利用酸性蛋白酶酶解鯊魚皮膠原蛋白製備的抗氧化多肽的製作方法

2023-04-24 21:59:26

專利名稱：利用酸性蛋白酶酶解鯊魚皮膠原蛋白製備的抗氧化多肽的製作方法
技術領域：
本發明提供了一種抗氧化多肽及其製備方法，更具體地涉及了一種利用酸性蛋白酶酶解鯊魚皮膠原蛋白製備的抗氧化多肽，屬於生物技術領域。
背景技術：
生物分子的氧化是一個自由基介導的過程，它會對食品和生物系統造成許多不利的影響。在好氧器官內，與動脈硬化、癌症等多中疾病相關的游離自由基會不可避免地隨著氧代謝的過程而產生。在食品中，食品營養成分的氧化會產生過氧化物，其不僅會影響食品的營養價值，引起食品品質下降，嚴重的甚至還會導致攝入者的身體發生疾病。因此，尋找安全的抗氧化劑以抑制過氧化物產生一直是生化營養學的研究熱點。由於BHT、TBHQ等化學合成抗氧化劑比天然抗氧化劑具有更好的效果和更便宜的價格，因此其已經被廣泛應用於食品行業中。但是，目前有研究發現合成抗氧化劑對人體肝、脾、肺等器官具有蓄積性致癌作用，從而引起了人們對其安全性的擔憂，並且開始逐漸限制其在食品中的使用。於是人們把目光轉向天然抗氧化劑。α -生育酚是一種被最普遍使用的天然抗氧化劑，它能有效保持食品中油脂的穩定性，但是卻不利於食品保存。因此，我們有必要尋找一種其它來源的安全的天然抗氧化劑。現有的研究發現，很多不同來源的水解蛋白都具有一定的抗氧化能力，如酪蛋白、 大豆蛋白、牛血清白蛋白、卵白蛋白、油料種子蛋白、小麥醇溶蛋白和玉米蛋白等的水解物都具有一定的抗氧化性。雖然多肽發揮抗氧化活性的機理還不是特別清楚，但是有報導稱某些芳香族胺基酸和組氨酸起到了重要作用。國內外的研究發現，膠原蛋白來源的肽比其它蛋白源肽具有更高效率的抗氧化性。而魚皮中膠原蛋白佔總蛋白質的80%以上，從獲得膠原蛋白的效率來看，魚皮是獲得膠原蛋白的重要來源。明膠中富含疏水性胺基酸以及其它與脂類具有較高親和性並且可以形成穩定乳化體系的胺基酸，故被認為是製備抗氧化多肽的良好原料。因此，如何從明膠中獲得具有特定胺基酸序列的高效抗氧化多肽就成為迫切的研究方向。

發明內容
為了解決上述問題，本發明提供了一種利用酸性蛋白酶酶解鯊魚皮膠原蛋白製備的的抗氧化多肽，使抗氧化活性得以高效地實現。本發明的一種抗氧化多肽，胺基酸序列為Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Ala-Gly-Ala-Al a_Gly。本發明還提供了一種抗氧化多肽的製備方法，以鯊魚皮為原料提取膠原蛋白，然後採用酸性蛋白酶對其進行酶解，分離純化、冷凍乾燥得到抗氧化多肽；所述酶解條件為 PH為3. O、溫度50°C、酶解時間為5h、酶-底物配比為3000U/g ；所述酶為酸性蛋白酶。所述分離純化的手段包括超濾、SP-Sephadex C_25離子交換色譜、Sephadex G-50分子篩和 RP-HPLC反相高效液相色譜。
3
所述分離純化的具體步驟為
(1)酶解產物首先利用分子量截留範圍為SOOODa和3500Da的超濾膜對酶解產物進行超濾分離，將其分為3個分子量範圍不同的組分，分別為分子量大於SOOODa的組分、分子量介於3500Da和SOOODa的組分、分子量小於3500Da的組分；(2)收集具有最佳抗氧化活性的組分，再用SP-S^hadex C_25陽離子交換色譜進行分離，上樣後洗去未吸附組分，再以含0 0. 35mol/L NaCl的0. 02mol/L、pH4. 0乙酸-乙酸鈉緩衝液進行線性梯度洗脫， 流速為0. 5ml/min，在225nm下進行測量，測定各吸收峰對應的洗脫組分的抗氧化活性；(3) 收集具有最佳抗氧化活性的峰，再用kphadex G-50凝膠色譜進行分離，洗脫液為去離子水，流速為0. 5ml/min，在225nm下進行測量，測定各吸收峰對應的洗脫組分的抗氧化活性； (4)收集具有最佳抗氧化活性的峰，再利RP-HPLC反相高效液相色譜進行進一步的分離，反相HPLC的分離以含0. 1% (體積)三氟乙酸的濃度梯度為5% 40%的乙腈溶液作為洗脫液進行線性洗脫，所用色譜柱為Gemini 5μ C18，上樣量為100 μ L，流速為lmL/min，檢測波長為215nm，測定各吸收峰對應的洗脫液的抗氧化活性，收集得到抗氧化活性最高的三個組分；(5)利用RP-HPLC反相高效液相色譜對三個組分進行鑑定，以含IOmM乙酸銨的濃度梯度為5% 27. 5%的乙腈溶液作為洗脫液進行線性洗脫，所用色譜柱為Gemini 5μ C18，上樣量為20 μ L，流速為lml/min，檢測波長為215nm，三個組分均分別分離得到單一的峰，即得到三個純的活性組分；利用蛋白質固相序列分析儀鑑定三個肽的胺基酸序列，得到本發明的抗氧化多肽的胺基酸序列為Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Ala-Gly-Ala-Ala-Gly。為了實現上述方案，本發明採取的具體步驟如下 (1)膠原蛋白的提取
本發明所採用的鯊魚皮為市售。鯊魚皮經水洗3次以除雜，然後搗碎(長度<lcm)，再用0. Imol/L的NaOH溶液(料液比w/v=l :6)在4°C下浸泡Mh。水洗至中性後浙幹水分，再加入0. 03w%的HCl溶液(料液比w/v =1:6)，在4°〇下浸泡41!後再水洗至中性。最後，加入蒸餾水(料液比w/v =1:6), 60°C水浴6h，經過濾、濃縮和冷凍乾燥後得到膠原蛋白。(2)膠原蛋白的酶解
酶購自福州福大百特生物試劑公司(中國·福州)。採用酸性蛋白酶酶解鯊魚皮膠原蛋白，蛋白濃度為30mg/ml，酶解條件取pH為 3.0、溫度501、酶解時間為5h、酶與底物比為(3000U/g)，用2M HCl調節pH穩定，水解5h 後，沸水浴中滅酶15min，然後迅速冷卻至室溫，置於離心機中，以4000r/min離心15min，取上清液備用。(3)酶解產物的分離、純化
將得到的酶解產物利用分子量截留範圍為SOOODa和3500Da的超濾膜對酶解產物進行超濾分離，將其分為3個分子量範圍不同的組分，分別為分子量大於SOOODa的組分、分子量介於3500Da和SOOODa的組分、分子量小於3500Da的組分；收集具有最佳抗氧化活性的組分，再經過SP-S印hadex C_25陽離子交換色譜(長20cm，直徑1. 6cm)進行分離，以含 0 0. 35mol/L NaCl的0. 02mol/L、pH4. 0乙酸-乙酸鈉緩衝液進行線性梯度洗脫，流速為 0. 5ml/min ；收集具有最佳抗氧化活性的峰，再用kphadex G-50 (長100cm，直徑2. 6cm)凝膠色譜進行分離，洗脫液為去離子水，流速為0. 5ml/min，洗脫峰在225nm下進行測量；收集具有最佳抗氧化活性的峰，利用RP-HPLC反相高效液相色譜進行再進一步的分離，反相 HPLC的分離以含0. 1%三氟乙酸(體積)的濃度梯度為5% 40%的乙腈溶液進行梯度洗脫， 所用色譜柱為Gemini 5μ C18，上樣量為100 μ L，流速為lml/min，檢測波長為215nm，收集得到抗氧化活性最高的三個組分。(4)抗氧化多肽的鑑定
利用RP-HPLC反相高效液相色譜對三個組分進行鑑定，以含IOmM乙酸銨的濃度梯度為 5% 27. 5%的乙腈溶液作為洗脫液進行線性洗脫，所用色譜柱為Gemini 5μ C18，上樣量為20 μ L，流速為lml/min，檢測波長為215nm，三個組分均分別分離得到單一的峰，說明得到三個純的活性組分，進一步鑑定肽的胺基酸序列。(5)抗氧化活性的測試
利用DPPH( 1，l-Diphenyl-2-picryl-hydrazyl)自由基清除率測定法研究抗氧化多肽。 配製濃度為1 X 10_5mOl/L的DPPH乙醇溶液，避光保存。將aiil，0. ImM的DPPH無水乙醇溶液加入到含有2mL不同酶解樣品的潔淨試管中，混勻。室溫下放置30min後，於517 nm處測定吸光度，吸光值越小，表明自由基清除能力越強。清除率(%)=〔1-(Ai- Aj)/A0) X 100%
式中，Atl為未加樣品的DPPH溶液的吸光值即2 mL,0. ImM的DPPH無水乙醇溶液+2ml的樣品溶劑，空白對照的吸光值Ai為加完樣品後的DPPH溶液的吸光值即aiil，0. ImM的DPPH 無水乙醇溶液+2mL的樣品的吸光值；Α」為DPPH溶液的溶劑和樣品混合後的吸光值即2ml 的無水乙醇+2 ml的樣品的吸光值。(6)胺基酸序列測定
利用蛋白質固相序列分析儀(Applied Biosystems Model 476A, Perkin Elmer Co. ΜΑ, U. S. Α)測定本發明的抗氧化多肽的胺基酸全序列為Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Ala-Gly-Ala-Ala-Gly，分子量為 724 Da。本發明透過目前天然抗氧化劑的缺陷以及公眾對人工合成抗氧化劑的憂慮，立足於尋找一種天然高效的抗氧化劑，以來自於鯊魚皮的膠原蛋白為出發點，著眼於通過酸性蛋白酶的切割條件控制，切割為具有特定的肽鏈長度和結構域組成的活性多肽，而使抗氧化活性得以高效地實現。本發明改變了現有抗氧化劑的提取與運用的思路和方法，消除了人工合成抗氧化劑所可能引起的副作用，是一種天然抗氧化劑，可以取代傳統的合成食品抗氧化劑。並且本發明還改善了我國對水產動物皮中膠原蛋白利用率偏低的情況，既可解決大量水產資源的再利用問題，又能解除消費者對抗氧化劑在食品安全方面的顧慮，對科技、經濟和食品業的發展將具有深遠的意義。


圖1為膠原蛋白酶解物經超濾分離後的DPPH自由基的清除效果； 圖2為膠原蛋白酶解物的SP-S^hadex C_25洗脫圖3為SP-S^hadex C-25四個色譜分離組分對DPPH自由基的清除效果； 圖4為組分B的kpadex G-50洗脫圖； 圖5為kpadex G-50洗脫組分對DPPH自由基的清除效果；
5CN 102219829 A
說明書
4/5頁
圖6為組分B- III的RP-HPLC洗脫圖7為B- III的RP-HPLC純化組分的DPPH自由基清除活性；
圖8為抗氧化多肽B- III a的RP-HPLC鑑定圖9為抗氧化多肽B- III c的RP-HPLC鑑定圖10為抗氧化多肽B- III d的RP-HPLC鑑定圖11為純化的抗氧化多肽B-III a清除DPPH自由基的量-效關係曲線。圖12為純化的抗氧化多肽B-III a清除ABTS自由基的量-效關係曲線。圖13為純化的抗氧化多肽B-III a抑制狗2+誘導卵黃脂蛋白多不飽和脂肪酸過氧化反應的量-效關係曲線。
具體實施例方式本發明的抗氧化多肽的胺基酸序列為Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Ala-Gly-Ala-Ala-G ly。製備方法如下
以鯊魚皮為原料提取膠原蛋白，然後使用酸性蛋白酶對其進行酶解，蛋白濃度為30mg/ ml，酶解條件是pH為3. O、溫度是50°C、酶解時間為5小時、酶-底物配比為3000U/g ；將得到的酶解產物利用分子量截留範圍為SOOODa和3500Da的超濾膜對酶解產物進行超濾分離，將其分為3個分子量範圍不同的組分，分別為分子量大於SOOODa的組分、分子量介於3500Da和SOOODa的組分、分子量小於3500Da的組分；收集具有最佳抗氧化活性的組分，再經過SP-S印hadex C_25陽離子交換色譜(長20cm，直徑1. 6cm)進行分離，以含0 0. 35mol/L NaCl的0. 02mol/L、pH4. 0乙酸-乙酸鈉緩衝液進行線性梯度洗脫，流速為 0. 5ml/min，在225nm下進行測量；收集具有最佳抗氧化活性的峰，再用kphadex G-50 (長 100cm,直徑2. 6cm)凝膠色譜進行分離，洗脫液為去離子水，流速為0. 5ml/min,洗脫峰在 225nm下進行測量；收集具有最佳抗氧化活性的峰，利用RP-HPLC反相高效液相色譜進行再進一步的分離，反相HPLC的分離以含0. 1%三氟乙酸(體積)的濃度梯度為5% 40%的乙腈溶液進行梯度洗脫，所用色譜柱為Gemini 5 μ C18，上樣量為100 μ L，流速為lml/min， 檢測波長為215nm，收集得到抗氧化活性最高的三個組分。經RP-HPLC反相高效液相色譜進一步鑑定，得到三個純的活性組分。本發明採用的儀器、檢測手段如下
本發明應用超濾、SP-S印hadex C_25離子交換色譜、kphadex G_50凝膠過濾色譜、 RP-HPLC反相高效液相色譜等多種分離純化手段，實現具有顯著活性的抗氧化多肽的高效分離純化。利用蛋白質固相測序儀(AppliedBiosystems Model 476A, Perkin Elmer Co. ΜΑ, U. S. Α)測定純化後的抗氧化多肽的胺基酸序列。為了進一步了解本發明內容、特點及功效，茲例舉以下實施例 實施例1
稱取7. 5克鯊魚皮膠原蛋白用去離子水溶解並定容至250ml，然後用2mol/L HCl將其 PH調節至3. 0。先將該溶液水浴加熱到50°C，接著再按照酶-底物配比為3000U/g的比例加入相應量的酶，酶解時間為5小時。接著在沸水浴中滅酶15分鐘，冷卻後再4000rpm離
6心15分鐘。收集上清液備用。將上清液用分子量截留範圍為SOOODa和3500Da的超濾膜進行超濾分離，將其分為3個分子量範圍不同的組分，分別為分子量大於SOOODa的組分、分子量介於3500Da和 SOOODa的組分、分子量小於3500Da的組分，並測定其抗氧化活性(如圖1所示)。可以看出， 分子量小於3500Da的組分具有最好的抗氧化活性。收集分子量小於3500Da的組分，用SP-S印hadex C-25陽離子交換色譜(長20cm， 直徑1. 6cm)進行再進一步的分離，以含0 0. 35mol/L NaCl的0. 02mol/L、pH4. 0乙酸-乙酸鈉緩衝液進行線性梯度洗脫，流速為0. 5ml/min，洗脫峰在225nm下進行測量，見圖2。收集各峰並測定抗氧化活性(如圖3所示)。可以看出，組分B具有最好的抗氧化活性。將分離出來組分B用kpadex G-50凝膠過濾色譜(長20cm，直徑1. 6cm)再進行分離，洗脫液為去離子水，流速為0. 5ml/min，洗脫峰在225nm下進行測量，見圖4。收集各峰並測定抗氧化活性(如圖5所示)。可以看出，組分B-III具有最好的抗氧化活性。將分離出來的組分B- III利用RP-HPLC反相高效液相色譜進行再進一步的分離(如圖6所示)，洗脫液為含0. 1%三氟乙酸(體積)的濃度梯度為5% 40%的乙腈溶液，所用色譜柱為Gemini 5μ C18，上樣量為100 μ L，流速為lml/min,檢測波長為215nm,測定各吸收峰對應的洗脫液的抗氧化活性(如圖7所示)，收集得到抗氧化活性最高的三個組分，分別為 B- III a、B- III c 禾口 B- III d。利用RP-HPLC反相高效液相色譜對分離得到的三個抗氧化多肽的純度進行鑑定， 以含10mM/L乙酸銨的濃度梯度為5% 27. 5%的乙腈溶液作為洗脫液進行線性梯度洗脫， 所用色譜柱為Gemini 5μ C18，上樣量為20 μ L，流速為lml/min，檢測波長為215nm，結果顯示，其為單一的峰，說明其已經達到較高純度(如圖8、圖9和圖10所示)。純化後的抗氧化多肽B-III a具有很強的抗氧化能力，由圖11、圖12和圖13可以看出，它清除DPPH自由基、ABTS自由基以及抑制脂質過氧化反應的半抑制濃度分別為 63. 56mg/ml、82. 34mg/ml 禾口 183. 13mg/ml。利用蛋白質固相測序儀(AppliedBiosystems Model 476A, Perkin Elmer Co. ΜΑ, U. S. Α)測定純化後的抗氧化多肽B-III a的胺基酸序列。得到其胺基酸全序列為Gl y-Pro-Ala-Gly-Pro-Ala-Gly-Ala-Ala-Gly (分子量為 724 Da)。
權利要求
1.一種抗氧化多肽，其特徵在於所述抗氧化多肽的胺基酸序列為Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Ala-Gly-Ala-Ala-Gly。
2.一種抗氧化多肽的製備方法，其特徵在於以鯊魚皮為原料提取膠原蛋白，然後採用酸性蛋白酶對其進行酶解，分離純化、冷凍乾燥得到抗氧化多肽；所述酶解條件為PH為 3. O、溫度50°C、酶解時間為證、酶-底物配比為3000U/g;所述酶為酸性蛋白酶。
3.根據權利要求2所述的抗氧化多肽的製備方法，其特徵在於所述分離純化的手段包括超濾、SP-kphadex C_25離子交換色譜、S^hadex G-50分子篩和RP-HPLC反相高效液相色譜。
4.根據權利3要求所述的抗氧化多肽的製備方法，其特徵在於所述分離純化的具體步驟為(1)酶解產物首先利用分子量截留範圍為SOOODa和3500Da的超濾膜對酶解產物進行超濾分離，將其分為3個分子量範圍不同的組分，分別為分子量大於SOOODa的組分、分子量介於3500Da和SOOODa的組分、分子量小於3500Da的組分；(2)收集具有最佳抗氧化活性的組分，再用SP-S^hadex C_25陽離子交換色譜進行分離，上樣後洗去未吸附組分，再以含0 0. 35mol/L NaCl的0. 02mol/L、pH4. 0乙酸-乙酸鈉緩衝液進行線性梯度洗脫， 流速為0. 5ml/min，在225nm下進行測量，測定各吸收峰對應的洗脫組分的抗氧化活性；(3) 收集具有最佳抗氧化活性的峰，再用kphadex G-50凝膠色譜進行分離，洗脫液為去離子水，流速為0. 5ml/min，在225nm下進行測量，測定各吸收峰對應的洗脫組分的抗氧化活性； (4)收集具有最佳抗氧化活性的峰，再利RP-HPLC反相高效液相色譜進行進一步的分離，反相HPLC的分離以含0. 1% (體積)三氟乙酸的濃度梯度為5% 40%的乙腈溶液作為洗脫液進行線性洗脫，所用色譜柱為Gemini 5μ C18，上樣量為100 μ L，流速為lmL/min，檢測波長為215nm，測定各吸收峰對應的洗脫液的抗氧化活性，收集得到抗氧化活性最高的三個組分；(5)利用RP-HPLC反相高效液相色譜對三個組分進行鑑定，以含IOmM乙酸銨的濃度梯度為5% 27. 5%的乙腈溶液作為洗脫液進行線性洗脫，所用色譜柱為Gemini 5μ C18，上樣量為20 μ L，流速為lml/min，檢測波長為215nm，三個組分均分別分離得到單一的峰，即得到三個純的活性組分；利用蛋白質固相序列分析儀鑑定三個肽的胺基酸序列，得到如權利要求1所述的抗氧化多肽的胺基酸序列為Aly-Pro-Ala-Gly-Pro-Ala-Gly-Ala-Ala-Gl 1。
全文摘要
本發明提供了一種利用酸性蛋白酶酶解鯊魚皮膠原蛋白製備的抗氧化多肽，以鯊魚皮膠原蛋白為原料，通過對酸性蛋白酶的酶解，分離純化得到特異性抗氧化多肽，其胺基酸全序列為Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Ala-Gly-Ala-Ala-Gly。本發明消除了天然抗氧化劑所具有的缺陷並且消除了公眾對人工合成抗氧化劑的憂慮，為開發基於食品源的抗氧化多肽以及探索其在食品、醫學上的廣泛應用奠定理論基礎。
文檔編號C07K1/34GK102219829SQ20111012824
公開日2011年10月19日 申請日期2011年5月18日 優先權日2011年5月18日
發明者林月萍, 江勇, 汪少芸, 王軍, 祝貝貝, 趙珺, 趙立娜 申請人:福州大學