一種與抗黃矮病基因Bdv2連鎖的同源序列及其應用的製作方法
2023-04-25 05:32:26
專利名稱：一種與抗黃矮病基因Bdv2連鎖的同源序列及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種抗黃矮病基因Bdv2連鎖的抗病基因同源序列及其特異引物與應用。
背景技術：
中間偃麥草是異源六倍體的多年生小麥近緣植物，具有許多對小麥改良有益的基因，如抗黃矮病、抗條鏽、葉鏽、稈鏽、白粉病以及耐旱、抗寒、優質等基因，其中抗黃矮病基因是栽培小麥缺乏的基因。中間偃麥草已廣泛用於小麥改良。目前，已將中間偃麥草第7部分同源群染色體7X長臂上抗黃矮病基因Bdv2成功地導入小麥，育成抗黃矮病的小麥—中間偃麥草小片段易位系HW642、YW443、YW243及TC系等(辛志勇等.Sciences in China(Series B)，1991，34(9)1055-10621；張增豔等.中國農業科學，1998，31(3)1-4；Banks等.Genome，1995，38395-405)。為了更好地利用中間偃麥草的抗黃矮病基因，徹底防治病害，分離克隆該抗病基因、揭示其抗病分子遺傳機制十分必要。
目前分離克隆功能產物序列未知的植物抗病(resistance，R)基因主要採用圖位克隆法和轉座子標籤法。圖位克隆時必須要對R基因進行精細定位，尋找與該基因緊密連鎖的分子標記，再利用基因區段兩側的標記篩選基因組文庫(YAC，BAC或TAC文庫)，構建克隆重疊群，確定侯選基因所在的克隆，對此克隆進行亞克隆，經互補試驗來證實基因的功能。轉座子標籤法需要有效的轉座子體系。小麥不僅基因組龐大，基因組大小為1.6×1010bp，相當水稻基因組的近40倍，而且重複序列含量豐富，未發現有效的轉座子體系，因此小麥抗病基因克隆一直是國際難題和研究熱點，至今尚未有分離到小麥抗病基因的報導。小麥-中間偃麥草易位系中抗黃矮病基因Bdv2來源於中間偃麥草染色體7XL。由於中間偃麥草與小麥染色體間重組交換頻率很低，難以精確定位7XL上分子標記與Bdv2間遺傳距離，採用上述方法克隆分離克隆抗黃矮病基因Bdv2十分困難。然而，已克隆植物R基因編碼的蛋白質結構具有一定保守性，如具有核苷酸結合位點(NBS)、富亮氨酸重複(LRR)和絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(STK)等保守區域，該特點為利用同源序列法分離其它植物抗病基因提供了依據和一條快捷的新途徑(Leister等.Nature genet，1996，14421-429；王石平等.植物學報，1998，40(1)43-51)。國內外學者已利用同源序列法從多種植物中分離克隆了多個(resistance gene analog，RGA)(Kanazin等.Proc Natl Acad SciUSA，1996，9311746-11750；Aarts等.Mol Plant-MicrobeInteract，1998，11251-258；Collin等.Mol Plant-Microbe Interact，1998，11968-978；鄭先武等.水稻NBS-LRR類R基因同源序列.中國科學(C輯)，2001，31(1)42-50；Collins等.Genome，2001，44375-381)。但迄今未見有關中間偃麥草抗病基因類似物(RGA)的報導。
與抗病基因緊密連鎖的RGA片段是從基因組文庫中分離抗病基因侯選克隆的重要探針。傳統篩選文庫的方法是菌落原位雜交法。由於小麥—中間偃麥草小片段易位系基因組龐大(相當於普通小麥基因組，約1.6×1010bp)，採用通常方法構建、保存和篩選該基因組文庫的工作量和資金非常巨大。為了減少保存文庫和篩選文庫所需的工作量和資金，本發明的發明人構建了抗黃矮病小麥—中間偃麥草易位系HW642的基因組TAC(transformation-competent artificial chromosome)文庫(王曉萍，張增豔，劉耀光等.遺傳學報，2002，29712-718)，以混合克隆池法保存，每一克隆池保存了1000個不同的重組克隆，其中一個特定克隆只佔每個克隆池的1/1000，難以用傳統的菌落原位雜交法進行有效篩選。劉耀光等建立了克隆池PCR(Pooled-PCR)法篩選TAC文庫的方法，並從「中國春」小麥TAC文庫中篩選到I型硫素基因(Liu Y G等.PlantJournal，2000，23(5)687-695)。克隆池PCR法篩選基因組文庫較傳統的菌落原位雜交法有以下優點①由於構建基因組文庫時，以大腸桿菌作為受體，因此與大腸桿菌基因組DNA有部分同源性的DNA序列，在菌落原位雜交時，背景往往很深，易於掩蓋陽性克隆的信息，通過克隆池PCR法篩選則可解決該問題。②每1個混合克隆池有1000個不同的克隆，其中一個特定克隆只佔每個克隆池的1/1000。用菌落原位雜交篩選時雜交信號過弱會影響篩選結果。而PCR擴增的靈敏度高，克隆池PCR法能夠檢測到混合克隆池中每個克隆。③PCR法速度快，效率高，易操作。
發明內容
本發明的目的是提供一種抗黃矮病基因Bdv2連鎖的抗病基因同源序列及其編碼的蛋白。
為了實現上述目的，本發明採用以下技術方案分別根據已克隆抗病R基因的NBS、LRR和STK(絲氨酸/蘇氨酸)激酶等保守結構，設計簡併引物。以中間偃麥草基因組DNA、抗病易位系HW642基因組DNA及顯微分離的7XL擴增產物為模板，進行PCR擴增。對預想的產物進行序列分析與RFLP分折，得到一種抗黃矮病基因Bdv2連鎖的NBS類抗病基因同源序列TirgaZ1。
該抗黃矮病基因Bdv2連鎖的同源序列TirgaZ1，是下列核苷酸序列之一1)序列表中的SEQ ID №1；
2)編碼序列表中SEQ ID №2多肽序列的多核苷酸；3)與序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列具有90％以上同源性的DNA序列；4)與序列表中SEQ ID №1互補的DNA序列。
序列表中的SEQ ID №1，由537個鹼基組成，其讀碼框為自5』端第1到537位鹼基，具有NBS結構的保守域p-loop(kinase1)、kinase2、kinase3及domain1(GLPLA)。
該抗病基因同源序列TirgaZ1與Bdv2共分離，位於7XL上，是與Bdv2連鎖的RGA基因片段，可作為篩選文庫的探針。
抗黃矮病基因Bdv2連鎖的同源序列TirgaZ1編碼的蛋白，是具有序列表中序列2胺基酸序列的蛋白質，或者是將序列2的胺基酸序列經過一個或幾個胺基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與序列2的胺基酸序列相同活性的由序列2衍生的蛋白質。
本發明的第二個目的是提供一種抗黃矮病基因Bdv2連鎖序列TirgaZ1的專用引物，以便用PCR法高效地篩選TAC文庫。
為了達到上述目的，本發明根據序列TirgaZ1設計了能夠檢測抗黃矮病基因Bdv2的專用引物SC-TZ1，是5』端的前六個核苷酸為gtatga和aggcaa的由6-30個核苷酸組成的核苷酸序列，其中優選的是與序列表中的SEQ ID №3、4限定的DNA序列具有90％以上同源性的核苷酸序列，最優選的是TZ1U+TZ1L，即序列表中的SEQ ID №3、4。用該引物能夠在含有Bdv2的抗黃矮病材料中擴增出約460bp的單一產物，而感病材料中無任何擴增產物，因此可作為引物，用於PCR法篩選文庫。
本發明的TirgaZ1可以作為篩選抗黃矮病侯選基因的探針得到廣泛應用。用SC-TZ1為引物篩選抗黃矮病候選基因發明人已經用引物SC-TZ1及克隆池PCR法，篩選了抗黃矮病小麥—中間偃麥草易位系HW642的基因組TAC文庫，獲得了4個陽性單克隆T1，T2，T3，T4。用限制性內切酶分析確定該4個陽性克隆分為2類，T1，T2，T3為1類，T4為另1類，插入片段分別為23、25kb左右，它們具共有序列也有不同序列。然後用TirgaZ1片段作探針，對T1和T4進行Southern雜交分析，發現這2個克隆為含有NBS類R基因片段TirgaZ1的侯選抗病基因克隆。Southern雜交結果表明，陽性克隆T1和T4是中間偃麥草易位染色體片段7XL的侯選抗黃矮病基因克隆。
本發明不僅篩選出抗黃矮病基因Bdv2連鎖的抗病基因同源序列，也可為篩選抗病基因，揭示植物抗病分子機制，徹底防治植物病害，提供了堅實的基礎。對於快速培育優良的抗病作物品種，提高作物的產量和品質具有重要的意義。
圖1為RGA引物擴增基因組DNA的電泳分析圖2為TirgaZ1/EcoRI的Southern雜交結果圖3為以TZ1U+TZ1L為引物擴增的結果圖4為第二輪篩選TAC文庫部分結果圖5為TZ1U+TZ1L擴增陽性克隆和對照圖6為TirgaZ1作探針與內切酶消化陽性克隆產物的Southern雜交具體實施方式
實施例1、中間偃麥草RGA的克隆與序列分析材料攜有抗黃矮病基因Bdr2的小麥—中間偃麥草易位系HW642、YW443、YW243、Y991029及附加系L1、中間偃麥草；感病材料感病系HW641S(HW642姊妹系)、小麥親本中8601、中7902、中國春(CS)，Vilmorin 27(Vi)；小麥—中間偃麥草易位系HW642基因組TAC文庫(王曉萍，張增豔，劉耀光等.遺傳學報，2002，29712-718)；均由中國農業科學院作物育種栽培研究所，農業部作物遺傳育種重點實驗室培育、收集、構建、保存1)RGA引物的設計和PCR擴增分別根據已克隆R基因的NBS、LRR和STK(絲氨酸/蘇氨酸)激酶等保守結構，設計簡併引物。
以中間偃麥草基因組DNA、抗病易位系HW642基因組DNA及顯微分離的7XL擴增產物為模板，分別利用表1中的引物對進行PCR擴增。PCR擴增反應總體積為25ul，反應液組成10mmol/L Tris-HCl(pH8.3)，50mmol/L KCl，2.0mmol/L MgCl2，，dATP、dCTP、dGTP和dTTP各200μmol/L，模板DNA 50ng，正反引物各0.4～0.5μmol/L，Taq聚合酶1U，加水至25μl，覆以石醋油1滴，在PCR擴增儀(Perkin Elmer Cetus，DNA Thermal cycle480)上進行。程序如下94℃預變性5min，再進行35個循環(94℃45s，50℃ 1.5min，72℃ 1.5min)，最後72℃延伸10min。
2)PCR產物的克隆與分析PCR產物用1.0％瓊脂糖凝膠、1×TAE電泳緩衝液進行分析。電泳結果表明，除NLRRR+NLRRF引物對外，其餘9對引物分別在中間偃麥草基因組DNA中擴增到1～3條理想帶(如圖1所示)。圖1中樣品1、6、11、15、20、25、307XL；2、7、16、21、26、31HW642；4-6、8-10、12-14、17-19、22-24、27-29、32-34中間偃麥草；引物1-3K2A/EGF引物對；4EGF；5K2A；6-7NLRRF/NLRRR引物對；9NLRRR；10NLRRF；11-12RFKF/RLKR引物對；13RLKR；14RLKR；15-17S1/AS1引物對；18AS1；19S1；20-22ST2F/ST2R引物對，23ST2R；24ST2F；25-27CF9F/CF9R；28CF9R29CF9F；30-32K1A/HD引物對；33HD；34K1A；Mλ/EcoRI+HindIII分子marker。
用玻璃奶試劑盒回收中間偃麥草及7XL的預想PCR擴增片段，回收產物用pGEM-Teasy vector(Promega)連接，電激轉化E.coli JM109菌株感受態細胞，塗於含IPTG、X-gal和氨苄青黴素(75mg/ml)的LB平板上，37℃培養過夜，挑取單個白色菌落，液體LB培養後用鹼裂解法提取質粒DNA。以最接近克隆位點的EcoRI酶切來檢測插入片段的有無與大小，再用Sau3AI酶解重組克隆進行初步分類，每類抽取1-2個克隆，採用T7或SP6引物測定插入片段的序列，用Blast軟體在GenBank資料庫進行同源序列搜索。結果表明，獲得10個具有開放閱讀框的中間偃麥草RGA，分別屬於NBS，STK，LRR類。
實施例2、與抗黃矮病基因Bdv2連鎖的RGA的鑑定與轉化1)RFLP分析RFLP分析程序參見張增豔等(Science in China(Series C)，1999，42(6)663-668)。利用中間偃麥草RGA片段為探針，對EcoRI、EcoRV、BamHI、HindIII、DraI、PstI、XhoI、XbaI、BglII限制性內切酶消化的中間偃麥草、HW642、HW641S和小麥親本中8601等基因組DNA進行RFLP分折。結果表明，大多數RGA片段/酶切組合沒有多態性，只有1個RGA片段TirgaZ1(即序列表中的序列1，其編碼蛋白序列為序列2)與EcoRI酶切組合，能夠檢測出抗病雜交帶；進一步擴大抗病與感病樣品，結果表明，TirgaZ1/EcoRI組合能夠在含有Bdv2的抗病材料(中間偃麥草，L1、抗病易位系HW642、YW443、YW243、Y991029及F2抗病單株)中檢測到約3.5kb的特異雜交帶，而沒有Bdv2的感病系HW641S，感病小麥親本中7902、Vi、CS及F2感病單株沒有上述特異雜交帶(如圖2所示)，圖中，1-2中間偃麥草，37XL，4-7抗病易位系，8-9感病系和小麥親本。說明TirgaZ1是Bdv2連鎖的RGA基因片段，可作為篩選文庫的探針。
分析TirgaZ1序列，其具有NBS結構的保守域p-loop(kinase1)、kinase2、kinase3及domain1(GLPLA)。該序列含有537bp鹼基，其讀碼框為自5』端第1到537位鹼基。
2)特異PCR標記的建立為了用PCR法高效地篩選文庫，根據TirgaZ1序列及其與大腸桿菌基因組序列比較的結果，分別從5『端88-112鹼基、447-470鹼基設計了1對特異PCR引物，見序列表中的序列3和4，TZ1UGTA TGA TGG TAA AGC TTT GCT GCT A
TZ1LAGG CAA CTT CTT GGG TCA CTG TAT優化PCR擴增條件後，以具有Bdv2抗病材料和沒有Bdv2的感病材料的基因組DNA為模板，進行PCR擴增。結果表明，TZ1U、TZ1L能夠在具有Bdv2的抗黃矮病材料中擴增出約460bp的單一產物，而感病材料中無任何擴增產物(圖3)，說明特異的TirgaZ1/EcoRI標記成功地轉換為經典的特異PCR標記(SC-TZ1)，可用於PCR法篩選文庫。圖3中，CS、Vi、中7902、中8601、HW641S為感病材料，7XL、YW243、YW443、HW642、Y991029、L1、TAF46、中間偃麥草為抗黃矮病材料，M為Marker。
實施例3、抗病易位系基因組TAC文庫的篩選1)克隆池PCR法進行TAC文庫篩選用鹼裂解法提取抗病易位系HW642的基因組TAC文庫的所有混合質粒。通過克隆池PCR法進行篩選第1輪篩選以1000個混合克隆的質粒作為一個擴增模板進行；第2輪篩選將初級陽性克隆池稀釋鋪單板、收集50-60個克隆構成次級克隆池作為1個擴增模板，第三輪篩選是將次級陽性克隆池再次稀釋分離單菌落作為擴增模板。PCR擴增反應總體積為25μl，其組成為10mmol/L Tris-HCl(pH8.3)，50mmol/L KCl，2.0mmol/L MgCl2，dATP、dTTP、dGTP、dCTP各0.2mmol/L，Taq聚合酶1U，10-50ng質粒，特異PCR引物TZ1U+TZ1L各為0.5μmol/L，補水至25μl，反應在PCR儀9600或PTC-100上進行，擴增程序95℃變性3min，(94℃ 45s，64℃ 1min，72℃ 1.5min)35個循環；然後72℃延伸10min。
通過第一輪篩選，分離到3個初級陽性克隆。每個初級克隆池稀釋塗布，50-60個菌構成1個次級克隆池，再次pooled-PCR篩選，獲得13個次級陽性克隆池(如圖4所示，為1-17個次級克隆池)，將次級陽性克隆池稀釋鋪成單菌落，對每個次級陽性克隆池挑取96-192個單菌落分別做模板進行PCR篩選，獲得4個陽性單克隆T1，T2，T3，T4。同時用引物對TZ1U+TZ1L擴增這4個單克隆和抗病對照(中間偃麥草Ti、抗病易位系HW642R)與感病對照(感病系HW641SS、小麥親本8601)基因組DNA。結果(圖5)表明，這4個陽性單克隆與抗病對照擴增帶一致，4個陽性單克隆為侯選克隆。
2)陽性單克隆的鑑定用EcoRI、EcoRV、NotI、PstI、ScaI、XhoI、HindIII、XbaI、BamHI等9種限制性內切酶消化上述4個陽性TAC克隆質粒，結果表明4個陽性克隆分為2類，T1，T2，T3為1類，T4為另1類，插入片段分別為23、25kb左右，它們有共有序列也有不同序列。然後將陽性克隆T1和T4的酶切產物鹼變性後轉移到尼龍膜上，用標記的TirgaZ1片段作探針，進行Southern雜交分析。結果表明，各種酶切產物均有明顯的不同雜交帶，並且同一酶切產物雜交帶中包含1-2條相同帶和1-3相異帶(如圖6所示)，說明這2個克隆為含有NBS類R基因片段TirgaZ1的抗病侯選基因克隆。
將陽性克隆T1和T4的酶切產物鹼變性後轉移到尼龍膜上，分別以中間偃麥草、抗病易位系HW642、小麥親本中8610基因組DNA(約30ng)作探針，進行Southern分析，程序同上。由Southern分析圖譜可知，陽性克隆T1、T4的XhoI，EcoRV，EcoRI，PstI酶切產物，能與中間偃麥草、HW642的基因組DNA雜交出與小麥雜交不存在的特異雜交帶，說明陽性克隆T1和T4插入片段中有中間偃麥草特異片段。
上述結果說明，陽性克隆T1和T4是來源於抗黃矮病易位系的中間偃麥草易位染色體片段7XL的抗黃矮病侯選基因克隆。
序列表16042101211537212DNA213中間偃麥草(Thinopyrum intermedium)4001caacgctagt ggcaatccat cacatttctt tgcaagcttt ctcccaagtt tttcaaactc 60gtccacatca cgtatggcag accttttgta tgatggtaaa gctttgctgc taaatagttc120ccaacttttc tcttcatcta acttcttcaa atgatgaaca tgggttggca tttggacatg180atttgcaaca tcttccttcc gggtggttaa tagtactcta ctaccattag ttgcatctgg240aaaagcttta acccttttat ttatctggtc ccatgtgtcg gtttcccaca catcatcaag300aactaccaag tatctttttt gcaatagaaa atcatggatc tcctttccca cctcatactc360attcatctta gcaattgact catctctgcc ccccattatt tgtttcataa tatcctttag420taaatcaatg cccttgaatt tttgagatac agtgacccaa gaagttgcct caaagtgttg480tttgacacta gatgaagtgt atacttttct agcgagcgtt gtcttcccaa ccccacc 5372102211179212PRT213中間偃麥草(Thinopyrum intermedium)4002Gly Gly Val Gly Lys Thr Thr Leu Ala Arg Lys Val Tyr Thr Ser1 5 10 15Ser Ser Val Lys Gln His Phe Glu Ala Thr Ser Trp Val Thr Val20 25 30Ser Gln Lys Phe Lys Gly Ile Asp Leu Leu Lys Asp Ile Met Lys35 40 45Gln Ile Met Gly Gly Arg Asp Glu Ser Ile Ala Lys Met Asn Glu50 55 60Tyr Glu Val Gly Lys Glu Ile His Asp Phe Leu Leu Gln Lys Arg65 70 75Tyr Leu Val Val Leu Asp Asp Val Trp Glu Thr Asp Thr Trp Asp80 85 90
Gln Ile Asn Lys Arg Val Lys Ala Phe Pro Asp Ala Thr Asn Gly95 100 105Ser Arg Val Leu Leu Thr Thr Arg Lys Glu Asp Val Ala Asn His110 115 120Val Gln Met Pro Thr His Val His His Leu Lys Lys Leu Asp Glu125 130 135Glu Lys Ser Trp Glu Leu Phe Ser Ser Lys Ala Leu Pro Ser Tyr140 145 150Lys Arg Ser Ala Ile Arg Asp Val Asp Glu Phe Glu Lys Leu Gly155 160 165Arg Lys Leu Ala Lys Lys Cys Asp Gly Leu Pro Leu Ala Leu170 175 179210321125212DNA213人工序列220
223
4003gtatgatggt aaagctttgc tgcta 252104211
212DNA213人工序列220
223
4004aggcaacttc ttgggtcact gtat 2權利要求
1.一種抗黃矮病基因Bdv2連鎖的抗病同源序列TirgaZ1，是下列核苷酸序列之一1)序列表中的SEQ ID №1；2)編碼序列表中SEQ ID №2多肽序列的多核苷酸；3)與序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列具有90％以上同源性的DNA序列；4)與序列表中SEQ ID №1互補的DNA序列。
2.根據權利要求1所述的連鎖序列TirgaZ1，其特徵在於所述連鎖序列的核苷酸序列是序列表中的SEQ ID №1。
3.一種抗黃矮病基因Bdv2連鎖的抗病同源序列TirgaZ1編碼的蛋白，是具有序列表中序列2胺基酸序列的蛋白質，或者是將序列2的胺基酸序列經過一個或幾個胺基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與序列2的胺基酸序列相同活性的由序列2衍生的蛋白質。
4.根據權利要求3所述的蛋白質，其特徵在於它是具有序列表中序列2的胺基酸殘基序列。
5.一種抗黃矮病基因Bdv2連鎖序列TirgaZ1的專用引物SC-TZ1，是5』端的前六個核苷酸為gtatga和aggcaa的由6-30個核苷酸組成的核苷酸序列。
6.根據權利要求5所述的專用引物SC-TZ1，其特徵在於所述SC-TZ1核苷酸序列是與序列表中的SEQ ID №3、4限定的DNA序列具有90％以上同源性的序列。
7.根據權利要求5或6所述的專用引物SC-TZ1，其特徵在於所述SC-TZ1核苷酸序列是序列表中的SEQ ID №3、4。
8.權利要求1所述的連鎖的抗病同源序列TirgaZ1作為篩選抗黃矮病候選基因探針的應用。
9.一種篩選抗黃矮病候選基因的方法，其特徵在於用SC-TZ1為引物進行篩選。
全文摘要
本發明公開了一種抗黃矮病基因Bdv2連鎖的抗病同源序列及其專用引物與應用。該連鎖序列TirgaZ1與序列表中的SEQ ID №1限定的DNA序列具有90％以上同源性，其蛋白序列是具有序列表中序列2胺基酸序列的蛋白質。將TirgaZ1轉化為穩定的PCR專用引物SC－TZ1，即與序列表中的SEQ ID №3、4限定的DNA序列具有90％以上同源性的序列。本發明還提供了一種利用上述引物篩選抗黃矮病候選基因的方法，以TirgaZ1為探針，篩選得到四個抗黃矮病候選基因，並對其中一個克隆T1進行測序。本發明為篩選抗病基因，徹底防治植物病害提供了堅實的基礎，對快速培育優良的抗病作物，提高作物的產量和質量具有重大的意義。
文檔編號C12P19/34GK1566345SQ03146360
公開日2005年1月19日 申請日期2003年7月10日 優先權日2003年7月10日
發明者張增豔, 辛志勇, 許景升, 王曉萍, 劉耀光, 林志珊, 李連城, 馬有志, 徐惠君, 陳孝 申請人:中國農業科學院作物育種栽培研究所