一種一體化檢測α、β突變型地中海貧血的試劑盒的製作方法

2023-04-25 06:39:26 1

專利名稱:一種一體化檢測α、β突變型地中海貧血的試劑盒的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種一體化檢測α、β突變型地中海貧血的試劑盒，特別是涉及一種利用多重不對稱擴增及反向點雜交技術檢測α、β地中海貧血突變型的試劑盒，該試劑盒包含一套特異性核苷酸多態性探針和擴增樣品中靶基因的PCR引物，可同時檢測由於點突變引起的α、β地中海貧血，將廣泛應用於地中海貧血的檢測及優生優育指導。
背景技術：
地中海貧血分為α、β、δ、δβ、Υδβ等幾種類型，常見的為α地中海貧血 (簡稱α地貧)和β地中海貧血(簡稱β地貧)，是我國南方各省最常見、危害最大的遺傳病之一，也是世界上最常見的遺傳性疾病之一。據WHO統計全世界約有1. 5億多人攜帶地貧基因。在我國的廣東、廣西、海南、香港、湖南、湖北、雲南、貴州、四川等地區常見，黃河以南至長江流域，臺灣、福建及西藏等省(區)均有病例報導；患者以漢族多見，亦可見於回、傣、壯、苗和布衣等少數民族，海南黎族地貧基因突變的發生率達58.4%。抽樣調查發現，廣西「地貧」基因攜帶者高達20%，居全國之首，廣東為12%，居第二位，四川、重慶等省市也是高發區，有報導發病率在4 7%。
α地貧是一種由於α-珠蛋白(a-Globin)基因突變導致α-珠蛋白合成減少， α-鏈/非 α-鏈比例失衡而產生的單基因遺傳性溶血性血紅蛋白病。分缺失型和突變型 (非缺失型突變)兩類，突變型α-地貧是指用限制性內切酶圖譜法未能檢測出明顯的基因缺失，但在其中可能包括導致基因功能喪失的小片段核苷酸的缺失，插入或鹼基替代。非缺失型α-地貧的突變大多位於功能較強的α2珠蛋白基因，故非缺失型血紅蛋白H病患者的臨床表現要比缺失型血紅蛋白H病患者的臨床表現更為嚴重。目前世界上已報導了至少46種引起非缺失型α -地貧的點突變，這些突變影響mRNA加工，mRNA的翻譯及翻譯後肽鏈不穩定或肽鏈縮短，導致α-珠蛋白鏈合成減少從而引起α地中海貧血。中國人群中目前已報導了 α aCD30、α α 31、α α 59、α α cs、α α QS、α α麗6種α地貧突變類型。我國最常見最早鑑定的是α α es、α α QS。α α QS是α 2基因第125密碼子CTG(亮氨酸)突變為CCG (脯氨酸)，是一種高度不穩定的α -珠蛋白，阻礙α 1 β 1 二聚體的形成，從而影響四聚體的合成；而α aes是α 2基因終止密碼突變，使α鏈延長為172個胺基酸。這種突變基因轉錄的mRNA不穩定，導致α鏈障礙。
β地貧是一種由β珠蛋白(β-Globin)基因異常導致肽鍊表達失衡而產生的單基因遺傳血液病，多由珠蛋白基因點突變所致。目前在中國發現的突變類型有27種，最常見的突變有 CD41/42(41. 6% )、IVSII-654(21. 8% )、CD17(18. 0% )、TATA 28(8. 0% )、 CD71/72(3. 9% ),TATA 29(1. 2% )等，其它突變類型(5. 5% )
目前用於單獨檢測α突變型地貧均為科研試劑，可檢測α α cs, α α QS、α α 三種突變型別，而在中國人群中也有報導的α am3°、α α CD3/ α α GD59三種型別沒有納入檢測範圍。檢測β突變型地貧目前存在商品化的試劑盒，但最多僅能夠檢測其中的17 種，對於一些少數民族地區和新近發現的突變無法檢測，如新疆發現的⑶8(_ΑΑ)發生率
516.6% (李厚鈞等，1994)，CD8/9(+G)(餘伍忠等，1996)，廣東發現的CD71/72(+T)(張力等，2008)，CD37(G —A)(鍾惠珠等，2009)等。同時對於一些其它類別的突變，如IVSII_5、 41/42 (-TTCT)和IVSII-5(G — C)雙重雜合子突變，目前商品化試劑盒也無法檢測，僅有學者在做少量的統計學研究。
曲敬等公開了「用於診斷地中海貧血的核酸雜交膜條及試劑盒」(公開號 CN 1718742Α)，該試劑盒僅檢測中國的17種突變型別；楊夢蘇公開了 「用於診斷地中海貧血的DNA晶片及其製備方法」(公開號CN1453363A)可檢測在中國發現的21種類型的突變。這兩個專利難以實現商品化，是因為它們都存在共同的不足不能檢測中國發現的27 種型別的突變，而且其探針設計需要通過大量的探針篩選才能得到比較滿意的結果；均把 β-Globin基因擴增為兩段，其中一段為600bp左右，而另一段為400bp左右。在雜交過程中，片段長度越長，雜交效率就越低，尤其是以玻片為載體的基因晶片，經驗上的數值是不超過400bp，而為了彌補雜交效率不足，相應的措施是延長雜交時間，但這一措施並不適合於快速檢測的初衷。
雖然β地貧突變檢測試劑國內有數個廠家生產和銷售，α突變型地貧也有一些科研試劑，但由於技術方法的局限，國內尚沒有一次性完成檢測的一體化試劑，往往要多個試劑盒多次檢測才能完成，繁雜又耗資耗時，因此本發明開發一種一體化檢測α、β地中海貧血核苷酸多態性的試劑盒。同時由於α地貧和β地貧少見突變型不僅是客觀存在的， 而且可能由於缺乏有效的檢測手段，沒有深入研究而被忽略，為全面提高人口素質，有必要完善檢測位點的覆蓋率，因此該發明的試劑盒還具有高覆蓋率的特點，可以檢測6種α地貧點突變和27種β地貧突變，以滿足臨床應用的需求。
本發明的試劑盒以尼龍膜為基底的核酸雜交膜條技術，其主要的基本原理如下 寡核苷酸探針為含有特定DNA序列的寡核苷酸片段，其末端帶有氨基標記。經活化處理的尼龍膜帶有羧基，探針的氨基對羧基形成親核攻擊脫水後形成醯胺鍵從而將探針結合到膜上。PCR引物的5'末端帶有生物素等標記基團，PCR反應結束後產物均帶有生物素標記。
PCR產物與探針的結合過程可分為兩個階段，第一階段在一定的溫度下產物與探針互補配對結合，這一階段的結合沒有選擇性，也就是說，只有部分互補配對也可以結合在探針上；第二階段為特異性的洗脫階段。第一階段的非特異性結合中，當完全互補配對，則 PCR產物與探針的結合力強於部分結合，通過一定的溫度和離子強度，將部分結合的PCR產物洗脫而完全互補配對的PCR產物因結合力強而不被洗脫。接下來通過辣根過氧化物酶結合於生物素基團，將PCR產物帶上一個連接的辣根過氧化物酶，因辣根過氧化物酶在尼龍膜中存在物理吸附，需要用緩衝液將物理吸附的辣根過氧化物酶洗脫。最後一步為加入酶的底物，進行顯色反應。
目前國內外基於膜雜交的商品化試劑均採用上述的原理，本發明在該技術平臺的基礎上，解決了雜交過程冗長的問題。同時在中國發現的6種α地貧突變型和27種類型的β地貧突變中，6種α地貧和17種β地貧為單鹼基突變，且α珠蛋白基因GC含量極高，部分探針超過70%，導致Tm值較高，使探針在同一條件下完成雜交本身就是件難以做到的工作。因此，有必要探索更為有效的探針設計方法。郭學敏等公開了「一種寡核苷酸探針的設計方法」(公開號CN 1461811A)，該方法是在突變位點以外設計一個或多個人工突變，形成雙突變或者多突變位點，但這樣仍然無法有效的區分C — G後形成的G. G錯配。本
6發明的試劑盒同時解決了這一技術難點。
本發明人通過反覆的實驗探索，成功開發了一種利用一種不對稱擴增的方法一體化檢測α、β地中海貧血核苷酸多態性的試劑盒，該試劑盒可以同時檢測6種α地貧點突變和27種β地貧突變，檢測過程更加快速，檢測結果也更為準確。

發明內容
本發明的目的在於提供一種一體化檢測α、β突變型地中海貧血的試劑盒，利用本試劑盒可以同時檢測6種α地貧點突變和27種β地貧突變。
為了解決上述任務，本發的具體技術路線為
1)分別根據α -Globin和β -Globin基因序列設計PCR引物，設計的引物能夠包括α-和β-地中海貧血全部突變位點。設計的引物可由專業的合成公司合成，如上海生工等。對上述引物的下遊部分或上遊和下遊進行生物素或其它基團的標記，使得擴增的產物中含有相應的標記，以便在雜交後對雜交結果進行分析。
2)在包含所述引物的PCR試劑中，使用兩管三重不對稱PCR進行擴增，不對稱PCR 的一個突出優勢為PCR完成後，擴增產物中具有可與α-Globin和β-Globin基因突變探針特異性結合的DNA序列，可直接用於雜交實驗而不需要通過熱變性或者鹼變性。PCR反應試劑涉及的組分可以使用市售的產品，如ΝΕΒ公司生產的Taq 5XMaster Mix, Fermentas 公司生產的熱啟動酶等。
3)根據α -Globin和β -Globin基因基因多態性的突變類型及相應的突變位點設計檢測探針，設計的探針可以在正義鏈和/或反義鏈。設計的探針可由專業的合成公司合成，如上海生工等。
4)將上述探針點在經過活化的雜交膜上，加入擴增產物後，在雜交體系中，通過高濃度的鹽離子溶液非選擇性的結合靶基因，然後通過低濃度的鹽離子濃度進行選擇性的洗脫，再交聯特異性結合的酶，最後加入酶的底物顯色。
為了完成上述檢測步驟，本發明提供的一體化檢測α、β突變型地中海貧血的試劑盒由PCR試劑、低密度晶片、雜交試劑三部分組成。
根據本發明一個優選的實施方案，PCR試劑包括α-PCR管和β-PCR管，其中 α -PCR管由三對α -PCR引物、酶及PCR反應的其它常規組分組成，β -PCR管由三對β -PCR 引物、酶及PCR反應的其組分組成，其特徵在於三對α-PCR引物分別為a2F和a 2R，a Fl 和a Rl, aF2禾口 aR2，三對β-PCR引物分別為IF-β和IRm禾口 2R_3，3F_3和 3R-3，序列如下
權利要求
1.一種一體化檢測α、β突變型地中海貧血的試劑盒，由PCR試劑、低密度晶片、雜交試劑組成，其中PCR試劑包括α-PCR管和β-PCR管，α-PCR管由三對α-PCR引物、酶及 PCR反應的其它常規組分組成，β-PCR管由三對β-PCR引物、酶及PCR反應的其它常規組分組成，其特徵在於三對α-PCR引物分別為a2F和a 2R，a Fl和a Rl, a F2和aR2，三對β -PCR引物分別為IF- β禾口 IR- β，2F- β禾口 2R- β，3F- β禾口 3R- β，序列為a 2F 5' -GGTGGAGGGTGGAGACGTCCTGGCC-3『 a 2R 5' -CACCTCCATTGTTGGCACATTCCGGGA-3『 a Fl 5' -GCTGTCTCCTGCCGACAAGACCAACGTCAAG-3『 a Rl 5' -GTGCGCGTGCAGGTCGCTCAGGGCGGACAG-3『 a F2 5' -CTCTTCTCTGCACAGCTCCTAAGCCACT-3『 a R2 5' -GCTGCTGCCCACTCAGACTTTATTCAAAG-3『 IF-β 5' -AGTAGCAATTTGTACTGATGGTATGG-3『 IR-β 5' -CCCAGTTTCTATTGGTCTCCTTAAACC-3『 2F-0 5' -GATAGGCACTGACTCTCTCTGC-3『 2R-3 5' -GAACTTAACCATAGAAAAGAAGG-3『 3F-0 5' -GTATCATGCCTCTTTGCACCATTC-3『 3R-0 5' -CACACAGACCAGCACGTTGCCCAGGAGC-3'。
2.根據權利要求
1所述的試劑盒，其特徵還在於PCR試劑中引物a2F，a2R終濃度為 0·2μΜ，弓丨物 a Fl, a F2, IF-β，2F-3 禾口 3F-3 終濃度為 0· 01 μ Μ，弓丨物 a Rl, a R2, IR-β， 2R- β和3R- β終濃度為0. 2 μ Μ。
3.根據權利要求
1所述的試劑盒，其特徵還在於PCR試劑中的酶為熱啟動酶或Taq酶。
4.根據權利要求
1所述的試劑盒，其中低密度晶片由膜、點在膜上的檢測a、 β -Globin基因突變位點的特異性探針組成，其特徵在於特異性探針的序列為■cod30N5'-GGCCCTGGAGAGGTGAG-3'■cod30M5'-AGGCCCTGAGGTGAGG-3'■cod31N5'-CCTGGAGAGGTGAGGCT-3'■cod31M5'-CCTGGAGAAGTGAGGCT-3'■cod59N5'-GGGCCACGGCAAGAAGG-3'■cod59M5'-GGGCCACGACAAGAAGG-3'-WM-codl22N5'-GCGGTGCACGCCTCCCT--3'-WM-codl22M5'-GCGGTGCAGGCCTCCCT--3'-QS-codl25N5'-CGCCTCCCTGGACAAGT--3'-QS-codl25M5'-CGCCTCCCCGGACAAGT--3'-CS-codl42N5'-AATACCGTTAAGCTGGAGC--3-CS-codl42M5'-AATACCGTCAAGCTGGAGC--3ΤΑΤΑ32-Ν 5 『 -TGGGCATAAAAGTCAGTG-3『 ΤΑΤΑ32-Μ 5 『 -TGGGAATAAAAGTCAGGTG-3『 ΤΑΤΑ30-Ν 5『 -GGCATAAAAGTCAGGGCTA-3『 ΤΑΤΑ30-Μ 5『 -GGCACAAAAGTCAGGGCTA-3『TATA29-N 5『 -GCATAAAAGTCAGGGCATG-3『 TATA29-M 5『 -GCATGAAAGTCAGGGCATG-3『 TATA28-N 5『 -GCATAAAAGTCAGGGCAGATG-3『 TATA28-M 5『 -GCATAGAAGTCAGGGCAGATG-3『 Cap+1-N 5' -CTATCTATTGCTTACATTTG-3『 Cap+1-M 5' -CTATCTATTGCTTCCATTTG-3『 Cap40-43-N 5『 -GCAACCTCAAACAGACA-3『 Cap40-43-M 5『 -GCAACCTCAGACACCAT-3『 Innitiation-N 5 『 -CTAAACAGACACCATGGTG-3『 Innitiation-M 5 『 -CTAAACAGACACCAGGGTG-3『 CD8-N 5『 -CTGAGGAGAAGTCTGC-3『 CD8-M 5『 -CTGAGGAGGTCTGCCG-3 『 CD8/9-N 5『 -CTGAGGAGAAGTCTGC-3『 CD8/9-M 5『 -TGAGGAGAAGGTCTGC-3『 CD14/15-N 5『 -TTACTGCCCTGTGGG-3『 CD14/15-M 5' -TTACTGCCCTGGTGG-3『 CD17-N 5' -CTCCTGTGGGGCAAGGTGA-3『 CD17-M 5『 -CTCCTGTGGGGCTAGGTGA-3『 CD19-N 5' -GGTGAACGTGGATGAAGTTAG-3『 CD19-M 5' -GGTGGACGTGGATGAAGTTAG-3『 CD26-N 5『 -GTAAGTTGGTGGTGAGGC-3『 CD26-M 5『 -GTAAGTTGGTGGTAAGGC-3『 CD27/28-N 5' -TGGTGAGGCCCTGG-3『 CD27/28-M 5' -TGGTGAGGCCCCTG-3『 CD30-N 5『 -CTTAGGCTGCTGGTGGTCTAC-3『 CD30-M 5『 -CTTAGGCTGCTGGTGGTCTAC-3『 CD31-N 5' -CTTAGGCTGCTGGTGGTC-3『 CD31-M 5' -CCTTAGGTGCTGGTGGTC-3『 CD37-N 5' -CCTTGGACCCAGAGGTTAC-3『 CD37-M 5' -CCTTAGACCCAGAGGTTAC-3『 CD41-N 5『 -TGGACCCAGAGGTTCTTTG-3『 CD41-M 5' -TGGACCCAGAGGTTTCTTTG-3『 CD41/42-N 5『 -GGTTCTTTGAGTCCTTTG-3『 CD41/42-M 5' -GGTTGAGTCCTTTGGGGA-3『 CD43-N 5' -CTTTGAGTCCTTTGGGGACT-3『 CD43-M 5' -CTTTTAGTCCTTTGGGGACT-3 『 71/72-N 5' -GGTGCCTTTAGTGATGG-3『 71/72-M 5' -TCGGTGCCTTTTAGTGATG-3『 CD95-N 5' -ACTGTGACAAGCTGCAC-3『CD95-M 5 『 -ACTGTGACAAAGCTGCAC-3『 IVSI-I-N 5' -GGCAGGTTGGTATCAAGT-3『 IVSI-I-M 5' -GGCAGTTTGGTATCAAGT-3『 IVSII-I-N 5' -GTTGGTATCAAGGTTACTA-3『 IVSII-I-M 5' -GTTGCTATCAAGGTTACAA-3『 IVSII-5-N 5' -GTAACTTCAGGGTGAGTCT-3『 IVSII-5-M 5' -GTAACTTCAGGGTGACTCT-3『 IVSII-nt654-N 5 『 -TAAGGCAATAGCAATATAC-3『 IVSII-nt654-M 5 『 -TAAGGTAATAGCAATATAC-3『 顯色控制點5' -GCCGTAACCGTCACAATCCGT-3 『。
5.根據權利要求
1所述的試劑盒，其特徵還在於低密度晶片中特異性探針的點樣量為 5pmolο
6.根據權利要求
1所述的試劑盒，其特徵還在於低密度晶片中膜的材料為硝酸纖維素、尼龍或醋酸纖維素。
7.根據權利要求
1所述的試劑盒，其中雜交試劑由雜交液I、雜交液II、酶、顯色液組成，其特徵在於雜交液I的組成為2XSSC，0. 5% SDS，雜交液II的組成為0. 5X SSC, 0. 5% SDS。
8.根據權利要求
1所述的試劑盒，其特徵還在於雜交試劑中酶為辣根過氧化物酶，用量為0. IU0
9.根據權利要求
1所述的試劑盒，其特徵還在於顯色液中顯色底物包括TMB或0PD。
專利摘要
本發明涉及一種一體化檢測α、β突變型地中海貧血的試劑盒，特別是涉及一種利用多重不對稱擴增及反向點雜交技術檢測α、β地中海貧血突變型的試劑盒。本發明的試劑盒由PCR試劑、低密度晶片、雜交試劑三部分組成，包含一套特異性核苷酸多態性探針和擴增樣品中靶基因的PCR引物，可以同時檢測中國常見的6種α地貧點突變和27種β地貧突變。由於本發明的試劑盒檢測過程更加快速，檢測結果也更為準確，將廣泛應用於臨床地中海貧血的診斷及優生優育指導。
文檔編號C12Q1/68GKCN102220411SQ201010152735
公開日2011年10月19日 申請日期2010年4月16日
發明者何蘊韶, 張太松, 彭春梅, 李明, 林炳生, 程鋼, 陳華雲 申請人:中山大學達安基因股份有限公司導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan