掉離子和溶劑，如果還存在磁珠就是抓到目標菌的磁珠； 6)這部分磁珠，加入無菌的去離子水形成磁珠的懸濁液，進行核磁共振的弛豫時間測定，在固定場強下，無菌的去離子水的T1/T2是一個恆定值，以無菌的去離子水為空白，測得的懸濁液的弛豫時間T1/T2相比無菌的去離子水有顯著降低，則說明含有磁珠，從而間接證明樣本中有目標緻病菌，磁珠的量與T1/T2的下降呈正比，可以通過加標定量磁珠而間接定量出目標菌的量。
2.根據權利要求1所述的基於r-Fe2O3OAu複合納米粒子間接富集的NMR食源性致病菌快速檢測方法，其特徵是所述NMR納米探針為r -Fe2O3OAu複合納米粒子，即以金為殼層材料的磁性核殼複合納米粒子材料，納米粒徑小於1000納米。
3.根據權利要求1所述的基於r-Fe2O3OAu複合納米粒子間接富集的NMR食源性致病菌快速檢測方法，其特徵是所述的目標菌的最終檢出評價方法基於核磁共振技術的弛豫時間的變化。
4.根據權利要求1所述的基於r-Fe2O3OAu複合納米粒子間接富集的NMR食源性致病菌快速檢測方法，其特徵是所述NMR弛豫時間特性，是指自旋-晶格弛豫時間(Tl)和自旋-自旋弛豫時間(T2)。
5.根據權利要求1所述的基於r-Fe2O3OAu複合納米粒子間接富集的NMR食源性致病菌快速檢測方法，其特徵是所述弛豫時間特性，Tl採用180° - τ -90°脈衝方法測定，Τ2採用CPMG序列方法測定。
6.根據權利要求1所述的基於r-Fe2O3OAu複合納米粒子間接富集的NMR食源性致病菌快速檢測方法，其特徵是目標菌先與I抗結合形成複合物，用2抗特異性免疫磁珠富集、分離，I抗起信號放大作用。
7.根據權利要求1所述的基於r-Fe2O3OAu複合納米粒子間接富集的NMR食源性致病菌快速檢測方法，其特徵是I抗指目標菌單克隆抗體，2抗指第I抗體的抗體，可以是單克隆也可以是多克隆抗體。
全文摘要
一種基於γ-Fe2O3@Au複合納米粒子間接富集的NMR食源性致病菌快速檢測方法，屬於食品安全致病菌快速檢測技術領域。本發明依賴於建立的可以用於食品液體樣本中致病菌的核磁共振檢測方法，利用1抗特異性結合目標菌，利用γ-Fe2O3@Au複合納米材料製備2抗免疫磁珠針對性地富集1抗標記的目標菌株，利用γ-Fe2O3@Au複合納米粒子的順磁和超順磁特性對核磁共振衰減信號弛豫時間的影響，檢測出樣本中是否含有目標緻病菌。γ-Fe2O3@Au複合納米粒子既是富集手段也是檢測探針。不同的具體的對應關係為順磁免疫磁珠，在一定條件下顯示出線性關係，即免疫磁珠含量大，樣品的T2/T1值越小，在一定範圍能夠定量檢測目標菌。該方法可以用於食品樣本中有害致病菌的快速檢測，從而可以作為大批待檢樣品的快速篩選。
文檔編號G01N33/577GK103196936SQ20131008358
公開日2013年7月10日 申請日期2013年3月17日 優先權日2013年3月17日
發明者張錦勝, 唐群, 賴衛華 申請人:南昌大學