黑木耳菌種的製作方法

2023-04-25 00:56:26

本發明涉及一株黑木耳菌種。
背景技術：
：黑木耳[auriculariaauricula(lexhook)underw]隸屬於擔子菌門、層菌綱、木耳目、木耳科、木耳屬，是世界上最早開始人工栽培的高等膠質擔子菌，具有滋潤強壯，清肺益氣，補血活血等功效，深受人們的喜愛。浙江省麗水市是中國南方黑木耳的主栽地區，近年來的栽培規模穩定在1.5億棒左右。隨著黑木耳代料栽培規模的擴大，市場上對黑木耳級別的劃分也產生了不同的標準，黑褐色、耳片小，單片、肉厚等特徵越來越成為優質耳的評價標準。現有的本地傳統栽培品種中，品種「916」片大、前期優質耳比例低；另一主栽品種「新科」耳形好、大小適中，但抗流耳能力較差，主要用於段木栽培。隨著黑木耳產業的發展，後備品種不足的問題日益凸顯，選育品質優、產量高、商品性佳、市場前景好的優良品種顯得尤為重要。技術實現要素：本發明要解決現有生產中使用的黑木耳菌種存在著小孔出耳不易形成單片、產量低、品質差的技術問題，而提供一株品質優、產量高、商品性佳、市場前景好的黑木耳菌種。本發明的黑木耳菌種麗耳3號，屬於黑木耳屬，保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址為北京市朝陽區北辰西路1號院3號，保藏日期為2016年7月5日，保藏編號為cgmccno.12525，分類命名為auriculariaauricula。麗耳3號菌種在pda培養基上菌絲體呈匍匐狀，菌絲較濃密，邊緣整齊、分支明顯。子實體為單片單生，小孔出耳單片率達到90%以上，耳片大小適中，無根，呈碗狀或耳狀，幹耳背面灰色，腹面黑色、有光澤，正反面顏色差別大，耳片邊緣圓整、背麵筋脈不明顯。麗耳3號由黑木耳「新科」和「916」通過單雙雜交育成，雜交菌株編號「x6」，篩選後進入栽培試驗，菌株統一編號後為「a18」。栽培試驗表明，該菌株具有早熟性好、子實體單生、背筋少的遺傳表現型特徵。該菌株改良了其親本「新科」易流耳、產量低，以及另一親本「916」出耳片成叢生狀的缺點，融合了親本「新科」早熟、耳形好和「916」高產、抗性好的優點，綜合性狀優良，定名為「麗耳3號」。本發明的黑木耳菌種經dna（issr）指紋多態性分析，其結果為：15條引物對待檢菌株1~3均擴增出穩定的條帶，多態性條帶在7~19條，15條issr引物對3個黑木耳待檢菌株1~3共擴增出201條穩定性條帶，其中多態性條帶達145條，多態性比率為72.14%。待檢菌株黑木耳-麗耳3號與對照菌株黑木耳-「新科」相似性係數為62%，與對照菌株黑木耳「916」的相似性係數為47%，可推定待檢菌株黑木耳-麗耳3號為不同於兩個對照菌株的新品種。rapd指紋圖譜分析結果表明：待檢菌株黑木耳-麗耳3號與對照菌株黑木耳-「新科」相似性係數為74%，對照菌株黑木耳「916」相似性係數為56%，也可推定待檢菌株黑木耳-麗耳3號為不同於兩個對照菌株的新品種。應用菌株的拮抗反應對麗耳3號與其親本菌株「新科」及「916」的差異的判斷，檢測結果表明，3個供試黑木耳菌株彼此之間交界處菌絲均呈現溝型，有明顯拮抗反應，進一步推定待檢菌株黑木耳-麗耳3號是不同於兩個對照菌株的新品種。由於本發明所提供的麗耳3號菌種具有子實體單片單生，耳片大小適中，無根，呈碗狀或耳狀，幹耳背面灰色，腹面黑色、有光澤，正反面顏色差別大，耳片邊緣圓整、背麵筋脈不明顯等黑木耳的品質特點，且黑木耳出耳單片率達到90%以上，改良了「新科」抗性差和「916」耳型差的缺點，具有良好的推廣前景。附圖說明圖1、引物h9、h23、p19、p23、p26對黑木耳菌株擴增的issr指紋圖譜（從左到右菌株編號依次為1~3，marker為dl2000）；圖2、引物h33、h26、h28、h25、p11對黑木耳菌株擴增的issr指紋圖譜（從左到右菌株編號依次為1~3，marker為dl2000）；圖3、引物h19、h20、p4、p27、p20對黑木耳菌株擴增的issr指紋圖譜（從左到右菌株編號依次為1~3，marker為dl2000）；圖4、黑木耳待檢菌株issr多態性的聚類圖；圖5、引物r2、r4、r5、r13、r6對黑木耳菌株擴增的rapd指紋圖譜（從左到右菌株編號依次為1~3，marker為dl2000）；圖6、引物r16、r18、r20、r14、r7對黑木耳菌株擴增的rapd指紋圖譜（從左到右菌株編號依次為1~3，marker為dl2000）；圖7、引物r8、r9對黑木耳菌株擴增的rapd指紋圖譜（從左到右菌株編號依次為1~3，marker為dl2000）；圖8、黑木耳待檢菌株rapd多態性的聚類圖；圖9、黑木耳麗耳3號(平板左)與「新科」(平板右)拮抗反應圖；圖10、黑木耳麗耳3號(平板左)與「916」(平板右)拮抗反應圖；圖11、黑木耳「新科」(平板左)與「916」(平板右)拮抗反應圖。具體實施方式實施例1：選用當地主栽的黑木耳「新科」和「916」做雜交親本，通過單單雜交和單雙雜交技術獲得f1代雜交菌株，經實驗室菌絲生長觀察和栽培試驗，篩選出菌絲生長旺盛、子實體單生、產量高於親本的菌株，收集子實體通過組織分離技術得到2代菌株；進一步開展栽培試驗，篩選得到目標農藝性狀較為穩定的優良菌株，組織分離後獲得雜交菌株編號「x6」，篩選後進入栽培試驗，該菌株早熟性好、子實體單生、背筋少，在品比栽培試驗中高產、穩產性表現突出。後經單株篩選後獲得穩定株系，該菌株改良了老品種「新科」易流耳、產量低和「916」叢生的缺點，融合了親本新科早熟、耳形好和916高產、抗性好的優點，綜合性狀優良，定名為「麗耳3號」。依據中華人民共和國農業行業標準《ny/t1730-2009食用菌菌種真實性鑑定issr法》，對本菌株進行與其親本的dna差異對比。送檢材料：黑木耳菌株3個，其中待檢菌株為麗耳3號，對照菌株2株分別為「新科」和「916」。檢驗方法：issr試驗引物序列（表1）主要參考文獻《中國黑木耳主要栽培菌株issr指紋分析及scar標記》、《黑龍江地區野生黑木耳菌種的issr指紋分析》、《黑木耳栽培菌株的issr分析》，由擎科生物技術有限公司合成。待檢菌株菌絲體活化，培養，基因組dna提取，質量檢測，pcr擴增及電泳檢測均按照中華人民共和國農業行業標準《ny/t1730-2009食用菌菌種真實性鑑定issr法》。表1菌種真實性鑑定所用issr引物待檢種類引物名稱引物序列黑木耳h1gagagagagagagagat黑木耳h2gagagagagagagagac黑木耳h3agagagagagagagagg黑木耳h4agagagagagagagagc黑木耳h5gsgtgtgtgtgtgtgtgt黑木耳h6agagagagagagagagt黑木耳h7tctctctctctctctcc黑木耳h8agagagagagagagagya黑木耳h9agagagagagagagagyc黑木耳h10gagagagagagagagayc黑木耳h11gagagagagagagagayt黑木耳h12gagagagagagagagayg黑木耳h13gagagagagagagagaa黑木耳h14tgcacacacacacac黑木耳h15gtgacacacacacac黑木耳h16agtgtgtgtgtgtgt黑木耳h17ccagtggtggtggtg黑木耳h18ggagtggtggtggtg黑木耳h19agagagagagagagaggc黑木耳h20acacacacacacacaccg黑木耳h21acacacacacacacac黑木耳h22acacacacacacacacc黑木耳h23gtgacgactctctctct黑木耳h24cacacacacacacacag黑木耳h25acacacacacacacacg黑木耳h26agagagagagagagagyt黑木耳h27cacacacacacacacarc黑木耳h28acacacacacacacacya黑木耳h29cacacacacacacacaa黑木耳h30tgtgtgtgtgtgtgtgc黑木耳h31tgtgtgtgtgtgtgtgg黑木耳h32agcagcagcagcagcagc黑木耳h33gacagacagacagaca黑木耳p4ggatgcaacacacacacac黑木耳p5cgtgtgtgtgtgtgt黑木耳p11gagagagagagagagaac黑木耳p13tctctctctctctctccg黑木耳p15gtgtgtgtgtgtgtgtta黑木耳p16tgtgtgtgtgtgtgtgga黑木耳p19acacacacacacacacct黑木耳p20acacacacacacacacctg黑木耳p21agcagcagcagcagcagcg黑木耳p22aagaagaagaagaagaagc黑木耳p23gagagagagagagagact黑木耳p24cacgagagagagagaga黑木耳p25gagagagagagagagacc黑木耳p26caccacacacacacaca黑木耳p27gtatgtatgtatgtatgg黑木耳p28gtatgtatgtatgtatgc結果與分析：黑木耳菌株的issr指紋圖譜：利用49條引物對3個供試黑木耳菌種進行了issr擴增，從中選取能夠擴增出穩定特異條帶的15條引物，分別為h9、h19、h20、h23、h25、h26、h28、h33、p4、p11、p19、p20、p23、p26、p27。15條引物對待檢菌株1~3均擴增出穩定的條帶，多態性條帶在7~19條，15條issr引物對3個黑木耳待檢菌株1~3共擴增出201條穩定性條帶，其中多態性條帶達145條，多態性比率為72.14%(圖1~圖3)。聚類分析：對擴增產物進行分析，將試驗出現的穩定性條帶進行統計，有條帶的記為1，無條帶記為0，用ntsys-pc2.0軟體進行聚類分析。檢測結論。issr分析結果表明：待檢菌株黑木耳-麗耳3號與對照菌株黑木耳-新科相似性係數為62%，與對照菌株黑木耳916的相似性係數為47%，推測待檢菌株黑木耳-麗耳3號為不同於兩個對照菌株的新品種（圖4）。麗耳3號在不同海拔的環境適應性及產量結果表明，具有一定的豐產特徵。參試菌株：浙耳608、916、麗耳2號、新科、842、早黑1號、862、麗耳3號。試驗地點：慶元、淳安、麗水百果園、蓮都區、武義。試驗安排：菌種統一製作，各試驗點按照當地生產管理方式進行栽培管理。試驗結果：試驗發現，麗耳3號菌絲生長速度較快，菌絲菌棒時間較其它菌株短2天以上，菌株長勢較好。年試驗菌株發菌速度統計單位：mm/d菌株慶元麗水百果園蓮都區淳安武義平均發菌速度浙耳6083.553.963.703.273.503.609163.573.964.113.543.303.70麗耳2號2.883.343.503.083.003.16新科3.163.643.573.203.003.318423.313.933.943.383.403.59早黑1號3.054.164.813.373.503.788623.224.124.073.203.703.66麗耳3號3.274.483.593.574.003.78栽培發現，麗耳3號耳芽形成時間早於其它菌株，比916和新科提早5天以上；較強的耳芽形成能力可促使耳芽及早封住刺孔口，降低雜菌侵染機率，有效降低排場後菌棒汙染率。產量：栽培試驗結果表明，麗耳3號的產量高於其它菌株。經方差分析和產量統計學分析，各試驗點處理間、地點、品種、品種與地點均具有極顯著的差異；麗耳3號與菌株842無顯著性產量差異，但與其它6個菌株間存在顯著性產量差異。試驗菌株產量結果統計單位：g/棒菌株慶元麗水百果園蓮都區淳安武義平均單產浙耳60867.8648.0739.654.4463.0054.5991671.0947.3740.256.1272.0057.35麗耳2號33.0264.6026.453.8730.0041.57新科63.549.1732.853.1173.0054.3184256.481.3742.657.7866.0060.83早黑1號61.171.4137.255.5361.0045.0486264.356.4633.554.4458.0053.34麗耳3號78.456.0447.958.4074.0062.94試驗菌株產量方差分析表變異來源自由度平方和均方ff0.05f0.01區組256.8428.421.573.114.89處理間3925466.55652.9935.98**1.561.87地點412502.923125.73172.24**2.493.57品種74816.44688.0637.91**2.132.88地點×品種288147.19290.9716.03**1.621.98誤差781415.5118.15總變異11926938.9註：數據採用stst方差分析軟體分析，統計分析時，小數點後取一位。試驗菌株產量統計學分析品種平均產量（g/棒）5%差異1%差異麗耳3號63.8aa84262.0aab91658.8bbc早黑1號58.1bcbcd新科55.2cdcd浙耳60855.2cdcd86253.9dd麗耳2號41.6ee麗耳3號在不同海拔表現出了較強的環境適應性，雖遭遇2015年秋冬季高溫多雨的惡劣天氣，仍表現出優良的菌株特性；從接種菌棒到第一次耳片採收，麗耳3號約需78-89天，菌株早熟性好；耳芽形成快，年內可採耳2-3潮，秋冬耳在總產量中佔比80%以上，優質耳比例高；耳片單生、商品性好；出耳早，年後採收1-2潮後即可結束栽培過程，有效縮短了生產周期，節省了時間和管理成本，又可避過春季的多雨天氣，整體上大幅提高了產品品質和經濟效益。實施例2：以rapd法進行對本菌株與其親本的dna差異對比。檢測依據：依據中華人民共和國農業行業標準《ny/t1743-2009食用菌菌種真實性鑑定rapd法》進行菌種dna的提取和最優引物的確定。送檢材料：黑木耳菌株3個，其中待檢菌株為麗耳3號，對照菌株2株分別為「新科」和「916」。檢驗方法：實驗引物序列（表6）依據《ny/t1743-2009食用菌菌種真實性鑑定rapd法》，由擎科生物技術有限公司合成。待檢菌株菌絲體活化，培養，基因組dna提取，質量檢測，pcr擴增及電泳檢測均按照中華人民共和國農業行業標準《ny/t1743-2009食用菌菌種真實性鑑定rapd法》。表6.菌種真實性鑑定所用rapd引物待檢種類引物名稱引物序列黑木耳r1aatcgggctg黑木耳r2acttcgccac黑木耳r3aggggtcttg黑木耳r4agtcagccac黑木耳r5caatcgccgt黑木耳r6caggcccttc黑木耳r7cccatatccc黑木耳r8ccgatatccc黑木耳r9ccgcatctac黑木耳r10gaaacgggtg黑木耳r11gaccgcttgt黑木耳r12gacggatcag黑木耳r13gggaattcgg黑木耳r14gggtaacgcc黑木耳r15ggtgatcagg黑木耳r16gtgacgtagg黑木耳r17gtgaggcgtc黑木耳r18gtgatcgcag黑木耳r19gttgccagcc黑木耳r20tcggcgatag黑木耳r21tgagtgggtg黑木耳r22tgccgagctg結果與分析：黑木耳菌株的rapd指紋圖譜。利用22條引物對3個黑木耳菌種進行了rapd擴增，從中選取能夠擴增出穩定特異條帶的12條引物，分別為r2、r4、r5、r6、r7、r8、r9、r13、r14、r16、r18、r20。12條引物對黑木耳菌株1~3均擴增出穩定的條帶，多態性條帶在6~16條，12條rapd引物對3個黑木耳菌株1~3共擴增出133條穩定性條帶，其中多態性條帶達57條，多態性比率為57.14%(圖5~圖7)。聚類分析：對擴增產物進行分析，將試驗出現的穩定性條帶進行統計，有條帶的記為1，無條帶記為0，用ntsys-pc2.0軟體進行聚類分析。檢測結論：rapd指紋圖譜分析結果表明：待檢菌株黑木耳-麗耳3號與對照菌株黑木耳-新科相似性係數為74%，對照菌株黑木耳916相似性係數為56%，推測待檢菌株黑木耳-麗耳3號不同於兩個對照菌株的新品種（圖8）。實施例3：以拮抗反應法進行對本菌株與其親本的dna差異對比。檢測依據：依據中華人民共和國農業行業標準《ny/t1845-2010食用菌菌種區別性鑑定拮抗反應》進行待檢樣品的接種、培養和觀察。送檢材料：黑木耳菌株3個，其中待檢菌株為麗耳3號，對照菌株2株分別為「新科」和「916」。檢驗方法：嚴格按照無菌操作，用φ5mm打孔器分別打取活化後適齡菌種菌落邊緣作接種塊，兩接種塊間隔30mm，分別置於距pda平板中心點的15mm處，菌絲朝上。在25℃的溫度下，通風、避光培養至接種塊菌絲接觸後，再在自然光下培養5d~7d。結果與分析：在燈下或自然光下，觀察培養物表面兩菌株交界處菌絲反應，結果如圖所示(圖9-圖11)。檢測結論：檢測結果表明，3個供試黑木耳菌株彼此之間交界處菌絲均呈現溝型，有明顯拮抗反應，推測待檢菌株黑木耳-麗耳3號不同於兩個對照菌株的新品種。當前第1頁12