牛奶中β-內醯胺類抗生素殘留的檢測方法

2023-04-25 06:37:41 1

專利名稱：牛奶中β-內醯胺類抗生素殘留的檢測方法
技術領域：
本發明涉及一種牛奶中內醯胺類抗生素殘留檢測方法，特別涉及用於牛奶中
e-內醯胺類抗生素殘留快速檢測的定性與初步定量方法。
背景技術：
牛奶是一種僅次於人類母乳的營養成分最全、營養價值最高的液體食品。牛奶中 富含蛋白質、脂肪、胺基酸、糖類、鹽類、鈣、磷、鐵等營養物質，以及維生素、酶和抗體等，最 容易被人體消化吸收。然而，在實際生產中牛奶存在抗生素問題，具有e-內醯胺環的抗 生素如青黴素G、阿莫西林、氨苄西林、頭孢菌素、鄰氯青黴素等作為一種高效的獸藥在奶牛 飼養業中可醫治乳房炎等疾病，隨著生活水平的提高，牛奶中抗生素殘留問題日益受到消 費者的重視，已成為乳業管理和技術監督的聚焦問題之一。牛奶中不允許殘留抗生素，其 主要原因一方面是人們長期飲用或食用有抗生素殘留的奶製品，也就相當於長期低劑量的 攝取抗生素，使人體產生耐藥性，給今後患病使用抗生素治療帶來不良影響，且對抗生素過 敏體質的人會出現過敏反應，危及健康，並對人體內正常菌群的平衡狀態造成破壞，使菌群 失調，甚至造成二重感染，使重症患者病情難以控制。另外，乳製品生產過程中發酵奶製品 (酸奶和乾酪)的生產依賴於乳酸菌的生長，而乳酸菌的生長受抗菌素的強烈抑制，會導致 發酵失敗。世界糧農組織(FA0)、世界衛生組織(WHO)的食品法對牛奶中抗生素最高殘留 限量都有明確規定，歐盟亦對最大殘留量(MRLs)作了詳細的規定。我國農業部2001年頒 布實施了《無公害食品生鮮牛乳行業標準》，對新鮮牛乳的衛生指標明確了 "抗生素不得檢 出"。 現有技術中，已應用的13 -內醯胺類抗生素殘留技術有微生物檢測法如TTC法，理 化檢測方法包括分光光度法、螢光、色譜、化學發光等技術，以及免疫分析法等。上述方法在 檢測精密度等方面各有所長，有的靈敏度低、選擇性差；有的操作過程步驟較為繁瑣，有的 需購置昂貴儀器，但大都存在檢測耗時長、成本高的缺點，使乳品加工企業造成諸多不便。
本發明的目的在於克服現有技術之不足，提供一種操作方法簡便、快速、檢測結果 準確、試劑用量小減輕對環境汙染、無需價格昂貴設備的牛奶中13-內醯胺類抗生素殘留 檢測方法。

發明內容
本發明方法的特徵是，所說的方法包括以下步驟 (1)將無抗牛奶作為空白樣品和待測樣品分別與離心試劑酸化乙腈按照體積比=
2 : (l-4)混合，然後離心分離，所說的酸化乙腈是由鹽酸乙腈按體積比=i : (l-5)混
合配製的； (2)用l-10X的稀硫酸調節離心後樣品上清液pH值為2-6，加入濃度為0. l_2g/L 的重金屬鹽溶液與離心上清液搖勻後靜置反應5-15min，重金屬鹽溶液加入量為上清液與 重金屬鹽溶液體積比2 : 1 ;
3
(3)用紫外分光光度計測試反應後產物紫外吸收光度值，記錄並對比數據判斷待 測牛奶樣品是否殘留有內醯胺類抗生素；判斷方法與空白牛奶樣品比較，樣品吸收度 比空白吸收度大，即含有抗生素且會影響奶製品發酵結塊狀態，其吸收度差值越大，則牛奶 中內醯胺類抗生素含量越高並可能會使酸奶發酵無法結塊，抗生素的具體含量可以根 據標準13-內醯胺類抗生素製作的工作曲線求得，本方法對13-內醯胺類抗生素含量的檢 測範圍為0. 01-50mg/L。所說的離心分離條件為800-3000r/min，離心3_10min。 所說的重金屬鹽溶液為硫酸銅溶液、硫酸鋅溶液、硫酸錳溶液、硫酸鎘溶液、醋酸 鉛溶液、氯化鈷溶液、硝酸鎳溶液中任一種。所述的紫外分光光度法測試波長選擇範圍為240-380nm。
同現有技術相比，本發明具有以下優點或積極效果
1、本發明所需樣品量及各種試劑用量少對環境為害小； 2、檢測速度快，全部操作過程可在30min內完成，抗生素的快速檢測為乳品加工 企業生產降低成本減輕運作風險提供了保證； 3、無需購置昂貴抗生素檢測儀器，只需配備低速離心機與紫外分光光度計即可完 成檢測； 4、本方法經多次實驗驗證，準確率高； 5、操作方法簡單，對操作人員無特殊技術要求； 6、本方法對|3 _內醯胺類抗生素總含量檢測範圍寬，檢測靈敏度高。
具體實施例方式
下面用實施例對本發明作進一步說明，但本發明的保護範圍並不限於此，保護範
圍以權利要求為準。本發明實施例中牛奶樣品均為市購新鮮牛奶。
實施例1 1、將100毫升無抗生素牛奶(空白)樣品和100毫升待測牛奶樣品分別與50毫 升酸化乙腈混合，然後在3000r/min條件下離心3min，所說的酸化乙腈是由鹽酸乙腈按 體積比=1:l配製的； 2、然後用1 %的稀硫酸調節離心後樣品上清液pH值至6，按照與上清液體積比 1 : 2加入0. lg/L硫酸銅溶液，搖勻後靜置反應15min; 3、用紫外分光光度計於240nm測試反應後上清液紫外吸收光度值，記錄並對比數 據判斷待測牛奶樣品是否殘留有P-內醯胺類抗生素。 記錄數據，計算得出其中空白樣品13-內醯胺類抗生素含量為0.01mg/L，待測樣 品P _內醯胺類抗生素含量為45. 91mg/L，對待測樣品進行酸奶發酵沒有結塊，不能用作酸 奶製品原料奶。該法檢測結果與用GB-19301-2003檢測結果一致。
實施例2 : 1、將100毫升無抗生素牛奶(空白)樣品和100毫升待測牛奶樣品分別200毫升 酸化乙腈混合，然後在800r/min條件下離心10min，所說的酸化乙腈是由鹽酸乙腈按體 積比=1:2配製的； 2、然後用10X的稀硫酸調節離心後樣品上清液pH值至2，按照與上清液體積比1 : 2加入2g/L醋酸鉛溶液搖勻後靜置反應5min ; 3、用紫外分光光度計於380nm測試反應後上清液紫外吸收光度值，記錄並對比數據判斷待測牛奶樣品是否殘留有P-內醯胺類抗生素。 記錄數據，計算得出其中空白樣品13-內醯胺類抗生素含量為0.85mg/L，待測樣品P-內醯胺類抗生素含量為1.04mg/L，對待測樣品進行酸奶發酵結塊狀態良好，可用作酸奶製品原料奶。該法檢測結果與用GB-19301-2003檢測結果一致。
實施例3 : l，將100毫升無抗生素牛奶(空白)樣品和100毫升待測牛奶樣品分別100毫升酸化乙腈混合，然後在1500r/min條件下離心8min，所說的酸化乙腈是由鹽酸乙腈按體積比=1:5配製的； 2，用6X稀硫酸調節離心後樣品上清液pH值至3，按照與上清液體積比l : 2加入lg/L氯化鈷溶液搖勻後靜置反應8min ; 3，用紫外分光光度計於320nm測試反應後上清液紫外吸收光度值，記錄並對比數據判斷待測牛奶樣品是否殘留有P-內醯胺類抗生素。 記錄數據，計算得出其中空白樣品13-內醯胺類抗生素含量為0.93mg/L，待測樣品P-內醯胺類抗生素含量為1.21mg/L，對待測樣品進行酸奶發酵結塊狀態良好，可用作酸奶製品原料奶。該法檢測結果與用GB-19301-2003檢測結果一致。
實施例4 : 1、將100毫升無抗生素牛奶(空白)樣品和100毫升待測牛奶樣品分別與50毫升酸化乙腈混合後在3000r/min條件下離心3min;，所說的酸化乙腈是由鹽酸乙腈按體積比=1:3配製的； 2，用1X的稀硫酸調節離心後樣品上清液pH值至6，按照與上清液體積比1 : 2加入0. 5g/L硫酸鋅溶液搖勻後靜置反應15min ; 3，用紫外分光光度計於240nm測試反應後上清液紫外吸收光度值，記錄並對比數據判斷待測牛奶樣品是否殘留有P-內醯胺類抗生素。 記錄數據，計算得出其中空白樣品13-內醯胺類抗生素含量為0.73mg/L，待測樣品P _內醯胺類抗生素含量為27. 91mg/L，對待測樣品進行酸奶發酵沒有結塊，不能用作酸奶製品原料奶。該法檢測結果與用GB-19301-2003檢測結果一致。
實施例5 : 與實施例1基本相同，只是將重金屬鹽溶液變更為lg/L硫酸錳溶液，在波長285nm紫外檢測條件下實施，記錄數據計算得出其中空白樣品P _內醯胺類抗生素含量為1.45mg/L，待測樣品13-內醯胺類抗生素含量為1.59mg/L，對待測樣品進行酸奶發酵結塊狀態良好，可用作酸奶製品原料奶。該法檢測結果與用GB-19301-2003檢測結果一致。
實施例6 : 與實施例2基本相同，只是將重金屬鹽溶液變為2g/L硫酸鎘溶液，在波長305nm紫外檢測條件下實施，記錄數據計算得出其中空白樣品13-內醯胺類抗生素含量為0.82mg/L，待測樣品13-內醯胺類抗生素含量為1.43mg/L，對待測樣品進行酸奶發酵結塊狀態良好，可用作酸奶製品原料奶。該法檢測結果與用GB-19301-2003檢測結果一致。
實施例7 :
5
與實施例2基本相同，只是將重金屬鹽溶液變為0. 5g/L硝酸鎳，在波長265nm紫外檢測條件下溶液實施，記錄數據計算得出其中空白樣品13-內醯胺類抗生素含量為1. 32mg/L，待測樣品13 -內醯胺類抗生素含量為2. 01mg/L，對待測樣品進行酸奶發酵結塊狀態一般，可用作酸奶製品原料奶。該法檢測結果與用GB-19301-2003檢測結果一致。
權利要求
一種牛奶中β-內醯胺類抗生素殘留的檢測方法，其特徵是，所說的方法包括以下步驟(1)將無抗牛奶作為空白樣品和待測樣品分別與離心試劑酸化乙腈按照體積比＝2∶1-4混合，然後離心分離，所說的酸化乙腈是由鹽酸∶乙腈按體積比＝1∶1-5混合配製的；(2)用1-10％的稀硫酸調節離心後樣品上清液pH值為2-6，加入濃度為0.1-2g/L的重金屬鹽溶液與離心上清液搖勻後靜置反應5-15min，重金屬鹽溶液加入量為上清液與重金屬鹽溶液體積比2∶1；(3)用紫外分光光度計測試反應後產物紫外吸收光度值，記錄並對比數據判斷待測牛奶樣品是否殘留有β-內醯胺類抗生素；判斷方法與空白牛奶樣品比較，樣品吸收度比空白吸收度大，即含有抗生素且會影響奶製品發酵結塊狀態，其吸收度差值越大，則牛奶中β-內醯胺類抗生素含量越高並可能會使酸奶發酵無法結塊，抗生素的具體含量可以根據標準β-內醯胺類抗生素製作的工作曲線求得，本方法對β-內醯胺類抗生素含量的檢測範圍為0.01-50mg/L。
2. 根據權利要求1的檢測方法，所說的離心分離條件為800-3000r/min，離心3-10min。
3. 根據權利要求1或2的檢測方法，所說的重金屬鹽溶液為硫酸銅溶液、硫酸鋅溶液、硫酸錳溶液、硫酸鎘溶液、醋酸鉛溶液、氯化鈷溶液、硝酸鎳溶液中任一種。
4. 根據權利要求1或2的檢測方法，其特徵是，所述的紫外分光光度法測試波長選擇範圍為240-380nm。
5. 根據權利要求3的檢測方法，其特徵是，所述的紫外分光光度法測試波長選擇範圍為240-380nm。
全文摘要
本發明提供一種牛奶中β-內醯胺類抗生素殘留檢測方法。通過離心、β-內醯胺類抗生素與重金屬化學反應及紫外分光光度法測試三個步驟檢測牛奶中β-內醯胺類抗生素殘留，檢測過程中所需樣品量及各種試劑用量少，對環境危害小；檢測速度快，全部操作過程可在30min內完成；無需購置昂貴抗生素檢測儀器，只需配備低速離心機與紫外分光光度計即可完成檢測。
文檔編號G01N21/78GK101706440SQ200910218268
公開日2010年5月12日 申請日期2009年12月2日 優先權日2009年12月2日
發明者劉謀盛, 張丹揚, 張尹, 楊亞玲 申請人:昆明理工大學