甘油磷酸脂醯轉移酶基因啟動子區序列在作物遺傳改良中的應用的製作方法
2023-05-24 15:44:11
專利名稱：甘油磷酸脂醯轉移酶基因啟動子區序列在作物遺傳改良中的應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及植物育種領域，具體涉及利用基因工程技術獲得一種甘油磷酸脂醯轉移酶(LAPPT)基因啟動子，並將其應用於水稻胚乳轉基因操作和遺傳改良。
背景技術：
胚乳是作物種子中重要的澱粉和和蛋白質儲藏的組織類型，世界糧食生產中60%的能量和蛋白質均來源於作物的胚乳。在作物轉基因研究過程中，相對於其它表達器官和組織類型，應用作物的胚乳作為異源基因或蛋白表達的平臺具有成本低、易於控制、產量大、生產過程安全等諸多優勢(Takaiwa et al， 2007， Endosperm tissue is a goodproduction platform for artificial recombinant proteins intransgenic rice.Plant Biotechnol J，5，84_92. ;Wu et al，2007，0ral immunization withtransgenicrice seeds expressing VP2 protein of infectious bursal disease virusinducesprotective immune responses in chickens. Plant Biotechnol J. 5，570-578)。 目前，通過遺傳修飾的方式對作物胚乳中的產物組成進行修飾是目前重要的研究方向，也取得了 一定的研究成果(Bajaj and Mohanty， 2005， Recent advances inricebiotechnology__towards genetically superior transgenic rice. Plant BiotechnolJ， 3 (3) ，275-307)。然而，在以往應用轉基因方式改良作物胚乳的研究中，由於缺乏有效的胚乳特異啟動子使得相關研究進展十分緩慢。因此，篩選和克隆新的胚乳特異啟動子類型並將外源基因特異表達在作物的胚乳中將是今後有關作物遺傳改良研究的熱點之一。
在以往的作物遺傳改良過程中，重複的使用同樣的啟動子類型是導致轉基因？冗默的主要原因(Bhullar et al，2003， Strategies for development offunctionallyequivalent promoters with minimum sequence homology for transgeneexpression inplants :cis—elements in a novel DNA context versus domain swapping.Plant Physiol, 132,988-998)。為了達到多基因轉化的目的，需要在作物的遺傳改良中開發一系列具有組織特異型和高效表達的啟動子類型。在前期的研究過程中，研究者已經陸續從水稻、小麥、玉米和大麥中篩選到了一些胚乳特異啟動子(Rasmussen and Donaldson,2006， Investigation of the endosperm—specific sucrosesynthase promoter fromrice using transient expression of reporter genes in guar seedtissue. PlantCell R印，25，1035—1042 ;Qu and Takaiwa，2004，Evaluation of tissuespecificity andexpression strength of rice seed component gene promoters intransgenic rice ;Plant Biotechnol J，2，113-125山amacchia et al，2001，Endosperm-specific activityof a storage protein gene promoter in transgenic wheatseed.J Exp Bot，52，243—250 ;Wiley et al， 2007， Promoter analysis andimmunolocalisation show thatpuroindoline genes are exclusively expressed instarchy endosperm cells ofwheat grain. Plant Mol Biol， 64，125—136 ; Russell andFromm 1997， Tissue—specificexpression in transgenic maize of four endospermpromoters from maize and rice.Transgenic Research, 6， 157-168)。然而，從實際的應用效果上來看，目前可以成功應用作物遺傳改良的啟動子類型依然十分有限，而且無法有效的針對作物重要的儲藏器官——種子進行定向的修飾和改良。 以往在種子胚乳特異啟動子克隆過程中，主要是針對碳水化合物和蛋白質代謝相關酶類進行研究，而忽略了以脂肪代謝酶為基礎克隆啟動子。甘油磷酸脂醯轉移醇(l_acyl_sn_glycerol_3_P acyltransferase， LPAAT)是在Kennedy途徑中——禾中作用於脂肪醯磷脂酸(LPA)sn-2位置乙醯化產生磷脂酸PA(Phosphatidicacid)的關鍵酶。磷脂酸在磷脂酸磷酸酶作用下，水解釋放出無機磷酸，而轉變為甘油二酯，再通過進一步的酯化反應生成甘油三酯(0kazaki et al. 2006， Thesignificance of C16 fattyacids in the sn_2 positions of glycerolipids in th印hotosynthetic growth ofSynechocystis sp. PCC6803. Plant Physiol， 141， 546-556)。目前，甘油磷酸脂醯轉移酶基因被證明在甘油脂肪酸的分布上起重要作用(Coleman and Lee， 2004， Enzymes oftriacylglycerol synthesis and their regulation. Prog Lipid Res，43，134—176 ;Nathet al，2009， Increasing erucic acid content throughcombination of endogenouslow polyunsaturated fatty acids alleles with Ld_LPAAT+Bn_fael transgenes inrapeseed(Brassica napus L).Theor Appl Genet，118，765-773)。
發明內容
本發明的目的在於針對現有植物胚乳特異型啟動子及其應用中所存在的不足，提
供一種從椰子中提取的甘油磷酸脂醯轉移酶(LPAAT)基因啟動子區序列。 本發明的另一目的在於提供上述甘油磷酸脂醯轉移酶基因啟動子在作物胚乳轉
基因操作和遺傳改良中的應用方法。 本發明還有一個目的在於提供一種從椰子中提取製備得到脂肪酸代謝途徑相關的甘油磷酸脂醯轉移酶基因啟動子的製備方法。 本發明甘油磷酸酯醯轉移酶基因啟動子區序列來源於椰子，在原有的序列基礎上進行甲基化、基因添加或缺失等修飾後，啟動子的作用效果有所改變。具體地，本發明上述目的通過如下方案予以實現 首先，本發明從椰子中提取製備得到了甘油磷酸脂醯轉移酶基因啟動子，具體步驟如下 (1)以椰子基因組DNA及椰子脂肪酸代謝酶為基礎，設計特異引物，引物序列如SEQ ID NO :2和SEQ ID NO :3所示； (2)通過染色體步行法擴增引物，得到甘油磷酸酯醯轉移酶基因啟動子區序列。 以往作物中胚乳啟動子的克隆都是基於儲藏蛋白和碳水化合物相關基因的基礎
上進行的，獲得的啟動子類型也是與此類蛋白質和碳水化合物代謝相關，而本發明以脂肪
酸代謝途徑中的酶類為基礎，克隆獲得的胚乳特異性啟動子將在代謝途徑的控制、表達部
位和表達量上均有與以往發現的啟動子類型有明顯不同，在使用範圍和效果上也有不同。
因此，本發明啟動子是以椰子基因組DNA和甘油磷酸脂醯轉移酶為基礎設計特異性引物的。
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上述製備過程中，所用的染色體步行法為本領域中的常用技術。
獲得甘油磷酸脂醯轉移酶基因啟動子區序列經過植物啟動子分析軟體PlantCARE (http://bioinformatics. psb. ugent. be/webtools/plantcare/html/)，分析證明該序列具有典型的植物組織特異性啟動子特徵，如1個TATA box(位於-4) 、6個CAATbox(分別位於-878、-877、-842、-356、-335和+18)和4個5' UTR胞嘧啶含量豐富區(分別位於-170、 -216、 -276和-326);另外，還含有一個重要的胚乳特異表達的順式作用元件Skn-1基序(位於-127)。該啟動子序列如SEQ IDNO :1所示。 本發明甘油磷酸脂醯轉移酶基因啟動子區序列特異性表達於作物胚乳中，可用於製備轉基因作物。 更進一步地，本發明甘油磷酸脂醯轉移酶基因啟動子區序列通過啟動gus基因在水稻胚乳中的表達來製備轉基因植株。 本發明甘油磷酸脂醯轉移酶基因啟動子區序列在作物遺傳改良中的應用，包括如下步驟 (1)將甘油磷酸脂醯轉移酶基因啟動子插入啟動子驗證表達載體pBIlOl. 3，啟動gus報告基因的表達； (2)將上述表達載體用於根癌農桿菌介導的植物愈傷組織轉基因研究，通過植物愈傷組織誘導、浸染、共培養、篩選、生根獲得轉基因植株。 為了驗證甘油磷酸脂醯轉移酶基因啟動子在作物胚乳中的表達控制效果，本發明通過引物設計和PCR擴增獲得了 3種5'端缺失的甘油磷酸脂醯轉移酶基因啟動子序列，缺失位置分別為-896、-817和_453。用上述三種缺失片段插入啟動子驗證表達載體。81101.3啟動gus報告基因的表達，將未插入任何片段的pBIlOl. 3空載體作為後期研究的對照載體。 將上述構建好的植物表達載體用於根癌農桿菌介導的水稻愈傷組織轉基因研究。將獲得的轉基因水稻植物轉入溫室培養後收穫的種子用於啟動子功能的表達驗證。通過對收穫種子的GUS表達分析證明在轉基因水稻的種子中，3種缺失片段的甘油磷酸脂醯轉移酶基因啟動子序列不同程度的啟動了 gus基因在水稻種子胚乳中的表達，但在葉片、花序、根、莖幹和葉鞘中未檢測到gus基因的表達。同時，3種不同缺失片段亦表現出不同的表達量，預示著在5'端缺失的過程中，特殊作用元件Skn-l基序在最終的表達效果上起了重要作用。 與現有技術相比，本發明具有如下有益效果 (1)本發明甘油磷酸脂醯轉移酶基因啟動子能夠特異的啟動目的基因在胚乳組織細胞中的表達，為作物遺傳改良中提供了新的啟動子類型，有很高的穩定性和可操作性；
(2)本發明甘油磷酸脂醯轉移酶基因啟動子與其他已有的啟動子之間的同源性很小，不會導致轉基因沉默現象； (3)本發明甘油磷酸脂醯轉移酶基因啟動子以椰子基因組DNA和脂肪酸代謝途徑中的甘油磷酸脂醯轉移酶為基礎設計引物，獲得的啟動子可用於脂肪酸代謝途徑調控中。
圖1為甘油磷酸脂醯轉移酶基因啟動子表達載體構建方式，其中A為不同5'端缺
5失片段和gUS基因連接方式；B為連接位點的編碼信息； 圖2為甘油磷酸脂醯轉移酶轉基因啟動子轉入水稻種子及其它組織類型的gus染色效果。其中，1為無啟動子的空載體PBI101. 3 (對照)轉化；2為缺失片段1構建載體(pBIlOl. 3-L1)轉化；3為缺失片斷2構建載體(pBIlOl. 3_L2)轉化；4為缺失片段3構建載體(pBIlOl. 3-L3)轉化；5為轉基因植株根染色效果；6為轉基因植株葉鞘染色效果；7為轉基因植株花染色效果；8為轉基因植株葉片染色效果；9為轉基因植株莖幹染色效果。
具體實施例方式
下面結合具體實施例對本發明作進一步的描述，但具體實施例並不對本發明做任何限定。 實施例l椰子基因組DNA的抽提 高質量的椰子基因組DNA通過CTAB法從幼嫩葉片中提取。材料液氮研磨後取0. lg加600 ii L CTAB提取液(含4% P -巰基乙醇)，繼續研磨使其懸浮均勻，置65。C水浴45min ;加700 y L苯酚:氯仿:異戊醇，37。C水浴鍋溫浴10min。 12000rpm離心10min ;取上清，加60ii L 5M NaCl， lmL冷凍無水乙醇，冰凍30min沉澱DNA ;10000rpm離心5min，棄酒精後風乾。風乾後的DNA加入TE，37。C水浴15-30min至DNA完全溶解，加700iiL氯仿異戊醇(24 : 1)，顛倒15min， 12000rpm離心5min ;取上清液，加30 ii L 5M NaCl， lmL冷凍無水乙醇-20。C沉澱30min， 10000rpm離心3min，棄上清；加70%酒精，10000rpm離心3min後棄上清，風乾；加100iiL，TE充分溶解後，加5iiL Rnase， 37。C水浴lh。再加200 y L氯仿異戊醇(24 : 1)，顛倒15min， 12000rmp離心5min ;取上清液，加30 ii L 5M NaCl， lmL冷凍無水乙醇，輕輕顛倒後-2(TC沉澱30min， 10000rpm離心3min ;棄酒精，加70X酒精浸泡，2h換一次，後浸泡過夜；8000rpm離心3min後棄酒精，風乾；加100 y L TE充分溶解。將獲得的DNA樣品稀釋1000倍後用分光光度計分別測定260nm和280nm處吸光值。應用兩處的吸光值的比值計算樣品的純度，並通過260nm處吸光值計算樣品中的DNA含量。
實施例2 LPAAT基因上遊啟動子序列的克隆和分析 甘油磷酸脂醯轉移酶基因上遊啟動子序列的克隆參照Universal GenomeWalkerKit(Clontech)的操作手冊進行。基因組DNA先用4種平端內切酶(EcoRI，Pvu II，Dra I，Stu I)分別酶切。酶切產物經純化後與特定接頭進行連接，連接產物用於第一輪的巢式PCR反應，甘油磷酸脂醯轉移酶基因特異引物核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示，接頭特異引物核苷酸序列如SEQ ID NO :3所示。PCR反應程序為94°C 25s， 72°C 3min， 7個循環94°C 25s，67°C 3min，32個循環；67°C 7min。第二輪的PCR以第一輪PCR反應的產物為底物，應用相同的擴增程序，引物核苷酸序列分別如SEQ ID NO :4和SEQ ID NO :5所示。擴增產物回收後連接在pMD18-T(TaKaRa)上並進行序列分析(TaKaRaBiotechnology Company, Dalian,China)。測序結果用植物啟動子專用分析軟體PlantCARE，進行分析，在分析的基礎進行進一步功能驗證。 實施例3植物表達載體的構建和遺傳轉化 為了驗證獲得啟動子區序列在組織特異性表達控制中的效果，三種不同5'端缺失的啟動子片段類型被用於植物表達載體的構建。缺失片段分別插入啟動子驗證表達載體pBIlOl. 3，分別命名為pBIlOl. 3-L3， pBIlOl. 3_L2， pBI101.3_Ll。 3個片段缺失的位點分
6別為-896， -817和-453。 PCR擴增引物兩端分別添加了 8個鹼基的酶切位點HindIII和BamHI。相關引物序列分別為
plOHL核苷酸序列如SEQ ID NO :6所示
pl01-2L核苷酸序列如SEQ ID NO :7所示
pl01-3L核苷酸序列如SEQ ID NO :8所示
plOl-R核苷酸序列如SEQ ID NO :9所示。 擴增產物回收後用兩種酶分別酶切(HindIII and BamHI)並連入pBIlOl. 3載體中。相關操作均按照分子克隆實驗指南提供的方案進行。未插入任何啟動子片斷的pBI101.3載體被作為陰性對照，連接後的載體用PCR擴增的方式進行驗證，引物核苷酸序列分別如SEQ ID NO :10和SEQ ID NO :11所示。
實施例4轉基因操作及表達驗證 4種帶有不同甘油磷酸脂醯轉移酶基因啟動子片斷的表達載體pBI101.3-Ll、pBIlOl. 3-L2、 pBIlOl. 3-L3和pBIlOl. 3_L0通過電擊轉化的方式轉入根癌農桿菌Agrobacterium tumefaciens EHA105中水禾舀品禾中Zhonghimll(Oryza sativa L ssp.Japonica)，愈傷組織誘導及遺傳轉化的操作按照相關文獻提供的操作程序進行，獲得的轉基因水稻植株移栽至溫室進行培養，直至種子完全成熟。 分別收取不同表達載體轉化的轉基因水稻植株的種子、葉片、葉鞘、莖幹、花序和根進行GUS染色，染色方法參照相關文獻進行，染色結果在體式顯微鏡下觀察並拍照(圖2)。 甘油磷酸脂醯轉移酶基因啟動子區序列在作物遺傳改良中的應用序列表
SEQUENCE LISTING
〈110>海南大學 〈120〉甘油磷酸脂醯轉移酶基因啟動子區序列在作物遺傳改良中的應用
〈130〉
〈160〉 11 〈170>PatentIn version 3. 2
〈210>1
〈211>946
〈212>DNA〈213〉人工序列〈400〉1gattecg皿ttcgagctcggtecccggggatcctctegagattectetegggcacgcgtg60gtcgacggcccgggctggteggragtgattttggaaccac120tec皿teggcctgatctettacggtgattttcagteatcactgccateggtteggtcatt180ctcactecacgcccagcccaccttettttggttttcctctttcgagcactctctctccct240cctctccaccgccagteagctcctcctcctctctccctcctctccaccatcagagcgctc300atccccggcatccctcgaccggccctgcctcctctttcttcctegccagcgctgcctcca360cccctgcctcctccttcttccttgactgaccccacctcctacttcttcctcggtcggccc420tecattctccttcttcctcgactegcctcacctcctgcttcttttttgatcggccctecc■
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8
〈210>7〈211>26〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400>7ataagcttcc tgatctattacggtga〈210>8〈211>26 [o川]〈212>DNA 〈213〉人工序列〈400>8ataagcttcc ttctttcttgaccgac〈210>9〈211〉32〈212>DNA〈213〉人工序列9atggatccag gact;atatatcccccacttc cc〈210>10〈211〉22〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>10ggacacttta tgcttccggctc〈210>11〈211>21〈212>DNA人工序列〈400〉11attccacagt tttcgcgatcc
權利要求
甘油磷酸脂醯轉移酶基因啟動子區序列在作物遺傳改良中的應用，其特徵在於所述甘油磷酸脂醯轉移酶基因啟動子區序列如SEQ ID NO1所示，該啟動子特異性表達於作物胚乳中，用於製備作物遺傳改良。
2. 根據權利要求1所述的甘油磷酸脂醯轉移酶基因啟動子區序列在作物遺傳改良中 的應用，其特徵在於包括如下步驟(1) 將甘油磷酸脂醯轉移酶基因啟動子插入啟動子驗證表達載體PBI101. 3，啟動gus 報告基因的表達；(2) 將上述表達載體用於根癌農桿菌介導的植物愈傷組織轉基因研究，通過植物愈傷 組織誘導、浸染、共培養、篩選、生根獲得轉基因植株。
3. 根據權利要求1或2所述的甘油磷酸脂醯轉移酶基因啟動子區序列在作物遺傳改良 中的應用，其特徵在於所述甘油磷酸脂醯轉移酶基因啟動子區序列來源於椰子。
4. 根據權利要求3所述的甘油磷酸脂醯轉移酶基因啟動子區序列在作物遺傳改良中 的應用，其特徵在於所述甘油磷酸脂醯轉移酶基因啟動子區序列的製備方法包括如下步 驟(1) 以椰子基因組DNA及椰子脂肪酸代謝酶為基礎，設計特異引物，引物序列如SEQ ID NO :2禾P SEQ ID NO :3所示；(2) 通過染色體步行法擴增引物，得到甘油磷酸酯醯轉移酶基因啟動子區序列。
5. 根據權利要求1或2所述的甘油磷酸脂醯轉移酶基因啟動子區序列在作物遺傳改 良中的應用，其特徵在於所述甘油磷酸脂醯轉移酶基因啟動子序列含有1個TATA盒、6個 CAAT盒、4個5UTR胞嘧啶含量豐富區。
6. 根據權利要求5所述的甘油磷酸脂醯轉移酶基因啟動子區序列在作物遺傳改良中 的應用，其特徵在於所述甘油磷酸脂醯轉移酶基因啟動子序列還含有一個胚乳特異表達的 順式作用原件Skn-l基序。
7. 根據權利要求5所述的甘油磷酸脂醯轉移酶基因啟動子區序列在作物遺傳改良中 的應用，其特徵在於所述TATA盒位於-4， 6個CAAT盒分別位於-878、-877、-842、-356、-335 和+18， 4個5' UTR胞嘧啶含量豐富區分別位於-170、 -216、 -276和-326。
8. 根據權利要求6所述的甘油磷酸脂醯轉移酶基因啟動子區序列在作物遺傳改良中 的應用，其特徵在於所述順式作用元件Skn-1基序位於-127。
全文摘要
本發明公開了一種甘油磷酸脂醯轉移酶(LPAAT)基因啟動子區序列及其在作物遺傳改良中的應用。本發明甘油磷酸脂醯轉移酶基因啟動子序列如SEQID NO1所示，該甘油磷酸脂醯轉移酶基因啟動子在作物遺傳改良中的應用方法為如下步驟(1)將甘油磷酸脂醯轉移酶基因啟動子插入啟動子驗證表達載體pBI101.3，啟動gus報告基因的表達；(2)將上述表達載體用於根癌農桿菌介導的植物愈傷組織轉基因研究，通過植物愈傷組織誘導、浸染、共培養、篩選、生根獲得轉基因植株。本發明基因啟動子來源於椰子，能夠特異的啟動目的基因在胚乳組織細胞中的表達，為今後作物遺傳改良中提供了新的啟動子類型，具有很高的穩定性和可操作性，不會導致轉基因沉默現象。
文檔編號C12N15/82GK101705242SQ200910193929
公開日2010年5月12日 申請日期2009年11月13日 優先權日2009年11月13日
發明者李東棟, 林擁軍, 鄭育聲 申請人:海南大學