一種透明質酸靶向的碳納米管負載抗癌藥物的製備方法

2023-04-25 01:09:31

一種透明質酸靶向的碳納米管負載抗癌藥物的製備方法
【專利摘要】本發明涉及一種透明質酸靶向的碳納米管負載抗癌藥物的製備方法，包括：（1）將多壁碳納米管和PEI在二甲基亞碸中通過EDC產生化學鍵合，透析凍幹，合成MWCNT/PEI；（2）將透明質酸溶解在水中加入EDC活化；（3）將上述MWCNT/PEI中加入FITC攪拌，再加入活化過的透明質酸，透析凍幹，合成MWCNT/PEI-FI-HA；（4）將上述MWCNT/PEI-FI-HA溶解於水中，加入DOX的水溶液，調節pH值，充分攪拌，透析凍幹即得載藥複合物。本發明的製備過程簡單，實驗條件為常溫常壓，易於操作；負載DOX後具有pH敏感型釋放及主動定位細胞的作用，有著很好的實用價值。
【專利說明】一種透明質酸靶向的碳納米管負載抗癌藥物的製備方法
【技術領域】
[0001]本發明屬於負載抗癌藥物領域，特別涉及一種透明質酸靶向的碳納米管負載抗癌藥物的製備方法。
【背景技術】
[0002]抗癌藥物的毒副作用和水溶性差一直是腫瘤化學治療中的瓶頸問題，因此使用藥物輸送系統受到了廣泛的關注。納米載藥系統憑藉其獨特的尺寸範圍(1-1OOnm)不僅可以降低藥物的生物毒性，有效提高藥物的溶解度和穩定性，還可以並且可以通過對藥物載體的修飾、載體藥物的選擇以及負載方法的設計來控制藥物的緩釋與定向輸送，從而達到最佳的治療效果。
[0003] 作為一種新型的納米級別材料，碳納米管在生物應用方面表現出了良好的潛能，由於碳納米管能夠攜帶藥物分子進入細胞，其表面連接靶向分子後，還可以實現特異性地靶向目標細胞，因此碳納米管很可能成為未來抗腫瘤藥物的理想載體，目前在基因、藥物、蛋白載體方面已經獲得廣泛的研究。由於碳納米管本身一般沒有可供反應的基團，不具有化學活性，所以在常見溶劑中存在易團聚、難分散的現象，這在很大程度上限制了碳納米管的研究與應用。因此，我們期望在保持碳納米管不被破壞，並保持中空管狀結構完整的前提下，使用化學方法對碳納米管進行一定程度的修飾，將一些活性官能團(羥基，羧基等)引入到碳納米管的表面。這不僅能夠提高碳納米管在常見溶劑中的溶解性，還能夠通過表面修飾的活性基團為碳納米管賦予新的功能。
[0004]聚乙烯亞胺(Polyethyleneimine, PEI)是一種攜帶大量氨基的高分子聚電解質材料，分為直鏈型和超支化型兩種，由於氨基的存在，可以連靜電吸附許多物質，也可以化
學鍵合一些反應基團。
[0005]聚乙烯亞胺同時也是一種高效的非病毒基因載體，它所具有的多個氨基使得PEI具有非常高的轉染效率。但是過多的表面氨基也加大了其細胞毒性，因此限制了 PEI的應用。因此，有必要對聚乙烯亞胺進行表面改性，一方面降低其細胞毒性；另一方面賦予PEI以新的功能，拓寬其應用範圍。
[0006]透明質酸(HA)主要分布於機體的組織、體液及細胞間質中。可以與細胞表面受體(CD44)結合，調節細胞的遷移、粘附和增殖.透明質酸在正常組織的含量很低，當機體出現免疫反應、變態反應等才會出現升高.研究結果表明，CD44與HA的特異性結合可促使已進入血流的癌細胞傾向於向HA轉移，並且HA特異性受體⑶44在多種惡性腫瘤中(Hela，KB等細胞)中均存在過度表達。採用透明質酸-螢光探針技術，可動態觀察到CD44在機體內的分布狀況，同樣也可作為含透明質酸受體腫瘤治療的靶向位點及對惡性腫瘤判斷的依據。
[0007]鹽酸阿黴素(Doxorubicin, D0X)屬蒽環類抗腫瘤抗生素,是一種抑制DNA和RNA合成的抗腫瘤藥物。其作用機制主要是嵌入DNA的相鄰鹼基對使DNA發生錯配，從而使DNA鏈裂解，阻礙DNA和RNA合成，對RNA的抑制作用最強。DOX抗瘤譜比較廣，對多種腫瘤均有作用，對各種生長周期的腫瘤細胞都有殺滅作用，屬於周期非特異性藥物。然而，DOX在大劑量時會對正常細胞也會產生強烈的細胞毒性。因此，為了降低DOX對人體的正常組織造成毒副作用，使用藥物載體對DOX進行負載，控制其釋放是十分必要的。
[0008]檢索國內外有關DOX靶向運輸方面的文獻和專利表明:以透明質酸修飾的碳納米管為載體材料，通過堆積作用負載阿黴素，達到靶向、PH敏感釋放的多重功效的研究還沒有報導。

【發明內容】

[0009]本發明所要解決的技術問題是提供一種透明質酸靶向的碳納米管負載抗癌藥物的製備方法，該方法操作簡單、反應條件溫和；該碳納米管複合材料可裝載抗腫瘤藥物D0X,該載藥複合物具有pH值敏感釋放，並且能夠主動對HeLa細胞進行靶向的殺傷作用。
[0010]本發明的一種透明質酸靶向的碳納米管負載抗癌藥物的製備方法，包括:
[0011](I)將多壁碳納米管分散在二甲基亞碸溶液中，加入EDC活化；加入PEI的二甲基亞碸溶液，於常溫下反應I~2天，透析除去未反應雜質，冷凍乾燥得到MWCNT/PEI ；
[0012](2)將上述MWCNT/PEI溶於水中，加入FITC的二甲基亞碸溶液，得到MWCNT/PE1-FI溶液；將I~2g透明質酸溶解在水中加入EDC活化，加入MWCNT/PE1-FI溶液中，常溫下反應I~2天，透析除去未反應雜質，最後冷凍乾燥得到MWCNT/PE1-F1-HA ；
[0013](3)將上述MWCNT/PE1-F1-HA溶解於水中，加入DOX的水溶液，調節pH值，充分攪拌，透析凍幹即得透明質酸靶向的碳納米管負載抗癌藥物。
[0014]所述步驟(1)中的多壁碳納米管與PEI的質量比為1:1~1:2。
[0015]所述步驟(1)中的多壁碳納米管與EDC的質量比為1:0.5~1:1.2。
[0016]所述步驟(2)中的MWCNT/PEI與FITC的質量比為1: 0.02~1: 0.05。
[0017]所述步驟(2)中的透明質酸與EDC的質量比為1:0.05~1:0.1。
[0018]所述步驟(2)中的MWCNT/PE1-FI與透明質酸的質量比為1:5~1:10。
[0019]所述步驟(2)中的MWCNT/PE1-F1-HA與DOX的質量比為1:0.5~1:2。
[0020]所述步驟(1)、(2)、(3)中的透析工藝為採用透析袋，先在pH=6_7的緩衝液中透析，再在水中透析。
[0021]對負載抗癌藥物的多功能碳納米管的製備、藥物緩釋及腫瘤靶向治療研究，做了一些測試:
[0022](1) TEM測試結果
[0023]TEM結果表明:多壁碳納米管經過多功能修飾過後依然保持其中空管狀結構，即修飾僅發生在碳納米管的表面，並不改變碳納米管本身的結構。參見圖1。
[0024](2) NMR測試結果
[0025]NMR測試結果表明:以多壁碳納米管為模板，PEI及HA分子成功的連接在碳納米管的表面。參見圖2。
[0026](3) UV-Vis 測試結果
[0027]UV-Vis圖譜證明了 FITC及PEI成功的連接在碳納米管的表面:參見圖3。
[0028](4) TGA測試結果
[0029]TGA的結果表明:選取421 °C為計算溫度，修飾在碳納米管表面的PEI約為26%，HA約為47%。參見圖4。[0030](5)藥物釋放結果
[0031]藥物釋放曲線表明:在72h後，DOX在pH=5.8的緩釋液中約釋放55%。而在PBS環境中僅釋放40%，兩者的釋放率存在顯著差異。參見圖5。
[0032](6) MTT細胞活力測定結果
[0033]MTT細胞活力測定結果表明:多壁碳納米管複合物本身生物相容性較好，細胞損傷較小，載藥複合物對HeLa細胞殺傷效果明顯。參見圖6。
[0034](7)流式細胞儀測定結果
[0035]流式細胞儀測定結果表明:靶向細胞HeLa對DOX的吞噬能力明顯高於非靶向細胞L929，表明載藥複合物MWCNT/PE1-F1-HA/DOX對HeLa細胞有著特異的治療效果。參見圖7。
[0036](8)雷射共聚焦顯微鏡測定結果
[0037]雷射共聚焦顯微鏡測定結果:用載藥複合物MWCNT/PE1-F1-HA/DOX分別作用於HeLa細胞和L929細胞4h後，HeLa細胞有明顯的螢光，說明載藥複合物MWCNT/PE1-F1-HA/DOX對HeLa細胞具有特異的治療效果。參見圖8。
[0038]有益.效果
[0039](I)本發明採用化學鍵合的方法，合成具有靶向性的多壁碳納米管複合材料，製備方法操作簡單、實驗條件溫 和。
[0040](2)本發明的多壁碳納米管複合材料克服了碳納米管分散性差的缺陷，有較高的藥物負載能力，且有PH敏感型釋放的性能。具有應用其做後續相關實驗分析的潛力。
[0041](3)透明質酸修飾過的多壁碳納米管複合材料對CD44受體表達的癌細胞具有靶向殺傷效果。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0042]圖1為本發明製備的多功能碳納米管MWCNT/PE1-F1-HA的TEM圖譜。
[0043]圖 2 為 MWCNT/PE1、HA 及 MWCNT/PE1-F1-HA 的 1H-NMR 圖譜；其中 2a 為 MWCNT/PE1、2b 為 HA、2c 為 MWCNT/PE1-F1-HA。
[0044]圖 3 為 MWCNT/PE1、HA 及 MWCNT/PE1-F1-HA 的 UV-Vis 圖譜。
[0045]圖 4 為 MWCNT/PE1、HA 及 MWCNT/PE1-F1-HA 的 TGA 分析。
[0046]圖5為載藥複合物CNT/D0X在不同pH值環境下的釋放曲線。
[0047]圖6 為 MTT 法測試的 HeLa 細胞經過 MWCNT/PE1-F1-HA (a)及 MWCNT/PE1-F1-HA/DOX (b)處理24h後的細胞活力。
[0048]圖7分別為不同濃度下的MWCNT/PE1-F1-HA/DOX載藥複合物(a，b，c)處理過的L929細胞，及不同濃度下的MWCNT/PE1-F1-HA/DOX載藥複合物(d，e，f )處理過的HeLa細胞的流式細胞圖，(g)為MWCNT/PE1-F1-HA/DOX載藥複合物在兩種細胞下的主螢光強度，(h)為兩種細胞對MWCNT/PE1-F1-HA/DOX載藥複合物中DOX的吞噬能力分析。
[0049]圖8分別為MWCNT/PE1-F1-HA/DOX載藥複合物處理過的L929細胞及HeLa細胞的雷射共聚焦顯微鏡圖。
【具體實施方式】
[0050]下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。此外應理解，在閱讀了本發明講授的內容之後，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落於本申請所附權利要求書所限定的範圍。
[0051]實施例1
[0052](1)將羧基化的 CNT (344.9mg)，溶解在 40mL DMSO 中，然後加入 EDC (354.32mg)活化攪拌反應3h。在攪拌的情況下，逐滴加入IOmL含PEI (540.01mg)的DMSO溶液，在室溫狀態下超聲攪拌反應24h。最後將反應溶液放入透析袋(MW=100，000)中，用透析法將未反應的雜質及副產物除去，先用PBS緩衝液透析2次，每次2L，再用蒸餾水透析7次。最後將產物冷凍乾燥後獲得MWCNT/PEI。
[0053](2)稱取360mgMWCNT/PEI於水中加 入12.5mgFITC的DMSO溶液，另稱取1.8g透明質酸於水中加入120.96mgEDC活化三小時，之後加入MWCNT/PEI溶液中，攪拌反應24h後。最後將反應溶液放入透析袋(MW=100，000)中，用透析法將未反應的雜質及副產物除去，先用PBS緩衝液透析2次，每次2L，再用蒸餾水透析7次。最後將產物冷凍乾燥。
[0054](4)對最終產物的TEM表徵如圖1所示，可以看出多壁碳納米管經過多功能修飾過後依然保持其中空管狀結構，即修飾僅發生在碳納米管的表面，並不改變碳納米管本身的結構。
[0055]實施例2
[0056](1)將羧基化的CNT (300mg),溶解在30mL DMSO中，然後加入EDC (304mg)活化攪拌反應3h。在攪拌的情況下，逐滴加入IOmL含PEI (452.3mg)的DMSO溶液，在室溫狀態下超聲攪拌反應24h。最後將反應溶液放入透析袋(MW=100，000)中，用透析法將未反應的雜質及副產物除去，先用PBS緩衝液透析2次，每次2L，再用蒸餾水透析7次。最後將產物冷凍乾燥後獲得MWCNT/PEI。
[0057](2)稱取200mgMWCNT/PEI於水中加入12.5mgFITC的DMSO溶液，另稱取Ig透明質酸於水中加入70mgEDC活化三小時，之後加入MWCNT/PEI溶液中，攪拌反應24h後。最後將反應溶液放入透析袋(MW=100，000)中，用透析法將未反應的雜質及副產物除去，先用PBS緩衝液透析2次，每次2L，再用蒸餾水透析7次。最後將產物冷凍乾燥。
[0058](4) MWCNT/PE1、HA、MWCNT/PE1-F1-HA 的 1H-NMR 圖譜如圖 2 所示，圖 2a 中的化學位移均為透明質酸中葡糖醛酸及N-乙醯氨基葡糖的質子峰。圖2b中的化學位移為2.37~
3.3Ippm的峰為PEI上的氨基質子峰，圖2c中相對於圖2a,在化學位移為2.31~2.89ppm之間出現了許多小的質子峰，即MWCNT/PEI分子的特徵峰。這些結果表明HA與MWCNT/PEI成功連接在一起。
[0059]實施例3
[0060](1)將IOmg MWCNT/PE1-F1-HA,溶解在IOmL水中，在攪拌的情況下，逐滴加入4mL含DOX (4mg)的水溶液，用氫氧化鈉調節pH值=8.5，在室溫狀態下，攪拌4h。最後將溶液放入透析袋(MW=8，000~14，000)中，用透析法將連接的藥物除去，先用PBS緩衝液透析3次，每次2L。最後將產物冷凍乾燥後獲得CNT/D0X載藥複合物。
[0061 ] (2 )將上述MWCNT/PE1-F1-HA/DOX載藥複合物在37 °C、兩種不同pH的緩衝液(pH=5.8、pH=7.4)下進行緩釋，通過UV-Vis檢測釋放的藥量來研究其對DOX的釋放效果。
[0062](3)將上述MWCNT/PE1-F1-HA/DOX載藥複合物與相同濃度下的純藥DOX及MWCNT/PE1-F1-HA分別作用於人子宮頸癌細胞(HeLa細胞)，培養24h後，通過MTT法檢測細胞活力來研究MWCNT/PE1-F1-HA/DOX載藥複合物對Hela的毒性作用及MWCNT/PE1-F1-HA的生物相容性；其中DOX的濃度為0.5~4 μ M。
[0063](4)將上述MWCNT/PE1-F1-HA/DOX載藥複合物分別作用於含有CD44受體的HeLa細胞及不含有CD44受體的小鼠胚胎成纖維細胞(L929細胞)，培養4個小時後，清洗細胞，使培養液中不含有游離的MWCNT/PE1-F1-HA/DOX載藥複合物，收集細胞進行流式細胞儀檢測。
[0064](5)將上述MWCNT/PE1-F1-HA/DOX載藥複合物分別作用於含有CD44受體的Hela細胞及不含有CD44受體的L929細胞，培養4個小時後，清洗、固定並對細胞進行染色，將染色完的蓋玻片放入雷射共聚焦顯微鏡中進行檢測。
【權利要求】
1.一種透明質酸靶向的碳納米管負載抗癌藥物的製備方法，包括: (1)將多壁碳納米管分散在二甲基亞碸溶液中，加入EDC活化；加入PEI的二甲基亞碸溶液，於常溫下反應I~2天，透析除去未反應雜質，冷凍乾燥得到MWCNT/PEI ； (2)將上述MWCNT/PEI溶於水中，加入FITC的二甲基亞碸溶液，得到MWCNT/PE1-FI溶液；將I~2g透明質酸溶解在水中加入EDC活化，加入MWCNT/PE1-FI溶液中，常溫下反應I~2天，透析除去未反應雜質，最後冷凍乾燥得到MWCNT/PE1-F1-HA ； (3)將上述MWCNT/PE1-F1-HA溶解於水中，加入DOX的水溶液，調節pH值，充分攪拌，透析凍幹即得透明質酸靶向的碳納米管負載抗癌藥物。
2.根據權利要求1所述的一種透明質酸靶向的碳納米管負載抗癌藥物的製備方法，其特徵在於:所述步驟(1)中的多壁碳納米管與PEI的質量比為1:1~1:2。
3.根據權利要求1所述的一種透明質酸靶向的碳納米管負載抗癌藥物的製備方法，其特徵在於:所述步驟(1)中的多壁碳納米管與EDC的質量比為1:0.5~1:1.2。
4.根據權利要求1所述的一種透明質酸靶向的碳納米管負載抗癌藥物的製備方法，其特徵在於:所述步驟(2)中的MWCNT/PEI與FITC的質量比為1: 0.02~1: 0.05。
5.根據權利要求1所述的一種透明質酸靶向的碳納米管負載抗癌藥物的製備方法，其特徵在於:所述步驟(2)中的透明質酸與EDC的質量比為1:0.05~1:0.1。
6.根據權利要求1所述的一種透明質酸靶向的碳納米管負載抗癌藥物的製備方法，其特徵在於:所述步驟(2)中的MWCNT/PE1-FI與透明質酸的質量比為1:5~1:10。
7.根據權利要求1所述的一種透明質酸靶向的碳納米管負載抗癌藥物的製備方法，其特徵在於:所述步驟(2)中的MWCNT/PE1-F1-HA與DOX的質量比為1:0.5~1:2。
8.根據權利要求1所述的一種透明質酸靶向的碳納米管負載抗癌藥物的製備方法，其特徵在於:所述步驟(1)、(2)、(3)中的透析工藝為採用透析袋，先在pH=6-7的緩衝液中透析，再在水中透析。
【文檔編號】A61K31/704GK103893777SQ201410095491
【公開日】2014年7月2日 申請日期:2014年3月14日 優先權日:2014年3月14日
【發明者】史向陽, 曹雪雁, 陶磊 申請人:東華大學