具有改進性能的抗-C5aR抗體的製作方法

2023-04-25 03:37:51 1

專利名稱：：具有改進性能的抗-C5aR抗體的製作方法
技術領域：
：本發明涉及改進的抗體，其結合於C5aR並且在診斷和治療方法中很有用。
背景技術：
：補體蛋白C3-C5中的每一個的蛋白分解產生具有稱為過敏毒素(6-9)的信號分子的氨基末端陽離子片段。這些氨基末端陽離子片,殳中最有效的C5a引起最寬的響應。考慮到作為白細月包的著邊(即炎症初期白細月包附集於血管壁，margination)和'滲透的炎性響應的成分，顆粒結合的蛋白水解酶的釋放、活化氧和氮衍生的自由基的產生改變了血流和毛細血管滲漏以及收縮平滑月幾的能力，C5a分子是"完全，，促炎介質。在亞納摩爾至納摩爾水平，C5a分子引發所有髓系(嗜中性粒細胞、嗜酸性粒細胞和嗜石威性粒細胞、巨噬細胞和單核細胞)的趨化性，並引起血管通透性(通過前列&，素和循環粒細胞使其可能性顯著加強)。更高的納摩爾濃度引發NADPH氧化酶的脫粒和活化。這種寬度的生物活性與其4也炎性介質形成對比。C5a牽涉到類風溼性關節炎、4艮屑病、敗血症、再灌注損傷和成人呼吸窘迫綜合^正的發病才幾制(Gerard和Gerard，1994;Murdoch和Finn,2000)。C5a的活性由C5a與其受體(C5aR)的結合介導。C5aR屬於七次跨膜G-蛋白偶聯受體的家族。C5aR是C5a的高親和力受體，具有lnM的Kd,並且位於大量不同的細胞型，包括白細胞上。每個細胞的受體的數量極高，高達每個白細胞200,000個位點。受體的生物學活化發生在整個使結合飽和的範圍內。C5aR結構與該七次^爭膜受體家族一致，其中胞外N-末端後是通過作為胞內和胞外環交替的螺旋間結構域連4妄的七次3爭膜螺旋，並以胞內C-末端結構域終止。C5aR包含擴展的N-末端月包外結構域。這種大的N-末端結構域是典型的G-蛋白偶聯受體，其結合包括IL-8和fMet-Leu-Phe(FMLP)受體家力矣的肽。利用C5aR拮抗劑對C5a響應的抑制應減少經由C5a介導的急性炎性應答，而不影響其他補體成分。為此，在之前已經描述過C5aR肽拮抗劑和抗畫C5a受體抗體(Watanabe"a/"1995;Pellas""/.:1998;Konteatisefa/"1994;ICanekoef"/.,1995;Morganefo/.，1993)。侈寸^口，WO95/00164(ScrippsResearchInst.)4笛述了4十隻於C5a受體的N-末端肽(殘基9-29)的抗體。WO03/062278(G2療法)描述了4十乂於C5aR的月包外環而不是N-末端結構域的抗體，這在抑制C5a與C5aR結合中是有效的。在該申請中披露的具體單克隆抗體是MAb7F3、MAb12D4和MAb6C12。在這些單克隆抗體中，MAb7F3對C5aR具有最高的結合親和力。
發明內容現在，本發明的發明人開發了新型單克隆抗體，當相比於MAb7F3時，其對C5aR具有實質性改進的結合親和力並且在小鼠關節炎模型中逆轉炎症是高度有效的。因此，本發明提供了一種抗體，包含與SEQIDNO:3[3C5Vh]中示出的可變重鏈CDR1、CDR2或CDR3環序列共有至少80%同一性的至少一個CDR環序列，其中該抗體減少或抑制C5a與C5aR的結合。在一種優選的實施方式中，該抗體包含與SEQIDNO:3[3C5Vh]中示出的可變重鏈CDR1、CDR2或CDR3環序列共有至少80%同一性的至少兩個CDR環序列。在一種進一步優選的實施方式中，該抗體進一步包含與SEQIDNO:4[3C5VI]中示出的可變輕鏈CDR1、CDR2或CDR3環序列共有至少80%同一'I"生的至少一個CDR環序列。在一種進一步優選的實施方式中，該抗體包含與SEQIDNO:4[3C5Vl]中示出的可變輕鏈CDR1、CDR2或CDR3環序列共有至少80%同一性的至少兩個CDR環序列。在一種進一步優選的實施方式中，該抗體包含分別與SEQIDNO:3和SEQIDNO:4中示出的重鏈和/或輕鏈序列共有至少80%同一性的序列，其中該抗體減少或抑制C5a與C5aR的結合。在一種優選的實施方式中，該抗體結合於人類C5aR或其片段，其中(i)當在相同條件下確定時，其ICso值比MAb7F3低至少1.5倍；或(ii)當在相同條件下確定時，其締合常數(Kon)比MAb7F3高至少1.5倍；或(iii)當在相同條件下確定時，其K。親和常數比MAb7F3低至少1.3倍。優選地，當在相同條件下確定時，該抗體以比MAb7F3低至少1.4倍的KD親和常數與人類C5aR或其片段結合。在一種進一步優選的實施方式中，該抗體結合至人類C5aR或其片段，其中(i)ICsoJ直小於500pM,4尤選小於300pM,並且更優選小於200pM;或(ii)締合常數(Kon)為至少6.8x105m"s";或(iii)Ko親和常^:小於1.4nM。優選地，該抗體結合於人類C5aR或其片段，其中(ii)締合常數(Kon)為至少16m"s";或(iii)KD親和常悽t小於0.5nM。優選地，C5aR的片l殳是包含序列LYRVVREEYFPPKVLCGVDYSHDKRRERAVAIV(SEQIDNO:2)的肽。本發明還提供了一種抗體，包含與SEQIDNO:5[7H3Vh]中示出的可變重鏈CDR1、CDR2或CDR3環序列共有至少80%同一性的至少一個CDR環序列，其中該抗體減少或抑制C5a與C5aR的結合。在一種進一步優選的實施方式中，該抗體包含與SEQIDNO:5[7H3Vh]中示出的可變重鏈CDR1、CDR2或CDR3環序列共有至少80%同一'I"生的至少兩個CDR環序列。在一種進一步優選的實施方式中，該抗體進一步包含與SEQIDNO:6[7H3Vl]中示出的可變輕鏈CDR1、CDR2或CDR3環序列共有至少80%同一'l"生的至少一個CDR環序列。在一種進一步優選的實施方式中，該抗體包含與SEQIDNO:6[7H3VI]中示出的可變輕鏈CDR1、CDR2或CDR3環序列共有至少80%同一'I"生的至少兩個CDR環序列。在一種進一步優選的實施方式中，該抗體包含分別與SEQIDNO:5和SEQIDNO:6中示出的重鏈和/或輕鏈序列共有至少80%同一性的序列，其中該4元體減少或水卩制C5a與C5aR的結合。本發明進一步提供了一種抗體，包含與SEQIDNO:7[8G7Vh]中示出的可變重鏈CDR1、CDR2或CDR3環序列共有至少80%同一性的至少一個CDR環序列，其中該抗體減少或抑制C5a與C5aR的結合。在一種進一步伊乙選的實施方式中，該才元體包含與SEQIDNO:7[8G7Vh]中示出的可變重4連CDR1、CDR2或CDR3環序列共有至少80%同一性的至少兩個CDR環序列。在一種進一步優選的實施方式中，該抗體進一步包含與SEQIDNO:8[8G7V1]中示出的可變輕鏈CDR1、CDR2或CDR3環序列共有至少80%同一性的至少一個CDR環序列。在一種進一步優選的實施方式中，該抗體包含與SEQIDNO:8[8G7VI]中示出的可變輕鏈CDR1、CDR2或CDR3環序列共有至少80%同一'f生的至少兩個CDR環序列。在一種進一步優選的實施方式中，該抗體包含分別與SEQIDNO:7和SEQIDNO:8中示出的重和/或輕鏈序列共有至少80%同一性的序列，其中該4元體減少或抑制C5a與C5aR的結合。在本發明的優選實施方式中，該抗體與人類C5aR的第二胞外環(殘基175206)是反應性的。在進一步優選的實施方式中，該抗體與包含人類C5aR的殘基179-184的表4立(EEYFPP)是反應性的。在本發明的一種進一步優選的實施方式中，該抗體是單克隆、重組抗體，嵌合或人源化抗體。該抗體可以是任何同種型。然而，在本發明的一種進一步優選的實施方式中，該抗體是IgG2a類或IgG3類抗體。在本發明另一優選的實施方式中，該抗體是選自由MAb3C5、MAb8G7和MAb7H3構成的組中的單克隆抗體。本發明還4是供了一種雜交瘤，以登錄號060818014呆藏在ECACC。本發明還4是供一種了雜交瘤，以登錄號06081802^f呆藏在ECACC。本發明還提供了一種雜交瘤，以登錄號06081803保藏在ECACC。應當理解，也可以生產本發明這些抗體的各種化學書f生物。例如，由本發明的抗體結合到標籤如放射性同位素或其他示蹤劑分子構成的免疫交耳關物(免疫共扼物，immunoconjugate)可以通過本4頁域已知的4支術製備。可替換地，所述抗體可以結合於治療有用的分子，該分子藉助於抗體的結合特異性而靶向其期望的作用部位。因此，本發明還提供了一種包含本發明的抗體和治療劑的結合物(conjugate)。應當理解，在本發明的內容中可以使用一個範圍的治療劑。優選的治療劑包括介導細胞死亡或蛋白失活的試劑。治療劑可以是本領域已知的大量毒素中的任一種。該毒素可以是，i單胞菌外毒素(/^ez^/owowosexotoxin)或其書亍生物。在一種4尤選的實施方式中，該毒素是PE40。本發明還4是供了一種包含本發明的抗體和可4企測標籤的結合物。該可4企測標籤可以是本4頁i或已知的^f壬^f可合適標籤。例如，該標籤可以是放射性標籤、螢光標籤、酶促標籤或造影劑。本發明還提供了一種分離的核酸分子，該核酸分子包含編碼本發明的抗體的序列。本發明還4是供了一種組合物，包含才艮據本發明的抗體和藥用載體。本發明還4是供了本發明的抗體作為藥劑的應用。本發明還提供了一種用於診斷受試者體內涉及白細胞或嗜中性粒細胞移行的紊亂的方法，該方法包括使從受試者獲得的樣品與本發明的結合物在體外接觸，以及檢測該結合物與樣品之間的免疫特異性結合。本發明還提供了本發明的抗體在製備用於治療涉及白細胞或中性白細胞移行的紊亂的藥劑中的應用。本發明還l是供了本發明的抗體在製備用於治療免疫病理學疾病的藥劑中的應用。在本發明的一個優選實施方式中，C5aR是人類C5aR。本發明還提供了一種用於抑制帶有C5aR的細胞與其配體的相互作用的方法，該方法包括"使該細月包暴露於本發明的抗體。本發明還4是供了一種用於4中制細月包中C5aR活性的方法，該方法包括使該細力包暴露於本發明的抗體。本發明還提供了一種治療受試者體內涉及中性白細胞移行的紊亂的方法，該方法包括^糹會予該受試者本發明的抗體。本領^yu支術人員應當理解，本發明的這些抗體也可以用來^r測、定量和/或局部化(localise)表達C5aR的細月包。因此，本發明還提供了一種用於診斷受試者體內涉及中性白細胞移行的紊亂的方法，該方法包括使從該受試者獲得的樣品與本發明的結合物接觸，以及檢觀'J該結合物與樣品之間的免疫特異性結合。i午多種免疫測定可以用於這些"^斷方法中。這才羊的免疫測定包括利用如放射免疫測定、ELISA、"夾心"免疫測定、沉澱素反應、凝膠分散沉澱素反應、免疫分散測定、凝集測定、補體結合測定、免疫放射測定、螢光免疫測定等技術的竟爭性和非竟爭性測定系統。可利用體外和體內測定。從受試者獲得的樣品可以包括任何體液，如外周血、血漿、淋巴液、腹膜液、腦脊液、或胸膜液，或者任何身體組織。體外測定可以利用組織或流體的組織學樣本或亞部分來實施。體內結合可以通過藉助於本領域已知的任何方式(如靜脈內、腹膜內、動脈內等)給予所述結合物以便可以檢測免疫特異性結合而實現。另外，可以使用成像技術，其中將本發明的抗體結合至合適的成像標籤。標記的抗體可以體內給予以確定C5aR在受試者體內的定位。因此，本發明還提供了一種用於診斷受試者體內涉及中性白細胞移行的紊亂的方法，該方法包括在一定條件下向該受試者給予用成像劑(顯像劑)標記的本發明的抗體以便在受試者體內在抗體和表現C5aR的細胞之間形成複合體(複合物)，以及使該複合體成像。在本發明的一種優選實施方式中，涉及中性白細胞移行的紊亂是C5aR介導的紊亂。優選地，該紊亂是免疫病理學紊亂。本發明還提供了一種用於將治療劑遞送到受試者體內的炎症部位的方法，該方法包括向受試者給予本發明的結合物。本發明還提供了一種用於將遺傳物質引入到表現C5aR的細胞內的方法，該方法包括使這些細胞與本發明的抗體接觸，其中所述抗體附著於遺傳物質或與其相關。在一種優選的實施方式中，表現C5aR的細胞選自由粒細胞、白細胞(如單核細胞、巨嗟細胞、嗜^喊性粒細胞和嗜酸性粒細胞)、肥大細胞以及淋巴細胞，淋巴細胞包括T細胞、樹突細胞、以及非髓系細胞(如內皮細胞和平滑肌細胞)。本發明還涵蓋鑑定結合C5aR的其他配體或其他物質的方法，所述結合C5aR的其他配體或其他物質包括哺乳動物C5aR功能的抑制劑和/或促進劑。例如，與本發明抗體或其功能片段具有相同或力口以鑑定。因此，本發明還涵蓋鑑定結合C5aR的配體或其他物質的方法，該結合C5aR的配體或其他物質包括受體功能的抑制劑(例如拮抗劑)或促進劑(例如激動劑)。在一種實施方式中，在測定中使用天然表達C5aR的細胞或已被遺傳改造成表達C5aR的合適宿主細胞或由？1入到所述細胞內的核酸編碼的變體，來鑑定和評估受體功能的配體、抑制劑或促進劑的效能。這樣的細胞在評估表達的受體蛋白或多肽的功能中也是有用的。圖1:由用L1.2/hC5aR細胞免疫的小鼠產生的抗-人類C5aRmAb不同程度地抑制^I-C5a與人嗜中性粒細胞的結合。誤差棒指示SD。圖2:用於構建hC5aR敲入(knock-in)小鼠的野生型小鼠的C5aR基因座和靶向載體的圖。用靶向載體中的人類C5aR基因外顯子3CDS精確地替代小鼠C5aR基因外顯子3CDS。小鼠C5aR基因側翼序列允許同源重組。利用Cre將由loxP位點側掛的選擇標記物PGKneo從第一敲入小鼠中刪除。用3，和5'糹罙針來確i人已正確地重組到小鼠C5aR基因座中的靶向載體。X,XbaI;V,EcoRV。圖3:來自雜合hC5aR敲入小鼠(/C^廣"之間的雜交(cross)的小鼠尾部的EcoRV消化的基因組DNA的DNA印跡(Southernblot)。該印跡與3，探針雜交，其將小鼠C5aR等位基因(10.0kb)和hC5aR敲入等位基因(8.1kb)相區別。圖4:C5aR在/C!R"+、/C5i^仏和野生型小鼠嗜中性粒細胞上的表達。中性白細月包用FITC結合的抗-人類C5aRmAb(7F3)或抗-小鼠C5aRmAb20/70染色。圖5:由hC5Rl+z+小鼠的嗜中性粒細胞產生的抗體表明廣譜的125I-C5a結合抑制，範圍從完全抑制到部分或很少的抑制，這取決於mAb克隆。結果代表對於每一個抗體的至少兩個獨立實-驗的結果，並且誤差4奉指示s.e.m.。圖6:抗-C5aRmAb具有亞納摩爾IC5o值。利用/2C5A"+小鼠嗜中性粒細胞(3C5、7H3和8G7)產生的抗體表現出比利用L1.2/hC5aR轉染子(7F3)產生的最佳mAb低5-10倍。IC5。值由3或4個獨立的竟爭性125I-C5a配體結合實-驗來確定。圖7:竟爭性配體結合測定表明從具有7F3或3C5的hC5aR轉染的L1.2細胞上的hC5aR的125I-C5a替代。ECso值由2或3個獨立實-驗確定。圖8:C5aR特異性mAb與嵌合人/小鼠C5aR受體的相對結合。示意性示出了嵌合體受體(來源於hC5aR的區域以紅色示出，而來源於mC5aR的區域以黑色示出)。四個胞外結構域的起源由4-字母代碼指代(HHHH是野生型人類C5aR,mHHH具有小鼠N-末端胞外結構域和人類第一、第二、以及第三胞外環等)。表達嵌合受體的瞬時轉染L1.2細胞用不同的抗-C5aRmAb染色。所有抗-hC5aRmAb表現出不同的、結構域限制的結合外形，結合至包含人類C5aRN-末端的受體或第二胞外環。抗-小鼠C5aRmAb20/70結合至包含小鼠C5aR第二胞外環的嵌合受體。圖9:表示每一單個抗-hC5aRmAb抑制C5a與人嗜中性粒細胞結合的程度的點陣圖。根據mAb識別的受體結構域對其進4亍分組。所有最有效的阻遏(阻斷)mAb(抑制C5a結合>90%的那些)對hC5aR的第二月包外環作圖。圖10:通過肽ELISA對hC5aR第二胞外環上的抗體結合位點作圖。mAb7F3和3C5結合至來自包含序列179EEYFPP184的hC5aR第二胞外環的所有重疊肽。圖11:(a)利用鑑定由mAb7F3和3C5識別的hC5aR上的關4定殘基的12肽的丙氨酸突變體對抗體接觸殘基的作圖。(b)利用鑑定由mAb8G7和7H3識別的hC5aR上的關4建殘基的12肽的丙氨酸突變體對抗體接觸殘基的作圖。圖12:在Biacore測定中，mAb7F3、3C5、8G7和7H3對於肽23的締合和離解速率以及結合親和力。圖13:抗-hC5aRmAb的治療效果的比較。在炎症發展後的第5天，/C5i廣"小鼠用7F3、3C5或8G7(以在PBS中的1mg/kg或3mg/kg)腹腔內(i.p.)注射一次。對照組接受PBS。圖示出了從第O天的腳爪(踝部)大小的變化。組平均值(11=5-7/組)。圖14:抗-hC5aRmAb的治療效果的比較。/705/廣/+小鼠用7F3、3C5或8G7(以在PBS中的1mg/kg或3mg/kg)腹月空內(i.p.)注射一次。對照組接受PBS。圖示出了臨床評分。組平均值(n=5-7/組)。序列J^i兌明SEQIDNO:1人類C5aR蛋白序列SEQIDNO:2人類C5aR肽SEQIDNO:33C5可變重鏈(蛋白)序列SEQIDNO:43C5可變輕鏈(蛋白)序列SEQIDNO:7H3可變重鏈(蛋白)序列SEQIDNO:67H3可變輕鏈(蛋白)序列SEQIDNO:78G7可變重鏈(蛋白)序列SEQIDNO:88G7可變輕鏈(蛋白)序列SEQIDNO:9經^奮飾的人類C5aR肽SEQIDNO:10-25用於構建嵌合小鼠/人類C5aR的引物SEQIDNO:26生物素化的人類C5aR肽(第二力包外環)SEQIDNO:27人類C5aR第二胞外環的殘基179184SEQIDNO::28-50來自包含序歹'JEEYFPP的人類C5aR第月包外環的重疊12肽SEQIDNO:51-62肽序歹'JVREEYFPPKVLC的丙氨酸突變體SEQIDNO:63亂序的VREEYFPPKVLC肽具體實施例方式C5aR結構人類C5aR的胺基酸序列在SEQIDNO:1中提供。人類C5aR的不同結構域限定如下胺基酸1-37月包外結構i或-N末端胺基酸38-61跨膜結構域胺基酸62-71月包內結構域胺基酸72-94跨膜結構域胺基酸95-110月包外結構域-胞外環1胺基酸111-132跨膜結構域胺基酸133-149月包內結構域胺基酸150-174跨膜結構域胺基酸175-206胞外結構域-力包外環2胺基酸207-227跨膜結構域胺基酸228-242胞內結構域胺基酸243-264^爭膜結構域胺基酸265-283胞外結構域-胞外環3胺基酸284-307跨膜結構域胺基酸308-350月包內結構域-C末端微生物保藏詳惰產生名為3C5的單克隆抗體的雜交瘤保藏在ECACC,登記號為06081801。產生名為7H3的單克隆抗體的雜交瘤保藏在ECACC，登記號為06081802。產生名為8G7的單克隆抗體的雜交瘤保藏在ECACC，登記號為06081803。這些保藏是根據《國際承認用於專利程序的微生物保存布達佩斯條約》的規定進行的。這保證從保藏日起保持培養物存活30年。有機體可以根據布達佩斯條約通過ECACC獲得，該條約保證在相關專利/>布後，7>眾可持久且不受限制地獲得該培養物。本專利申請的受讓人同意，當在合適條件下進行培養時，如果培養物保藏死亡或喪失或損壞，則將才艮據通知用相同培養物的存活樣本及時進行替換。保藏的菌一朱的可獲得性並不^皮解釋為違反任何.明的"i午可。抗體本發明的抗體包括多克隆抗體、單克隆抗體、人源化抗體、雙砵爭異'hii元體、以及異源4禺聯4元體(heteroconjugateantibody)。如在本發明中所使用的，術語"抗體，，包括完整分子及其片段，如能夠結合表4立決定子的Fab、F(ab，)2和Fv。這些抗體片4殳<呆留一些選擇性地與其抗原或受體結合的能力，並限定如下(1)Fab，包含抗體分子的一價抗原結合片段的片段，可通過用木瓜蛋白酶消化整個抗體以生成完整輕鏈和一個重鏈的一部分而產生；(2)Fab，，抗體分子的片段，可通過用胃蛋白酶處理完全抗體，接著還原，以生成完整輕鏈和重鏈的一部分而獲得；每個抗體分子獲得兩個Fab，片段；(3)(Fab，)2,抗體的片段，可通過用胃蛋白酶處理完全抗體(沒有隨後的還原)而獲得；F(ab)2是通過兩個二硫鍵保持在一起的兩個Fab'片^:的二聚體；(4)Fv，限定為包含輕鏈的可變區和重鏈的可變區的遺傳設計片革殳，以兩個鍊表示；(5)單鏈抗體("SCA"),限定為包含輕鏈可變區、重鏈可變區的遺傳設計分子，由合適的多肽連結子連接成遺傳融合的單鏈分子；以及(6)單域抗體，通常是缺少輕鏈的可變重(鏈)結構域。本發明的優選抗體包含基本上與MAb3C5、7H3或8G7相同的可變區或者一個或多個CDR環。MAb3C5、7H3或8G7的可變區的序列在SEQIDNO38中列出。這些可變區中的每一個的CDR環限定如下MAb3C5CDRHI:SEQIDNO:3的殘基26-36(包括端值)；CDRH2:SEQIDNO:3的殘基51-66(包4舌端4直)；CDRH3:SEQIDNO:3的殘基97-108(包括端值)；CDRLl:SEQIDNO:4的殘基24-39(包括端值)；CDRL2:SEQIDNO:4的殘基55-61(包括端值)；CDRL3:SEQIDNO:4的殘基94-102(包4舌端4直)。MAb7H3CDRHI:SEQIDNO:5的殘基26-35(包括端值)；CDRH2:SEQIDNO:5的殘基50-68(包括端值)；CDRH3:SEQIDNO:5的殘基99-108(包括端值)；CDRLl:SEQIDNO:6的殘基24-39(包括端值)；CDRL2:SEQIDNO:6的殘基55-61(包括端值)；CDRL3:SEQIDNO:6的殘基94-102(包括端值)。MAb8G7CDRHI:SEQIDNO:7的殘基26-36(包括端值)；CDRH2:SEQIDNO:7的殘基51-66(包括端值)；CDRH3:SEQIDNO:7的殘基97-108(包括端值)；CDRLl:SEQIDNO:8的殘基24-39(包括端值)；CDRL2:SEQIDNO:8的殘基55-61(包括端值)；CDRL3:SEQIDNO:8的殘基94-102(包括端值)。Ll、L2、L3和H2CDR由Kabat定義。HI和H3CDR的限定修改自Kabat定義並在它們的N-末端處包括另外的殘基。擴展CDRHI以包括由Chothia定義為CDR-H1的一部分的殘基。擴展CDRH3以包4舌2個"妄觸(contact)"殘基。關於Kabat標號、定義Ab和抗原之間的CDR和4妄觸殘基的信息參見http:〃www.bioinfo.org.uk/abs。感興趣i也注意到，MAb3C5和8G7的CDR環共有以下水平的序列同一性tableseeoriginaldocumentpage24應當理解，可將序列表中示出的可變區或CDR環加以^修飾以用於本發明。通常，進行修飾以保持序列的結合特異性。例如可以在不影響抗體結合特異性的情況下進行保守置換。本發明涵蓋這樣的抗體，其包含與SEQIDNO:3~8中的任一個中的CDR環具有至少80%,更優選至少85%,更優選至少90%，更優選至少95%，更優選至少98%同一性的至少一個CDR環。例如，為了H畛飾的序列保持基本上相同的結合特異性，可以在該CDR環內進行1、2、3或4個胺基酸置才灸。在一種可替換的實施方式中，可以有意地對本發明抗體的胺基酸序列進4亍開的WO93/08829以及Trauneckera"/.,EMBOJ.,10:3655-3659(1991)中披露了類似的程序。可將具有期望的結合特異性的抗體可變結構域(抗體-抗原結合部位)融合於免疫J求蛋白恆定結構域序列。該融合優選與免疫球蛋白重鏈恆定結構i或，包拮「4交鏈、CH2和CH3區i或的至少一部分融合。優選具有第一重鏈恆定區(CH1),其包含對於在所述融合的至少一種中存在的輕鏈結合所必需的部位。將編碼免疫球蛋白重鏈融合的DNA,以及如果期望的話，將免疫球蛋白輕鏈插入到分離的表達載體中，並共轉染進合適宿主有機體中。對於產生雙特異性抗體的進一步的糹田節，參見，侈'H口Suresh^1,MethodsinEnzymology,121:210(1986)。根據WO96/27011中描述的另一種方法，可以對一對抗體分子之間的界面進行改造以使從重組細胞培養物回收的雜二聚體的百分比最大化。優選的界面包括抗體恆定結構域的CH3區的至少一部分。在這種方法中，用較大側鏈(例如，酪氨酸或色氨酸)替代來自第一抗體分子的界面的一個或多個小胺基酸側《連。通過用專交小的胺基酸側鏈(例如，丙氨酸或蘇氨酸)替代大胺基酸側鏈而在第二抗體分子的界面上形成與該4交大側鏈相同或類似大小的互補"空腔"。這提供了一種增大雜二聚體的產率超過其他不需要的最終產物(例如同二聚體)的機制。雙特異性抗體可製備成全長抗體或抗體片4殳(例如，F(ab，)2雙特異性抗體)。在文獻中已經描述過由抗體片段產生雙特異性抗體的技術。例如，雙特異性抗體可利用化學鍵合來製備。Brennan爭,Science229:81(1985)描述了一種程序，其中完整的抗體^皮蛋白水解地切割以產生F(ab，)2片段。這些片段在二硫醇複合試劑亞砷酸鈉的存在下被還原，以穩定鄰位的二硫醇並防止分子間二硫化物形成。然後，所產生的Fab，片萃殳轉化成石克代硝基苯甲酸鹽(thionitrobenzoate，TNB)書f生物。然後Fab，-TNB書亍生物之一通過用巰基乙胺還原而再轉化成Fab，-石克醇，並與等摩爾量的另一Fab，-TNB衍生物混合以形成雙特異性抗體。生產的該雙特異性抗體可用作用於酶的選擇性固定的試劑。Fab，片段可以直接從大腸桿菌(五.co/,')回收並化學偶聯以形成雙特異性抗體。Shalaby爭，J.Exp.Med.175:217-225(1992)描述了完全人源化雙特異性抗體F(ab，)2分子的生產。每一個Fab，片段分別由大腸桿菌分泌並經受體外直接化學偶聯以形成雙特異性抗體。由此形成的雙特異性抗體能夠結合至過表達ErbB2受體的細胞和正常人類T細胞，以及觸發人細胞毒性淋巴細胞對人乳腺腫瘤靶標的溶胞活性。用於直4妻從重組細胞培養物製備和分離雙特異性抗體片段的各種技術也已^皮描述過。例如，已利用亮氨酸4立鏈產生雙特異性抗體(Kostelny爭，J.Immunol.148(5):1547-1553(1992))。通過基因融合將來自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉鏈肽連接至兩個不同抗體的Fab，部分。抗體同二聚體在4交鏈區#1還原形成單體，然後^皮再氧化形成抗體雜二聚體。這種方法也可用於生產抗體同二聚體。由Hollinger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6444-6448(1993)描述的"雙特異抗體"技術提供了一種用於製備雙特異性抗體片段的可替換機制。這些片段包含通過連接子連接至輕鏈可變結構域(VL)的重鏈可變結構i或(Vh),該連4妄子太短以致於不允許相同鏈上的兩個結構i或之間配對。因此，一個片革殳的Vh和VL結構域^皮迫與另一個片,殳的互補VL和VH結構域配對，從而形成兩個抗原結合部位。也已經報導了通過利用單鏈Fv(sFv)二聚體來製備雙特異性抗體片#殳的另一種策略，參見Gruber爭,J.Immunol.152:5368(1994)。考慮了具有多於兩個效價的抗體。例如，可製備三特異性抗體(Tutt爭，J.Immunol.147:60(1991))。弄源偶聯拔體(HeteroconjugateAntibody)異源偶聯抗體也屬於本發明的範圍。異源偶聯抗體由兩個共<介結合的抗體構成。例如，已使這樣的抗體使免疫系統細胞靶向不需要的細胞(美國專利第4，676，980號)，並用於治療HIV感染(WO91/00360;WO92/200373;EP03089)。考慮了這些抗體可以利用合成蛋白質化學中的已知方法進行體外製備，包括涉及交聯劑的那些方法。例如，可以利用二^/f匕物交換反應或通過形成石克醚4建來構建免疫毒素。用於該目的的合適試劑的實例包括亞氨基硫醇鹽(或亞氨基石克羥酸鹽，iminothiolate)和4-巰基丁亞氨酸甲西旨(methyl畫4畫mercaptobutyrimidate)以及在例如美國專利第4,676,980號中披露的那些。^t^子^然炎造可能需要就效應子功能而修飾本發明的抗體，以增強例如抗體在治療癌症中的效力。例如，可將半胱氨酸殘基引入到Fc區域中，從而允許在該區域中形成鏈間二硫鍵。由此產生的同二聚抗體可以具有改進的內在化能力和/或增大的4卜體介導的細胞殺傷以及抗體依賴性細胞毒性(ADCC)，參見Caron爭，J.ExpMed.,176:1191-1195(1992)和Shopes，J.Immunol.,148:2918-2922(1992)。具有增強的抗腫瘤活性的同二聚抗體也可以利用如在Wolffetal.CancerResearch,53:2560-2565(1993)中描述的異雙功能交聯劑來製備。可替換地，可以對抗體進4亍改造(具有兩個Fc區i或)並且由此可以具有增強的補體溶解和ADCC能力，參見Stevenson爭,Anti-CancerDrugDesign3:219-230(1989)。本發明還涉及包含結合至細胞毒性劑如化療劑、毒素(例如，細菌、真菌、植物或動物源的酶促活性毒素或它們的片段)、或放射性同位素(即，放射性結合物)的抗體的免疫交聯物。以上已經描述了用於產生這樣的免疫交聯物的化療劑。可以使用的酶促活性毒素及其片段包括白喉A鏈、白喉毒素的非結合活性片段、外毒素A鏈(來自綠膿假單胞菌)、蓖麻毒素A鏈、相思豆毒素A鏈、蒴蓮才艮毒素(modeccin)A鏈、a-/V疊王求菌、油桐蛋白、石竹素蛋白、美洲商陸蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜抑制劑(momordicacharantiainhibitor)、^寫果素、巴豆毒蛋白、急草黃4卬製劑(sapaonariaofficinalisinhibitor)、白樹毒素、米4乇潔才木(mitogellin)、局限曲菌素、酚黴素、依諾黴素以及單端孢黴烯類毒素。可使用各种放射性核素來生產放射性結合物抗體。實例包括212Bi、31I、131In、^Y和^Re。抗體和細胞毒性劑的結合物利用各種雙功能蛋白偶聯劑製成，所述偶聯劑例如3-(2-吡啶二硫基)丙酸N-琥珀醯亞胺酯(SPDP)、亞氨基石克雜環戊烷(iminothiolane)(IT),亞氨酸酯(如己二亞胺酸二曱酯鹽酸鹽)、活性酯(如辛二酸二琥珀醯亞胺酯)、醛(如戊二醛)的雙官能團衍生物，雙-疊氮基化合物(如雙(對疊氮基苯曱醯基)己二胺)、雙-二偶氮衍生物(如雙-(對二偶氮苯曱醯基)-乙二胺)、二異氰酸酯(如2,6-二異氰酸亞苄酯)、以及雙-活性含氟化合物(如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)。例如，蓖麻毒蛋白免疫毒素可如在Vitetta等，Science,238:1098(1987)中所述進行製備。碳-14標記的l-異硫氰基千基-3-甲基二亞乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用於》文射性核素與抗體結合的示例性螯合劑，參見W094/11026。在另一種實施方式中，可將抗體結合至"受體"(如抗生蛋白鏈菌素)以用於月中瘤預定4立(tumorpretargeting)，其中4元體-受體結合物給予患者，接著利用清潔劑從血液循環除去未結合的結合物，然後給予結合至細胞毒性劑(例如放射性核素)的"配體"(例如，抗生物素蛋白)。在某些情況下，依據它們的診斷或治療效力，一個同種型的單克隆抗體可能比另一同種型的單克隆抗體是更加4尤選的。例如，才艮據關於抗體介導的溶胞作用的研究，已知同種型y-2a和，3的未修飾小鼠單克隆抗體在溶解靶細胞中通常比y-l同種型的抗體更有效。這種差異性效力^皮，認為是由於y-2a和y-3同種型更積極參與靶細胞的溶胞石皮壞的能力。單克隆抗體的特定同種型可二次地由分泌不同同種型的單克隆抗體的親代雜交瘤來製備，通過使用同胞選擇(sibselection)衝支術來分離類別壽爭才奐變異體(class-switchvariant)(Steplewski,etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,82:8653，1985;Spira,etal.,J.Immunol.Methods,74:307,1984)。結合特性在本發明的一種實施方式中，所述抗體依據其抑制濃度50值來定義。術i吾"抑制濃度50°/。"(簡寫為"ICso")表示一種抑制劑對於該抑制劑所靶向分子的給定活性(例如，C5a與C5aR或其片4殳的結合)的50%抑制所需的濃度。本領域技術人員應理解，更低的IC50J直對應於更有效的抑制劑。在一種實施方式中，本發明的抗體抑制C5a與C5aR的結合，其中當在相同條件下測定時，其ICso值比MAb7F3低至少1.5倍。在另一實施方式中，本發明的抗體抑制C5a與C5aR的結合，其中ICso低於500pM,更優選低於400pM，更優選低於300pM,並且更優選低於200pM。優選地，這些ICso值是如本文的實施例中所述通過利用人嗜中性粒細胞實施的結合測定來確定的。本發明的另一實施方式涉及結合C5aR或其片段的抗體，其中當在相同條件下測定時，其Kd(親和常數)比MAb7F3低至少1.3倍，優選低1.4倍。在另一實施方式中，本發明的抗體結合至C5aR或其片段，其中Kd小於1.4iiM，更優選小於0.7nM，更優選小於0.5nM,更優選小於0.3nM。本發明的另一實施方式涉及結合C5aR或其片段的抗體，其中當在相同條件下測定時，其締合常數或ka速率比MAb7F3高至少1.5倍。在另一實施方式中，本發明的抗體結合至C5aR或其片段，其締合常悽t或ka速率為至少6.8x15m-V1,更優選為至少106]VrV1,優選為至少3xi06ivrV1。在一種優選的實施方式中，結合親和力是通過抗體與來源於人C5aR的肽的結合的BIACore分析來確定的。優選地，來源於人C5aR的肽包含序列LYRVVREEYFPPKVLCGVDYSHDKRRERAVAIV(SEQIDNO:2)。更優選地，該結合分析在本文實施例中所描述的條件下通過BIACore結合分析來實施。體外測定本發明的單克隆抗體適合體外利用，例如，在免疫測定中它們以液相利用或結合至固相載體利用。這些抗體可以用於監測樣品中的C5aR水平。類似地，抗-獨特型抗體用於測量樣品中C5a水平。另外，在這些免疫測定中，可以各種方式可4全測地標記這些單克隆抗體。可利用本發明的單克隆抗體的免疫測定類型的實例是直接形式或間接形式的竟爭性和非竟爭性免疫測定。這樣的免疫測定的實例是放射性免疫測定(RIA)和夾心(免疫)測定。使用本發明的單克隆抗體的抗原檢測可利用以正向、反向或同步模式運行的免疫測定，包括在生理學樣品上的免疫組織化學測定來完成。本領域技術人員將知曉或者可以易於理解其他免疫測定形式而無需過度實驗。本發明的抗體可結合至許多不同載體並用來4企測C5aR的存在。熟知的的載體的實例包括玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、葡聚糖、尼龍、澱粉酶、天然和改性纖維素、聚丙烯醯胺、瓊脂糖和》茲4失礦(magnetite)。對於本發明目的而言，載體的性質可以是可溶性的或不溶性的。本領域4支術人員將知曉用於結合單克隆抗體的其他合適載體，或者能夠利用常規實驗確定。在一種實施方式中，天然表達C5aR的細胞或包含編碼C5aR或其變體的重組核酸序列的細胞用於本發明的結合測定。在適於受體表達的條件下保持這些細胞。在適合於結合的條件下(例如，在合適結合緩衝液中)使這些細胞與抗體或片段接觸，並通過標準技術檢測結合。為了確定結合，結合的程度可相對於合適對照加以確定(例如，與在沒有抗體下確定的背景對比，與第二抗體(即一個標準)的結合對比，與抗體和未轉染細胞的結合對比)。包含受體或脂質體(包含受體)的細胞部分，如膜部分可代替完整細胞使用。結合抑制測定也可用來鑑定結合C5aR和抑制C5a與C5aR或功能變異體的結合的抗體或其片^:。例如，可實施一個結合測定，其中相比於在沒有抗體下的C5a的結合，檢測或測量C5a的結合(在存在該糹元體的情況下)的減少。包含分離和/或重組哺乳動物C5aR或其功能變異體的糹且合物可以與C5a和^t體同時4妄觸或以一個4妄一個的順序接觸。在抗體存在的情況下配體結合程度的降低表明通過該抗體使結合受到抑制。例如，配體的結合可被降低或消除。可獲得鑑定結合C5aR的抗體的存在的其他方法，如其他合適的結合測定，或監測由受體結合觸發的事件的方法，包括信號轉導功能和/或細胞應答(例如白細胞運輸)的刺激。以這種方式鑑定的抗體可進一步評估以確定在結合後它們是否起到抑制C5aR的其他功能和/或評定它們的治療應用的作用。信號轉導分析配體或促進劑(如激動劑)與C5aR的結合可導致通過這種G蛋白偶聯受體的信號轉導，並且刺激G蛋白的活性以及其他胞內信號分子。通過一種化合物(例如抗體或其片段)對信號轉導功能的誘導可利用任〗可合適的方法加以監測。這樣的測定可用來鑑定C5aR的抗體激動劑。抗體或其功能片段的抑制活性可在測定中利用配體或促進劑，並評估抗體抑制由配體或促進劑誘導的活性的能力而力o以；角定。G蛋白活性，如GTP水解為GDP,或之後的由受體結合觸發的信號轉導事件，如胞內(細胞溶質)游離鈣濃度快速和瞬間增大的誘導可通過本領域已知的方法或其他合適方法進行測定(參見，例如，Neote，K.""/.，Cell,72:415-425，1993;VanRiper"a/"J.Exp.Med.，177:851-856,1993;Dahinden,C.A."a/.,J.Exp.Med.，179:751-756,1994)。例如，Sledziewski等人利用雜合G蛋白偶聯受體的功能測定可用來監測配體或促進劑結合受體和激活G蛋白的能力(Sledziewski等，美國專利第5,284,746號)。知方法和/或本文描述的方法來確定抗體或片革殳抑制由配體或促進劑誘導的活性的能力。趨化性和細胞刺激的測定趨化性測定也可用來評估抗體或其功能片革殳阻遏配體與C5aR的結合和/或抑制與配體和受體的結合相關的功能的能力。這些測定基於由化合物誘導的細胞體外或體內的功能遷移。趨化性可通過任何合適的手段進行評估，例如在利用96孔趨化性板的測定中，或利用其他本領域已知的用於評估趨化性的方法。例如，Springer等人4葛述過體夕卜3爭內皮趨鬥生測定、法(tmnsendothelialchemotaxisassay)的使用(Springer等，WO94/20142，1994年9月15公開；還參見Berman等，Immunol.Invest.17:625-677(1988))。也已描述過越過內皮進入月交原凝月交的遷移(Kavanaugh爭，J.Immunol"146:4149-4156(1991))。小鼠Ll-2pre-B細胞或具有趨化能力的其他合適宿主細月包的穩定轉染子可以用於趨化性測定中。通常，趨化性分析監測合適細胞(如白糹田胞(例如淋巴細胞、嗜酸性粒細胞、嗜^5威性粒細胞))進入或通過屏障(例如，內皮、濾器)，朝向化合物的增高水平，從該屏障的第一表面朝相對的第二表面的定向運動或移動。膜或濾器提供便利的屏障，以使合適細胞進入或通過濾器朝向化合物的增高水平，從該濾器的第一表面朝該濾器的相對第二表面的定向運動或移動^皮監測。在一些測定中，膜用物質塗覆以促進粘附，如ICAM-1、纖連蛋白或膠原。這樣的測定提供白細胞"尋靶(homing)"的體外近似。例如，可以4企測或測量合適容器(一種容納裝置)中細胞從第一室遷移進入或通過樣吏孔膜遷移進入第二室(其包含待測試抗體，並且其通過所述膜與第一室分開)的抑制。選4奪合適的膜，該膜具有用於監測響應於化合物的特定移動的合適孔大小，包括例如硝化纖維素、聚碳酸酯。例如，可使用大小為約3-8微米，並優選為約5-8孩i米的孔。孔的尺寸可以是在濾器上均勻的或者在合適的孔的尺寸的一個範圍內。為了評估遷移和遷移的抑制，可利用標準技術(例如顯微鏡)確定遷移到濾器中的距離、越過保持粘附於濾器的第二表面的細胞數量、和/或在第二室中累積的細胞數量。在一種實施方式中，將細胞用可檢測標籤(例如，放射性同位素，螢光標籤，抗原或表位標籤)加以標記，並且可在抗體或片^殳存在和不存在的情況下，通過利用適當方法(例如，通過衝全測;汶射活性，焚光，免疫測定)而確定粘附於所述膜和/或在第二室中存在的標籤的存在來評估遷移。由抗體激動劑誘導的遷移程度可相對於適當對照來確定(例如，由所述抗體i秀導的未豸#染細力包的移動相比，相比於在沒有抗體下確定的背景移動，相比於由第二化合物(即，一個標準)誘導的移動程度)。在一種實施方式中，尤其是對於T細胞、單核細胞或表達C5aR的細胞，可監測跨內皮遷移。在該實施方式中，評估通過內皮細胞層的移行(transmigration)。為了製備細胞層，可以在樣t孔濾器或膜(可選地塗覆有諸如膠原、纖連蛋白或其他胞外基質蛋白的物質)上培養內皮細胞，以促進內皮細胞的附著。優選地，培養內皮細胞直至形成匯合(融合)的單層。各種哺乳動物內皮細胞可用於單層形成，包4舌例如請爭月永、動月永或樣史血管內皮，如人臍靜月永內皮細月包(CloneticsCorp，聖;也亞哥，力。利福尼亞州)。為了測定響應於特定哺乳動物受體的趨化性，優選相同的哺乳動物的內皮細胞；然而，也可以使用來自異源哺乳動物種或屬的內皮細^^。通常，通過檢測在朝向化合物水平增大的方向上，從濾器的第一表面朝向濾器的相對第二表面進入或穿過膜或濾器的細胞的定向移動而實施測定，其中該濾器包含在第一表面上的內皮細月包層。定向移動/人鄰近第一表面的區域發生，進入或穿過所述膜，朝向位於濾器的相對側上的化合物。在鄰近第二表面的區域中存在的化合物的濃度大於鄰近第一表面的區域中的化合物濃度。在用來測試抗體抑制劑的一種實施方式中，可將包含能夠遷移並表達C5aR的細胞的組合物置於第一室中。將包含能夠誘導第一室中細胞的趨化性(具有化學引誘物功能)的一種或多種配體或者促進劑的組合物置於第二室中。優選地，在細胞置於第一室之前不久，或與這些細胞同時，放置包含待測試抗體的組合物，優選地在第一室中。在該測定中，可結合受體並抑制表達C5aR的細胞趨化性誘導(通過配體或促進劑)的抗體或其功能片段是受體功能的抑制劑(例如，刺激功能的抑制劑)。在抗體或片^:存在下由配體或促進劑誘導的遷移程度的降低指示抑制活性。可實施單獨的結合研究以確定抑制是否是抗體與受體結合的結果或者經由不同機制發生。下文描述了監測組織的白細月包'滲透(響應於該組織中注入的4匕合物(例如，趨化因子或抗體))的體內測定(參見炎症模式)。這些體內尋耙的模式測量細胞響應於配體或促進劑通過遷移和趨化至炎症部位的能力以及評估抗體或其片段阻遏這種遷移的能力。除了上述方法，抗體或片段對C5aR的刺激功能的作用可通過利用包含受體的合適宿主細胞，監測由活性受體誘導的細胞應答而進行評估。C5aR的其他配體、抑制劑和/或促進劑的鑑定上述的測定，其可用來評估本發明的抗體和片段的結合以及功能，可適於鑑定其他配體或結合C5aR或其功能變異體的其他物質，以及C5aR功能的抑制劑和/或促進劑。例如，具有與本發明的抗體或其功能部分相同或類似結合特異性的試劑可通過利用所述抗體或其部分的竟爭測定進^亍鑑定。因此，本發明還涵蓋鑑定該受體的配體或結合C5aR的其他物質、以及受體功能的抑制劑(例如拮抗劑)或促進劑(例如激動劑)的方法。在一種實施方式中，在測定中使用帶有C5aR蛋白或其功能變異體的細胞(例如，白細胞，被改造成表達哺乳動物C5aR蛋白或功能變異體(由引入所述細胞內的核酸編石馬)的細月包系或合適的宿主細月包)，以鑑定和;平估配體或結合受體的其他物質的效力，包括受體功能的抑制劑或促進劑。這樣的細胞也可用於評估表達的受體蛋白或多肽的功能。根據本發明，結合受體的配體和其他物質、受體功能的抑制劑和促進劑可在合適測定中鑑定，並且進一步評估治療作用。受體功能的拮抗劑可用來抑制(降低或阻止)受體活性，而配體和/或激動劑可用來誘導(觸發或增強)其中指定的正常受體功能。因此，本發明提供了一種治療炎性疾病，包括自身免疫性疾病和移植物排斥的方法，包括向個體(例如，哺乳動物)給予受體功能的拮抗劑。本發明進一步提供了一種通過向個體給予受體功能的新型配體或激動劑來刺激受體功能的方法，提供了選擇性刺激白細胞功能的一種新途徑，其例如在治療傳染性疾病和癌症中是有用的。如本文中所-使用的，C5aR蛋白的"配體"是指一種特定種類的物質，其結合於哺乳動物C5aR蛋白，包括天然配體以及天然配體的合成和/或重組形式。在一種優選的實施方式中，C5aR蛋白的配體以高親和力發生結合。如本文中所使用的，"拮抗劑"是一種抑制(降低或阻止)C5aR蛋白的至少一種功能特性的物質，如結合活性(例如，配體結合、促進劑結合、抗體結合)、信號轉導活性(例如，哺乳動物G蛋白的活化、細胞溶質游離鈣濃度的快速和瞬間增大的誘導)和/或細胞應答功能(例如，趨化性、胞吐作用或通過白細胞的炎性介質釋》文的刺激)。術語拮抗劑涵蓋結合受體的物質(例如，抗體、天然配體的突變體、小分子量有機分子、配體結合的其他竟爭性抑制劑)、以及抑制受體功能而不與其結合的物質(例如，抗-獨特型抗體)。如本文中所使用的，"激動劑"是一種促進(誘導，引發，增強或增加)C5aR蛋白的至少一種功能特性的物質，如結合活性(例如，配體、抑制劑和/或促進劑結合)、信號轉導活性(例如，哺乳動物G蛋白的活化、細胞溶質游離鈣濃度的快速和瞬間增大的誘導)和/或細胞應答功能(例如，趨化性、胞吐作用或通過白細胞的炎性介質釋》文的刺激)。術語激動劑涵蓋結合受體的物質(例如，抗體，來自另一物種的天然配體的同系物)、以及促進受體功能而不與其結合的物質(例如，通過激活相關蛋白)。在一種優選的實施方式中，激動劑不同於天然配體的類似物。因此，本發明還涉及一種衝企測或鑑定結合C5aR或結合其變異體的配體的試劑(包括配體、拮抗劑、激動劑和結合C5aR或功能變體的其他物質)的方法。4艮據該方法，可將待測試的試劑、本發明的抗體或抗原結合片段(例如，具有與7F3相同或類似的表位特異性的抗體，以及其抗原結合片段)以及包含C5aR或其配體結合變異體的組合物進行組合。將前述組分在適合於抗體或抗原結合片段與C5aR結合的條件下進行組合，並且根據本文所述的方法或其他合適方法直接或間接地檢測或測量抗體或片段與C5aR的結合。相對於合適對照(例如，在沒有待測試的試劑下)形成的複合體的量的減少是該試劑結合所述受體或變體的指徵。包含C5aR的組合物可以是帶有重組C5aR蛋白或結合其變異體的配體的細胞的膜部分。抗體或其片4殳可用標籤加以標記，如》文射性同位素、自^走標籤、抗原或表位標籤、酶標籤、螢光基團以及化學發光基團。抗-C5aRmAb的置換可以更易於鑑定C5a受體拮抗劑是有原因的。C5a與C5aR的結合是涉及C5aR的不同區域的兩步過程(參見Klco"2005)，且抗-C5aR單克隆抗體，即7F3或3C5識別第二胞外環中的用於抑制的單個關鍵區域。炎症模型可用來評估本發明的抗體和片#殳作為治療劑在體內的作用的炎症的體內模型是可獲得的。例如，可監測經過與C5aR反應性的趨化因子和抗體或其片段皮內注入到合適動物，如兔、小鼠、大鼠、豚鼠或獼」猴中的白細月包滲入(參見，例如，VanDamme,J.爭，J.Exp.Med.,176:59-65(1992);Zachariae,C.O.C."J.Exp.Med.171:2177-2182(1990);Jose,P.J.等，J.Exp.Med.179:881-887(1994))。在一種實施方式中，皮月夫活組織4企查組織學i也評估白細月包(例如，嗜酸性粒細胞，粒性白細胞)的滲入。在另一實施方式中，將能夠趨化且外滲的標記細胞(例如，穩定轉染的表達C5aR的細胞)給同時或之後給予。與沒有抑制劑下的滲入程度相比，抗體存在下滲入程度的降低是抑制的指徵。應用本發明的抗體可應用於在各種應用，包括研究、it斷和治療應用。C5aR在白細胞運輸中具有重要的作用。因此，C5aR是嗜中性灃立細力包、嗜酸性4立細力包、T細力包或T細力包亞組或單核細力包遷移到某些炎性部位的化學引誘物受體，所以抗-C5aR抗體可以用來抑制(減少或阻止)白細胞遷移，尤其是與嗜中性粒細月包組織損傷，如再灌注損傷和〗木克、T細力包才幾能障礙如自身免疫性疾病，或過壽丈反應或單核細胞介導的紊亂如動力永粥辨^更化相關。本文描述的抗體可用作抑制(減少或阻止)(a)與受體的結合(例如配體、抑制劑或促進劑的結合)，(b)受體信號轉導功能，和/或(C)刺激功能的抑制劑。用作受體功能的抑制劑的抗體可直接或間*接地阻遏配體或促進劑結合(例如，通過引起構象變化)。例如，抗體可通過抑制配體的結合或通過脫*文(有或沒有抑制配體的結合)而抑制受體功能。因此，本發明提供了一種抑制哺乳動物(例如人類患者)體內白細胞運輸的方法，包括向該哺乳動物*會予有效量的本發明的抗體。本發明還提供了一種抑制與C5aR活性相關的其他作用如從嗜石成性粒細胞釋i文組胺和從嗜酸性粒細胞、嗜石威性粒細胞和嗜中性粒細月包釋》文顆粒的方法。給予本發明的抗體可導致疾病狀態的改善或消除。單克隆抗體也可免疫治療地用於免疫病理學相關疾病。如本文聯合本發明的抗體使用的，術語"免疫治療地"或"免疫療法"表示預防性以及治療性給藥。因此，這些抗體可給予高危險患者以便減輕免疫病理學疾病的可能性和/或嚴重性，或者給予已顯示活動性疾病的跡象，例如由於革蘭氏陰性菌感染導致的敗血症的患者。這些抗體可用來治療變態反應、動a永粥才羊^f匕形成、過壽文反應、惡性肺瘤、慢性和急性炎症、組胺和IgE介導的變態反應、休克、以及類風溼性關節炎、動脈粥樣硬化、多發性硬化症、同種異體移植物排斥、纖維變性疾病、譯喘、炎性腎小球病或任何免疫複合物相關紊亂。可利用本發明的抗體治療的人類或其他物種的疾病或症狀包括^旦不限於(a)炎性或變態疾病和症4犬，包4舌呼p及性變態疾病，例如哮喘、變應性鼻炎、超敏性肺病、過敏性肺炎、間質性肺疾病(ILD)(例如，特發性肺纖維化、或與類風溼性關節炎相關的ILD、系統性紅斑狼痴、強直性脊柱炎、系統性石更化症、斯耶格4侖綜合;f正(Sjogren'ssyndrome)、多月幾炎或皮月幾炎)；過每丈反應或超壽文反應、藥物變態反應(例如，對青黴素，頭孢菌素)、昆蟲叮咬過敏；炎性腸疾病，如克羅恩氏病(Crohn'sdisease)和潰痴性結腸炎；脊推關節炎；硬皮病；4艮屑病和炎性皮膚病，如皮炎、溼疹、特應性皮炎、變應性接觸性皮炎、蕁麻滲、血管炎(例如，引起壞死的、影響皮膚的和超壽文性血管炎)；(b)自身免疫性疾病，如關節炎(例如，類風溼性關節炎，牛皮辮性關節炎)、多發性硬化症、系統性紅斑狼瘡、重症肌無力、青少年型糖尿病、腎炎(如腎小球腎炎)、自身免疫性甲狀腺炎、貝士刀淨爭病(Behcet'sdisease);(c)移植物排斥(例如在移植中)，包括同種異體移植物排斥或移一直物抗宿主病；(d)動脈粥樣硬化；(e)具有白細胞(白血球)滲入皮膚或器官的癌症；(f)可由其中不期望的炎性應答受到抑制而得到治療的其他疾病或症狀(包括C5aR介導的疾病或症狀)，包括但不限於再灌注損傷、<木克、成人呼吸窘迫綜合4正、某些惡性血液病、細月包因子i秀導的毒性(例如感染性休克、內毒素性休克)、多肌炎、皮肌炎、類天皰瘠、阿爾茨海,默病和肉芽腫病包4舌肉才羊瘤病、血友病滑月莫炎和與年齡相關的黃斑退4於性病變。本發明的抗-C5aR抗體可阻遏一種或多種配體的結合，從而阻遏導致以上紊亂的一種或多種事件的下遊級聯反應。在一種優選的實施方式中，本發明的抗體用於治療敗血症、<木克和成人呼吸窘迫綜合4正。在另一實施方式中，本發明的不同抗體可用來檢測C5aR以測量受體的表達，例如在白細胞(例如嗜中性粒細胞、單核細胞、B細胞)、內皮細胞上和/或在用受體基因轉染的細胞上。因此，它們可用於診斷或研究目的的諸如細胞分選(例如，流式細胞儀，螢光活化細胞分選)的應用中。本發明的抗-C5aR抗體在診斷應用中具有價值。通常，診斷測定需要檢測由抗體或其片段與C5aR結合得到的複合體的形成。對於診斷目的，抗體或抗原結合片段可被標記或未標記。抗體或片段可直接標記。可採用各種標籤，包括但不限於放射性核素、螢光劑、酶、酶底物、酶輔因子、酶抑制劑和配體(例如，生物素，半抗原)。本領域二技術人員知曉大量適合的免疫測定(參見，例如美國專利第3,817,827;3,850,752;3,901,654和4，098，876號)。組織才羊品的免疫組織化學也可以用於本發明的i貪斷方法中。當未標記時，可利用合適方式檢測抗體或片段，例如在凝集測定中。未標記抗體或片段也可與另一(即一種或多種)可用來4企測抗體的合適試劑的組合4吏用，如與第一抗體(例如，抗-獨特型抗體或對於未標記免疫3求蛋白是特異性的其他抗體)或其他合適試劑(例如，標記蛋白A)是反應性的標記抗體(例如，第二抗體)。也可製備用於檢測生物學樣品中存在C5aR蛋白的試劑盒。這樣的試劑盒包括結合至C5aR的抗體或其功能片段，以及一種或多種適合於才全測抗體或片革殳與C5aR之間的複合物的存在的輔助試劑。本發明的抗體組合物可以凍幹形式4是供(單獨或與另外的對其他表位特異性的抗體的組合)。抗體可以是標記或未標記的，其可與佐劑成分(adjunctingredient)(侈寸^口，鄉爰沖齊'J,^口Tris、石粦酸鹽和碳酸鹽、穩定劑、賦形劑、殺菌劑和/或無活力蛋白例如牛血清白蛋白)一起包括在所述試劑盒中。例如，抗體可作為與佐劑成分的凍幹混合物提供，或者佐劑成分可單獨提供以由使用者進行組合。通常，基於活性抗體的量，這些佐劑材泮牛(adjunctmaterials)以<氐於約5%重量存在，並且基於抗體濃度，通常以至少約0.001%重量的總量存在。在採用能夠結合至單克隆抗體的第二抗體的情況下，可在試劑盒中提供這樣的抗體，例如在單獨的小瓶或容器中。如果存在第二抗體，則其通常被標記，並且可以與上述抗體製劑類似的方式進4於配製。類似地，本發明還涉及一種通過細胞的C5aR才企測和/或定量表達的方法，其中，包含細胞或其部分(例如力莫部分)的組合物在適合。抗體的檢測是抗體和C5aR之間的複合物形成的指徵，表明存在受體。抗體與細胞的結合可利用諸如在WO03/062278中描述的那些技術進行確定。該方法可用來檢測在來自個體(例如，在樣品，如體液，如血液、唾液或其4也合適才羊品)的細月包上的C5aR的表達。在T細月包或單核細月包表面上的C5aR表達水平也可例如通過流式細月包4義來確定，而且表達水平(例如，染色強度)可與疾病易感性、進展或危險相關聯。給藥模式各種給藥途徑是可能的，包括但不必限於口服、飲食、局部、非腸道(例3口，請爭月永內、動月永內、月幾內、皮下注射)、吸入(例^口，支氣管內、目艮內、鼻內或口腔吸入、鼻內滴劑)，取決於待治療的疾病或症狀。其4也合適的糹會藥方法還可包^r可再加載或可生物降解裝置以及緩慢釋放聚合物裝置。本發明的藥物組合物也可作為與其他試劑聯合療法的一部分而給予。待給予的抗體的劑型將根據選擇的給藥途徑和劑型(例如，溶液、乳液、膠嚢)而不同。包含待給予的抗體的適合的藥物組合物可在生理學可接受賦形劑或載體中製備。也可使用抗體的混合物。對於溶液或乳液，合適的載體包括例如，含水或含醇/含水溶液、乳液或混懸液，包4舌鹽水和糹爰衝介質。非腸道載體可包4舌氯4b鈉溶、液、林才各式葡聚糖(Ringer'sdextrose)、葡聚4唐和氯化鈉、乳酸化林格或非揮髮油。各種適當的含水載體對於本領域技術人員是已知的，包括水、緩衝水、緩沖鹽水、多元醇(例如甘油、丙二醇、液體聚乙二醇)、葡聚糖溶液和甘氨酸。靜脈內載體可包括各種添加劑、防腐劑、或流體、營養劑或電解質補充劑(通常，參見，Remington'sPharmaceuticalScience,第16片反，Mack,Ed.1980)。組合物可以可選地才艮據需要包含藥用輔助物質至適當的生理條件，如pH調節和緩衝劑以及毒性調節劑，例如乙酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣和乳酸鈉。本發明的抗體和片段可在才艮據本領域已知凍幹和重建4支術使用之前被凍幹以用於在合適載體中儲存和重建。所選介質中活性成分的最佳濃度可才艮據經-驗、才艮據本領域4支術人員熟知的程序進行確定，並取決於期望的最終藥物製劑。對於吸入，抗體或片段可溶解並加載到合適的分配器(例如，霧化器、噴霧器或壓縮氣溶膠分配器)中以用於給藥。本發明抗體給藥的劑量範圍為足夠大以產生期望的效果，其中免疫病理學疾病的症4犬減輕或者感染的可能性或乂于于免疫系統的刺激降低。該劑量不應太大而引起有害副作用，如高粘滯症候群、肺水胂、充血性心力衰竭等。通常，劑量將隨著患者的年齡、症狀、性別和疾病程度而不同並且可由本領域技術人員確定。劑量可由任4可併發症事件中的單個醫生調節。劑量可以在一天或多天中以每天一個或多個劑量給藥，從約0.1mg/kg至約300mg/kg,優選從約0.2mg/kg至約200mg/kg，最優選/人約0.5mg/kg至約20mg/kg變化。本發明的一種或多種抗體可通過適當途徑，單獨地或與另一藥物或藥劑組合(之前、同時或之後)^合予個體。例如，本發明的抗體也可與其他單克隆或多克隆抗體(例如，聯合結合趨化因子受體的抗體，該趨化因子受體包括但不限於CCR2和CCR3)聯合使用，或與抗-TNF或其他抗炎性藥劑或與現有的血漿產品耳關合使用，如商業上可獲得的在預防或治療中使用的y球蛋白和免疫^求蛋白產品。本發明的抗體可以作為與抗生素和/或抗菌劑結合的單獨給藥組合物4吏用。本領域技術人員將理解，本發明的抗體可以通過給予包含編碼該抗體的序列的核酸分子而？1入到受試者體內。該核酸分子的形式可以是DNA或RNA或包含DNA或RNA的嵌合分子。編碼該抗體的核香酸序列可以#1克隆進入表達載體中，其中編石馬該^式劑的序列操作性地與表達控制元件連接。表達控制元件在本領域是熟知的，並且包括例如啟動子、增強子以及適當的啟始和終止密碼子。可採用各種方法將編碼抗體的核酸引入到體內靶細胞中。例如，可在耙部^立注射淨果露核酸、可以嚢化入脂質體、或者可以藉助於病毒載體引入。單獨或例如在陽離子脂質體中嚢化的核酸分子的直接注射可以用於將編碼TSP-1的核酸的穩定基因轉移到體內未分化或分化細胞中(Ulmer等，1993)。另外，可以利用粒子轟擊方法將核酸轉移到體內各糹且織中(Williams等，1991)。病毒載體可用於將編碼抗體的核酸分子基因轉移到體內特定細胞類型中。病毒是特化的感染劑，其可在特定細胞類型中感染並繁殖。&+A&&#^始,W"^二,Mt"W;舌A所選定的體內細胞。病毒載體的選擇將部分取決於待靶向的細胞類型。特化病毒載體在本領域是熟知的，其可靶向特定細胞類型。這樣的載體包括，例如，具有一^:或組織特異性啟動子的重組腺相關病毒載體(US5,354,678)。重組腺相關病毒栽體具有額外的優點，即重組病毒可穩定地整合到甚至是^^眠非增殖性細胞的染色質中(Lebkowski等，1988)。病毒載體可被構建成通過將組織特異性啟動子或增強子併入到該載體中而進一步控制表達所編碼抗體的細月包類型(Dai等，1992)。逆轉錄病毒也適合用於體內遞送編碼該抗體的核酸分子的方法。這樣的載體可4皮構建成充當感染性顆粒或非感染性顆粒(其4又經過單次初始一^r的感染)。也可以以組織特異性方式，利用組織特異性配體或經由橋接分子與該核酸分子非共4介複合的抗體，利用受體介導的DNA遞送方法將編碼抗體的核酸分子遞送到細胞中(Curiel等，1992;Wu和Wu，1987)。為了獲得受試者體內抗體表達的基因轉移，也可通過例如自體同源細月包的體外轉染而實施。用於這樣的體外轉染的合適細胞包括血細胞，因為這些細胞易於通過本領域熟知的方法進行操作並再次回引到受試者體內。通過體外細胞轉染的基因轉移可通過各種方法實施，包括例如磷酸4丐沉澱、二乙基氨基乙基葡聚糖、電穿孔、脂轉染或病毒感染。這樣的方法在本領域是熟知的(參見，例如，Sambrook等，MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringsHarbourLaboratoryPress(1989))。一旦細胞被轉染，然後就將它們移植或嫁接回到待治療的受試者體內。一旦引入到體內，這些細胞可產生抗體，其可進入循環並抑制疾病或病症部位處的血小板聚集。在說明書全文中，術語"包含"，或變形如"包含"應理解為包含所述元件、整體或步驟，或多個元件、整體或步驟的組，但不排除任何其他元件、整體或步驟，或多個元件、整體或步驟的組。已包含在本說明書中的文獻、條例、材料、裝置、論文等的任何論述僅用於提供用於本
發明內容的目的。不應視為這些內容的任何或全部形成現有技術基礎的一部分或者與本發明相關領域中的公知常識，如在本申請每一個權利要求的優先權日之前在澳大利亞存在的。本發明現在將通過以下實施例進行舉例說明，這些實施例並不用於以任何方式限制本發明。本文引述的所有參考文獻的教導通過引用併入本文。實施例實驗詳述人類C5tf及^yvV、葳的Z蘭在小鼠C5aR基因啟動子的控制下，採用敲除/敲入策略以構建表達人類C5aR但不表達小鼠C5aR的轉基因小鼠。靶載體包含C5aR基因外顯子3的小鼠C57BL/6基因組DNA上遊的3.5kb區域、人類C5aR基因外顯子3編碼序列、小鼠C5aR基因3'未翻譯區域、磷酸葡萄糖激酶啟動子和由loxP部位側懸的新黴素抗性基因以及載體pLOz中的C5aR基因的小鼠基因組DNA下遊的3kb區域(Ozgene,Perth,Australia)。基因組DNA片孚殳利用PCR擴增產生。將該載體轉染到C57BL/6胚胎幹細胞中，並將來自G418抗性克隆的DNA通過DNA印跡進行篩選。XbaI和EcoRV消化的DNA分別與5，和3，探針雜交以鑑定在5，和3，端都具有正確同源性重組事件的克隆體。乂人用正確靶向ES克隆體注射的胚泡產生的嵌合體與C57BL/6站,性交配。通過小鼠尾部基因《且DNA的DNA印跡來i正實人類C5aR基因的種系傳遞。產生了人類C5aR基因UC5W+/+)的小鼠純合子，並且PCR、DNA印跡和FACS染色證實缺少mC5aR。嗜尹遂在勿應為、離改進的如先前所述從健康志願者的外周靜脈血分離人嗜中性粒細胞(Haslett""/.,(1985))。簡而言之，收集到EDTA塗覆的真空採血管(vacutainer)內的血樣以400xg離心15min,然後一誇血漿和血沉棕黃層(buffycoat)去除。隨後1%葡聚糖沉澱30分鐘，白血細胞通過300xg離心5分鐘而成片狀沉澱(pellet)並用PBS清洗。然後將這些細月包在65%帕可爾(percoll)(密度1.093g/ml，AmershamBioscience)的墊層上以500xg離心30分4中。離心後，將嗜中性粒細胞再懸浮在PBS中。利用注射器穿過骨頭通過強制注射具有10%胎牛血清的5mlDMEM(GIBCO)介質而將小鼠嗜中性粒細胞從後腿股骨分離出來。嗜中性粒細胞在菲科帕克(Ficoll-Paque(AmershamBioscience))上通過密度離心而分離。紅血細胞用4氐滲糹爰衝液(155mMNH4C1，10mMKHC03,1mMEDTA)溶解。通過臺盼藍排斥確定細胞存活性並且將嗜中性粒細胞片狀沉澱再懸浮在PBS中。卓2磬絲增孩將C57BL/6小鼠用2xl7表達高水平的hC5aR的L1.2轉染子免疫化(CampbellWa/.(1996))，以2周間隔腹膜內5次然後靜脈內一次。在最後一次靜脈內免疫之後4天，取出脾並利用標準程序將細胞與SP2/0細胞系融合。用lxl(T從/2ClR"+小鼠股骨分離的嗜中性粒細胞以類似方式對C57BL/6小鼠免疫化，靜脈內兩次，腹膜內一次以及最後進行靜脈內免疫。雜交瘤在含有10%Fetalclone(HyClone)和HAT補體(SIGMA)的DMEM(GIBCO)中生長，並取培養物上清用於初始篩選。所選抗體的生產4安比例增大並通過蛋白A或G色譜純化mAb,濃縮，緩衝交換，並除去內毒素。MAb濃度利用小鼠IgGELISA試劑盒(Roche)確定。流式^y應^"量為了評估mAb對轉染細月包或白細月包的反應性，我們-使用了間，接免疫螢光染色和流式細;^包計量法。細^<用PBS清洗一次，並再懸浮在100|al含有2%人血清和0.1%疊氮化鈉(染色緩衝液)、純化抗體或50jal雜交瘤培養物上清液的PBS中。在4。C下20分鐘之後，細胞用染色緩衝液清洗兩次，並再懸浮在50jalFITC-結合的親和純化的F(ab，)2羊抗-小鼠IgG(JacksonImmunoResearchLaboratories)(在染色緩沖液中以1:200稀釋)中。在4。C下孵育20分鐘後，細胞用染色緩衝液清洗兩次並在FACSCalibur(Becton-Dickinson)上進4亍分衝斤，以確定表面表達的水平。石輿4b丙啶染色用來排除死細胞。錄合縱清洗人嗜中性粒細月包並以lxl0々ml再懸浮在結合糹爰衝液(50mMHEPES,pH7.5，lmMCaCl2，5mMMgCl2,以及0.5。/oBSA)中。對於每一個結合反應(終體積為120(^1)，將40pl具有適當量的抗-hC5aRmAb、同種型匹配的對照mAb或未標記的人類C5a(SIGMA)的細胞懸浮液(4x105個細胞)在室溫下孵育15分鐘。以0.4nM的終濃度加入1251標記的人類C5a(PerkinElmer)，並且使反應在室溫下孵育60分鐘。然後收集細胞並用含有150mMNaCl的結合緩衝液清洗3次。然後將細胞轉移到具有MicroScint20閃爍'液的Opti4反(PerkinElmer)並在TopCount(Packard)上i十算i文射活性。每一個樣品一式三4分地進行測定。#浙1.儀器試劑1.1硬體/軟體BIACore2000/BIACore2000控制軟體運行緩衝液HBS-EP(BIACore，#BR-1001-88)再生緩衝液lOOmMHCl傳感器晶片傳感器晶片SA(鏈黴親和素)；BIACore#BR-1003-98)生物素化人類C5aR肽(第二個環)生物素-SGSGLYRVVREEYFPPKVLCGVDYSHDKRRERAVAIV畫OH(SEQIDNO:26)。2.測定程序/儀器設置2.1測定的;危速30|xl/min2.2條件3xl-分鐘注射在50mMNaOH中的1MNaCl的SA晶片(Fcl和Fc2)。2.3才羊品製備在HBS-EP(BIACore，#BR-12001-88)中的稀釋抗體樣品對每一抗體^f吏用以下濃度i)100nMii)50nMiii)25nMiv)12.5nMv)6.25nMvi)3.125nM。2.47於照測定在繼續進4於動力學研究之前測試用於與鏈黴親和素(Fcl)非特異性結合的抗體。使用最高濃度的待在動力學測定中使用的抗體(在HBS-EP中的100nM)。2.5生物素化-肽23(C5aR肽)與SA傳感器晶片Fc2的固定在HBS-EP中製備1|ag/mL的Biot-肽。以手動注射1000RU固定至Fc2。2.6抗體動力學測定利用動力學分4斤嚮導(KineticAnalysisWizard),依照^是示並車lr入如以下概括的分析參數2.6.1輸入要運行的濃度系列即，3.125,6.25,12.5，25,50,100nM。一式兩<分;也運4亍才羊口Oo2.6.2選擇"直接結合測定"2.6.3選擇"濃度系列"2.6.4在對話框中4lT入以下參^t:<吏用Fc2，其中Fcl作為參照流速30^1/分鐘注射時間2分4中穩定時間10分鐘離解時間20分鐘選^J奪"運行如所輸入的樣品"選擇"下一步"。2.6.5再生方法單次注射流速30^1/分鐘再生多爰沖液100mMHCl注射時間2分鐘再生後的穩定時間2分鐘。2.6.6將抗體和再生緩衝液置於指定臺架位置(rackposition)2.6.7運行嚮導(Wizard)。辨遞量艦將新鮮分離的人嗜中性粒細胞如前所述(Ponath爭(1996))在37。C下用Fluo-3AM(分子探針)加載30分鐘。樣品在FACSCalibur流式細胞儀上運行並隨時間測量線性螢光強度。趟化遂熟定將懸浮在趨化性緩衝液(具有50%M199(SIGMA)和2%胎牛血清(HyClone)的RPMI1640)中的人類或小鼠嗜中性粒細胞(l-2xl05個細月包/孔)置於12孔轉移孔^反(12-welltranswellplate)(CorningCostarCo.)的上室中，並允許在30分鐘內越過3(am濾器移動到含有人類或小鼠C5a的下室中。通過60秒計數在FACSCalibur上計算遷移細胞的數量。正前方角度和側面散射口設置成排除石爭片或不相關細月包。《這嵌^vL^/小葳C5fl及的細應殺的詢建利用改進的PCR基重疊延伸技術(Wurch爭1998)構建嵌合人類/小鼠C5a受體。簡而言之，人類或小鼠C5aR基因的不同片段通過PCR擴增。將重疊片段進行組合、變性和再退火併進行第二輪PCR擴增。具有適當限制性酶部位的全長嵌合受體序列在第三個PCR步驟中擴增，並克隆入pcDNA3.1(+)(Invitrogen)以用於表達。才艮據人類C5aR和小鼠C5aR基因序列(基因文庫(Genebank)登錄號分別為M62505和S楊65)設計PCR引物。該引物包含相鄰人類和小鼠C5aR序歹'J(表1)。表1示出了用來構建嵌合小鼠/人類C5a受體的PCR引物序列。紅顏色的序列來自人類C5aR基因，而藍色序列對應於小鼠C5aR。C5aR基因5，端正向引物併入了ATG的Kozak序列(下劃線)上遊和HindIII部位(黑體)。3'反向引物併入了Xbal位點(黑體)以促進克隆入表達載體。tableseeoriginaldocumentpage61^^合成農的4位為、浙在塑4丁(MimotopesPtyLtd,Melbourne,澳大利亞)上以固定形式合成兩組具有N-端生物素和間隔子GSGS的肽。第一組含有所有可能的來自人類C5aR第二胞外環的12個胺基酸(mers)，每一個偏移一個氨基S臾。第二組是序列VREEYFPPKVLC的12個胺基酸，每一個具有由丙氨酸代替的一個殘基。這些肽在200nl60%DMSO開始進4亍重建，隨後在PBS中稀釋以獲得用於直4妄ELISA的10|ig/ml的最終濃度。鏈親和素塗覆的微量滴定板(NUNC)用在200|al體積中的10昭/ml的肽/孔塗覆，並在4°C下孵育過夜。板用ELISA清洗緩衝液(在PBS中的0.05%口土溫20)清;先3次。以2.5ng/ml力口入Mab，並將板在室溫下孵育3h。將在ELISA清洗緩沖液中1:1000稀釋的HRP-結合的兔抗-小鼠IgG抗體用於4企測。板利用TMB(3，3',5,5'-四甲基聯苯胺，SIGMA)顯影並在A54onm處讀數。衷這我'體"^染入丄丄2細應小鼠L1.2細胞在補充有10%胎牛血清(HyClone)的RPMI1640(GIBCO)中生長，並根據製造商的指示利用Lipofectamine2000(Invitrogen)轉染。A/ftx:7V類貝溼'絲^f義^"型如先前所述(Korganow"(1999))從K/BxN關節炎小鼠收集血清。通過在第0天和第2天腹膜內注射150(al血清而在受體小鼠體內誘導實'驗性關節炎，並如所述(Lee""/.(2002))監測疾病發展。每天測定踝厚度和臨床評分。臨床評分通過加合四個爪的評分對每一小鼠進行計算0-正常，l-稍微發紅，2-發紅且有些腫脹，3-發紅且肺脹嚴重。在第-1天和第1天(預防性治療)或第5天(治療性治療)腹膜內注射抗-hC5aR或同種型對照mAb(在PBS中的l畫10mg/kg)。鍵^為、浙KxB/N模型中獨立對照和治療組之間的差異的統計顯著性利用Kruskal-Wallis試-驗，4妄著通過在此之後的利用Dunn's多次比4交衝企-驗的分析而確定。實施例1:利用轉染L1.2細胞產生mAb至C5aR(比較例)我們首先通過利用用於化學誘導物受體的已知方法將mAb產生至hC5aR(Heath"a/.(1997);Qinaa/.(1998);Wu"(1997);Qin，"a/.(1996))。用表達極高水平的hC5aR(80，000受體/細胞)的L1.2細胞(小鼠B細胞淋巴瘤系)免疫小鼠。實施5次融合，並且超過40個不同的mAb鑑定為與hC5aR轉染子特異性反應，但不與表達其他緊密相關化學誘導物受體如CXCR1、CXCR2或其他C5a結合受體C5L2特異性反應(Gerard&(2005))。大量這些mAb抑制125I標i己的人類C5a與hC5aR4爭染子的結合。前導mAb鑑定了，7F3，表明C5a結合的有效抑制(圖1)，在趨化性測定中抑制人嗜中性粒細胞到C5a的趨化性並且阻遏人嗜中性粒細胞中的C5a誘導的鉤通量(悽t據未示出)。實施例2:利用來自^IJUV小鼠的hC5aR的嗜中性粒細胞產生mAb至C5aR在發展有效抗-C5aRmAb的第二方法中，人類C5aR敲入小鼠在小鼠C5aR基因(CM7)處由靶向同源性重組產生。內源性C5aR編碼序列的同時缺失及其用hC5aR編碼序列的替代通過用靶向構建體轉染小鼠胚胎幹細胞(ES)細胞實現(圖2)。從672個中篩選出的兩個ES克隆體^皮鑑定為包含正確輩巴向的hC5aR序列。實現了hC5aR4爭基因的種系4專遞(Germlinetransmission)，並且由這些ES細胞產生5隻嵌合小鼠，從而建立了hC5aR敲入系。利用BL/6Cre刪除品系(deleterstrain)從敲入基因座刪除由loxP部位側懸的PGK-neo基因。通過DNA印跡鑑定用於人類C5aR轉基因UC^/+/+)的小鼠純合子(圖3)。來自這些小鼠的嗜中性粒細胞表示出表達極高水平的hC5aR,如通過FACS染色的抗-hC5aRmAb所判斷的(圖4)。來自野生型小鼠的嗜中性粒細胞未由抗-人類C5aRmAb7F3染色，^旦由4元-小鼠C5aRmAb,20/70強烈染色(Somri"(2003))(圖4)。人類和小鼠C5aR僅共有65%的同源性，但對於發展hC5aR敲入小鼠重要，小鼠和人類C5a以類似親和力結合至人類C5aR(Gerard"a/.(1992))(我們未公開的觀察結果)。來自/2C5i"+小鼠的嗜中性粒細胞以類似方式遷移至人類和小鼠C5a。我們/人一個融合體產生了大量hC5aR特異性mAb。用來自/zC5A廣〃小鼠的嗜中性粒細胞免疫野生型小鼠產生的抗-C5aRmAb都是不同的，因為重鏈可變區的胺基酸序列都是不同的，表明它們起源於單獨的克隆體。配體結合測定表明，這些mAb中的許多表現出1251標記的C5a與人嗜中性粒細胞的結合抑制優於mAb7F3。由hC5aR+〃小鼠產生的抗體表現出對125I-C5a與嗜中性粒細胞的結合的廣譜抑制，範圍為基本上完全抑制(例如，3C5、8G7、7H3)至部分或4艮少4中制，這取決於mAb克隆體(圖5)。與mAb7F3的503pM的ICso相比，最有效的抑制劑(mAb3C5)的ICso為171pM(圖6)。進一步進行竟爭性配體結合研究以測量從hC5aR-轉染的L1.2細胞上的hC5aR用7F3或3C5替代125I-C5a。而且，3C5(EC50:0.021nM)對C5aR表現出比7F3(EC50:0.48nM)顯著更高的親和力(圖7)。實施例3:由mAb結合的C5aR表位的扇^徵hC5aR轉染子和表達hC5aR的小鼠嗜中性粒細胞的使用允許產生有效地識別4壬4可力包外結構域以及依賴於三級結構的表位的mAb。因此，我們確定了hC5aR上的關鍵表位，由我們已產生的阻遏mAb識別。由於這些抗體識別人類C5aR但不識別小鼠C5aR，所以我們構建了一組人類/小鼠C5aR嵌合受體(圖8)。利用重疊延伸PCR方法(Shevchuk"a/.(2004)),用來自小鼠C5aR的同源性區域順序4齊代人類C5aR的單個或多個胞外結構域。嵌合受體在小鼠L1.2細胞中表達並且通過FACS染色確定mAb反應性。具有最有效阻遏活性的所有抗體，包括mAb7F3、3C5、7H3和8G7,結合至hC5aR的第二胞外環(圖9)。為了限定在C5aR第二胞外環上的最有效阻遏抗體的精確接觸殘基，我們利用一組12肽實施了肽掃描分析以及ELISA,每一個有11個胺基酸重疊，覆蓋hC5aR的第二胞外環。mAb3C5和7F3表現出與no.l至no.7的7個肽(包含共有六肽序列179EEYFPP184)的強烈結合(圖10)。利用跨越該肽區域的每一個胺基酸的丙氨酸取代對表位^EEYFPP^進行進一步研究。圖IIA和圖IIB示出了，胺基酸E179、E18G、Y^和F182對於通過mAb7F3、3C5、8G7和7H3的肽識別是關4建的。因此，在由我們針對hC5aR產生的許多mAb中，-使C5a結合或功能的最有效抑制劑都對在C5aR的第二胞外環中的非常特異性區域作圖。實施例4:Mab結合親和力BIACore分析用來確定抗體7F3、3C5、8G7和7H3與肽23(第二月包外環，人類C5aR的殘基173-205—LYRVVREEYFPPKVLCGVDYSHDKRRERAVAIV)的結合親和力。結果示於圖12中並總結在表2中。表2:對於抗-C5aRmAb的範圍的BIACore數據的總結締合(on)速離解(off)速結合親和力結合親禾率ka(鹿s)率kd(1/s)KA(1/M)KD(nM)7H3-N95.95E+059.95E-035.97E+0716.73C53.30E+061.60E-032.10E+090.488G7-M63.70E+065.90E-036.30E+081.67F36.40E+054.50E-041.40E+090.72D7(mlgG2a對照)4.60E+031.90E-042.50E+07406G7(mlgG3對照)1.90E+042.60E-047.20E+0714實施另外的BIACore分析以比較抗體7F3和3C5與肽23在不同條件下的結合親和力。這些另外的分析的結果示於表3中。這些另外的BIACore實驗的條件如在上面"實驗詳述"部分所述，其中有以下改變實驗2:在動力學分析中包含的抗體濃度一100nM-0.78nM;離解20分鐘。實驗3:在動力學分析中包含的抗體濃度一7F3:25nM-0.78nM;3C5:6.25nM-0.78nM;離解5分4中。實驗4:在動力學分析中包含的抗體濃度一7F3:25nM-1.56nM;3C5:6.25nM-0.4nM;締合1分鐘，離解3分鐘。表3:對於7F3和3C5的另外的BIACore數據的總結實驗mAb締合(on)速離解(off)速結合親和力結合親和力率ka(l/Ms)率kd(l/s)KA(1/M)KD(nM)17F32.10E+053.80E-045.40E+081.803C56.80E+055.20E-041.30E+090.7627F32.90E+053.50E-048.10E+081.203C51.50E+067.00E-042.20E+090.4537F33.32E+054.62E-047.19E+081.393C51.06E+061.11E-039.60E+081.0447F32.86E+055.98E-044.79E+082.093C51.03E+061.44E-037.16E+081.40這些結果表明，3C5對於C5aR肽具有比7F3大約1.5倍提高的親和力。實施例5:小鼠類風溼性關節炎模型中的抗-hC5aRmAb的測試表達人類分子的轉基因小鼠的開發是一種在適當動物模型中測試新型人類療法(設計用於人類)的方便的方式。C5aR在小鼠炎性關節炎的病理學中起著重要作用。例如，保護C5aR缺陷型小鼠免患由抗-葡萄糖6-磷酸酯異構酶自身抗體(Ji(2002))或II型月交原mAb(Grant""/.(2002))i秀導的關節炎。對抗-hC5aRmAb測試它們保護或逆轉/zC5i"+小鼠中的實驗性關節炎的發展。將來自關節炎K/BxN小鼠的血清轉移到健康小鼠誘導模擬K/BxN病的關節特異性炎性反應(Kouskoff"(1996);Korganow""/.(1999))。用抗-hC5aRmAb或同種型匹配對照mAb在第-l天和第1天對/C5i"+小鼠進行預處理，並在第0天和第2天腹膜內(i.p.)注射K/BxN血清。在血清轉移後，用對照抗體處理的小鼠表現出具有關節腫"長和炎性滲入的典型臨床關節炎，而用抗-hC5aRmAb處理的小鼠表現出完全沒有炎症(臨床或組織學上)。在/2C5i,+小鼠和對照同窩出生的小鼠之間在發展疾病方面沒有可觀察到的不同(數據未示出)，表明人類C5aR是完全功能性的，因為在KxB/N才莫型中的疾病依賴於C5aR(JiW(2002);Grant"(2002))。更重要地，在疾病誘導後給予抗體5天，我們觀察到建立的炎症的顯著逆轉。mAb對表達hC5aR的小鼠嗜中性粒細胞(3C5和8G7)的作用比mAb7F3持續更長時間(圖13和圖14)。少至1mg/kg的mAb3C5能夠逆轉炎症並提供持續的抑制。本領域才支術人員應當理解，在不背離如廣泛描述的本發明的精神或範圍的情況下，可以對如在具體實施方式中示出的本發明進行許多變形和/或改變。因此，本發明的實施方式在所有方面應視為是舉例i兌明性的而不是限制性的。參考文獻Allegretti,M.etal.TargetingC5a:recentadvancesindrugdiscovery.Curr.Med.Chem.12,217-236(2005)。Campbell,J丄，Qin，S.,Bacon，K.B.,Mackay,CR.&Butcher,E.C,Biologyofchemokineandclassicalchemoattractantreceptors:differentialrequirementsforadhesion-triggeringversuschemotacticresponsesinlymphoidcells.JCe〃Biol134,255-266(1996)。Gerard,C.&Gerard,N.P.C5Aanaphylatoxinanditsseventransmembrane-segmentreceptor.Annu.Rev.Immunol.12,775-808(1994)。Grant,E.P.etal.EssentialrolefortheC5areceptorinregulatingtheeffectorphaseofsynovialinfiltrationandjointdestructioninexperimentalarthritis.J.Exp.Med.196,1461-1471(2002)。Guo，R.F.&Ward,P.A.RoleofC5aininflammatoryresponses.Annu.Rev.Immunol.23,821-852(2005)。Haslett,C，Guthrie,L.A.,Kopaniak,M.M"Johnston,R.B,,Jr.&Henson,P.M.Modulationofmultipleneutrophilfunctionsbypreparativemethodsortraceconcentrationsofbacteriallipopolysaccharide.AmJPathol119,101-110(1985)。Heath,H.etal.Chemokinereceptorusagebyhumaneosinophils.TheimportanceofCCR3demonstratedusinganantagonisticmonoclonalantibody.J.Clin.Invest.99,178-184(1997)。Ji,H.etal.Arthritiscriticallydependentoninnateimmunesystemplayers.Immunity16,157-168(2002)。Kaneko，Y.,etal.,AntagonisticpeptidesagainsthumananaphylatoxinC5a,Immunology,1995.86(1):p.149-54。Klco，J.M.etalNatStructMolBiol.12:320-326(2005)。Konteatis,Z,D.,etal.，DevelopmentofC5areceptorantagonists。Differentiallossoffunctionalresponses.JournalofImmunol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體作為藥劑的應用。31.—種用於診斷受試者體內涉及白細胞或嗜中性粒細胞移行的紊亂的方法，所述方法包括使從所述受試者獲得的樣品與本發明的結合物在體外接觸，以及檢測所述結合物與所述樣品之間的免疫特異性結合。32.根據權利要求1至22中任一項所述的抗體在製備用於治療涉及白細胞或嗜中性粒細胞移行的紊亂的藥劑中的應用。全文摘要本發明涉及改進的抗體，其結合至C5aR並且用於診斷和治療方法中。文檔編號A61K39/395GK101506237SQ200780031002公開日2009年8月12日申請日期2007年8月22日優先權日2006年8月22日發明者查爾斯·雷伊·麥凱申請人:G2炎症私人有限公司