植物耐旱性相關蛋白及其編碼基因與應用的製作方法

2023-04-24 23:34:36

專利名稱：：植物耐旱性相關蛋白及其編碼基因與應用的製作方法
技術領域：
：本發明涉及植物耐旱性相關蛋白及其編碼基因與應用，特別涉及一種來源於擬南芥的植物耐旱性相關蛋白及其編碼基因與應用。
背景技術：
：乾旱是非生物脅迫中限制作物產量的主要因素，由於乾旱而導致的作物損失量超過其他逆境造成損失的總和。隨著人類的經濟發展和人口膨脹，水資源短缺現象日趨嚴重，這也直接導致了千旱地區的擴大與幹早化程度的加重，乾旱化趨勢已成為全球關注的問題。因此，了解和認識植物對乾旱脅迫的反應機制，進而提高植物特別是農作物的抗旱能力，已成為如何進一步提高作物產量的重要研究工作，倍受世界各國政府和科學家的關注，也是當前生命科學研究的熱點。擬南芥C^a&'f/opw'st力ah'a朋)是一種典型的模式植物(其作用與實驗鼠、果蠅等模式生物相當)，已被廣泛應用於植物遺傳學、發育生物學和分子生物學的研究。擬南芥約有1.3億個鹼基對，約2.7萬個基因。目前大部分基因的功能還不清楚，利用突變技術研究基因功能已經成為一種有效的方法。對擬南芥而言，T-DNA插入突變是主要途徑，並且己經得到大量T-DNA插入突變體。擬南芥的大多數基因在其他植物中都能找到與之同源的序列，有關擬南芥的絕大多數發現也都能應用於其他植物研究。以往的研究已經證明，對擬南芥的研究將幫助科學家找到提高農作物產量的方法。面對農作物生產中日益嚴重的土壤乾旱問題，克隆植物耐旱基因並對其功能進行研究，對儘快培育作物耐乾旱品種有重要的實踐意義。
發明內容本發明的目的是提供一種植物耐旱性相關蛋白及其編碼基因與應用。本發明所提供的植物耐旱性相關蛋白，名稱為AtDT-2(^^&VoAsAz^"'朋aDroughtTolerance),來源於擬南芥屬擬南芥(AraWopw\st力a〃朋a),是如下(a)或(b)的蛋白質(a)由序列表中序列2的胺基酸殘基序列組成的蛋白質；(b)將序列表中序列2的胺基酸殘基序列經過一個或幾個胺基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有植物耐旱性功能的由(a)衍生的蛋白質。其中，序列表中的序列2所示的蛋白序列由545個胺基酸殘基組成。為了使(a)中的AtDT-2分泌到細胞周質或培養基中或使其功能穩定，可在由序列表中序列2的胺基酸殘基序列組成的蛋白質的N端連接上信號肽序列，為了(a)中的AtDT-2便於純化，可在由序列表中序列2的胺基酸殘基序列組成的蛋白質的N端或C端連接上如表1所示的標籤。表l.標籤的序列tableseeoriginaldocumentpage4上述(b)中的AtDT-2可人工合成，也可先合成其編碼基因，再按照下述方法進行生物表達得到。上述(b)中的AtDT-2的編碼基因可通過將序列表中序列1的DNA序列中缺失一個或幾個胺基酸殘基的密碼子，和/或進行一個或幾個鹼基對的錯義突變，和/或在其5'端連上信號肽的編碼序列，和/或在其5'端和/或3'端連上表l所示的標籤的編碼序列得到。上述植物耐旱性相關蛋白的編碼基因也屬於本發明的保護範圍。上述植物耐旱性相關蛋白的cDNA基因，可具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQIDW:1的核苷酸序列；2)編碼框為序列表中SEQIDJN"2:1的5'端第227_1864位核苷酸序列的多核苷酸；3)在高嚴謹條件下可與l)或2)所述的DNA序列雜交的核苷酸序列。其中，序列表中序列1是由2568個脫氧核苷酸組成，自序列表中序列1的5'端第227—1864位核苷酸序列為編碼序列(ORF)，編碼具有序列表中序列2的胺基酸殘基序列的蛋白質。上述植物耐旱性相關蛋白的基因組基因，可具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQIDW2:3的核苷酸序列；2)序列表中SEQIDW2:3的核苷酸序列；3)在高嚴謹條件下可與1)、2)或3)所述的DNA序列雜交的核苷酸序列。上述高嚴謹條件可為在0.1XSSPE(或0.1XSSC)，0.1%SDS的溶液中，在65°C下雜交並洗膜。含有上述植物耐旱性相關蛋白的編碼基因的表達載體、轉基因細胞系及宿主菌均屬於本發明的保護範圍。利用可以引導外源基因在植物中表達的載體，將本發明所提供的^t"71-^基因導入植物細胞，或將Jtzr-2基因過表達，提高了轉基因植株對乾旱的耐受能力。為了便於對轉基因植物細胞或植物進行鑑定及篩選，可對所使用的載體進行加工，如加入植物可選擇性標記或具有抗性的抗生素標記物。被轉化的植物宿主既可以是單子葉植物，也可以是雙子葉植物。本發明的耐旱基因對於植物耐乾旱分子機制的研究，植物抗逆性品種的選育具有重要的理論及實際意義。圖l為擬南芥突變體6^^W)的插入突變基因的鑑定結果；圖2為乾旱條件下擬南芥突變體(&^:—^X^W)的表型分析結果；圖3為gus染色方法進行^tzr^基因表達定位結果圖4為^tzr-^在不同組織部位的表達結果圖5為A"7-2基因在A"71-i"基因過量表達植株(0E)、突變體5^A一Mi^W和5^7A—0^"7恢復突變植株(COM)中的表達RT-PCR結果；圖6為野生型(Columbia型)、突變體仍％^0、過量表達植株(0E2)及突變體&7Lft^4W恢復突變植株(COM2)四種材料乾旱處理表型分析；圖7為野生型(Columbia型)、突變體(5"a7A—0《2^7)、過量表達植株(0E2)及突變體feA—ft^W7恢復突變植株(COM2)四種材料乾旱處理土壤相對含水量變化結果；圖8為野生型(Columbia型)、突變體(5aM—做"^)、過量表達植株(0E2)及突變體&7々_0^^^恢復突變植株(COM2)四種材料乾旱處理離體葉片失水速率結果。具體實施例方式實施例l、植物耐旱性相關的基因及其編碼蛋白的獲得一、Columbia背景的對耐早性敏感的擬南芥突變體的獲得從ABRC(ArabidopsisBiologicalResourceCenter)購得到編號為Salk—082441的T-DNA插入突變體L代種子(簡稱突變體Salk—082441)，該編號為Salk—082441的T-DNA的純合突變體在土壤乾旱條件下表現為較野生型(Columia型)敏感症狀。1、Salk一082441進行T-DNA插入的純合體獲得和鑑定首先對Salk—082441進行T-DNA插入的純合鑑定。利用http:〃signa1.salk.edu/tdnaprimers.2.html網站進行弓l物設計。突變體Salk—082441中T-DNA插入突變體的獲得是通過載體pBIN-pR0K2將攜帶的T-DNA揷入到目的基因，從而導致目標基因功能喪失。Salk—082441T-DNA插入突變體的鑑定需要3條引物，分別是LP、RP和Lbal。其中LP、RP為^W7-i"基因組上的序列，Lbal為T-DNA插入左邊界的序列，三條引物的序列分別為LP:5，-ccaacaatccgactcagaa~3，RP:5'-atcctgatccgactaagcg-3，Lbal:5，-tggttcacgtagtgggccatcg-3，。分別以LP/RP和Lbal/RP為引物對，以T-DNA插入突變體基因組DNA為模板進行PCR擴增，鑑定表明上述^^WJ的T-DNA插入突變體L代種子為純合的T-DNA插入突變體&^L6<S^^02、插入突變基因的表達鑑定同時，以野生型(Columbia型)和DNA水平鑑定為純合插入的突變體fe^:—做^W在MS培養基生長兩周幼苗為材料，各取100-200mg，用Trizol(Invitrogen)提取其總RNA,經甲醛變性RNA瓊脂糖凝膠電泳檢查RNA的完整性。sscDNA的合成按照SupercriptII(Invitrogen)的使用說明，合成單鏈sscDNA。用引物Primerl:5，—gacatatgatgggtaactgtaacgcctg—3'(下劃線部分為保護鹼基和切點)和Primer2:5，-g§gleg§ettaaacaggaacagtttgtcca-3'(下劃線部分為保護鹼基和切點)進行半定量RT-PCR鑑定插入突變的預測基因是否表達。擴增條件如下將合成的單鏈cDNA稀釋10倍，作為以下PCR反應的模板20nL體系，內含IOXPCR緩衝液2pL，2.5mMdNTPmix0.4nL，10,Primer1和Frimer2各0.4pL，TaqDNA聚合酶(15U/pL)O.2|nL。在PE9700上擴增95。C預變性5min，95°C30s，56°C30s,72°Clmin40s，共計35個循環；72。C延伸10min，將獲得的PCR產物(1654bp)，用0.8%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。A屍基因為看家基因，作為對照。其擴增引物為Primer3:5，-atgccccaggacatcgtgatttcat-3'，Primer4:5，-ttggcggcacccttagctggatca-3'。該看家基因的擴增方法為將合成的單鏈cDNA稀釋10倍，作為以下PCR反應的模板20|iL體系，內含10XPCR緩衝液2|xL，2.5mMdNTPmix0.4pL，10(aMPrime:r3禾卩Primer4各0.4pL，TaqDNA聚合酶(15U/pL)0.2|iL。在PE9700上擴增95。C預變性5min,95°C30s，56°C30s，72°Clmin，共計20個循環；72'C延伸10min，將獲得的PCR產物(685bp)，用0.8%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。插入突變基因的表達檢測結果如圖1所示，結果表明，該突變基因在野生型(Columbia型)中有表達，而在突變體5"a^L^9i^W中，完全被敲除，不表達。63、突變體^7yt^^^^在乾旱條件下的表型觀察結果擬南芥野生型(Columbia型)和突變體5"a7vtO^"7在MS培養基上生長7天後移栽至土壤中。溫室培養條件溫度22t:、光照強度為100iamol.m"、s-1，光周期16h(光)/8h(暗)，相對溼度60%-70%。植物材料在土壤中繼續生長兩周後，分別分成兩組，一組停止澆水進行乾旱處理(其他條件相同繼續培養)，乾旱處理21天(乾旱處理)，另一組繼續按照正常澆水培養方法培養21天(陽性對照)。然後均恢復澆水，培養1天，上述過程中觀察植株表型。結果如圖2所示，結果表明，突變體6^^LftS^W葉片萎蔫嚴重，野生型(Columbia型)葉片輕度萎蔫；恢復澆水後，野生型植株能恢復生長，而突變體5"s^t^S^W不能恢復生長，全部死亡。圖2中l為正常澆水培養的擬南芥野生型(Columbia型)，2為正常澆水培養的突變體ft^W/，3為乾旱處理的擬南芥野生型(Columbia型)，4為乾旱處理的突變體5^^LftS^W，5為乾旱處理恢復澆水後的擬南芥野生型(Columbia型)，6為乾旱處理恢復澆水後的突變體&^一仍2^7。二、本發明抗旱相關基因(^f/7-力及其編碼蛋白的獲得1、本發明抗旱相關基因力的cDNA的獲得按照步驟一的步驟1的方法提取擬南芥(Columbia型)幼苗總RNA、反轉錄為cDNA。以此cDNA為模板、利用分別設有A^zI和&cI酶切位點的一對引物進行PCR擴增，得到抗旱相關基因的cDNA全長。引物序列如下-Primer5:5，-ttggtaccatgggtaactgtaacgcctgt-3，(處"I);Primer6:5'-ttgagctcttaaacaggaacagtttgtccag-3，(5acl)。採用Takara公司的高保真的PyrobestDNA聚合酶對^t"7-i"cDNA全長進行擴增，擴增體系為5(VL，含10XPyrobestPCR緩衝液5pL，10mMdNTPmixlpL，10jiMPrimer5和Primer6各1^L，PyrobestDNA聚合酶0.25pL，模板3-5^(共0.l嗎)，補充滅菌超純水至50pL,反應體系在冰上進行操作。在PE9700儀器上進行擴增，預變性5min，95。C變性30s，56°C30s，72°Clmin30s，循環數30個，72。C延伸10min。將擴增片段用1%的瓊脂糖凝膠進行電泳，回收擴增片段，連接到pMD18-T載體，酶切、擴增、測序鑑定，測序結果表明，上述PCR擴增得到的片段具有序列表中序列l的核苷酸序列，為本發明的抗旱相關基因cDNA基因命名為Zt"r-麼序列表中序列l的核苷酸序列由1638個鹼基組成，其編碼序列為自序列表中序列1的第227—1864位核苷酸，編碼具有序列表中序列2的胺基酸殘基序列。將上述獲得的正確的含有力f《#-2的重組載體命名為pMD1fZ7^。2、本發明抗旱相關基因UWr-力的基因組DNA的獲得採用CTAB法提取擬南芥基因組DNA，以此為模板，利用分別設有feci和酶切位點的一對引物擴增目的基因的全長(4682bp)，引物序列如下(下劃線為保護鹼基和酶切位點)Primer7:5，-ttgagctctacttaatccaccacatgtccct-3，(5"acl);Primer8s5，-ttgtcgactgatggtgtctgcaattgtagaac-3，。採用Takara公司的LATaqDNA聚合酶對JW7-2基因全長及啟動子區域進行擴增，擴增體系為50|xL，含10XLAPCR緩衝液5(iL，10mMdNTPmix8pL，10|iMPrimer7和Primer8各2|aL，LATaqDNA聚合酶O.5pL，模板3-5(iL(約O.lpg)，補充滅菌超純水至50pL。在PE9700儀器上進行擴增，預變性3min，95。C變性lmim，56°Clmin，72°C5min，循環數30個，72。C延伸20min。將擴增片段用1%的瓊脂糖凝膠進行電泳，回收擴增片段，連接到pMD18-T載體，酶切、擴增、測序鑑定，測序結果表明，上述PCR擴增得到的片段具有序列表中序列3的核苷酸序列，為本發明的抗旱相關基因cDNA基因命名為」W7-麼序列表中序列3的核苷酸序列由4682個鹼基組成，自序列表中序列3的第1691—2342位核苷酸為第一個外顯子，第2476—2619位核苷酸為第二個外顯子，第2712—2864位核苷酸為第三個外顯子，第2954—3069位核苷酸為第四個外顯子，第3178—3345位核苷酸為第五個外顯子，第3438—3668位核苷酸為第六個外顯子，第3786—3959位核苷酸為第七個外顯子，編碼具有序列表中序列2的胺基酸殘基序列。將上述獲得的正確的含有ZM^^基因組DNA的重組載體命名為pMD18-g譜7-麼實施例2、本發明的植物耐旱性相關的基因及其編碼蛋白的功能驗證一、^wr-2在植物組織中的表達定位結果i、Gus染色方法進行jwr-i"基因表達定位以CTAB法提取擬南芥(Col咖bia型)基因組DNA，採用Takara公司PyrobestDNA聚合酶進行PCR擴增//f"r-2啟動子，片段長度1573bp，反應條件95°C，預變性5min;95。C30s，56。C30s，72。Clmin40s，30個循環；72。C10min。引物Primer9:5,-aagcacttaagctctgtgtgg-3，，PrimerlO:5，-tttagttcatatggacgccg-3，。將PCR產物用0.8%瓊脂糖凝膠回收，末端補A後，裝入Takara公司pMD18-T載體上，測序正確後採用和屍"I切下啟動子目的片段，插入到pCAMBIA1381載體的5amM和P"I酶切位點之間得到重組載體。將該重組載體PCR、酶切鑑定，將確認正確的含有^f/^-i"啟動子和其下遊連接的GUS基因的重組載體命名為P譜w.'.'GU5"。用P^w.'.'GU5轉化根癌農桿菌GV3101感受態細胞(Clough和Bent，1998，PlantJ.16:735-743)，進行PCR鑑定陽性克隆，將鑑定正確的含有P層；:GUS的重組菌株採用農桿菌介導的花芽浸沾法(Clough和Bent，1998，PlantJ.16:735-743)轉化野生型擬南芥(Columbia型)植株，獲得轉P^w.vGU5"擬南芥植株，收穫T,代種子。t代種子在含有50ng/raL的潮黴素的MS培養基上進行篩選，得到根和葉均能生長的陽性轉化植株，繼續栽培，單株種植單株收L代種子。在含有50嗎/mL的潮黴素的MS培養基上統計T2代幼苗的分離比(抗潮黴素:不抗潮黴素)，統計數分離比符合3:1x2檢驗的T2代幼苗繼續繁種至T3代，即為純合的轉P^^.vGUS擬南芥種子。將純合的轉P^w.GUS擬南芥T3代轉化材料進行GUS染色，染色液含0.5mg/mLX-gluc、0.1M磷酸緩衝液(pH8.0)、0.5mM鐵氰化鉀、0.5mM的亞鐵氰化鉀、10mMEDTA(pH8.0)、2%(V/V)甲醇、0.1%(V/V)Tritonx-100。具體染色方法為將待染色的材料浸入X-gluc染色液中，於37'C避光孵育12h，用磷酸緩衝液衝洗材料，浸泡在75%酒精進行脫色，照相。在進行葉片染色前將葉片在不含X-gluc的染色液中抽氣10min，然後再進行染色。結果如圖3所示，GUS染色結果表明力f"r-2基因在植物的各個部位具有表達。圖3中，l為萌發兩天幼苗，2為萌發七天幼苗，3為成苗葉片，4為保衛細胞，5為花器官。2、JWr-2在不同組織部位的表達Trizol(Irwitrogen)試劑分別提取擬南芥萌發2天幼苗、7天幼苗、土壤栽培四周植株的根、莖、蓮坐葉、花、角果、莖生葉材料的RNA，利用S叩ercriptII(Invitrogen)反轉錄獲得單鏈cDNA，分別採用引物對不同部位進行定量RT-PCR擴增，f,為看家基因，具體方法如實施例1的步驟一中的步驟2所示。結果如圖4所示，結果表明^itz:r^基因的表達具有普遍性，在葉片中表達較高。圖4中1為萌發2天幼苗，2為萌發7天幼苗，3為根，4為莖，5為蓮坐葉，6為花，7為角果、8為莖生葉。二、^Z^-2基因轉基因功能驗證1、A"r^過量表達植株(轉super::AZr^植株)禾n5^A—朋i^2恢復突變體植株(轉pCAMBIA1300-g^z^7S突變體)的獲得將pMD18-A"r^質粒，用《/wI和&cI進行酶切，回收得到1638bp的力z^r^cDNA片段，將該片段插入到表達載體pBIB-S叩er質粒(pBIB-S叩er載體的構建方法利用引物aagcttGTGGGCCTGTGGTCTCAAGAT和tctagaCTAGAGTCGATTTGGT從質粒pMSP-1(NiM,CuiD，EinsteinJ，NarasimhuluS，VergaraC，GelvinSB.Strenghtandtissuespecificityofchimaericpromotersderivedfromtheoctopineandmannopinesysthasegenes.19957:661-676.)中擴增出長l.lkb的s叩er啟動子序列；將擴增得到的super啟動子用HindIII和XbaI雙酶切，回收super啟動子片段，插入到質粒pBIB9(BecherD.Binaryvectorswhichallowtheexchangeofplantselectablemarkersandr印ortergenes.NucleicAcidsRes.199018:203.)的HindIII和XbaI酶切位點之間中，得到pBIB-S叩er質粒)的A^3l和&cI酶切位點之間得到重組載體，將該重組載體進行PCR、酶切鑑定，將鑑定表明正確的重組載體命名為super:MtZ7-麼將pMD18-g力W7^用5"acl和5"WI進行雙酶切，回收4682bp的力W71-連因組基因片段，將該片段插入到pCAMBIA1300質粒(CAMBIA公司)的5^cI和5"aH酶切位點之間，得到重組載體，將重組載體進行酶切和測序鑑定，將簡單表明正確的含有^wr-連因組基因的重組載體命名為pCAMBIA1300-g^Zr-麼分別將super::^Z7-^或pCAMBIA1300-gJt"r-難化根癌農桿菌GV3101的感受態細胞得到重組菌，利用菌落PCR和酶切的方法鑑定，將經鑑定表明含有得到s叩er::^Z77-溯陽性克隆菌株命名為GV-super:MW7-麼將經鑑定表明含有得到pCAMBIAl300-g力i的陽性克隆菌株命名為GV-pCAMBIAl300-g力z^7-麼將GV-super::」tZ7-2採用農桿菌介導的花芽浸沾法(Clough和Bent，1998，PlantJ.16:735-743)導入擬南芥野生型(Columbia型)中，將GV-pCAMBIA1300-g」fZr-2也採用上述農桿菌介導的花芽浸沾法導入擬南芥&^:一^a^W突變體，然後分別收穫T。植株的種子，即分別得到L代種子。按照步驟一的步驟l的方法篩選單拷貝純合突變體，經篩選共得到質粒單拷貝插入JW71-逝量表達純合株系(轉super::力W7-淑南芥純合株系)5個，質粒單拷貝插入5aM—M^"7恢復突變純合株系(轉pCAMBIA1300-g^"7-^突變體純合株系)6個。2、J^r^過量表達植株(轉super:Mt"7^植株)和5^vt做"^恢復突變體植株(轉pCAMBIA1300-gA"r-2突變體)的定量RT-PCR檢測對得到的單拷貝純合株系進行定量RT-PCR檢測，^F為看家基因，以野生型擬南芥(Columbia型)和突變體5"s7A—ft^4W為對照，具體RT-PCR檢測方法如實施例1的步驟一中的步驟2所示。結果如圖5所示，結果表明獲得三個^^r-邀因的表達量明顯高於野生型植株的力f/r-教量表達株系(轉super::^Zf-i擬南芥純合株系)，分別命名為0E1、0E2、0E3;兩個^z^7"^的表達量與野生型(Columbia型)植株相當的5^t。《^^^恢復突變株系(轉pCAMBIA1300-g/ItZ^-凍變體純合株系)，分別命名為C0M1、COM2。圖5中1為野生型擬南芥(Col咖bia型)，2為擬南芥突變體^7;iL<<S^^，3為轉super::Jt"7-i擬南芥純合株系0E3，4為轉s叩er::A"7-i擬南芥純合株系0El，2為轉super::^"7-i擬南芥純合株系0E2，6為轉pCAMBIA1300-g^Z^-凍變體純合株系C0M1，7為轉pCAMBIA1300-g力W7-S突變體純合株系C0M2。3、A/^-2過量表達植株(轉super::JM7S擬南芥純合株系)和^s^t做i^W恢復突變體植株(轉pCAMBIA1300-gJtZr-2突變體純合株系)的表型觀察將在MS培養基上萌發後生長7天的擬南芥野生型(Columbia型)、突變體^77tttS^^L代、力W7-2過量表達(轉s叩er::力W7-2擬南芥純合株系)和5"3^L(^i^^恢復突變(轉pCAMBIA1300-g」tZr^突變體純合株系)幼苗移入土壤中繼續生長2周，2周內正常澆水(具體條件如實施例1中步驟一的步驟3所示)；2周後停止澆水進行乾旱處理(其他條件相同繼續培養)，乾旱處理21天後恢復澆水。整個過程觀察各植株的表型。結果如圖6所示,乾旱處理19天時，突變體5^7t仍2^^表現明顯的萎蔫症狀，野生型(Columbia型，圖6中A)表現輕微萎蔫，而yJW7-i1過量表達植株(轉super::力Wr^擬南芥純合株系0E2，圖6中C)和Sa^t^^W7恢復突變植株(轉pCAMBIA1300-g^z^7-2突變體純合株系COM2)生長良好；乾旱處理21天時，突變體5^Tt做i^W葉片表現嚴重萎蔫並發紫，野生型(Columbia型)和&"—做^W恢復突變植株(轉pCAMBIA1300-g^z^r^突變體純合株系COM2,圖6中D)比JtZr-2過量表達植株(0E2，圖6中C)表現更加明顯的萎蔫表型，葉片巻曲程度高。恢復澆水後，突變體5"a^LftK^W不能繼續生長，全部死亡，而野生型(Columbia型)、^z^T-^過量表達植株(0E2，圖6中C)和ft^W7恢復突變植株(COM2，圖6中D)都能繼續生長，但2過量表達植株(0E2，圖6中C)的長勢優於野生型和。S^W恢復突變植株(COM2，圖6中D)，說明^f/r-2過量表達植株(0E2，圖6中C)具有較野生型強的耐受乾旱的能力。圖6中A為野生型擬南芥，B為突變體5^7A—ft^W7，C為轉super::^t"r-2擬南芥純合株系0E2，D為轉pCAMBIA1300-g^t"7-2突變體純合株系COM2。4、野生型、突變體5^7A—ftX"厶^z^7-^過量表達植株(0E2)和5"a7A—ft5^"7恢復突變植株(COM2)四種材料生理指標的檢測1)土壤相對含水量變化檢測擬南芥野生型(Columbia型)、突變體仍2W7乙代、2過量表達植株(轉super::^Z7-i"擬南芥純合株系)0E2和^7t^SW^恢復突變植株(轉pCAMBIA1300-g力Mr-2突變體純合株系)COM2按照步驟3的方法進行幼苗培養及乾旱處理。在進行乾旱處理之日起設定土壤最初含水量為100%，每隔三天稱量小盆重量，測定土壤相對含水量(稱重時小盆的重量/最初小盆的重量)。結果如圖7所示，結果表明，從停止澆水的第6天開始，在同樣的乾旱處理時間，突變體5WK^2^^的土壤相對含水量最少，」f"r-2過量表達植株(轉s叩er:M^r-2擬南芥純合株系0E2)11的土壤相對含水量最多，野生型(Columbia型)和5"a^L^^^7恢復突變植株(轉pCAMBIA1300-g力W7-2突變體純合株系COM2)的土壤相對含水量基本一致，介於突變體A^W2和JW7^過量表達植株(轉super::JtW"-i"擬南芥純合株系0E2)之間。圖7中，l為擬南芥野生型(Columbia型)，2為突變體L代，3為A"r-2過量表達植株(轉s叩er::力Wr-2擬南芥純合株系)0E2，4為恢復突變植株(轉pCAMBIA1300-gJW7-2突變體純合株系)COM2。2)土壤失水速率檢測將MS培養基上生長7天的擬南芥野生型(Columbia型)、突變體fe^:—做i^WT4代、^t"7-2過量表達植株(轉super::」^97-2擬南芥純合株系)0E2和5a^t^9i^W恢復突變植株(轉pCAMBIA1300-g^"7-2突變體純合株系)COM2幼苗移栽到土壤中，在與步驟3的方法相同溫室條件下繼續生長4周，正常澆水。生長4周後，將植物材料的地上部剪下，立即稱重，然後放在溼度40%、溫度23-25'C條件下進行失水實驗。每間隔一定時間進行稱重，每個株系重複4次，以失去最初鮮重的百分比計算失水量，以單位時間的失水量表現為地上部的失水速率。結果如圖8所示，野生型(Columbia型)和Salk—082441恢復突變植株(COM2)失水速率基本一致，突變體Salk_082441失水最快，^W/"^過量表達植株(0E2)失水最慢。圖8中，1為擬南芥野生型(Columbia型)，2為突變體0&^WT4代，3為」t"7-i"過量表達植株(轉s叩er::力"r-i"擬南芥純合株系)0E2，4為&7々_^^"7恢復突變植株(轉pCAMBIA1300-g/^"7-2突變體純合株系)COM2。序列表〈160〉3〈210〉1〈211〉2568〈212〉DNA擬南芥屬擬南芥(AraZ油A^'s"ah'扁)〈400〉1tctctccccccggcgtccattccttgatctcgcctgtgtatcg卿tcggtgttctcaaaaggtcgtg^ccacgaagctcgaagacgttt^gctta^gagctgttgcgtcgagatttgggctat"tgataggaagtccga^atccgaaatcccaaccca^atgaacta^cctttctctgaggccagactaaattaaaccgatgtaatccttaggtcgagttagcttgcacgtcgtgagggctagttatgctttttgatcagaacgattgaaacctgagatttggcttgttattatatggtttcg^3ggactctccaatgagataagctagtttgctgacattcgccggctatgagcaagcgaattcggaatcgatttctagcgattataggataacgaggattgttgcctgaggttgtatttcttgttctgtgttcttctccagaagttccgactttttcgccggaaatttttcttctgtttcttaacaaaaccatctagatttcacctc^actcagaatcacttacaaagcgaa3ggtctactttaga^cgtgcattagaggacatgatgatgtgttgct犯ta肌caaacctggagttga卿gacctcacctgaatcaccgccaataatccttctcagccatggtcaaagccgaagatccccagatcagcgacactctgtactgcttcgaacagcctgagcatcctggttatggtacacggagccactctaatgaaggagaattgataagtttagattatggacacccgcgttt60ccgtcacttx120ttcttcttct180gtaactgtaa240aaaaacccaa300ctccaatacg360aatacatctt420atcgtga^ac480ctgtcgatat540caaacgtagt600agctttgtga660gtgctgctgc720gagttatgca780ctccactaaa840cagagattgt900caggggttga960tgtgtggagtgccggagttattatctatatcttgctctgtggtgttcctccgttttgggc1020tgagactgaacaaggtgttgctcttgcgatcttgcggggagttcttgattttaagagaga1080cccttggcctcagatatcagagagtgccaagagccttgtgaagcagatgttggatcctga1140tccgactaagcggttaactgctcagcaagtgttagctcacccatggatacagaatgcaaa,1200gaaagctcccaatgttcctttaggagatatagtcagatctaggttgaagcagttctctat1260gatgaacagattcaaaaagaaagttcttcgtgtaattgcggagcacttgtctattc肌ga1320ggttgaagtgataaagaacatgttctcactgatggatgatgacaaggatggtaaaataac1380ttacccggaactcaaagctgggcttcagaaggtcggttcacaacttggtgaaccagagat1440caaaatgttgatggaagtggcggatgtcgatggaaatgggtttctggattatggagagtt1501tgtagctgtgataattcacttgcagaagatagagaatgatgaacttttcaaactagcttt1560tatgtttttcgacaaagatggaagtacatacattgaacttgatgagctacgggaagcttt1620agcggatgagttaggcgagccagacgccagtgttctaagcgacatcatgcgtgaagttga1680cactgacaaggacggacgtataaactatgatgagtttgtgacgatgatgaaagctggaac1740tgactggagaaaggcatcgagacaatattcaagagagaggttcaaaagcttaagcattaa1800cttgatgaaagatgggtcattgcatctccatgacgctctcactggacaaactgttcctgt1860ttaaatttattcgttatcaccaaaaacagagcaatgctccgttttttccccatttcataa1920attgggaattttccgggcttgttctttgagggatgggaattttacggaagctatggttct1980ttacatatataaacattttacattgtattttgtatgtaatgttttgttcaaaggttgtat2040ttttattgtctcaaagcccctaaaccaaagagtcaaaggaaagatctttattacactgac2100accttatcaaactcagcagaagtcttgtccatgtccttgtccttggccacaacatctttg2160taacggtaccaatgtgagaccaacaagaaataggccaagtttagagtcatcataccagca2220accaagaagtagaaatactccaatcttcccttgtttaaatcttccggaagccaacttcct2280cctgaaaatccctctgtggtatcgtgtaccgccgataacaaaaaggtgctgaggtaactc2340gccaatccgattccacaataatacagagaaccagcaaaacttcgcatgttctctggaaac2400tgtttgtagtaaaactccatttgtccaactccagcgagggcgtccgcgatacccattagc2460actagctgaggaatcaaccacataccggacatcgaagagattgcgccttttcttggggcc2520aaccctagcgtcggttttgtgagagctacctttcttctgtattgttct2568〈210〉2〈211>545〈212〉PRT〈213>擬南芥屬f以南芥(AraZ^cfopsis^^7^3723)〈400〉2MetGlyAsn1ProSerSerPheAlaGly35AspVallie50LeuGlyArg65ThrAspArgArgLysLeuAlalieMet115AlaSerTyr130GluGlyGlyCysLys20AspAsn5ProPheProMetGluLeuGluArg100SerThr85ThrGluAspGluLeuAlaCysLysLysThrArgSerAsn55GlyArg70HisGluAsnGlu135PheAspValArgProSer40GinThrLeuProGlu120AsnAsn25ProAlaValAsplie105HisPro10ArgAlaLeuAla90GluAspAspGlyGluPheGly75CysSerArgAlaProlieThrGinlieSer60lieAspProAsnValLysLysArg45AspThrLysSerValArgValHisLeuVal125MetGluSer15LeuAsn30ValLeuLysTyrTyrLeulieSer95ArgGlu110LysLeuGluLeuLysProLyslieCys80LysValLysCysVal140ArglieValAlaArgGlyHisTyrThr15145GluArgAlaAlaMetCysHisSer180AlaAla165Asn150AlaValAlaArgPheLeuPhe195LeuPheGly210ValGlySerProTyr225GlyProGlyValMetAsnLysLysSerValPhe155ThrlieAlaGlu170ArgAspLeuLysHis185AsnSerProLeuGlu200LysProGlyAspPhe215MetAlaProGluGlyLeuCysGlyValTyr230ValTrpSerAlaAsp245ProProPheTrpVal235ValLys220LeuVal260LeuArgGlyValLeuAlalie275SerGluSerAlaGinlie290AspProThrLysArg305lieGinAsnAlaLeu280SerLys295ThrAlaGinGinAla265AspPheLysArgLeuValLysLeu310LysAlaProAsnArgSerValLeuArgLeu340ValLys325LysGinPheSerVal315ProArg355AsnMetPheSerMet345LeuSerlielieAlaGluHis360MetAspAspAspArgGinValVal175ProGlu190Alalie160MetAsnAspLys205PheThrGlulieLysArgAspArglielieTyrGly250GluThrGluGinAsp285MetGly270ProLeulie255ValTrpAspGin300LeuAlaHisProVal330MetAsnArgPheLeuGlyAsplie335LysLys350ValGluTyr240LeuAlaProProTrp320ValLysValGlyLeuGinLys380LysVal395Glu365AspGlyLyslielieLysAsnMetPheSerLeu370375ThrTyrProGluLeuLysAla385390GlyGluProGlulieLysMetTLeuMetGluValAlaAspValAspGlyGlySerGinLeu400formulaseeoriginaldocumentpage17aattcttactactatatattaattaggtctcttatatatggattgaatggtatccaaatcaagaaaacgagtatgacattgacaattgaacggtttctactttctaagccaaagaaacatttgttgttgacttxcattaatggaatatttttacctatataactttgctttattttctacagtctatacacacaatattttcctatccttcctagcatctagattatgattgtacacataaatgcaaattagaaacaaaa犯ttgctccatattattatgatttttcttctattttacgtttttaaaaaatagtttgggatcaacgtcgcctcaccgtatccaccacgctggtcaacaactcttatcccttcatttcattaccattaatttaaactgttaattatacgtttggccgtaattaaatgctcttttaattaggttttaatttgtgttaaatctaagagtttgaattttctaaattgatagaactataatatgatcaatataaagattttgtttgtttgtttataaaaccactgaccaaaaaataaagaagtgaattctattagaagaaaaaaaaaattgaaaaaaaattacaaaaatctctcaagttattaaatgcatcataatcaaagactcccttttttttaattgaatcattttcctcacctgaacccgcgttttctctctttggaatatagacgcgcaacacacatttt240cccaaggtaatgtaatgtaaaaccaagata300cttgtagcga3gtc3gg3taggscgacttg360agttttcattgatttttagtgtttttaaat420cgtactttgcttcttcttttcgaattttat化Oaacacaataagtattgctcataattgagga540tctttttttctgtcgggaatttcttcatat600caaaaacagEiaaagaactagacttcaaaat660aaaaaaatatattcaa肌cta^aaata^aai720acattgtatatctctagagaagaaaataat780acttattgttttgtcttacaatctcagagt840ttcaacaaaactctcttcctcgaacttcaa900cacaccaacggctaacattgtcctcctcgc960gttttgaagtctgcctatatttcttttcaa1020gtgaaatccaacctttaaattttctgatgc1080atcattgttgtcggttatcatttgtacatx1140cttataataataLataactgaaaatacaaat1200aaaaatgcaagagttaatccactgagttca1260tcataagcttggaccaaaaaatxcatctag1320gtttctaagaagatggtgcaatggttagaa1380actaatactgtatattactatacacaaaaa1440aacaaaMccgaaatttcgaaaggtccgac1500cccctcccaacccaactctccaattcgccg1560gaaaatcaccgccaccgtcacttccggcgtccatatgaactaaagagataagcttttttc1620ttctataatccttcttcttcttcttccttgatctcctttctctgagtttgctgagtttct1680taactcagccatgggtaactgtaacgcctgtgtaaggccagactcaaaagaatcaaaacc1740atcttcaaagccgaaaaaacccaatcgagatcggaaattaaacccattcgccggagattt1800caccagatccccagctccaatacgtgttctcaaagatgtaatccctatgagcaatcaaac1860tcagatcagcgacaaatacatcttaiggtcgtgaattaggtcgaggcgaattcggaatcac1920ttacctctgtactgatcgtgaaacccacgaagctttagcttgcaaatcgatttcaaagcg1980aaagcttcgaacagctgtcgatatcgaagacgttcgtcgtgaggtagcgattatgtctac2040tttacctgagcatccaaacgtagttaagcttaaggctagttatgaggataacgagaacgt2000gcatctggttatggagctttgtgaaggaggtgagctttttgatcggattgttgctagagg2160acattacacggagcgtgctgctgcagctgttgcgagaacgattgctgaggttgtgatgat2220gtgtcactctaatggagttatgcatcgagatttgaaacctgagaatttcttgtttgctaa2280taaaaaggagaattctccactaaaggctattgattttggcttgtctgtgttcttcaaacc2340tggtaaagattcaatttttagtgtttcttaactcagtggatggttctatttttagactat2400cctgccatatcttcatgtttatggaagtttgtgtagatatctgagattgggtaaataacg2460ttttctttattgtaggagataagtttacagagattgtaggaagtccgtattatatggctc2520cagaagtgttgaagagagattatggaccaggggttgatgtgtggagtgccggagttatta2580tctatatcttgctctgtggtgttcctccgttttgggctggttagcttcttcttttaatta2640ttttagcagctgtgtaattgttcacctatgttgattagataaaccgataagattgtggtt2700tctattgacagagactgaacaaggtgttgctcttgcgatcttgcggggagttcttgattt2760taagagagacccttggcctcagatatcagagagtgccaagagccttgtgaagcagatgtt2820ggatcctgatccgactaagcggttaactgctcagcaagtgttaggtgaagttcttgtgtt2880tctgttttctttaatggtcgtagttaccttaatccactctattactaatgattttctttt2940tctcacctttcagctcacccatggatacagggagatatagtcagatctaggttgaagcaggttcttcgtgtaagtgttttttttttgcctctgttgtgtgtgtctatatttggttttgatattgcggagcacttgtctattcaagaggttgatgatgacaaggatggtaaaataacttacggttcacaacttggtgaaccagagatcaaacccttatctgattaaagaccaattcagtgtatggcUtgacgcgcaggcggatgtcgatgtagctgtgataattcacttgcagaagatagtgtttttcgacaaagatggaagtacatacacggatgagttaggcgagccagacgccagtgctgacaaggttctttcaaatatccaaaaaagtcaagagaaaagatatatccctctgcttctacaggacggacgtataaactatgatgagtggagaaaggcatcgagacaatattcaagagtgaaagatgggtcattgcatctccatgacgtttattcgttatcaccaaaaacagagcaatgaattttccgggcttgttctttgagggatgtatataaacattttacattgtattttgtatttgtctcaaagcccctaaaccaaagagtcaatcaaactcagcagaagtcttgtccatgtcgtaccaatgtg3g3ccaac3sgssataggcaatgcaaagaaagctcccaatgttccttta3000ttctctatgatgaacagattcaaaaagaaa3060tttacttttctgctgaagtttgtagagagt3120cattatcatccctgttaatgcttccaggta3180gaagtgataaagaacatgttctcactgatg3240ccggaactcaaagctgggcttcagaaggtc3300atgttgatggaagtggtaatttaagcattg3360tcttctctgataaacatagctgaaatctgt3420gaaatgggtttctggattatggagagtttg3480agaatgatgaacttttcaaactagctttta3540ttgaacttgatgagctacgggaagctttag3600ttctaagcgacatcatgcgtgaagttgaca3660atcctcctttaaggcctaacaataaagctt3720tgagtcggattgttgggcttgtttgctttt3780ttgtgacgatgatgaaagctggaactgact3840agaggttcaaaagcttaagcattaacttga3900ctctcactggacaaactgttcctgtttaaa3960gctccgttttttccccatttcataaattgg4020ggaattttacggaagctatggttctttaca4080gtaatgttttgttcaaaggttgtattttta4140朋gga^agatctttattacactgacacctt4200cttgtccttggccacaacatctttgtaacg4260caagtttagagtcatcataccagcaaccaa4320gaagtagaaatactccaatcttcccttgttaaatccctctgtggtatcgtgtaccgccgatccgattccacaataatacagagaaccagcgtagtaaaactccatttgtccaactccagcctgaggaatcaaccacataccggacatcgatagcgtcggttttgtgagagctacctttcttaaatcttccggaagccaacttcctcctga4380taac肌aaaggtgctgaggtaactcgccaa4440aaaacttcgcatgttctctggaaactgttt4500gagggcgtccgcgatacccattagcactag4560agagattgcgccttttcttggggccaaccc4620tctgtattgttctacaattgcagacaccat4680468權利要求1、一種植物耐旱性相關蛋白，是具有下述胺基酸殘基序列之一的蛋白質1)序列表中的SEQID№.2的胺基酸殘基序列；2)將序列表中的SEQID№.2胺基酸殘基序列經過一個或幾個胺基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有植物耐旱性相關功能的由SEQID№2衍生的蛋白質。2、權利要求l所述的植物耐旱性相關蛋白的編碼基因。3、根據權利要求2所述的編碼基因，其特徵在於所述植物耐旱性相關蛋白的編碼基因的編碼框為序列表中SEQIDW:l的5'端第227—1864位核苷酸序列的多核苷酸。4、根據權利要求3所述的編碼基因，其特徵在於所述植物耐旱性相關蛋白的編碼基因具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQIDW:l的核苷酸序列；2)序列表中SEQIDW2:3的核苷酸序列；3)在高嚴謹條件下可與l)或2)所述的DNA序列雜交的核苷酸序列。5、含有權利要求2或3或4所述的植物耐旱性相關蛋白編碼基因的重組表達載體、轉基因細胞系或宿主菌。6、擴增權利要求2或3或4所述基因中任一片段的引物對。7、權利要求1所述的植物耐旱性相關蛋白及其編碼基因在培育耐旱性提高的植物中的應用。8、根據權利要求7所述的應用，其特徵在於所述植物為擬南芥。全文摘要本發明公開了一種與植物耐旱性相關蛋白及其編碼基因與應用。該蛋白是具有下述胺基酸殘基序列之一的蛋白質1)序列表中的SEQID№.2的胺基酸殘基序列；2)將序列表中的SEQID№.2胺基酸殘基序列經過一個或幾個胺基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有植物耐旱性相關功能的由SEQID№2衍生的蛋白質。該基因具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQID№1的核苷酸序列；2)編碼序列表中SEQID№2蛋白質序列的多核苷酸；3)在高嚴謹條件下可與1)或2)所述的DNA序列雜交的核苷酸序列。本發明的蛋白及其編碼基因可用於培育耐旱性提高的植物新品種。文檔編號C12N15/11GK101508726SQ20091008112公開日2009年8月19日申請日期2009年4月2日優先權日2009年4月2日發明者武維華,鄒俊傑,魏鳳菊申請人:中國農業大學