微生物法在有機相中合成沒食子酸丙酯的方法
2023-04-25 06:29:31 2
專利名稱：微生物法在有機相中合成沒食子酸丙酯的方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，尤其涉及一種微生物法在有機相中合成沒食子酸丙酯的方法。
背景技術：
生物轉化屬於化學和生物學的交叉領域，生物催化劑和反應介質是生物轉化的兩大要素。生物催化劑工程運用發酵技術或從動植物中分離提取獲得大量的酶，其研究經歷了自由酶、固定化酶和細胞的過程；介質工程則為生物催化劑作用過程提供理想的溶劑體系，傳統上以水為溶劑體系，自Klibanov等開創有機相酶催化反應以來，有機溶劑介質體系得到了廣泛的研究。
單寧酶全稱為單寧醯基水解酶(tannin acyl hydrolase，EC 3.1.1.20)，是一種細胞膜結合酶，可分泌到胞外，能水解水解性單寧和沒食子酸酯類中的酯鍵和縮酚酸鍵，從而生成沒食子酸和葡萄糖及相應的醇類化合物。單寧酶主要產生於真菌類麴黴屬(Aspergillus)和青黴屬(Penicillium)的微生物，尤其是麴黴屬的黑麴黴(Aspergillus.niger)和米麴黴(Aspergillus oryzae)。另外，在酵母、細菌和植物中也有產單寧酶的研究報導。
沒食子酸酯類是沒食子酸的重要衍生物之一，能促進纖維蛋白和血栓的溶解、擴張血管、增加冠動脈血流量及有效抑制血小板的凝集，廣泛地應用於治療心腦血管疾病。同時，沒食子酸酯類還可清除體內的氧自由基，對炎症、病毒性疾病、細菌感染性疾病、胃潰瘍、輻射損傷、過敏及老年性痴呆等均有一定的治療和防治作用，在醫藥領域中具有廣泛而重要的應用前景。其中沒食子酸丙酯(propyl gallate，PG)表現的尤為突出。PG是FAO/WHO組織批准的油溶性合成食品抗氧化劑，對人體無任何毒副作用，是國際上通用的食品抗氧化劑。PG的醫藥商品名為「通脈酯」，是治療心腦血管疾病的一類新藥，具有抗血小板聚集、增強纖維蛋白和血栓溶解、擴張血管及增加冠動脈血流量等療效。同時它還能清除體內氧自由基、預防乳腺癌，對Lrewis肺癌具有抑制和抗轉移作用。
目前，PG是由沒食子酸和丙醇酯化反應而成，合成方法可分為化學合成法和生物合成法，在工業化生產領域中化學合成法一直是佔主導地位。由於沒食子酸中苯環及其上的羧基和兩個酚羥基形成共軛大π鍵，其反應活化能很高，因此其酯化反應所需的條件較為苛刻。鑑於此，化學合成法一般是以離子交換樹脂、濃硫酸或固體酸等作為催化劑，將沒食子酸與過量的丙醇回流脫水製備成PG。該生產過程不僅製備時間長、產率不高，而且濃硫酸具有強氧化性，易使具有鄰二酚結構的沒食子酸發生氧化，生成大量的副反應產物，且還會嚴重腐蝕生產設備。而相比之下，採用生物合成法酯化合成PG就容易得多，而且反應條件溫和，不存在副反應等諸多問題。1952年Toch和Hensler首次在水相中利用單寧酶(tannase EC 3.1.1.20)催化合成沒食子酸甲酯和乙酯，開創了生物合成桔酸酯的先河.
隨著20世紀70～80年代中有機相酶(細胞)促反應研究的蓬勃興起，迄今為止，該研究領域中已積累大量的研究成果和建立起較為完善的理論基礎，並顯示出水相酶促反應所無法比擬的優勢，尤其是有機相中反應平衡點可向合成方向移動，以及依賴於水的副反應(水解反應)顯著減少，這無疑為有機相中進行合成PG的酯化反應創造條件。1985年，Weetal首次用固定的單寧酶成功催化合成沒食子酸丙酯和沒食子酸戊酯，168h酯化率分別為41.4％和78％，同年Weetal取得了沒食子酸丙酯合成的專利，1989年Gaathon等利用反膠束固定化單寧酶合成沒食子酸丙酯，90h的產率為51％，但是由於反膠束物化性能不穩定，很難放大和工業化生產。至今對於生物法合成桔酸酯的研究仍在不斷探索中。
發明內容
本發明的目的是提供一種微生物法在有機相中合成沒食子酸丙酯的方法。
方法的步驟如下1)將黑麴黴孢子培養得到的菌絲體收集過濾，用0.85％(w/v)NaCl溶液衝洗，在0.01～0.2mol/L pH 2.2～5.8緩衝溶液中平衡後過濾，得到含水量為60～80％(w/w)的菌絲體。所述的緩衝溶液pH2.2～3.6的為甘氨酸—鹽酸緩衝液，pH3.6～5.8的為乙酸—乙酸鈉緩衝液(配製方法見《生物化學實驗原理和方法》李建武等編，北京大學出版社，1994年，p404)。
2)在有機溶劑苯體系中，每升有機溶劑中加入0.06～0.1L的正丙醇和4～10mmol的沒食子酸，再在每升有機溶劑中加入20～50g的上述黑麴黴菌絲體，在攪拌速度150～220rpm和反應溫度20～50℃下進行生物催化反應，反應時間為48～96h。
上述的黑麴黴孢子培養方法為將CGMCC保藏號No.3.315的黑麴黴(Aspergillus niger)接種到黑麴黴菌種保藏培養基上，在30℃下培養5天，然後將萌發的黑麴黴孢子接種到300L的發酵培養基中，其中孢子濃度為105個/ml，在攪拌速度180rpm和培養溫度30℃條件下培養72h。
黑麴黴菌種保藏培養基為(單位％(w/v))單寧酸0.5％，蛋白腖0.1％，K2HPO40.1％，NaH2PO40.1％，MgSO4·7H2O 0.05％，瓊脂6％。
黑麴黴發酵培養基為(單位％(w/v))單寧酸1.0～4.0％，可溶性澱粉0.2～0.4％，蔗糖0.3～0.8％，葡萄糖0.1～0.3％，豆餅粉0.5～1.0％，NH4NO30.1％，K2HPO40.1％，KCl 0.05％，MgSO4·7H2O 0.05％，CaCl20.02％，MnCl2·6H2O 0.04％，FeSO40.001％，pH 6.0。
本發明的優點文獻報導的方法均使用游離單寧酶或者固定化單寧酶作為生物催化劑，但是麴黴屬的單寧酶為胞內酶，分布在真菌的細胞壁與細胞膜之間，結合得非常牢固，相當於固定在細胞中，導致單寧酶分離純化過程中破壁取酶非常困難，而本方法建立了黑麴黴產單寧酶的發酵培養基，利用該產單寧酶的黑麴黴菌絲體作為生物催化劑，不使用傳統的自由酶或者固定化酶，省去了酶的分離純化過程，而且完整細胞具有對有機溶劑的耐受性更高，易於回收等優點，因此大大降低了生產成本；通過有機介質工程，將黑麴黴菌絲體加入有機介質體系中催化酯化反應，在溫和的反應條件下，沒食子酸丙酯反應產率達到30～60％。至今國內外仍未有文獻報導直接利用產單寧酶的黑麴黴菌絲體作為催化劑在有機介質體系中合成沒食子酸丙酯。
具體實施例方式
實施例1將CGMCC保藏號No.3.315的黑麴黴(Aspergillus niger)接種到黑麴黴菌種保藏培養基上，在30℃下培養5天，然後將萌發的黑麴黴孢子接種到300L的發酵培養基中，其中孢子濃度為105個/ml，在攪拌速度180rpm和培養溫度30℃條件下培養72h。
黑麴黴菌種保藏培養基為(單位％(w/v))單寧酸0.5％，蛋白腖0.1％，K2HPO40.1％，NaH2PO40.1％，MgSO4·7H2O 0.05％，瓊脂6％。
黑麴黴發酵培養基為(單位％(w/v))單寧酸1.0％，可溶性澱粉0.2％，蔗糖0.8％，葡萄糖0.3％，豆餅粉0.8％，NH4NO30.1％，K2HPO40.1％，KCl 0.05％，MgSO4·7H2O 0.05％，CaCl20.02％，MnCl2·6H2O 0.04％，FeSO40.001％，pH 6.0。
將上述培養72h的菌絲體收集過濾，用0.85％(w/v)NaCl溶液衝洗，在0.01mol/L pH 3.6乙酸—乙酸鈉緩衝溶液中平衡1小時後過濾，得到含水量為80％(w/w)的菌絲體。將300L有機溶劑苯加入攪拌式反應器中，然後在其中加入30L正丙醇溶液、3mol沒食子酸，15kg菌絲體，然後在反應溫度45℃，攪拌速度220rpm條件下反應72小時，最終沒食子酸丙酯產率32％。
實施例2將CGMCC保藏號No.3.315的黑麴黴(Aspergillus niger)接種到黑麴黴菌種保藏培養基上，在30℃下培養5天，然後將萌發的黑麴黴孢子接種到300L的發酵培養基中，其中孢子濃度為105個/ml，在攪拌速度180rpm和培養溫度30℃條件下培養72h。
黑麴黴菌種保藏培養基為(單位％(w/v))單寧酸0.5％，蛋白腖0.1％，K2HPO40.1％，NaH2PO40.1％，MgSO4·7H2O 0.05％，瓊脂6％。
黑麴黴發酵培養基為(單位％(w/v))單寧酸4.0％，可溶性澱粉0.4％，蔗糖0.3％，葡萄糖0.1％，豆餅粉0.8％，NH4NO30.1％，K2HPO40.1％，KCl 0.05％，MgSO4·7H2O 0.05％，CaCl20.02％，MnCl2·6H2O 0.04％，FeSO40.001％，pH 6.0。
將上述培養72h的菌絲體收集過濾，用0.85％NaCl(w/v)溶液衝洗，在0.1mol/L pH 2.6甘氨酸—鹽酸緩衝溶液中平衡1小時後過濾，得到含水量為80％(w/w)的菌絲體。將100L有機溶劑苯加入攪拌式反應器中，然後在其中加入6L正丙醇溶液、0.4mol沒食子酸，2kg菌絲體，然後在反應溫度20℃，攪拌速度150rpm條件下反應48小時，最終沒食子酸丙酯產率41％。
實施例3將CGMCC保藏號No.3.315的黑麴黴(Aspergillus niger)接種到黑麴黴菌種保藏培養基上，在30℃下培養5天，然後將萌發的黑麴黴孢子接種到300L的發酵培養基中，其中孢子濃度為105個/ml，在攪拌速度180rpm和培養溫度30℃條件下培養72h。
黑麴黴菌種保藏培養基為(單位％(w/v))單寧酸0.5％，蛋白腖0.1％，K2HPO40.1％，NaH2PO40.1％，MgSO4·7H2O 0.05％，瓊脂6％。
黑麴黴發酵培養基為(單位％(w/v))單寧酸2.0％，可溶性澱粉0.3％，蔗糖0.5％，葡萄糖0.2％，豆餅粉0.9％，NH4NO30.1％，K2HPO40.1％，KCl 0.05％，MgSO4·7H2O 0.05％，CaCl20.02％，MnCl2·6H2O 0.04％，FeSO40.001％，pH 6.0。
將上述培養72h的菌絲體收集過濾，用0.85％NaCl(w/v)溶液衝洗，在0.2mol/L pH 2.2甘氨酸—鹽酸緩衝溶液中平衡1小時後過濾，得到含水量為60％(w/w)的菌絲體。將200L有機溶劑苯加入攪拌式反應器中，然後在其中加入13L正丙醇溶液、1.0mol沒食子酸，6kg菌絲體，然後在反應溫度40℃，攪拌速度180rpm條件下反應72小時，最終沒食子酸丙酯產率58％。
實施例4將CGMCC保藏號No.3.315的黑麴黴(Aspergillus niger)接種到黑麴黴菌種保藏培養基上，在30℃下培養5天，然後將萌發的黑麴黴孢子接種到300L的發酵培養基中，其中孢子濃度為105個/ml，在攪拌速度180rpm和培養溫度30℃條件下培養72h。
黑麴黴菌種保藏培養基為(單位％(w/v))單寧酸0.5％，蛋白腖0.1％，K2HPO40.1％，NaH2PO40.1％，MgSO4·7H2O 0.05％，瓊脂6％。
黑麴黴發酵培養基為(單位％(w/v))單寧酸3.0％，可溶性澱粉0.3％，蔗糖0.6％，葡萄糖0.3％，豆餅粉0.5％，NH4NO30.1％，K2HPO40.1％，KCl 0.05％，MgSO4·7H2O 0.05％，CaCl20.02％，MnCl2·6H2O 0.04％，FeSO40.001％，pH 6.0。
將上述培養72h的菌絲體收集過濾，用0.85％NaCl(w/v)溶液衝洗，在0.1mol/L pH 5.8乙酸—乙酸鈉緩衝溶液中平衡1小時後過濾，得到含水量為70％(w/w)的菌絲體。將50L有機溶劑苯加入攪拌式反應器中，然後在其中加入4L正丙醇溶液、0.2mol沒食子酸，2kg菌絲體，然後在反應溫度50℃，攪拌速度200rpm條件下反應96小時，最終沒食子酸丙酯產率51％。
權利要求
1.一種微生物法在有機相中合成沒食子酸丙酯的方法，其特徵在於，方法的步驟如下1)將黑麴黴孢子培養得到的菌絲體收集過濾，用0.85％(w/v)NaCl溶液衝洗，在0.01～0.2mol/L pH2.2～5.8緩衝溶液中平衡後過濾，得到含水量為60～80％(w/w)的菌絲體；2)在有機溶劑苯體系中，每升有機溶劑中加入0.06～0.1L的正丙醇和4～10mmol的沒食子酸，再在每升有機溶劑中加入20～50g的上述黑麴黴菌絲體，在攪拌速度150～220rpm和反應溫度20～50℃下進行生物催化反應，反應時間為48～96h。
2.根據權利要求1所述的一種微生物法在有機相中合成沒食子酸丙酯的方法，其特徵在於所述的黑麴黴孢子培養方法為將CGMCC保藏號No.3.315的黑麴黴(Aspergillus niger)接種到黑麴黴菌種保藏培養基上，在30℃下培養5天，然後將萌發的黑麴黴孢子接種到發酵培養基中，其中孢子濃度為105個/ml，在攪拌速度180rpm和培養溫度30℃條件下培養72h。
3.根據權利要求1或2所述的一種微生物法在有機相中合成沒食子酸丙酯的方法，其特徵在於所述的黑麴黴菌種保藏培養基為單寧酸0.5％(w/v)，蛋白腖 0.1％(w/v)，K2HPO40.1％(w/v)，NaH2PO40.1％(w/v)，MgSO4·7H2O0.05％(w/v)，瓊脂6％(w/v)。
4.根據權利要求1或2所述的一種微生物法在有機相中合成沒食子酸丙酯的方法，其特徵在於所述的黑麴黴產單寧酶的發酵培養基為單寧酸1.0～4.0％(w/v)，可溶性澱粉0.2～0.4％(w/v)，蔗糖0.3～0.8％(w/v)，葡萄糖0.1～0.3％(w/v)，豆餅粉0.5～1.0％(w/v)，NH4NO30.1％(w/v)，K2HPO40.1％(w/v)，KCl 0.05％(w/v)，MgSO4·7H2O 0.05％(w/v)，CaCl20.02％(w/v)，MnCl2·6H2O 0.04％(w/v)，FeSO40.001％(w/v)，pH6.0。
5.根據權利要求1所述的一種微生物法在有機相中合成沒食子酸丙酯的方法，其特徵在於所述的緩衝溶液pH2.2～3.6的為甘氨酸-鹽酸緩衝液，pH3.6～5.8的為乙酸-乙酸鈉緩衝液。
全文摘要
本發明公開了一種微生物法在有機相中合成沒食子酸丙酯的方法。方法的步驟如下1)將黑麴黴孢子培養得到的菌絲體收集過濾，用0.85％(w/v)NaCl溶液衝洗，在0.01～0.2mol/L pH 2.2～5.8緩衝溶液中平衡後過濾，得到含水量為60～80％(w/w)的菌絲體；2)在有機溶劑苯體系中，每升有機溶劑中加入0.06～0.1L的正丙醇和4～10mmol的沒食子酸，再在每升有機溶劑中加入20～50g的上述黑麴黴菌絲體，在攪拌速度150～220rpm和反應溫度20～50℃下進行生物催化反應，反應時間為48～96h。本方法建立了黑麴黴產單寧酶的發酵培養基，利用該產單寧酶的黑麴黴菌絲體作為生物催化劑，不使用傳統的自由酶或者固定化酶，省去了酶的分離純化過程，降低了生產成本。
文檔編號C12P7/62GK1635127SQ20041006817
公開日2005年7月6日 申請日期2004年11月10日 優先權日2004年11月10日
發明者李永泉, 喻曉蔚 申請人:浙江大學