可溶性單鏈t細胞受體蛋白的製作方法

2023-04-25 04:12:36

專利名稱：可溶性單鏈t細胞受體蛋白的製作方法
1．發明領域本發明涉及可溶性單鏈T細胞受體蛋白，以及製備和應用這些蛋白的方法。這些蛋白用途很多，包括體外篩選能表達所需肽—MHC複合體的細胞。
2．背景T細胞應答受抗原與T細胞受體(TCR)結合的調節。ICR類型之一為膜結合的異二聚體，由類似免疫球蛋白可變區(V)和恆定區(C)的α鏈和β鏈組成。TCRα鏈包括共價連接的V—α鏈和C—α鏈，而β鏈包括與C—β鏈共價連接的V—β鏈。V—α鏈和V—β鏈組成一個能結合超抗原或屬於主要組織相容性複合體(MHC)(人類為HLA複合體)範疇之抗原的口袋或裂隙。總見Davis，免疫學年鑑3537(1985)；基礎免疫學，第三版，W．Paul編，Rsen出版公司，紐約(1993)。
據信TCR在免疫系統的發育和功能中起重要作用。例如，據報導TCR介導細胞殺傷、增強B細胞增殖、影響各種疾病包括癌症、過敏、病毒感染及自身免疫病的進程和嚴重性。因此，對獲得商用、研究用和醫用TCR之方法的開發引起人們極大的興趣。
一般來說，TCR難以大量分離。其中一個主要的障礙是不含TCR跨膜區的可溶性TCR的產生。更具體地說，據報導如果TCRα鏈和β鏈沒有參與包括γ、δ、ε和ζ鏈的CD3複合體的裝配，則該蛋白通常被降解。參見如Shin等(1993)科學2591901。
常常在細菌中嘗試生產無跨膜區的可溶性TCR。但細菌性TCR表達常導致形成包涵體如不溶和不正確摺疊的分子。很多情況下，由這些方法經困難地蛋白溶解和重新摺疊步驟後可獲得TCR。這些步驟大大減少了TCR產量並對TCR的穩定性和功能產生負影響。
獲得可溶性TCR的進一步嘗試集中於設計可溶性更好的TCR分子。例如，將TCR與各種蛋白和多肽序列如磷脂醯肌醇連接序列和CD3鏈融合。目的常常是在特殊細胞區室中表達TCR以輔助蛋白摺疊。表達在細胞表面的TCR融合蛋白常用常規方法切割以獲得可溶性TCR。但通常只產生少量能完全可溶並有功能的TCR。參見如Matsui，K等(1991)科學254，1788(1991)；Engel，I．等(1992)科學256，1318；Lin，A．Y．等(1990)科學249，677。
產生可溶性TCR的其它嘗試包括合成包含與免疫球蛋白恆定區共價連接的TCR V鏈在內的TCR異二聚體分子。例如，Gregoire，C．等(1991)PNAS 88，8087報導了包括與κ型輕鏈C區(Cκ)連接的Cα、Vα序列的TCRαβ鏈異二聚體的分泌。該文獻還公開了VβCβCκ序列。亦參見Weber，S等(1992)自然，356793。
儘管據報導TCR異二聚體的合成有時可增加可溶性表達，但這些方法有重大缺陷。例如，合成常要求將DNA共轉染入特定細胞，這些細胞必須正確裝配多蛋白鏈。這些方法常大大降低功能性異二聚體TCRαβ的產量。
值得注意的是，據報導Cκ鏈對TCR異二聚體的表達有負影響。例如有人提出，替換Cκ鏈有時可增加TCR異二聚體的化合價。而且，已公開的包含Cκ區的Vβ嵌合鏈加工、分泌和／或摺疊都十分困難。參見Gregoire等，文獻同上；Mariuzza，R．A．和Winter，G．(1989)2647310；Gascoigne，N．R．J．等，PNAS(USA)(1987)，842936。
還有人嘗試構建含TCRV區的單鏈蛋白(即sc—TCR)，以產生完全可溶並有功能的TCR。簡而言之，sc—TCR包括融合的V—α和V—β鏈。參見Novotny，J等，PNAS(USA)88，8646(1991)；Soo Hoo，W．F．等，PNAS(USA)89，4759(1992)；Wulfing，C．和P1uckthun，A．，分子生物學雜誌242，655(1994)；Kurucz，I．等，PNAS(USA)90 3830(1993)；PCT WO96／13593；Ward，E．S．等，分子生物學雜誌224，885，(1992)；和Schlueter，C．J．等，分子生物學雜誌256，859(1996)。
但以上產生sc—TCR的方法常產生不溶性、非正確摺疊的分子。例如，已公開的PCT申請WO 96／18105公開了表達sc—TCR的方法，它一般需要有不很方便的蛋白重摺疊和溶解步驟。這些方法產生的sc—TCR量常低得出乎人的意料。亦參見Ward，E．S．等，文獻同上，及Schlueter，C．J．，文獻同上。
關於改進sc—TCR生產已提出了好幾個方案。這些方案包括指導蛋白在細胞表面表達及有溶解作用的載體蛋白的應用。參見如，已公開的PCT申請WO 96／18105和WO 96／13593。然而，這些方法產生的sc—TCR常需要耗時的操作以獲得哪怕是普通量的蛋白。
有關免疫系統分子的體外和體內相互作用一直吸引人們的極大興趣。因而十分需要可簡便地大量生產可溶並完全有功能的TCR分子。例如，有人提出TCR V區為可有效調節TCR功能的小分子(如TCR拮抗物或激動劑)提供了具有吸引力的靶。因此獲得可生產大量可溶並完全有功能的sc—TCR融合蛋白的便利方法比較合乎需要。
發明簡述本發明涉及可溶性單鏈T細胞受體蛋白，如包括單鏈T細胞受體與免疫球蛋白輕鏈恆定區共價連接的融合蛋白。已發現免疫球蛋白輕鏈恆定區與單鏈T細胞受體的融合意外地能促進可溶性表達。無需進行困難的溶解、切割或重摺疊步驟。即可分離出大量單鏈T細胞受體蛋白。
本發明的單鏈T細胞受體(即sc—TCR)蛋白完全有功能並可溶。一方面，sc—TCR蛋白包括共價連接的TCR Vα和Vβ鏈與免疫球蛋白輕鏈恆定區(即Ig—CL)或合適的Ig—CL片段的融合。另一方面，所提供的sc—TCR不含融合的Ig—CL鏈或片段。本發明之sc—TCR融合蛋白有時在本文中稱為「sc—TCR融合蛋白」、「可溶性融合蛋白」或類似稱呼。可溶性sc—TCR蛋白的表達減少了宿主細胞中不溶顆粒的形成，從而顯著提高該蛋白的穩定性和產量，並使純化更為簡易。
sc—TCR融合蛋白通常包括與單鏈V鏈共價連接的Ig—CL鏈或合適片段。V鏈包括Vα，β序列，其中V—α鏈一般與V—β鏈通過肽連接序列融合。融合產物進一步通過V—α鏈或V—β鏈共價連接至Ig—CL鏈或合適的Ig—CL片段上。Ig—CL鏈或其片段可與單鏈V序列有間隔，如被本文所提供的肽連接序列隔開。
通常，Ig—CL是序列已知的κ—或λ—型免疫球蛋白輕鏈恆定區。κ—型免疫球蛋白輕鏈恆定區本文常稱為「Cκ鏈」，而λ—型免疫球蛋白輕鏈恆定區本文常稱為「Cλ鏈」。例如，Ig—CL鏈可為如下所述Cκ鏈或其合適片段。本發明提供完全可溶並有功能的融合蛋白及獲得大量sc—TCR融合蛋白或相同來源並有多種應用的sc—TCR的方法。
部分實例中，sc—TCR無需與Ig—CL鏈或其片段融合便完全有功能並可溶。尤其是，我們意外地發現很多sc—TCR分子無需與Ig—CL鏈或其片段融合便能表達。本發明因此提供不含融合的Ig—CL鏈或其片段的sc—TCR分子以及產生sc—TCR分子的方法。
本發明之sc—TCR蛋白具有很多重要的優點。例如，此前的實踐常需要在獲得大量蛋白之前對TCR相關蛋白(如TCR受體、TCR異二聚體、sc—TCR)進行大量操作。對比之下，本發明之sc—TCR可大量得到。其中sc—TCR融合蛋白包括對其可溶性、產量和功能具有正影響的融合的Ig—CL鏈或合適Ig—CL片段。因此對TCR和sc—TCR與諸如小分子(如合成肽、藥物等)和抗原呈遞細胞(APC)之相互作用的分析可通過應用本發明提供的可溶性融合蛋白而得到促進。而且，有各種各樣的sc—TCR融合蛋白可用來與超抗原或APC相互作用，下文將就此作更全面描述。
此外，Ig—CL鏈或合適Ig—CL片段與sc—TCR的融合為經常規免疫學方法如下文所公開方法檢測和純化融合蛋白提供了一種方便的方法。
還有一些好處是由下文所示編碼sc—TCR蛋白的DNA構建體提供的。例如，所提供的一些DNA構建體包含以可開關的盒式編碼sc—TCR的DNA區段，另一區段編碼所需sc—TCR。DNA構建體可編碼與很多TCR Vαβ序列完全相容的融合的Ig—CL鏈或Ig—CL片段，並可在宿主細胞中表達以提供大量的蛋白。本發明因此提供生產研究用、醫用或商用充足量的完全可溶並有功能的sc—TCR蛋白的方法。
本發明的sc—TCR蛋白有多種體外和體內用途。
例如，sc—TCR蛋白可體外用於檢測和分析配體如肽以及TCR配體的MHC／HLA分子組成。sc—TCR蛋白還可用於診斷如檢測有致病性的T細胞。sc—TCR還可用於功能分析、細胞和分子分析、結構分析，包括X射線晶體學、核磁共振成像、計算技術如計算機圖象顯示。特別興趣在於那些可很容易適用於鑑定對TCR和MHC複合體之間相互作用有調節能力的小分子的已知技術。相關技術可用於篩選可能阻斷TCR和TCR特異性抗體之間相互作用的小分子。特別引起關注的是設計用於體外檢測TCR拮抗物的篩選技術。
sc—TCR蛋白還具有重要的體內應用。例如，這些蛋白可用於與致病性T細胞如涉及免疫相關失調或疾病的T細胞競爭；或用於免疫哺乳動物如人類，以抵抗T細胞結構如出現在T細胞表面、造成或輔助其它分子致病或引發其它有害功能的TCR胞外區。尤其是，sc—TCR蛋白可用於按如下述已知免疫學方法產生抗體。這些方法產生的抗體可用於以體內調節免疫應答為目的的治療方案，如通過抑制或減少識別所指抗原之特異性T細胞數而進行調節。尤其是，可選擇特異性結合TCR表位的單克隆抗體，從而可以靶向參與致病的特定T細胞亞組或群，並將其清除或在數量上大大減少。如下文將詳述，sc—TCR蛋白或其結合抗體可不經修飾，或若有必要，有時可通過一段肽連接序列與所需分子如藥物、毒素、酶或放射性物質共價連接。
本發明之sc—TCR蛋白還可用於體外篩選表達所需肽—MHC複合體的APC。更具體地說，它已用於獲得並擴展所選的含所需肽—MHC複合體之APC的好幾種方案中。
編碼sc—TCR融合蛋白的DNA構建體還可用於按1997年3月7日提交的未決美國專利申請流水號08／813，781(已引入本文作為參考)所述方法製備噬菌體展示庫。
sc—TCR蛋白還可用於體外篩選肽文庫以檢測肽結合序列如潛在的超抗原。
本發明還涉及含有編碼目的sc—TCR蛋白之序列的核酸區段(RNA，mRNA，cDNA或基因組DNA)。其中該核酸區段可編碼與Ig—CL鏈或合適Ig—CL片段共價連接的所需sc—TCR。sc—TCR編碼核酸可由各種來源獲得，包括對可公開獲得的TCR和Ig—CL鏈DNA序列進行聚合酶鏈式反應(PCR)擴增。核酸區段可以以能在適當的真核或原核細胞表達系統中表達sc—TCR蛋白的DNA載體形式提供。該區段可以包括可操作連接的轉錄因子如啟動子、前導序列、轉錄起始序列和最適增強子序列，以驅動可溶性sc—TCR蛋白在所需細胞表達系統中表達。或者，DNA載體自身可提供部分或所有控制元件。
編碼sc—TCR的核酸區段常經過構建除去了天然TCR控制元件。但有時可能需要用本領域內已知的免疫球蛋白啟動子和／或增強子驅動sc—TCR蛋白表達。當可溶性融合蛋白在能進行RNA剪接的某類細胞(通常為哺乳動物細胞)中表達時，由本發明之核酸區段編碼的Ig—CL鏈或合適Ig—CL片段常包含內含子和外顯子序列。當需要將sc—TCR融合蛋白表達在原核細胞中時，可去除或大大減小內含子以得到最大表達。如下文詳述，各種Ig—CL鏈或其合適片段可按所需與sc—TCR分子融合，只要表達的sc—TCR融合蛋白經以下試驗測定為完全可溶並具有功能即可。
本發明特別提供編碼不含Ig—CL鏈或其合適片段之sc—TCR分子的核酸區段和含有該DNA區段的載體。
本發明進一步提供分離本文所公開的可溶性sc—TCR蛋白的方法。這些方法一般包括將目的核酸區段或含有其的載體導入能表達融合蛋白的細胞。含有該區段或載體的宿主細胞均在能支持細胞增殖的培養基中培養。宿主細胞可以是能表達可溶形式的可溶性融合蛋白的真核細胞，優選哺乳動物細胞。但有時可能需要在細菌中表達可溶性融合蛋白。如下文將詳述，表達可溶性sc—TCR蛋白的細菌細胞可在慢誘導條件下培養。慢誘導條件一般指培養基中一種必需營養物經幾小時被耗竭，從而誘導sc—TCR蛋白可溶性大量表達的細胞培養條件。故在這類實例中需要設計細菌表達載體以便在慢誘導條件下產生最大表達。若有必要，表達在真核或原核細胞中的可溶性sc—TCR蛋白可純化為相當純的sc—TCR融合蛋白。
本發明特別提供分離不含融合Ig—CL鏈或片段之sc—TCR分子的方法。這些方法一般包括向哺乳動物細胞中導入編碼sc—TCR的DNA區段或含有該核酸區段的載體、在適當培養基中在允許sc—TCR表達的條件下培養哺乳動物細胞、從哺乳動物細胞或培養基中純化sc—TCR以分離sc—TCR受體。
本發明還包括對含有本發明之可溶性sc—TCR蛋白的編碼序列的載體或核酸區段進行分離的方法。一般而言，該方法包括將載體或核酸區段導入宿主細胞，優選哺乳動物細胞，培養細胞，自宿主細胞中純化融合蛋白以獲得相當純的融合蛋白。該載體或核酸區段隨後按常規方法分離成很純的形式。通常，該載體或區段為DNA。
某些實例中，可溶性sc—TCR包括一個或多個融合的效應物或標記(通常一或兩個)。其中部分實例中標記可用於協助從通常伴隨融合蛋白的天然細胞成分中純化sc—TCR蛋白。在其它實例中，蛋白標記可用於向可溶性蛋白中導入預定的化學切割位點或蛋白裂解位點。尤其是在DNA載體中，如在可溶性融合蛋白和Ig—CL鏈或合適片段之編碼序列之間導入一個標記編碼片段，從而在有必要時可以將sc—TCR分子與Ig—CL鏈或片段切開(即分開)。
本發明特別提供包括效應物的可溶性sc—TCR融合蛋白和不含融合Ig—CL鏈或片段的sc—TCR分子，其中效應物為細胞毒素或可檢測標記的適於診斷或成像研究的原子或化合物。sc—TCR融合蛋白和sc—TCR分子有多方面應用，包括細胞或組織的體內檢測和／或成像，以及細胞的體外或體內損害或殺傷。靶細胞或組織常常包括一個或多個能選擇性結合sc—TCR的配體。細胞實例包括腫瘤細胞如黑色素瘤細胞及病毒感染細胞(如，被巨細胞病毒之類的靈長類DNA病毒或AIDS病毒之類的靈長類RNA病毒感染的細胞)。
應用本發明或聯合其它方案有可能減小或消除動物如哺乳動物體內不需要的免疫應答。大體上，本發明提供了通過提供包含在藥學可接受製劑中的有效量sc—TCR蛋白而減小或消除哺乳動物體內免疫應答的治療方法。或者，可溶性融合蛋白的sc—TCR部分可應用於治療方法中。sc—TCR融合蛋白或sc—TCR一般能與一個或多個TCR，尤其是那些與致病性T細胞相關的TCR競爭配體(如抗原)。
本發明還提供增強本文之sc—TCR蛋白的特異性結合親和力的方法。例如，未決的美國專利申請第08／813，781號公開了製備sc—TCR「突變型蛋白(mutein)」的方法，該「突變型蛋白」對抗原的特異性結合親和力比相應TCR(即天然含有sc—TCR融合蛋白Vαβ鏈的TCR)的高約2—10倍。這類方法一般包括用標準的寡核苷酸定向引物誘變sc—TCR分子，以將一或多個預定胺基酸突變導入分子，從而增進特異性結合。所公開的sc—TCR突變型蛋白尤其可用於體外和體內，如參與對涉及不需要之免疫應答的T細胞的抑制或清除。該未決的美國專利申請中公開的方法能方便地適用於按所需增進本文之sc—TCR融合蛋白和sc—TCR分子的特異性結合。
此外，本發明的特點還在於製備與能TCR特異性結合之抗體(多克隆、單克隆或嵌合的)的方法。這類方法常包括用相當純的sc—TCR蛋白樣品作免疫原。有時優選用如sc—TCR分子作免疫原以使對免疫反應性Ig—CL鏈或片段的免疫排斥作用減至最小。抗體實例有經常規雜交瘤技術所得單克隆抗體。抗體也可從包含一或多個sc—TCR表位的免疫原性肽生成。這些抗體有多種應用，包括檢測生物學樣品如血液、血清或組織標本中的致病性T細胞。如曾指出，抗體可通過減少靶T細胞與抗原或MHC／HLA肽複合體的相互作用而在體內或體外顯著消除或抑制靶T細胞的活性。在某些設計方案中，經本領域內熟知方法使抗體共價連接適當的細胞毒性、抗代謝或可測性標記將很有幫助。
本發明進一步提供經對哺乳動物施用有效量sc—TCR蛋白或sc—TCR分子，包括由sc—TCR融合蛋白製備的sc—TCR，而誘導哺乳動物，尤其人類這樣的靈長類的免疫應答的方法。若用於誘導免疫應答的是sc—TCR融合蛋白，優選Ig—CL鏈或片段的單元型與所用宿主相容。利用這些免疫原，就有可能使哺乳動物對出現在T細胞(即靶T細胞)表面並涉及致病性或不需要的免疫應答的TCR抗原性結構產生免疫。這類T細胞可經常規方法鑑別，或有必要還可純化並分析其增殖能力。鑑別、純化和分析T細胞的方法如下述。
表現所需增殖應答的T細胞可建立細胞系，從中分離核酸並用於產生sc—TCR融合蛋白。可為靶的目的TCR抗原性結構常包括克隆型(clonotypic)表位、V—α或V—β家族特異性表位、構象表位和線性表位。抗TCR抗原性結構的免疫常抑制T細胞活性，從而減少或清除致病性T細胞或產生不利影響的T細胞。哺乳動物常通過施用免疫有效量(即能產生有效抗體效價)並包含在藥學可接受混合物中的sc—TCR或sc—TCR融合蛋白進行免疫，以使靶T細胞被宿主免疫系統耗盡或清除。
本發明還涉及對能特異性結合TCR的小分子進行檢測的試驗。這類試驗一般是體外篩選，其中本發明之sc—TCR蛋白與固相支持物(如微滴板)結合併與目的小分子在適於sc—TCR與該小分子特異性結合的條件下一起溫育。例如，目的sc—TCR或sc—TCR融合蛋白可用於熟知的淘選型篩選以檢測並分離特異性結合TCR V區的小分子。在一些實例中優選應用sc—TCR融合蛋白，以便使Ig—CL或相應Ig—CL片段與固相支持物結合，從而使支持物與sc—TCR V區的相互幹擾減至最小。
本發明特別涉及用以檢測能抑制超抗原或肽—MHC複合體與TCR之間特異性結合的小分子的篩選方法。一般而言，這類篩選方法涉及體外試驗，其中本發明之sc—TCR蛋白與小分子及超抗原或肽—MHC複合體在允許可溶性融合蛋白形成特異性結合複合體的條件下一起溫育。在單獨的對照反應中，可溶性融合蛋白與超抗原或肽—MHC複合體在相同溫育條件下溫育。然後按常規蛋白結合試驗技術選擇能抑制超抗原或肽—MHC複合體與sc—TCR特異性結合的配體。
本發明還涉及檢測經組合類型化學產生的配體的篩選方法。例如，在一項試驗中，目的sc—TCR分子與固相支持物結合，並與第一已知配體如某超抗原及由常規組合化學產生的第二配體系列混合。第二配體系列的一個實例是常有一個預定胺基酸有差別的肽集合。然後將溫育條件定為適合第一配體與sc—TCR蛋白的特異性結合的條件。第二配體系列中能有效阻斷sc—TCR蛋白與第一配體相互作用的肽可按標準方法檢測並分離。如此篩選測得的配體具有多種用途，包括用於藥用組合物以及體外和體內檢測APC。
本文參考的所有文獻均為全文參考。以下非限制性實施例可舉例說明本發明。
附圖簡述

圖1A和1B圖示pJRS149(1A)和pKC12．2(1B)載體。
圖2為概述各種DNA載體之構建的流程圖。
圖3為概述從pKC12．2構建pKC45，pKC46(pSUN18)和pKC51 DNA載體的流程圖。
圖4圖示PEN2 DNA載體。
圖5圖示pKC60和pKC67 DNA載體的插入物。
圖6(6A—6G)列表顯示用於構建下述DNA載體的寡核苷酸引物。圖6A(SEQ ID NO1—16)，圖6B(SEQ ID NO17—30)，圖6C(SEQ ID NO31—45)，圖6D(SEQ ID NO46—63)，圖6E(SEQ ID NO64—79)，圖6F(SEQ ID NO80—95)，圖6G(SEQ ID NO96—100)。
圖7列表顯示用於構建sc—TCR融合蛋白V—β鏈的DNA寡核苷酸引物(SEQ ID NO101—115)。
圖8列表顯示用於構建sc—TCR融合蛋白V—β鏈的DNA寡核苷酸引物(SEQ ID NO116—130)。
圖9A和9B圖示pKC60—m、pKC67—m、pKC73—m、pKC74—m、pKC75—m的插入物(9A)和pNAG—I—m和pNAG3—m的插入物(9B)。
圖10圖示含有sc—TCR融合蛋白的哺乳動物DNA表達載體。編碼sc—TCR(「sc—TCR變體」)的DNA插入物與小鼠κ內含子和小鼠κ外顯子融合。
圖11(包括圖11a和11b)列表顯示用於構建sc—TCR融合蛋白的DNA寡核苷酸引物(SEQ ID NO7，10，60，75，131—145)。
圖12顯示產生於中國倉鼠卵巢(CHO)細胞的sc—TCR(D011．10)κ融合蛋白的蛋白印跡。
圖13顯示純化的sc—TCR(D011．10)κ融合蛋白的蛋白印跡。
圖14是用考馬斯亮蘭染色的SDS—PAGE凝膠，示純化的sc—TCRκ融合蛋白的染色。
圖15顯示三結構域sc—TCR—κ融合蛋白和四結構域sc—TCR—κ融合蛋白瞬時表達的蛋白印跡。
圖16圖示sc—TCR(DO11．10)κ融合蛋白變異體瞬時表達的ELISA試驗。
圖17圖示sc—TCR(p—149)κ融合蛋白之哺乳動物細胞表達的夾心ELISA試驗。
圖18圖示p149 sc—TCR和p149 sc—TCRκ融合蛋白之哺乳動物細胞瞬時表達的夾心ELISA試驗。
發明詳述如上簡述，我們發現製備和應用完全可溶並有功能的sc—TCR是可能的。例如，有可能通過與Ig—CL鏈或合適Ig—CL片段共價連接促進sc—TCR分子的可溶性表達。一般而言，sc—TCR蛋白包括V—α鏈與V—β鏈經單鏈肽連接序列共價連接。sc—TCR融合蛋白包括與V—α鏈或V—β鏈融合的Ig—CL鏈或合適鏈片段。與Ig—CL鏈或片段的融合可增強完全有功能的sc—TCR在多種細胞中的可溶性表達。
一般，此sc—TCR蛋白的製備可按本文所公開的過程，經公認的重組DNA技術完成。例如，質粒DNA的製備、DNA的限制酶剪切、DNA連接、將DNA導入細胞、細胞培養、所表達蛋白的分離和純化均為已知技術。總參見Sambrook等，分子克隆實驗室手冊(第二版，1989)；和Ausubel等(1989)，分子生物學最新方案，John WileySons，紐約。
sc—TCR分子的一般結構及其製備和應用方法已公開於未決的美國專利申請第08／813，781號。
簡而言之，sc—TCR分子包括經適當肽連接序列共價連接的V—α鏈和V—β鏈。例如，V—α鏈和V—β鏈可通過與V—α鏈C端和V—β鏈N端融合的適當肽連接序列共價連接。sc—TCR融合蛋白的V—α鏈和V—β鏈一般約200—400個胺基酸長，優選約300—350個胺基酸長，並與天然TCR的V—α鏈和V—β鏈至少90％相同，優選100％相同。術語「相同」指V—α鏈或V—β鏈的胺基酸100％同源於相應天然TCR的V—α鏈或V—β鏈。
sc—TCR分子的V—α鏈可再包含與V—β鏈C端融合的C—β鏈或其片段。V—α鏈還可包含與V—α鏈的C端及肽連接序列的N端融合的C—α鏈或其片段。通常在那些包含C—β鏈片段的融合蛋白中，片段長約50—126個胺基酸，且常不含最後的第127位半胱氨酸殘基。而含C—α鏈的融合蛋白中，片段長可在約1—90個胺基酸的範圍內變化(即最多至但不含最後的半胱氨酸的C—α鏈)。例如一個實施方案中，融合蛋白包含約1—72個胺基酸、位於第1至72位胺基酸的C—α鏈片段。在另一個實施方案中，C—α鏈片段約1—22個胺基酸，位於第1至第22位(亮氨酸)。C—α鏈片段通常不含任何半胱氨酸殘基，一個例外是Cα90變異體包含兩個半胱氨酸殘基。為促進完全可溶並有功能的蛋白的表達，Ig—CL鏈或合適片段共價連接於sc—TCR分子上，如連接於V—β鏈或C—β片段的C端。儘管一般並不優選，但Ig—CL鏈或其片段可能共價連接於V—α鏈N端。在大多數實例中，Cα和Cβ鏈長度的選擇將取決於幾種參數，包括所選特定V鏈和可溶性融合分子的預期應用。
本發明的其它sc—TCR蛋白包括如兩個肽連接序列，其中第一個肽連接序列融合在V—α鏈C端和V—β鏈N端之間。V—β鏈C端可與C—β鏈片段N端融合。第二個肽連接序列再與V—β鏈或C—β鏈片段的C端以及Ig—CL鏈或其片段或效應物或標記分子等的N端融合。
在其它實施方案中，sc—TCR蛋白可通過將V—β鏈與V—α鏈經適當肽連接序列融合而製成，其中V—β鏈或C—β鏈片段的C端與V—α鏈的N端共價連接。Ig—CL鏈或其片段可按需要共價連接於分子的C或N端，但一般優選連接於C端。
本發明之scTCR蛋白可包含一或多個融合蛋白標記。例如，就可溶性融合蛋白而言，蛋白標記可融合於sc—TCR V—β鏈(或C—β鏈片段)的C端以及Ig—CL鏈或其片段的N端。sc—TCR融合蛋白可因此包括如兩個蛋白標記，其中第一個標記融合在V—β鏈(或C—β鏈片段)的C端以及Ig—CL鏈或其片段的N端，第二個標記(相同或不同的)融合在Ig—CL鏈或其片段的C端。或者，單一的蛋白標記可融合於Ig—CL鏈或其片段的C端。
也涉及諸如含有一或多個蛋白標記融合於V—α鏈N端的融合體之類的其它sc—TCR融合蛋白。
sc—TCR蛋白的肽連接序列通常選擇成能使sc—TCR分子生成與天然TCR V—α鏈和V—β鏈的類似的結合位點。Vα鏈和Vβ鏈可衍生自未經誘導的T細胞，但大多數情況下V鏈是與病理如免疫相關失調或疾病有關的形式。
更尤其是，分隔Vα，β鏈的肽連接序列靈活地將V鏈定位於能特異性結合配體如目的抗原的口袋中。例如，結合sc—TCR融合蛋白的配體可用於調節T細胞活性，如下述試驗所測。這類試驗實例有體外試驗，包括幾個連續步驟培養表達TCR的T細胞、用sc—TCR蛋白(或從中獲得的sc—TCR)在允許TCR與配體結合的條件下與T細胞接觸，然後評估可溶性融合蛋白是否能調節T細胞的活性。Ig—CL鏈或Ig—CL鏈片段與sc—TCR分子的融合在某些方案中可通過例如促進sc—TCR的可溶性表達及維持sc—TCR在水溶液如細胞培養液中的完整性而提高試驗性能。
如上述，本發明sc—TCR融合蛋白之一包含與如sc—TCR分子C端共價連接的Ig—CL鏈或合適Ig—CL鏈片段。在一個實施方案中，sc—TCR融合蛋白包含融合的哺乳動物Ig—CL鏈，優選小鼠或人類全長Ig—CL鏈，如Cκ鏈。幾種Ig—CL鏈的核酸和蛋白序列業已公開。見如基礎免疫學，(1993)第三版，W．Paul編，Rsen出版公司，紐約；和Kabat，E．A．等，(1991)有免疫學意義之蛋白的序列(第五版)公共健康服務機構，國立衛生研究所。
術語Ig—CL鏈亦包括與所公開的全長序列有一或多個胺基酸替換或添加的區別的免疫球蛋白輕鏈恆定區。例如，可在所公開之Ig—CL鏈序列一或兩個鏈末端經如常規重組方法加入一個胺基酸。此外，重組方法可用於根據需要在鏈中替換指定胺基酸。胺基酸添加通常有約1—30個中性或親水性胺基酸，優選約1—10個這類胺基酸。Ig—CL鏈中一個胺基酸被另一個胺基酸替換應是保守或非保守的胺基酸替換。故Ig—CL鏈序列中酪氨酸被苯丙氨酸替換就代表了胺基酸保守替換的實例，而精氨酸被丙氨酸替換是胺基酸非保守替換。正如下文將就Ig—CL鏈片段而指出，含有融合的Ig—CL鏈的sc—TCR融合蛋白將是完全可溶並有功能的。
此外，下文特別公開的優選Ig—CL鏈序列中胺基酸的替換或添加將屬於本發明範圍內。
在某些實例中，應用Ig—CL鏈片段如小鼠或人類Cκ鏈片段將十分有利。例如，當需要減小融合蛋白的分子量時，可以將適當的Ig—CL鏈片段與sc—TCR分子融合。「適當的Ig—CL鏈片段」或相關術語指當與目的sc—TCR分子融合時形成下文規定的完全可溶並有功能的sc—TCR融合蛋白的Ig—CL片段。目的Ig—CL鏈片段(包括Cκ和Cλ型)可按常規重組方法製備，如經PCR擴增小鼠或人類Cκ或Cλ鏈片段，然後將PCR產物連接至編碼目的sc—TCR分子的DNA區段或載體上。如下文指出，可加工PCR產物使其包含限制酶剪切位點以利於克隆。適當的小鼠或人類Cκ鏈片段一般約在70—150個，優選約90—120個，更優選約100—110個胺基酸長度之間。適當的小鼠或人類Cκ鏈DNA序列的實例如下述。見實施例5、6和7。
本發明的sc—TCR是完全有功能並可溶的。術語「完全有功能」或類似術語指融合蛋白能特異性結合配體。檢測這種特異性結合的試驗已在此公開，包括常規免疫印跡技術如蛋白印跡。
術語「完全可溶」或類似術語指融合蛋白低速離心時不易自水溶液如細胞培養液中沉澱。而且，如果sc—TCR融合蛋白在高於約5—37℃的溫度下，在中性或接近中性pH的條件下，有低濃度陰離子或非離子去汙劑或不含去汙劑時保持於水溶液中，則它是可溶性的。此時，可溶性蛋白常常有低沉降值，如少於約10—50 svedberg單位。此處的水溶液通常含有緩衝化合物以穩定pH(一般在約pH5—9之間)和離子強度(在約2mM—500mM之間)。有時加入蛋白酶抑制劑或溫和的非離子去汙劑，必要時還可加入載體蛋白如牛血清白蛋白(BSA)至數毫克／毫升。含水緩衝液的實例有標準磷酸鹽緩衝液、tris鹽緩衝液或其它已知緩衝液以及細胞培養液。
如上文指出，已發現很多sc—TCR分子在哺乳動物細胞中表達時即使未融合Ig—CL鏈或其片段也是完全有功能並可溶的。例如，圖9B下部所示pNAG3—m和p149—m載體編碼的sc—TCR分子在下文特指的哺乳動物細胞中表達時完全有功能並可溶。pNAG3—m載體編碼的sc—TCR分子中依次共價連接有Vα鏈、Cα鏈、肽連接序列、Vβ鏈和Cβ鏈。公開的還有在Cα鏈中包含胺基酸缺失至多達全長Cα鏈的sc—TCR分子。參見圖9A和9B下部以及圖5所示pKC60載體。此外，未決的美國專利申請第08／813，781號公開了包含依次共價連接的Vα鏈、Cα鏈片段、肽連接序列和Vβ鏈的sc—TCR分子的製備方法。因而，有可能製備包含修飾的(或缺失的)Cα和Cβ鏈、無Ig—CL鏈或合適片段融合的各種sc—TCR分子。sc—TCR分子可根據在此所述方法檢驗在特定哺乳動物細胞中的可溶性表達。
本發明之sc—TCR大都由RNA、mRNA、cDNA或基因組DNA等核酸區段編碼。通常，核酸區段為DNA區段。例如，本發明之DNA區段通常包括可操作連接的前導序列，以提供適當的細胞加工信號。一般而言，前導序列與編碼sc—TCR的DNA序列的5』端融合。例如，前導序列可與編碼V—α鏈(或在有些實施方案中是編碼V—β鏈)之DNA序列的5』端融合。但應認識到，儘管是將特定前導序列與特定α或β鏈連接，但仍常常可用重組技術替換這些前導序列，而不會對融合蛋白的加工產生有害影響。故在一實施方案中，V—α鏈5』端與適當前導序列的3』端共價連接。前導序列大都約12—26個胺基酸殘基長。設計用於插入細菌表達載體的DNA區段可包括Pel B序列，而用於插入哺乳動物細胞表達載體的DNA區段可包括Ig—CL前導序列，如哺乳動物Cκ前導序列。下文將提供Cκ前導序列的實例。
術語「可操作連接」指遺傳序列與核酸區段、或給定片段或序列的5』上遊序列或3，下遊序列有效地(即有功能地)連接。那些鄰近序列常常對該核酸區段或序列在目的細胞類型中的加工和／或表達具有有利影響。
本發明用於細菌表達的DNA載體可包括啟動子如trp操縱子啟動子、lac啟動子、trp—lac啟動子、1acuvs或phoA啟動子。啟動子實例如phoA，它在慢誘導條件下可持續數小時(如2—10小時)提供強烈的、受調節的表達。在適當培養條件下，大多數強啟動子都能提供水平高達甚至超過宿主蛋白總量之10％的可溶性融合蛋白。
可溶性融合蛋白的單鏈V區可衍生自幾乎任何TCR V區。合適的Vαβ鏈常常是那些免疫誘導後基因表達增加的鏈。分析TCR V鍊表達增加的方法已為人知(見如Hafler，D．A．等，實驗醫學雜誌1671313(1988)；Mantgazza，R．等，自身免疫力3，431(1990))。
sc—TCR融合蛋白可包含能方便得到基本全長編碼序列的Vα、β鏈。自細胞中獲得全長TCR V鏈序列的方法為已知。或者，Vα、β鏈區可通過對公開提供的、至少部分序列已知的Vα、β鏈進行PCR擴增而獲得。Vβ基因序列的實例有Vβ8．1、Vβ6．1、Vβ5．1、Vβ5．2、Vβ5．3、Vβ2．1和Vβ2．3基因序列。見Abe等(1992)PNAS(USA)894066；Wang等，(1993)；PNAS(USA)90188；Lahesma等(1993)免疫學雜誌1504125；Kotzin等(1991)PNAS(USA)889161；Uematsu等(1991)PNAS(USA)888534。其它TCR V鏈序列亦見Kabat，E．A．等(文獻同上)和Chotia，C．等(1988)EMBO雜誌73745。
此外，實施例3提供了用於PCR擴增各種V—α和V—β鏈的寡核苷酸引物。適當寡核苷酸引物的其它實例亦見圖7和8。
若想從生物學來源獲得TCRV鏈，可按標準免疫學方法鑑別目的TCR，包括應用主要結合TCR V區某表位並優選特異於該表位的TCR特異性抗體。通常，表面表達可通過已知技術如螢光顯微術、流式細胞術、或免疫化學進行檢測。特異性結合TCR可變區的很多抗體均為已知。見如已公開的PCT專利申請WO 90／06758。
可通過本領域內已知的雜交方法，用針對各種TCR基因家族的寡核苷酸探針進行特異性雜交而直接探測，或優選在PCR擴增後探測所測TCR的DNA或RNA。一般執行高嚴謹度核酸雜交條件。術語「高嚴謹度雜交」指核酸在約65℃、0．1xSSC的條件下溫育。見Sambrook等，文獻同上。TCR DNA序列或其目的部分可直接從擴增的DNA或RNA獲得並可根據需要亞克隆入適當載體。
已知有其它方法可獲得TCR V區DNA。例如，含V區基因的目的TCR可通過對TCR或其相應於V區的優選部分測序而鑑別。DNA序列可在將DNA克隆進本領域內已知的適當測序載體之後或通過首先測定TCR的至少部分蛋白序列再測定DNA序列而測定。本領域內一般技術人員均知，上述操作及技術人員熟知的其它操作可用於成功鑑別目的TCR並從該TCR獲得V區基因，從而製備出單鏈Vαβ構建體以與目的Ig—CL鏈或合適Ig—CL片段融合。
更為特別的是，當需要從生物來源獲得TCR V區DNA時，編碼目的V—α和V—β鏈的DNA區段可從細胞如T細胞雜交瘤或細胞毒T細胞(CTL)獲得。T細胞(如Ts、Tc或TH細胞)可體內獲得，或T細胞可以是培養的T細胞雜交瘤(如D10或B12細胞系)。參見以下實施例1。CTL可以是未經誘導的或可與嚙齒類(如小鼠、大鼠、家兔)或靈長類(如人類或黑猩猩)的免疫系統致病性應答相關。例如，CTL或其它T細胞可來自已確診或疑有以下疾病的病人萊姆病、Kawasaki病、麻風病、癌症(即對腫瘤相關抗原如CEA的免疫應答)、或自身免疫病(尤其是與移植排斥有關的疾病)、多發性硬化症、胰島素依賴型糖尿病、類風溼性關節炎和過敏；或傳染病，尤其是與RNA或DNA病毒有關的傳染病。具體的目標病毒包括人類免疫缺陷病毒(HIV)、巨細胞病毒(CMV)、流感病毒、肝炎病毒、痘病毒、EB病毒、腺病毒或多瘤病毒。CTL來源的實例是從已有腺癌和黑色素瘤的病人分離的抗原特異性CTL和TIL(見如，Cox等，科學(1994)264716；Rosenberg，S．A．等N．Eng．J．Med．(1988)3191676；Kawakami，Y．等，實驗醫學雜誌(1994)180347；Kawakami，Y．等PNAS(1994)916458)。
如前文關於自細胞獲得V—α和V—β鏈的敘述，好幾種可替換的方案可用於製備從中分離的核酸。更具體地說，為製備V—α和V—β鏈DNA，從那些證實了有所需TCR結合特異性的細胞中分離mRNA。這類方法一般包括應用合適的PCR方案，其中使用得自mRNA的第一鏈cDNA模板。然後可應用標準的重組技術製備所需α和β鏈。然後可修飾編碼所需α和β鏈的DNA區段以便包含適當的肽連接序列和蛋白標記(若有必要)。
一般地，PCR方法中所用DNA寡核苷酸引物約長12—50個核苷酸，優選約長20—25個核苷酸。PCR寡核苷酸引物可適當包含限制位點以便按需要向PCR產物中加入特異性限制酶切割位點。引物實例均提供在隨後的實施例和附圖中。產生的PCR產物將包含擴增的V—α和V—β鏈序列，並可作修飾以便按所需包含核糖體結合位點、前導序列和啟動子序列以得到融合蛋白的最佳表達。
編碼目的sc—TCR分子的DNA區段可按下述方法大量製備(每克細菌細胞毫克量)。
以下提供的用於製備可溶性融合蛋白的特定sc—TCR包括帶有哺乳動物V—α和V—β鏈的sc—TCR。實例有靈長類，尤其是人類和黑猩猩；嚙齒類，如免疫原初小鼠如裸鼠或帶有能表達HLA—A2抗原複合體的轉基因的小鼠(Vitiello，A．等，實驗醫學雜誌(1991)175，1002)。特定目標人群包括那些有上述任一病理如自身免疫病的人。包含來自不同哺乳動物的V—α和V—β鏈DNA序列的嵌合構建體可按已知方法構建，並也屬於本發明範圍內。
如上述，肽連接序列可有效地將融合蛋白V—α和V—β鏈定位，以形成配體結合口袋。可溶性融合蛋白因此能特異性結合配體如超抗原、或MHC／HLA肽複合體相關肽抗原、或小分子。特別指出，本發明目標之一是提供能與T細胞表面的天然TCR競爭的可溶並完全有功能的sc—TCR融合分子。術語「競爭」指可溶性融合蛋白能夠以等同於或在某些情況下超過TCR對相同配體之特異性結合親和力的水平結合配體。例如，根據下述方法，sc—TCR融合蛋白(或由其衍生的sc—TCR分子)能有與天然TCR大致相當或高出多達約2—10倍的結合親和力。
通常，與缺少融合Ig—CL鏈或其片段的sc—TCR分子相比，目的Ig—CL鏈或合適Ig—CL片段的融合對sc—TCR融合蛋白特異性結合力的減小不超過30％，優選不超過10％，更優選不超過5％或更低。結合試驗實例已在此公開，包括下述標準蛋白印跡試驗和表面等離子體激元共振(Surface Plasmon Resonance)試驗。
在本發明的一個實施方案中，多肽連接序列有約7—20個胺基酸，優選約10—20個胺基酸，更優選約12—20個胺基酸。連接序列通常柔性地位於融合蛋白中，可使V—α和V—β鏈定位於可提供目的配體如肽抗原特異性結合的構象。連接序列優選主要包含帶小側鏈的胺基酸，如甘氨酸、丙氨酸和絲氨酸，以提供最佳彈性。優選地，連接序列的約80％或90％或更多包含甘氨酸、丙氨酸或絲氨酸殘基，尤其是甘氨酸和絲氨酸殘基。優選連接序列不含任何可抑制彈性的脯氨酸殘基。連接序列適當地連接於融合蛋白中V—α鏈的C端和V—β鏈的N端。見以下實施例1和2。
更尤其是，適當連接序列包括(GGGGS)4序列(即(Gly Gly Gly GlySer)4)，如JA302(SEQ ID NO96)和JA301(SEQ ID NO95)。優選地，所選連接序列共價連接於sc—TCR V—α鏈的C端殘基和V—β鏈的第一個胺基酸之間。然而，如前述，也可能是其它肽連接序列構型，其中部分包含與Ig—CL鏈或合適Ig—CL鏈片段如Cκ鏈片段的融合。已公開多種可用於連接抗體可變區的多肽連接序列(見M．Whitlow等，方法酶學方法手冊，297—105(1991))。或者，可憑經驗輕易鑑別其它合適的連接序列。例如，可以克隆並表達包含帶連接序列的融合蛋白的編碼DNA的DNA載體，並檢驗融合分子是否能結合抗原。一項試驗實例是標準抗原結合試驗如HarlowLane，文獻同上所公開的。或者，可檢驗所表達的、含連接序列的融合蛋白調節T細胞活性的能力，如本文參考試驗所測。見以下實施例8、10和11。連接序列的合適大小和序列也可通過基於融合蛋白之預定大小和形狀的常規計算機模擬技術測定。肽連接序列實例有在V—α和V—β鏈之間的多肽連接序列末端包含適當的限制酶位點(如XhoⅠ和SpeⅠ)的那些。
多數實例中，編碼目的sc—TCR分子的DNA區段可經基因工程重組進入適當的DNA載體。例如，在目的V鏈是經PCR擴增的實施方案中，寡核苷酸引物常在其兩末端具有所需限制性位點，以便可用另一目的DNA區段替換該DNA區段。
因此，本發明之合適DNA載體是目的sc—TCR分子可輕易插入其中的載體。有時，當製備可溶性融合分子時，Ig—CL鏈或合適Ig—CL鏈片段將由該載體編碼並通過連接與此DNA區段融合。其它實例中，Ig—CL鏈或片段將在與載體連接之前與DNA區段融合。
本文所用術語「載體」指能摻入宿主細胞導致目的核酸區段如編碼上述sc—TCR融合蛋白的區段或序列表達的任何目的核酸序列。載體可包括如線性核酸區段或序列、質粒、粘粒、噬菌粒和外源染色體DNA。特定地，載體可為重組DNA。本文所用術語「表達」或「基因表達」指目的核酸序列的蛋白產物的產生，包括DNA轉錄和RNA轉錄物的翻譯。通常將編碼本發明sc—TCR融合蛋白的DNA區段插入載體，優選DNA載體中，以便在合適的宿主細胞中複製該DNA區段。
在目的細胞中表達本發明sc—TCR蛋白的方案很多。例如，可將編碼sc—TCR蛋白的DNA序列摻入DNA載體，方法已知如用酶在預定位點剪切載體，隨後將DNA連接至載體。然後將含DNA序列的載體導入合適的宿主以進行sc—TCR蛋白的可溶性表達。合適載體的選擇可憑經驗根據與克隆方案相關的因素而定。例如，載體應與所用宿主細胞相容，並具有對其正確的複製子。而且，載體應能容納將表達的編碼該蛋白的DNA序列。優選載體能在哺乳動物細胞中表達可溶性蛋白，如inVitrogen供應的pCDNA3。其它可用於哺乳動物細胞的合適載體亦見Sambrook等，文獻同上和Ausubel等，文獻同上。通常，設計在細菌中表達、編碼可溶性融合蛋白的DNA載體不含全長Cλ或Cκ內含子，但這些序列可包含於設計在能剪切RNA的哺乳動物細胞中表達的載體中。
優選將DNA載體設計成可在真核細胞，尤其是哺乳動物細胞中表達可溶性sc—TCR。必要時可安排DNA載體使之在細菌宿主中複製，從而可獲得適量DNA載體。例如，DNA載體常包括(ⅰ)在大腸桿菌中有功能的複製起點；(ⅱ)選擇性抗生素抗性基因；(ⅲ)強病毒啟動子如巨細胞病毒(CMV)啟動子和可選擇的CMV增強子元件；(ⅳ)Ig—CL前導序列；(ⅴ)目的sc—TCR分子，(ⅵ)與Ig—CL外顯子連接的全長Ig—CL內含子，(ⅶ)生長激素多聚腺苷化序列如牛生長激素(bgh)po1y A序列和(ⅷ)選擇性真核標記的編碼DNA如與抗生素抗性基因(如新黴素)連接並與病毒性多聚腺苷化序列(如猴病毒40(SV40)poly A序列)融合的強病毒性啟動子(如SV40啟動子)。或者，DNA載體可包括上述(ⅰ)—(ⅴ)以及(ⅶ)—(ⅷ)，不含(ⅵ)的與Ig—CL外顯子連接的全長Ig—CL內含子。Ig—CL前導序列的實例有小鼠κ前導序列。全長Ig—CL內含子和外顯子的實例有全長Cκ基因。適於哺乳動物細胞表達的DNA載體實例如圖10(pSUN27載體)。見下述實施例5。
用於目的哺乳動物細胞的本發明DNA載體可經常規技術修飾以使之在其它哺乳細胞中的可溶性表達最優化。例如，上述編碼新黴素抗性基因的真核標記可由編碼腺苷激酶(TK)基因的DNA取代，從而促進sc—TCR融合蛋白在TK—(TK缺陷)哺乳動物細胞中表達。DNA載體可用本領域內已知的其它方法修飾，如改變啟動子、抗生素抗性基因，用免疫球蛋白啟動子、SV40、腺病毒或乳頭瘤病毒啟動子取代CMV啟動子以使sc—TCR融合蛋白在目的哺乳動物細胞中得到最佳表達。或者，編碼sc—TCR蛋白的DNA序列可根據需要插入適於酵母或昆蟲細胞表達的已知載體。參見如，Ausubel等，文獻同上及SummerSmith，文獻同上。
適用的宿主細胞可經各種方法轉化，包括逆轉錄病毒轉移、病毒或噬菌體感染、鈣、脂質體或聚凝胺介導的轉染、biolistic轉移，或本領域內已知的其它這類技術。
前文已指出，有時在非哺乳動物細胞中表達可溶性融合蛋白可能比較理想。例如，適於在細菌中表達融合蛋白的宿主細胞包括易於轉化並在培養基中表現快速生長的細胞。特別優選的宿主細胞包括大腸桿菌、枯草芽孢桿菌等。其它宿主細胞包括，酵母如釀酒酵母和昆蟲細胞。昆蟲細胞表達的細胞實例為杆狀病毒能感染的細胞如Sf9細胞。亦參見，SummerSmith(1988)杆狀病毒載體和昆蟲細胞培養方法手冊，德克薩斯農業實驗站公報(Texas Agricultural Experimental StationBulletin)第1555號，學院站(College Station)，德克薩斯州。
採用的細胞培養條件一般是穩定轉化或轉染的細胞系可因如在載體中加入適當的細胞選擇標記(如抗生素抗性基因或G418)而得到選擇的條件。表達sc—TCR融合蛋白的細胞可經已知過程如應用市售特異性結合V—α或V—β鏈的單克隆抗體的ELISA試驗進行測定。或者可選用特異性結合可溶性融合蛋白Cκ或Cλ鏈(或片段)的單克隆抗體。單克隆抗體和適用的試驗的實例提供在以下實施例中。
設計用於在細菌中複製和表達目的可溶性融合蛋白的載體包括如，(ⅰ)在大腸桿菌中有功能、衍生自如pBR322、優選眾所周知的pUC19載體的複製起始區；(ⅱ)選擇性抗生素抗性基因，如青黴素和／或新黴素抗性基因；(ⅲ)轉錄終止區，如大腸桿菌trp操縱子的終止區；(ⅳ)轉錄啟動子，如phoA、tac、tac—1ac、1acZ、1acuvs、T7或T3啟動子；(v)前導序列，如pelB或ompA前導序列；(ⅵ)編碼與目的Ig—CL鏈或合適Ig—CL鏈片段，如全長小鼠或人類Cκ外顯子融合的sc—TCR的DNA區段；及(ⅶ)轉錄終止子，如來自大腸桿菌核糖體RNA位點的T1T2序列。或者，載體可包括上述(ⅰ)—(ⅶ)，只是sc—TCR不含融合的Ig—CL鏈或片段。
在細菌表達用DNA載體中包含特殊核苷酸序列可在慢誘導條件下輔助sc—TCR融合蛋白的可溶性表達。例如，下述phoA啟動子和pelB前導序列可用於在慢誘導條件下表達sc—TCR融合蛋白。參見以下實施例6。在構建體中還可包含強翻譯起始序列以提高翻譯效率。用於哺乳動物細胞表達的優選起始序列是Kozak共有序列(CCACCATG)(SEQ ID NO97)。
DNA載體的前導序列可適宜指導融合蛋白表達在宿主細胞膜或宿主細胞培養液中，該序列常包括限制酶位點，使編碼如目的V—α鏈的DNA可方便地連接於構建體。適宜地，限制酶位點可摻入在前導序列的3』端，有時本文稱之為連接序列，長度如約2—10個密碼子，並與V—α鏈相連，使V—α鏈編碼區通常為V—α編碼區的第一個胺基酸。例如，一個限制酶位點是Sfi I位點，但也可將其它限制位點插在V—α鏈編碼區之前，以使V—α鏈能更為便利地插入載體構建體。如上述，這類限制酶位點聯合常位於V—α鏈起點的第二限制酶位點的應用，使得可快速、直接地插入各種編碼V—α鏈，或V—α，C—α鏈的序列。優選的前導序列包含強翻譯起始位點，而且有時還在它們的mRNA 3』端包含帽位點。如上述，前導序列實例包括細菌表達用的pelB和OmpA，哺乳動物細胞表達用的Cκ小鼠κ鏈前導序列。
sc—TCR蛋白可以各種方式在細菌中表達。例如，編碼sc—TCR融合蛋白的DNA載體在細菌中的表達可通過長時間(約2—8小時)慢誘導細胞完成。例如，如下實施例6述，DNA載體可製成包括與sc—TCR蛋白編碼序列可操作連接的phoA(強)啟動子。宿主細胞可隨後用該DNA載體轉化，並使宿主細胞培養液中磷酸鹽在幾個小時內耗竭，常約2—10個小時，更優選約4—6小時。
由本文DNA載體編碼的sc—TCR蛋白可經多種標準技術純化。例如，如上述，可溶性融合蛋白可包含一或多個蛋白標記(相同或不同)，包括帶有化學或蛋白酶切割位點的標記。特別是，蛋白標記可以是在生理pH下帶電荷的多肽，如6xHIS。在此實施方案中，可使用適宜的合成基質純化融合蛋白。更特別地，該合成基質可以是市售sepharose基質，如Ni—Sepharose或這類能在約pH6—9結合6XHIS標記的其它適宜基質。其它適宜標記包括能特異性結合市售單克隆抗體的EE或myc表位。通常，能與抗體，如單克隆抗體特異性結合的各種表位均能作為蛋白標記。其它適宜的合成基質包括已附著了能特異性結合本發明sc—TCR蛋白的抗體的基質。蛋白標記實例包括帶有腸激酶、因子Xa、蛇毒或凝血酶剪切位點的那些標記。參見如，已公布的PCT專利申請WO 96／13593。
表達的sc—TCR蛋白可用已知方法分離並純化，如免疫親和層析、免疫吸附、免疫沉澱等等。重要的是，製備過程應該不至於為獲得大量融合蛋白而要求比較長時間的分離步驟。根據以下詳述的蛋白純化方法，大多數sc—TCR蛋白的產量為每約50—100克宿主細胞糊產2—20毫克。
為製備在此公開的sc—TCR蛋白，一般將細胞提取物或宿主細胞培養物離心，所得上清經親和或免疫親和層析，如蛋白A或蛋白G親和層析或利用能特異性結合所表達sc—TCR融合蛋白的抗體的免疫親和層析方案而純化。這類抗體的實例如市售能特異性結合sc—TCR的V—α鏈或V—β鏈的單克隆抗體。這樣的抗體實例如得自Pharmagen的H57、MR5—2和F23．1。或者，可用能特異性結合sc—TCR蛋白中免疫球蛋白鏈的市售抗獨特型抗體純化sc—TCR融合蛋白。這類抗體的應用實例提供在以下實施例5中。蛋白的單克隆抗體親和純化眾所周知，並已公開，如參見HarlowLane的《抗體實驗室手冊》(1988)一書。
如上述，本發明之sc—TCR蛋白以可溶並完全有功能的形式提供。因此，sc—TCR蛋白將穩定地分泌至培養基中並能特異性結合目的配體如肽抗原或合成性小分子。更特別地，sc—TCR蛋白在生理條件下、在離液劑如去汙劑等基本缺乏或完全缺乏時一般保持穩定。因此，這類可溶性蛋白一般不包括富含疏水胺基酸如發現於TCR跨膜區的那些胺基酸的區。但有時可包括其適宜部分，只要sc—TCR保持完全可溶即可。即，融合蛋白的表達不會導致在相應宿主細胞中形成大量的包涵體。包涵體用顯微鏡或常規生化技術如離心沉降可輕易測得。
本發明的sc—TCR蛋白可如上述製備，也可按以下實施例製備。編碼目的V—α或V—β鏈的DNA可來自如T細胞、T細胞雜交瘤系、或公共提供的V—α和V—β鏈序列，如上述。DNA可經PCR、克隆或其它適當方法擴增。例如，可將編碼目的V—α鏈的DNA克隆至適當載體，然後克隆編碼目的V—β鏈和適當單鏈連接序列的DNA以產生所需sc—TCR。如上述，有時sc—TCR包含編碼C—α和／或C—β鏈片段的DNA。對於可溶性sc—TCR融合蛋白，sc—TCR分子構建體還與Ig—CL鏈或片段，如小鼠或人類Cκ鏈或合適Cκ鏈片段融合。正如前文已指出，編碼Cκ鏈的DNA可經PCR擴增並與編碼sc—TCR的DNA連接。或者，Cκ鏈可包含在DNA載體，如Near等(見下文)所公開的那些中。再將編碼融合蛋白的DNA區段導入該DNA載體。DNA載體隨後在宿主細胞中表達，收穫融合蛋白，必要時純化。
本發明之sc—TCR融合蛋白一般由包含依次以下共價連接的DNA區段編碼啟動子／前導序列／V—α鏈／單鏈連接序列／V—β鏈／Cκ鏈；啟動子／前導序列／V—α鏈／單鏈連接序列／V—β鏈，C—β鏈片段／Cκ鏈；啟動子／前導序列／V—α鏈，C—α鏈／單鏈連接序列／V—β鏈／Cκ鏈；或啟動子／前導序列／V—α鏈，C—α鏈片段／單鏈連接序列／V—β鏈，C—β鏈片段／Cκ鏈。sc—TCR分子的實例如上所述，除了Cκ鏈不由該DNA區段編碼。將編碼sc—TCR蛋白的DNA載體導入目的細胞，包括本文公開的特異性表達系統，以使融合蛋白可溶性表達。
在此提供的sc—TCR蛋白可經常規方法修飾以包括多種共價連接的效應物或標記。適宜的效應物或標記包括具有所需生物學、化學或生理特性的那些。更特別地，效應物分子可以是如植物或細菌來源的細胞毒素，諸如白喉毒素(DT)、志賀毒素、相思豆毒蛋白、霍亂毒素、蓖麻毒蛋白、皂素(saporin)、假單胞菌外毒素(PE)、美洲商陸抗病毒蛋白或gelonin。這些毒素的生物活性片段為本領域內已知，包括如DTA鏈和蓖麻毒蛋白A鏈。此外，毒素可以是在細胞表面具有活性的製劑，如磷脂酶類(如磷脂酶C)。而且，效應物分子可以是化療藥物如去乙醯長春鹼醯胺、長春新鹼、長春鹼、氨甲蝶呤、阿黴素、博來黴素或順鉑。或者，效應物分子可以是適用於診斷或成像研究的可檢測性標記分子，如碘131、釔90、錸188或鉍212之類的放射性核素。已公開的有關含有效應物或標記的蛋白製備和應用參見如，Moskaug等，生物化學雜誌264，15709(1989)；Pastan，I．等，細胞47，64L 1986；Pastan等，作為新型治療製劑的重組毒素，生物化學年鑑61，331，(1992)；「嵌合毒素」O1snes和Phil，Pharmac．Ther．，25，355(1982)；已公開的PCT專利申請WO 94／29350；已公開的PCT專利申請WO 94／04689；和美國專利第5，620，939號。
有關利用在此公開的sc—TCR融合分子和不含融合Ig—CL鏈(或片段)的sc—TCR分子進行診斷和成像研究的其它方法和材料的公開內容，亦參見A．K．Abbas(見下文)及後續討論。
含有共價連接的效應物分子的可溶性sc—TCR蛋白有多種重要用途。例如，該sc—TCR蛋白可用於將效應物分子送至能特異性結合sc—TCR的特定細胞。因而，sc—TCR蛋白提供了選擇性損傷和殺死含此配體之細胞的方法。可由sc—TCR蛋白損傷或殺死的細胞或組織實例包括能表達一或多種可與sc—TCR特異性結合的配體的腫瘤和病毒感染細胞。易受損傷或殺死的細胞或組織可根據本文公開的方法輕易地進行分析。
與效應物分子融合的sc—TCR蛋白的特別實例如下諸如以下實施例6和7公開的p149 sc—TCR之類的sc—TCR可用圖9B所示pNAG1或pNAG3載體轉染哺乳動物細胞而產生。sc—TCR p149蛋白識別呈遞於人類HLA抗原中的由人類野生型p53腫瘤抑制蛋白加工的肽片段；HLA—2．1。sc—TCR p149及其肽配體已述於Theobald，M．J．等，PNAS(USA)(1995)，9211993。此肽序列為STPPPGTRV(SEQ ID NO．146)。腫瘤抑制蛋白p53的表達在惡性細胞中上調。已顯示50％的腫瘤在其表面表達的p53水平增高(Holliston，M．D．等，科學(1991)，25349)。因此，特異於該表位的sc—TCR分子可用毒素標記，將該毒素送至表達p53肽片段HLA—2．1配體的惡性細胞。這種靶特異性免疫治療可只針對惡性細胞進行有效殺傷。體外測量細胞毒活性的方法已為人知，包括下述常規生活力試驗。帶有與效應物連接的p149 sc—TCR的sc—TCR分子具有其它重要用途。例如，該sc—TCR分子可用於選擇性殺傷表達p149肽的人類乳腺癌細胞。可進行體外研究，其中標記有毒素的p149分子殺傷乳腺癌細胞的能力可利用非放射活性細胞毒性試驗根據Eu3+釋放細胞毒性分析評估(Bouma，G．J．等，(1992)人類免疫學(Hum．Immunol．)3585)。帶有融合的效應物分子的sc—TCR分子可輕易地進行體內檢驗。例如，可通過將表達p149／HLA—A2．1的乳腺癌細胞移植到HLA／A2轉基因小鼠中進行體外研究(Theobald等，(1995)文獻同上)。可將毒素標記的sc—TCR p149分子按預定劑量注射給小鼠，測量腫瘤大小的變化可指示sc—TCR分子的效力。此外，存活時間可作為評估新型抗腫瘤療法效力的第二標準。
已知還有其它適宜的效應物或標記分子。例如其中之一是在生理pH下荷電的多肽如6xHIS。此時，sc—TCR分子或可溶性sc—TCR融合蛋白可用能在約pH 6—9特異性結合6xHIS標記的市售金屬—sepharose基質如Ni—sepharose純化。EE表位和myc表位也是合適的蛋白標記，這些表位可被一或多種市售單克隆抗體特異性結合。
本發明sc—TCR融合蛋白的分子量可根據很多因素變化，包括是否選擇了全長Cκ或Cλ鏈或其合適片段，或是否應用了一或多種蛋白標記。通常，可溶性融合蛋白的分子量大於約45kDA，其中的V—α和V—β鏈分子量大於約20 kDA，更常常介於約21—26kDa之間。本發明之融合蛋白的分子量通常約50—75kDa。所有上述分子量均根據常規分子量大小測量試驗如SDS—PAGE凝膠電泳測定。總見Sambrook等，文獻同上，HarlowLane，文獻同上；Ausubel等，文獻同上。
在一些方案中，將本發明之sc—TCR蛋白製備成多價將十分有利，如可增加sc—TCR的效價。簡而言之，可將一至四個(相同或不同)蛋白用如標準生物素—抗生物素蛋白標記技術共價連接在一起、或與適宜固相支持物如膠乳顆粒偶聯而製成多價sc—TCR蛋白。化學交聯的蛋白(如與dendrimer交聯)也是適宜的多價蛋白。例如，該蛋白可通過包含編碼帶化學反應性側鏈的胺基酸殘基如Cys或His的序列而修飾。這類帶化學反應性側鏈的胺基酸可位於融合蛋白中的多個位置，優選遠離sc—TCR的抗原結合區。例如，可溶性融合蛋白C—β鏈C端可與包含這類反應性胺基酸的蛋白純化標記或其它融合蛋白共價連接。包含適宜側鏈可使兩個或更多融合蛋白化學連接到dendrimer顆粒上，形成多價分子。Dendrimer是表面可帶有多種不同官能團中任何一種的合成性化學多聚體(D．Tomalia，A1drichimica Acta，2691101(1993))。可根據本發明進行應用的dendrimer實例如E9 starburst多胺dendrimer和E9comburst po1yamine dendrimer，它們可連接半胱氨酸殘基。
構建編碼本發明之可溶性蛋白及其它生長製劑，尤其是T細胞共同刺激因子如B—7基因家族之類(如B7—1或B7—2)的DNA載體，以便增強含有融合蛋白的細胞的活性可能也比較合乎需要。
本發明之可溶性蛋白可用於檢測和鑑定超抗原。例如，本發明之方法可用於對T細胞的未鑑定表位作圖，進行如下編碼隨機肽文庫的序列或已選定肽的序列可提供在肽文庫中。然後用本發明的可溶性sc—TCR蛋白篩選此文庫，優選用帶有可檢測標記的融合蛋白(如標有放射性原子或發光分子)。從融合分子中釋放出融合蛋白所特異性結合的肽並隨後擴增。對肽進行序列分析可鑑定融合蛋白所結合的序列。此外，可檢驗已克隆的肽序列對表達相應於融合蛋白V—α和V—β鏈之TCR的T細胞的結合。多種隨機肽文庫可任選其一應用。參見如，J．Scott等，科學(1990)249386；J．Devlin等，科學(1990)249404；S．Cwirla等，PNAS(USA)，(1990)；876378；J．Hammer等，實驗醫學雜誌(1992)1761007；Rhode，P．R．等，免疫學雜誌(1996)1574885；及D．O』Sullivan等，免疫學雜誌(1991)1472663。
有很高利用價值的單鏈Ⅰ類和Ⅱ類MHC／肽複合體(在其中常稱為scMHCⅠ類和Ⅱ類複合體)見已公開的PCT專利申請PCT／US95／09816和PCT／US97／01617，以及提交於1995年2月1日的未決美國專利申請流水號08／382，454號。已公開的PCT專利申請PCT／US95／09816和PCT／US97／01617，以及未決的美國專利申請流水號08／382，454號還公開了極有價值的體外和體內T細胞結合試驗，它們可方便地適用於檢驗在此公開的sc—TCR蛋白。已公開的PCT專利申請PCT／US95／09816和PCT／US97／01617，以及未決的美國專利申請流水號08／382，454的內容均引入本文作為參考。
本發明之sc—TCR蛋白調節T細胞活性的能力(即降低或消除T細胞活性如增殖)可按上述已公開的PCT專利申請PCT／US95／09816和PCT／US97／01617以及上述未決的美國專利申請流水號08／382，454中的試驗和進行該試驗的材料容易地進行測定。
更特別地，如上述已公開的PCT專利申請PCT／US95／09816和PCT／US97／01617號，以及上述未決的美國專利申請流水號08／382，454所公開，可進行體外試驗以測定分子是否能調節T細胞活性。這類試驗經改造可測定sc—TCR蛋白的功能。總之，一個試驗實例可經如下1—4步連續步驟完成。T細胞可適當表達這樣一種標記，該標記可進行分析、可指示T細胞的活化、或活化後對T細胞活性的調節作用。因此，如上述專利申請所述，可應用活化時表達白細胞介素—2(IL—2)的小鼠T細胞雜交瘤D011．10。測定IL—2的濃度可證實特定sc—TCR融合分子是否能調節T細胞雜交瘤的活性(如減少IL—2的產生量)。這類合適試驗一般可按以下步驟執行1.獲得包含對應於本發明之sc—TCR蛋白的TCR的T細胞雜交瘤或T細胞。
2．然後在可增殖的條件下培養T細胞雜交瘤或T細胞。
3．隨後將增殖的T細胞雜交瘤或T細胞與一或多種sc—TCR融合蛋白接觸。
4．將T細胞雜交瘤或T細胞與能特異性結合該TCR並活化T細胞雜交瘤或T細胞的配體接觸。配體實例包括抗原如超抗原(帶有上述呈遞肽的sc—MHCⅠ類或Ⅱ類複合體)、或適當的APC。
5．將T細胞雜交瘤或T細胞與適當的共同刺激因子接觸以提供活化必需的信號。隨後分析T細胞雜交瘤或T細胞的標記如IL—2的產生。24小時後，IL—2產量減少如40％或更多，說明sc—TCR融合蛋白結合了配體並因此調節了T細胞的活性。
如上已公開的PCT專利申請PCT／US95／09816和PCT／US97／01617，以及上述未決的美國專利申請流水號08／382，454所述，試驗中所用T細胞常常在適合於增殖的條件下溫育。例如，將D011．10T細胞雜交瘤在約37℃、5％CO2，於完全培養基(添加了10％FBS、青黴素／鏈黴素、L—穀氨醯胺及5×10—5M2—巰基乙醇的RPMI 1640)上溫育。可以將濃度通常為10—8—10—5M的系列稀釋的融合蛋白加入T細胞培養基中。T細胞活化信號優選由已攜帶相應抗原的抗原呈遞細胞提供。據信使用使T細胞活化略低於最高水平的抗原劑量和APC數目能更好地檢測融合蛋白對T細胞應答的抑制作用。與sc—TCR融合蛋白接觸後IL—2產量的減少，說明融合蛋白能調節T細胞活性。
如已公開的PCT專利申請PCT／US95／09816和PCT／US97／01617，以及上述未決的美國專利申請流水號08／382，454所述，不測量表達蛋白如IL—2，而可通過用本領域內公認的放射性標記技術測量抗原依賴性T細胞增殖的變化而測定對T細胞活化的調節。例如，可在試驗培養基中加入可檢測性標記(如氚標記)的核苷酸。DNA中摻入這樣的標記核苷酸的量可作為T細胞增殖的度量。這項試驗不適用於無需抗原呈遞便能生長的T細胞，如T細胞雜交瘤。它適用於測量分離自哺乳動物的未轉化T細胞活化的調節。與融合蛋白接觸後T細胞增殖水平降低，說明此分子可調節T細胞活性並抑制免疫應答。優選使用體外T細胞增殖試驗測量融合蛋白對體內T細胞集落擴展中抗原特異性改變的影響。IL—2產生或T細胞增殖的測量可用於測定sc—TCR融合蛋白是否能改變T細胞的活化。例如，與融合蛋白接觸後APC刺激的T細胞的IL—2產量的減少說明融合分子可調節T細胞活性並抑制T細胞介導的免疫應答。
一般而言，適用於這些試驗的T細胞均由轉化的T細胞系如T細胞雜交瘤或分離自哺乳動物(如人類等靈長類或小鼠、大鼠、家兔等嚙齒類)的T細胞提供。其它適用的T細胞包括1)可公開獲得的或可通過已知方法製備的T細胞雜交瘤，2)T輔助細胞和3)T細胞毒細胞，優選細胞毒性CD8+細胞。T細胞可用已知方法從哺乳動物中分離。參見如，R．Shimonkevitz等，實驗醫學雜誌，(1983)158303。
體內試驗也可能適用於測定可溶性融合蛋白調節T細胞活性的能力，包括抑制或鈍化T細胞發育的能力。例如，可分析sc—TCR融合蛋白抑制免疫球蛋白類別轉換(即IgM轉換成IgG)的能力。參見如P．Linsley等，科學，(1992)257792—795。
用到可溶性sc—TCR蛋白的診斷方法還包括體內診斷性成像和HLA分型(參見如A．K．Abbas，細胞和分子免疫學，第328頁，W．B．Saunders Co．1991)。用於體內成像的融合蛋白帶有放射性標記(如125I、32P、99Tc)或可施用於哺乳動物、且試驗對象可用已知過程掃描對sc—TCR的結合的其它可檢測標記。對哺乳動物的這種分析可輔助對多種疾病包括如伴有APC之不利表達的免疫系統失調的診斷和治療。
這些試驗還可用於評估sc—TCR蛋白(或得自可溶性融合蛋白的sc—TCR)在自身免疫病治療中的應用。例如，如已公開的PCT專利申請PCT／US95／09816和PCT／US97／01617，以及上述未決的美國專利申請流水號08／382，454所述，實驗性變態反應性腦脊髓炎(EAE)是小鼠自身免疫病，並是公認的多發性硬化症模型。在一項試驗實例中，小鼠經處理患上EAE，然後施用適當的sc—TCR蛋白(或得自可溶性融合蛋白的sc—TCR)。接著評估動物以確定EAE的進展在施用融合蛋白或sc—TCR後是否受到抑制或阻止。
本發明sc—TCR蛋白誘導免疫應答(包括針對前述特定疾病進行免疫接種)的能力可輕易通過體內試驗測定。例如，可以將該sc—TCR蛋白(或得自可溶性融合蛋白的sc—TCR)施用於小鼠等哺乳動物，在開始用藥及隨後的一定時間間隔(如施用sc—TCR的2、5和8周後)時多次取血樣。從血樣中收集血清，分析是否因免疫接種產生了抗體。抗體濃度可按標準的免疫技術測定。
本發明還提供經施用編碼sc—TCR蛋白的DNA序列而在哺乳動物，特別是人類等靈長類的細胞中表達該蛋白的方法。優選地，可根據已知方法將攜帶融合蛋白編碼區、受到合適啟動子如CMV啟動子的適當控制的DNA直接注射於試驗對象的骨骼肌。有關施用質粒DNA、受施對象的細胞對該DNA的吸收以及蛋白的表達方法已有報導(參見J．Ulmer等，科學，(1993)2591745—1749)。對於可溶性融合蛋白，優選所編碼的Ig—CL鏈或其片段與所用宿主為免疫相容。
本發明之sc—TCR蛋白具有多種治療用途。例如，可以施用該sc—TCR蛋白以減少或消除哺乳動物的免疫應答，如治療患有或疑有癌症、傳染病、過敏或自身免疫病(如多發性硬化症、胰島素依賴型糖尿病、類風溼性關節炎等等)的人類等哺乳動物。可經任何一種適宜的用藥方式給藥，諸如直接施用編碼該融合蛋白的DNA。那些遭受或將要遭受不必要的免疫應答所帶來痛苦的人，如接受諸如心臟、腎臟、皮膚或其它器官移植手術的病人也適合這類治療。在有關移植物排斥反應的情形下，治療最好開始於手術前。
根據本發明，有多種方法可用於減少或消除哺乳動物的免疫應答。其中，一種減少不必要免疫應答的治療方法是施用有效量的目的sc—TCR融合體以減少或消除致病性T細胞與超抗原或肽—MHC複合體之間的相互作用。從而可選擇性控制T細胞介導的免疫應答如T細胞的增殖、分化、活化或B淋巴細胞的激活。優選地，該融合蛋白具有與介導不必要免疫應答的致病性T細胞至少相同或優選更強的對抗原的特異性結合親和力。此時尤其優選上述已證實對配體的特異性結合親和力增強的sc—TCR融合蛋白突變型蛋白。融合的Ig—CL鏈或片段可用於通過常規免疫試驗鑑定結合至靶細胞的融合蛋白。
sc—TCR蛋白、衍生自合適sc—TCR融合蛋白的sc—TCR、或根據在此公開的方法製備的抗體可通過注射如腹膜內注射或靜脈注射施用於哺乳動物。融合蛋白，至少是用於治療的那些分子，優選產自哺乳動物細胞或其它適宜細胞，並在使用前純化，以使之基本上或完全不含熱原質。治療的最佳用量可通過常規方法確定，一般根據多種因素包括用藥途徑、病人體重、總的身體狀況、性別及本領域內技術人員認定的其它這類因素而變化。
用藥可以是單劑或或間隔數天或數周的多劑。術語「單劑」在此可以是一次釋放的單劑，也可以是緩釋劑。試驗對象可以是哺乳動物(如人類或牛等牲畜以及狗和貓等寵物)，包括以包含sc—TCR、sc—TCR融合蛋白或抗體的藥用組合物進行的治療。本發明的這類藥用組合物均按本領域內已知過程製備和應用。例如，包含藥用有效量融合蛋白的製劑可以單劑或多劑容器如封閉的安瓿和小瓶的形式提供，也可凍幹貯存(此時只要求在使用前加入無菌液態載體如注射用水)。對於多種用途還優選用脂質體製劑。胃腸道外施用的其它組合物也適於此，包括含水和不含水的無菌注射液(其中可能含抗氧化劑、緩衝液、抑菌劑以及使製劑與受者血液等滲的溶質)；含水和不含水的無菌懸浮液(其中可能有懸浮劑和增稠劑)。
包括減少或消除T細胞應答的本發明方法也可與已知免疫抑制劑、抗病毒試劑、抗癌劑或抗炎劑聯合應用，以更有效地治療T細胞介導的疾病。例如，該融合蛋白可與常規免疫抑制藥物如環孢菌素或抗炎劑如皮質類固醇和非類固醇類藥物聯合用於治療自身免疫病和過敏。
如上述，sc—TCR蛋白(或衍生自目的sc—TCR融合蛋白的sc—TCR分子)可用於按本領域內已知技術產生抗體，並常常製成該融合蛋白的純化樣品。選用於產生抗體的sc—TCR融合蛋白可如上述從Ig—CL鏈或片段裂解下來，以減少針對該免疫球蛋白鏈的免疫反應。如此獲得的sc—TCR可作為免疫原使用。抗體也可由包含目的sc—TCR的一或多個表位的免疫原性肽生成。
更特別地，抗體的製備可通過單獨用sc—TCR蛋白的純化樣品、如上述分離自目的sc—TCR融合蛋白或免疫原性肽的sc—TCR分子，或聯合使用合適載體，對哺乳動物進行免疫接種而完成。優選地，用該sc—TCR分子作為免疫原。適合的哺乳動物包括典型的實驗動物如綿羊、山羊、家兔、豚鼠、豬、大鼠和小鼠。優選用大鼠和小鼠，尤其是小鼠獲得單克隆抗體。抗原施用於哺乳動物的合適途徑可任選如皮下、腹膜內、靜脈內、肌肉內或皮內注射。最佳免疫間隔、免疫劑量等可在相對較大範圍內變動，並可根據此公開內容憑經驗確定。典型的過程包括經數周多次注射抗原。用常規技術從免疫動物血清中收集抗體並篩選出特異於sc—TCR的抗體。尤其感興趣的是特異性結合V—α或V—β鏈的抗體，特別是其中的高變區，包括識別其上的線性或構象表位的抗體。單克隆抗體的產生可在能生產抗體的細胞、及採用形成雜交瘤細胞的標準融合技術用於生成單克隆抗體的那些細胞中完成。參見G．Kohler等(1975)，自然，256456。通常，這包括使抗體生產細胞與永生化細胞系如骨髓瘤細胞融合，產生雜交細胞。或者，單克隆抗體可用Huse等(1989)，科學，2561275的方法自細胞中產生。
一個合適的方案是在約2—7個月內對小鼠腹膜內免疫接種包含純化sc—TCR複合體的組合物。然後可以取出免疫小鼠的脾細胞。取脾細胞之前分析免疫小鼠血清中對sc—TCR具有特異性的抗體的效價。然後將取出的小鼠脾細胞與帶有諸如次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶缺陷(HGPRT—)或胸苷激酶缺陷(TK—)之類標記的適當同基因或異基因(優選異基因)淋巴樣細胞系融合。優選用骨髓瘤細胞作為淋巴樣細胞系。以如約1比4的比例將骨髓瘤細胞和脾細胞混合。細胞可採用聚乙二醇(PEG)法融合。參見G．Kohler等，自然，文獻同上。將如此克隆到的雜交瘤培養於培養基如RPMI—1640上。參見G．E．More等(1967)，美國醫學會雜誌，199549。通過如放射免疫分析或酶免疫分析法篩選融合操作後培養的雜交瘤分泌能與純化的sc—TCR特異性結合的抗體的情況。可用ELISA按標準方法篩選含抗體的血清。在這類篩選中顯示陽性結果的雜交瘤可擴增並用有限稀釋法克隆。最好再進行篩選，選出能結合溶液中以及生物樣品中的sc—TCR的抗體。所分離的抗體可用任何適當的免疫技術包括親和層析進一步純化。
在有些應用中，可能需要生成能特異性結合sc—TCR的嵌合抗體衍生物，如組合了非人類動物可變區和人類恆定區的抗體分子，因而使抗體在人類試驗者體內比相應的非嵌合抗體免疫原性更小。可製備各種類型的這類嵌合抗體，包括通過如產生人類可變區嵌合體，其中可變區部分、尤其是抗原結合區的保守區為人類來源，而只有高變區為非人類來源。有關人源化嵌合抗體及其產生方法的討論參見S．L．Morrison，(1985)科學，2291202；Oi等(1986)，生物技術，4214；Teng等(1983)，PNAS，U．S．A．，807308；Kozbor等(1983)，今日免疫學，47279；Olsson等(1982)，酶學方法，93。
如上述，sc—TCR蛋白可按標準誘變技術輕易地修飾以提高對目的配體的特異性結合。例如，目的sc—TCR可通過分離有肽連接序列如上述連接的合適V—α和V—β鏈的編碼DNA區段而製備。必要時DNA可與Ig—CL連接，然後在目的V—α或V—β鏈內進行誘變如定點誘變。誘變方法的實例有丙氨酸掃描誘變(參見如Nisbet，I．T．等，(1985)基因分析技術2，23；Hines，J．C．，基因(1980)11，207；亦參見Sambrook等，文獻同上)。若要調節sc—TCR融合蛋白的特異性結合親和力，所選突變常為可影響sc—TCR互補決定區(即CDR，有時稱為高變區)的結合親和力的那些胺基酸替換。更特別地，這種胺基酸替換可以是保守或非保守替換，在本文中指sc—TCR中一個胺基酸被另一個胺基酸替換。在一些實例中，替換包括一個胺基酸被具有基本相似的化學特點的另一個胺基酸替換(保守的)。在另一些實例中，替換包括一個胺基酸被具有基本不同化學特點的另一個胺基酸替換(非保守的)。因此，sc—TCR中酪氨酸殘基被苯丙氨酸殘基替換代表的是保守型胺基酸替換，而丙氨酸殘基被脯氨酸殘基替換代表的是非保守替換。本領域內技術人員將能理解，誘變還可包括改變分隔sc—TCR之V—α和V—β鏈的肽連接序列的長度或胺基酸組成。此外，可誘變Ig—CL鏈或片段以按需要改變其長度或胺基酸組成。但在大多數實例中，誘變針對的是V—α或V—β鏈，在融合蛋白的V—α或V—β鏈中平均產生一個胺基酸替換的突變。誘變程度可通過對誘變後V—α或V—β鏈的DNA測序而方便地進行分析。
優選地，V—α或V—β鏈的誘變將使sc—TCR融合蛋白對配體的特異性結合水平比天然TCR增加至少約2倍。
儘管是不太優選的方法，仍可用已知的化學誘變技術按所需對sc—TCR融合蛋白進行修飾。
本發明還提供了檢測能抑制配體和T細胞受體間特異性結合的分子的方法。該方法包括在有能特異性結合T細胞受體的配體存在時溫育單鏈T細胞受體融合蛋白，在有該配體和目的分子存在時溫育該單鏈T細胞受體融合蛋白；評價在有和無該分子時，該配體和該單鏈T細胞受體融合蛋白之間的相互作用，其中有該分子時融合蛋白與配體間的相互作用比無該分子時弱說明該分子能抑制該配體和該T細胞受體之間的特異性結合。必要時此方法可用sc—TCR分子取代sc—TCR融合蛋白。
本文中術語抗體一般指完整的免疫球蛋白，也指能與該可溶性融合蛋白的sc—TCR分子結合的免疫活性片段。免疫球蛋白及其免疫活性片段包含抗體結合位點(即能特異性結合融合蛋白的peritope)。抗體片段的實例有，如Fab、F(v)、Fab』、F(ab』)2片段、還原免疫球蛋白的二硫鍵得到的「半分子」、單鏈免疫球蛋白或其它合適抗原結合片段(參見如Bird等(1988)，科學，242；Huston等(1988)，PNAS(USA)，855879；Webber等(1995)，分子免疫學，32249)。抗體或其免疫活性片段可以是動物的(如小鼠或大鼠等嚙齒類)、或嵌合形式(參見Morrison等(1984)，PNAS，816851；Jones等(1986)，自然，321)。
術語「特異性結合」或類似術語指在此公開的、能結合另一分子而形成特異性結合對的分子。但此分子不識別或結合其它分子，正如蛋白印跡ELISA、RIA、移動抑制試驗、酶免疫分析、競爭試驗、飽和試驗或領域內已知的其它蛋白結合試驗所測定。總參見Ausubel等，文獻同上；Sambrook等，文獻同上；Harlow和Lane，文獻同上以及其中引用的有關檢測分子間特異性結合之方法實例的參考文獻。
相當純的可溶性融合蛋白或核酸均至少約90—95％純，優選至少98—99％純或更純，以便藥用。一旦部分純化或達到實質性純度，該可溶性融合蛋白就可用於治療(包括離體地)，或如本文所述在開發或執行體外或體內試驗時應用。
本文提到的所有文件均全文引入本文作為參考。
以下非限制性實施例用以舉例說明本發明。
實施例1—可溶性sc—TCR融合蛋白的構建小鼠DO11．10細胞TCR的DNA序列已有報導(Kappler，J．等PNAS(1994)91 8462)。該TCR識別並結合I—AdMHCⅡ類分子中跨越第323—329位胺基酸的小雞卵白蛋白肽(即OVA)。編碼TCR的DNA一般按KapplerMarrack，文獻同上所述方法進行製備。
可簡述為，用oligo—dT包被的磁珠按廠家(Dynal)建議從1×106個DO11．10細胞中分離mRNA。將含C—α特異性「反向(back)」引物KC113(SEQ ID NO．6)與D011．10 mRNA的混合物溫育製成TCRα鏈的cDNA。再向混合物中加入常規量的核苷酸和逆轉錄酶以形成cDNA。用相似的方法，但用「反向」引物KC111(SEQ ID NO．4)替換KC113引物製備β鏈cDNA。以α鏈cDNA為模板，用引物KC112(SEQ ID NO．5)和KC113進行PCR以擴增一段650 bp的5』XhoⅠ—3』XmaⅠα鏈片段。一段750bp的鏈片段用引物KC111和KC110(SEQ ID NO．3)經PCR擴增而得，其5』和3』端分別有SfiⅠ和SpeⅠ位點。
由D011．10TCR構建sc—TCR，其中有共價連接的V—α和V—β鏈。有時，V—α鏈還包含C—α鏈片段和C—β鏈片段(見圖5)。一般Cα鏈片段長約9個胺基酸，但在以下實施例4中公開了更大的C—α鏈。C—β鏈通常在緊鄰全長C—β鏈中的第127位半胱氨酸殘基之前的第126位胺基酸處被截短。我們發現，帶有該半胱氨酸殘基對sc—TCR表達極其不利。
實施例2—用於在大腸桿菌中表達sc—TCR融合蛋白的載體包含與噬菌體衣殼蛋白(基因Ⅲ或基因Ⅷ)融合的sc—TCR分子的編碼DNA區段的DNA載體的構建已述於上述未決的美國專利申請第08／813，781號。可簡述為，為構建這些編碼可溶性融合蛋白的DNA載體，對選自上述未決的美國專利申請的DNA載體進行修飾。參見實施例4—7。
A．DNA載體pJRS149DNA載體pJRS149是具有pBluScriptTM(Invitrogen)骨架的噬菌粒。
B．DNA載體pKC12如圖1所示，將編碼噬菌體基因Ⅲ的DNA克隆至pKC12載體。
C．DNA載體pKC14和pKC15
以fd tet噬菌體(ATCC錄入號37000)為模板，用OPR156(「正向」，SEQ ID NO．58)和OPR157(「反向」，SEQ ID NO．59)引物PCR擴增噬菌體基因Ⅷ的DNA序列。再將基因Ⅷ的PCR產物以XmaⅠ—EcoRⅠ片段形式克隆至載體pLL001中，產生載體pKC14。pLL001質粒衍生自PUC—19DNA，其中在多接頭區含有XmaⅠ和EcoRⅠ位點。此位點便於亞克隆基因Ⅷ片段。此外，pLL001載體可作為穿梭載體用於克隆基因ⅧDNA。將一段96bpNcoⅠ—EcoRⅠ片段如圖1所示克隆至pJRS149載體中，便可由pKC14衍生載體pKC15。NcoⅠ—EcoRⅠ片段包含有多克隆位點(如SfiⅠ，NcoⅠ，SpeⅠ，XhoⅠ和XmaⅠ)的合成性多接頭、pe1B前導序列、phoA啟動子和基因Ⅷ基因。載體pKC15帶有源自pJRS149骨架的另一個pe1B前導序列，能使基因克隆處於雙順反子操縱子控制之下。
D．DNA載體pKC16和pKC18以α鏈cDNA為模板，使用引物KC113(SEQ ID NO．6)(「正向」)和KC112(SEQ ID NO．5)(「反向」)擴增TCRV—α、C—α基因，可從pKC16克隆XhoⅠ—XmaⅠ片段。以β鏈cDNA為模板、以KC11O(SEQ ID NO．3)(「正向」)和KC111(SEQ ID NO．4)(「反向」)為引物經PCR擴增得到V—β、C—β基因片段，並克隆至pKC15中，形成pKC18。
E．DNA載體pKC27、pKC42和pKC44經退火引物JA301(SEQ ID NO．95)和JA302(SEQ ID NO．96)製備(G4S)4多接頭，構建載體pKC27。再將接頭以SpeⅠ—XhoⅠ片段的形式克隆至pKC15載體。然後分別將V—α13．1和V—β、C—β區克隆至pKC27 DNA。簡短說，V—α13．1基因片段經利用引物KC114(SEQ ID NO．7)(「正向」)和KC126(「反向」)(SEQ ID NO．19)、以載體pKC16 DNA為模板的PCR擴增而得。將V—α13．1基因作為SfiⅠ—SpeⅠ片段克隆至pKC42。pKC18用XhoⅠ和XmaⅠ消化後凝膠純化V—β 8．2和C—β鏈DNA。將此片段克隆至pKC42，製成pKC44載體。總之，pKC44載體包括sc—TCR，此sc—TCR是在phoA啟動子的轉錄控制之下的sc—TCR／基因Ⅷ融合蛋白。
F．pKC12、pKC45、pKC46和pKC51 DNA載體從pKC12構建載體pKC45、pKC46和pKC51的過程見圖3，並如下述。
修飾pKC12載體以使編碼實施例1之sc—TCR的DNA在lacZ啟動子的轉錄控制下表達。簡短說，將已退火的引物KC134(SEQ ID NO．27)(「正向」)和KC135(SEQ ID NO．28)(「反向」)克隆至pKC12，使pKC12得到修飾，而產生載體pKC45。這樣的修飾在已帶有SfiⅠ和EcoRⅠ位點的pKC12多接頭區加入了XmaⅠ位點。此外，pKC45在EE—標記的5』端連接了編碼基因Ⅲ的DNA序列，還含有琥珀終止密碼子。
琥珀終止密碼子使sc—TCR融合蛋白在諸如XL1—blue的lacIq琥珀抑制子宿主內的表達減少至約15—20％。為了將編碼sc—TCR／基因Ⅲ融合蛋白的DNA克隆至pKC45，用SfiⅠ和XmaⅠ切割pKC44 DNA。然後對sc—TCR片段進行凝膠純化，克隆至pKC45，產生pKC46。sc—TCR在pKC46中的插入如圖3示，它與EE標記和基因Ⅲ衣殼蛋白融合。
用XmaⅠ和EcoRⅠ消化pKC44和pKC46載體，使sc—TCR／基因Ⅷ融合蛋白受控於lacZ啟動子的轉錄控制。基因ⅧDNA序列自消化後的pKC44DNA分離，作為SfiⅠ—EcoRⅠ片段克隆至凝膠純化的載體pKC46 DNA中，產生pKC51。將pKC51中的sc—TCR插入片段與基因Ⅷ衣殼蛋白融合。與載體pKC46不同的是，pKC51載體不包含EE標記或琥珀終止密碼子。
實施例3—將編碼融合蛋白的DNA克隆至DNA載體pEN2實施例1產生的可溶性sc—TCR的表達可通過如圖4示亞克隆至pEN2載體而增加。pEN2載體包括phoA啟動子、基因10核糖體結合點及已修飾的pelB前導序列。在pEN2骨架中插入sc—TCR的pKC60和pKC67如圖5示及下述。
A．構建DNA載體pKC60pKC60載體通過將一段1204 bp的SfiⅠ—EcoRⅠ片段導入pEN2而得。SfiⅠ—EcoRⅠ片段由V—α、V—β和C—β區組成。該片段是通過以pKC51的DNA為模板、用引物KC114(「正向」SEQ ID NO．7)和JWTCR208(「反向」SEQ ID NO．75)擴增而得。JWTCR209引物在C—β區3』端包含EE標記和XmaⅠ位點。XmaⅠ位點的加入有利於基因Ⅲ和基因Ⅷ的基因克隆。pKC60載體通過將上述sc—TCR XmaⅠ—EcoRⅠ片段克隆至pEN2載體而得。
B．構建DNA載體pKC61為產生截短的sc—TCR，用引物KC115(「正向」SEQ ID NO．8)和JWTCR209(「反向」SEQ ID NO．74)經PCR擴增pKC46的V—α、V—β序列。將所得PCR擴增產物亞克隆至載體pKC60，產生載體pKC61。pKC61再在其EE標記序列的3』端加入6Xhis標記而修飾。
C．構建pKC62和pKC64 DNA載體編碼噬菌體基因Ⅲ的DNA以TCR215(SEQ ID NO 6F)和218(SEQ IDNO 64)為引物、pKC46載體DNA為模板進行擴增，然後克隆至pKC60以產生載體pKC64。基因Ⅷ的基因以TCR212(SEQ ID NO 71)和213(SEQ IDNO 70)為引物、pKC51載體DNA為模板進行擴增，再克隆至pKC60以產生載體pKC62。
D．DNA載體pKC63和pKC65的構建基因Ⅲ(pKC65)和基因Ⅷ(pKC63)融合蛋白的相應目的基因片段經PCR擴增後克隆至pKC61載體骨架中。pKC65和pKC63因此都含有引物序列中編碼的6xHis尾。
E．DNA載體pKC66和pKC67的構建以pKC51的DNA為模板、用引物KC114(正向SEQ ID NO7)和JWTCR217(反向SEQ ID NO66)擴增包含V—α以及C—α鏈片段前8個胺基酸的SfiⅠ—SpeⅠ片段，製備pKC66和pKC67載體。為產生pKC66和pKC67載體，用KC114和JWTCR217引物擴增TCR DNA，然後將擴增的DNA亞克隆至已用SfiⅠ和SpeⅠ消化了的pKC62或pKC60中。這些載體各包含C—α區N端的8個胺基酸殘基。將載體用於構建下述TCR文庫。載體pKC66包含基因Ⅷ的基因。
正如未決的美國專利申請第08／813，781號所述，DNA載體pKC46(pSUN18)和pKC62(pSUN19)已依照布達佩斯條約保藏於12301 Parklawn大街，Rockville，MD的美國典型培養物保藏中心(ATCC)。這些DNA載體是於1997年2月26日保藏在ATCC的，錄入號為97895(pSUN18)和97896(pSUN19)。DNA載體pKC62(pSUN19)有phoA啟動子、修飾的pelB序列、基因10核糖體結合點及噬菌體基因Ⅷ啟動子。DNA載體pKC46(pSUN18)有1acZ啟動子、EE標記及噬菌體基因Ⅲ蛋白。這些DNA載體可在大腸桿菌或其它合適的宿主中按常規方法培養。
DNA載體pKC46(pSUN18)和pKC62(pSUN19)均設計為能容納多種Vα、Vβ—Cβ及多肽連接序列。兩種DNA載體的Vα鏈可用SfiⅠ和SpeⅠ經限制性消化切出。Vβ—Cβ鏈可經XhoⅠ—XmaⅠ限制性消化切出。此外，這些DNA載體使得能夠經SpeⅠ和XhoⅠ限制性消化而替換肽連接序列。
實施例4—載體pKC24、pKC73、pKC74、pKC75的構建如下述構建DNA載體以作為與小鼠IgGκ鏈的融合蛋白形式表達實施例1中的D011．11 sc—TCR。
為製備帶有編碼與小鼠IgGκ鏈融合之DO11．11 sc—TCR的DNA區段的DNA載體，用引物KC114(SEQ ID NO7)和KC117(SEQ ID NO 10)經PCR再次擴增pKC16的VαCα鏈，產生5』SfiⅠ—3』SpeⅠ片段。將此DNA克隆至pKC15並測序。將正確片段限制性消化，連接至已被SfiⅠ—SpeⅠ消化的pKC15 DNA中，產生pKC24載體。pKC15和pKC16構建體的衍化已在上述實施例2C和2D中有述。
然後以pKC24 DNA為模板、用引物KC114(SEQ ID NO7)和KC165(SEQ ID NO 131)、KC114和KC166(SEQ ID NO 132)以及KC114和KC167(SEQ ID NO 133)經PCR擴增，產生附加了不同長度C—α鏈的V—α鏈。將這些PCR產物克隆至pGEM—T Easy載體系統(Promega)以便測定DNA序列。將正確片段經限制性消化並克隆至表達載體pKC60。在所有三個片段中，C—α鏈片段均結束於半胱氨酸殘基。這一「終末」半胱氨酸殘基被變為絲氨酸殘基，但內部的所有半胱氨酸殘基均未突變。最後的構建體pKC73帶有C—α鏈的22個胺基酸，pKC74有72個胺基酸，pKC75有90個胺基酸(即完整C—α鏈)。pKC73、pKC74和pKC75 DNA載體插入物圖示於圖9A。
V—βC—β鏈用引物JWTCR222(SEQ ID NO．60)和JWTCR208(SEQ IDN0．75)PCR擴增為5』SfiⅠ—3』XmaⅠ片段。測序後，克隆至表達載體作為只有β鏈的陰性對照。
實施例5—可溶性DO11．10 sc—TCR融合蛋白的構建在哺乳動物細胞中和表達能夠大量生產的可溶性sc—TCR將是非常合乎需要的。為提高可溶性蛋白表達的水平，將sc—TCR構建體克隆至哺乳動物細胞表達系統。
按上述實施例3A，E製備的大腸桿菌DNA構建體pKC60和pKC67用引物KC169(SEQ ID NO．143)和KC170(SEQ ID N0．144)再次進行PCR擴增，產生5』AgeⅠ—3』BstBⅠ sc—TCR—IgGκ鏈(Cκ)融合基因。TCR—IgCκ表達載體的構建如下載體骨架為質粒pCDNA3(Invitrogen)。用HindⅢ／XhoⅠ切割該質粒，並插入「輕鏈多接頭」DNA區段以產生開始的「輕鏈載體」。此接頭包含限制性位點Hindm、KpnⅠ、ClaⅠ、PmlⅠ、EcoRV、AgeⅠ、XmaⅠ、BamHⅠ和XhoⅠ以便於隨後經克隆產生質粒pCDNA．LCPL。將帶有輕鏈前導序列、抗CKMBκ輕鏈基因組片段和3』UTR的SmaⅠ／BclⅠDNA區段克隆至pCDNA3．LCPL的EcoRV／BamHⅠ位點。此片段中的小鼠κ內含子、外顯子和3』UTR衍生自Richard Near博士提供的pNeo／26—IOVL(Near，R等，(1990)，分子免疫學2791—909)。然後進行誘變以消除NruⅠ(209bp)、MluⅠ(229bp)和BstBⅠ(2962bp)，並導入NheⅠ(1229bp)和BamHⅠ(1214bp)位點，產生pCDNA3mut．LCPL．LCVK。
載體再經進一步修飾以除去可變的輕鏈CKMB Vκ。具體做法是，用EcoRV／XhoⅠ消化質粒pCDNA3mut．LCPL．LCVK，插入帶有EcoRV、AgeⅠ、BstBⅠ和XhoⅠ位點的接頭寡核苷酸片段，產生pSUN9。
D011．10 sc—TCR用引物對KC169正向(5』gAg gTg ACC ggT gAg CagTAC g TTT gTC TgC Tcg gCC CCA g—3』)和KC170反向(5』gTg gAg TTCgAA Aag TgT ACT TAC g TTT gTC TgC Tcg gCC CCA g—3)進行PCR擴增後，作為AgeⅠ／BstBⅠ片段克隆至pSUN6載體，以構建pSUN27載體(pKC60—M)並表達該載體得到sc—TCR—κ恆定區融合蛋白。
pSun27模板DNA也可用引物KC169(SEQ ID NO．143)和KC201(SEQID NO．145)進行PCR擴增，產生不含IgGκ鏈融合體的5』AgeⅠ—3』BstBⅠsc—TCR。pKC73、pKC74和pKC75 DNA也可用引物對經PCR擴增產生sc—TCR和sc—TCR—IgG Cκ融合片段，以連接至適當的哺乳動物表達載體中。
例如，將D011．10 sc—TCR—IgG Cκ融合片段克隆至pGEM—T Easy載體系統(Promega)以便DNA測序。將正確片段限制性消化並克隆至哺乳動物表達載體。所得哺乳動物表達載體包含CMV啟動子、新黴素抗性基因、小鼠IgGκ前導序列、小鼠κ內含子和小鼠κ恆定區外顯子序列。所得載體命名為pKC60－M(pSUN27)和pKC67—M。這些載體的sc—TCR插入物如圖9A所示。載體如圖10所示。
用冷PBS清洗CHO細胞以備轉染。將細胞重懸浮於PBS中並與10—40μg PvuI線性化的pKC60KM混合。冰上置10分鐘後，細胞用設置為傳送250伏、960μFd脈衝的Gene Pulser(BioRad)進行電穿孔。經脈衝的細胞置於冰上，加入10％IMDM培養基(IMDM、10％FBS、2mM穀氨醯胺、5000單位／ml青黴素、5000μg／ml鏈黴素)。將細胞稀釋後加入96孔板中。37℃10％CO2溫育過夜後，將細胞培養於新黴素選擇性培養基(IMDM、0．77 mg／ml G418)中，每3—7天換一次培養基。「模擬」轉染用細胞和PBS進行，作為陰性對照。
用抗獨特型抗體、抗D011．10TCR mAb、KJ—1在ELISA試驗中篩選表達可溶性sc—TCR—IgG Cκ分子的轉染體。已公開的關於sc—TCR的報導已證實，功能性TCR與對抗獨特型單克隆抗體(mAb)的結合之間具有十分密切的關係，即抗獨特型mAb所識別的sc—TCR可主要識別MHC相關肽。參見Relter，Y．等，(1995)免疫2，281—287。為篩選轉染體，96孔板用KJ—1的碳酸氫鈉緩衝液，pH 8．2被動包被過夜。在試驗日，用3—5％脫脂奶粉(NFDM)封閉板至少1小時。洗滌各孔，將轉染體上清加入板中。溫育並洗板後，板上加生物素化的抗CβmAb H57—597(ATCC錄入號HB—218)作用30分鐘，然後洗板並與鏈黴抗生物素蛋白—HRP溫育。加入TMB底物，用1N硫酸猝滅反應，經讀取450nM的吸收值而鑑別出陽性孔。大腸桿菌中產生的sc—TCR的純化產物作為標準參照物。
鑑別出的陽性轉染體較多，但只選用來自最高稀釋板的克隆作擴大培養。4克隆在自原始96孔板開始傳代之前，再次用ELISA檢驗。根據這一定量篩選，克隆產生的可溶性DO11．10 sc—TCR—IgG Cκ均在200—400ng／ml的範圍內。這些資料明確指示，可溶性sc—TCR—IgG Cκ融合蛋白具有正確摺疊的Vα和Vβ對。
載體pSUN27已按布達佩斯條約保藏於上述地址的ATCC。該DNA載體於1997年9月17日保藏於ATCC，錄入號209276。載體pSUN27包括CMV啟動子、小鼠輕鏈前導序列、Kozak共有序列、小鼠Cκ基因內含子和外顯子序列。參見圖10，及Near等，文獻同上。
載體pSUN27經設計能使各種sc—TCR分子與小鼠Cκ融合。例如，為將所需sc—TCR分子插入pSUN27載體，載體的多接頭序列可用限制酶AgeⅠ和BstBⅠ消化並連接至已用AgeⅠ和BstBⅠ或ClaⅠ消化的sc—TCR分子上。此外，載體pSUN9能容納多種Ig—CL鏈或其它Ig—CL鏈片段。例如，為構建含有人類Cκ鏈的可溶性融合蛋白，可用BstBⅠ和XhoⅠ消化pSUN9。人類κ片段是將pDRHK載體用EcoNⅠ和XhoⅠ消化得到的，並克隆至pSUN9的BstBⅠ和XhoⅠ位點。
載體pDRHK已按布達佩斯條約存放於上述地址的ATCC。該DNA載體於1997年9月17日存放於ATCC，錄入號209274。載體pDRHK為哺乳動物表達載體，包括CMV啟動子、小鼠IgCκ前導肽、克隆區、小鼠κ內含子和人類κ恆定區外顯子序列。
圖12顯示了由CHO細胞產生的單鏈TCR(DO11．10)—κ融合體的蛋白印跡。上清取自親和純化之前(第2道)和層析收集部分(第3道)。將5μl樣品與2x SDS裂解緩衝液按1∶1的比例混合，在12％SDS—PAGE上按變性及非還原條件電泳。用兩步檢測系統檢測蛋白。首先，將膜用生物素標記的H57 mAb(1∶5000的稀釋度)進行探測，然後，使膜與鏈黴抗生物素蛋白辣根過氧化酶(1∶2500)一起溫育。數據表明CHO細胞表達了sc—TCR—κ融合體，提示與CNBr活化的sepahrose珠偶聯的H57mAb可用於從培養上清中有效取出sc—TCR—κ融合體。
圖13顯示了純化的sc—TCR(DO11．10)—κ融合體的蛋白印跡。對含有sc—TCR—κ融合體(參見圖12)的培養上清300ml進行H57 mAb親和柱層析。按標準的親和層析過程進行，用0．1M甘氨酸pH3．0從層析柱中洗脫sc—TCR—κ融合體。第1道代表大腸桿菌中產生的sc—TCR(DO11．10)(陽性對照)，遷移到大約50千道爾頓(kD)。第2—4道代表純化的sc—TCR(D011．10)—κ融合體從最高濃度(第2道)到最低濃度(第4道)的稀釋液。膜用與圖12所述基本相同的方法探測。
圖14顯示純化的sc—TCR—κ融合體的考馬斯亮蘭染色。純化經兩個抗體親和柱完成。第一步，使含有sc—TCR—κ融合體的培養上清通過KJ—1抗體柱。KJ—1是識別D011．10TCR中正確配對的Vα和Vβ鏈的抗克隆型mAb。第1(最強)—3(最弱)道代表純化的sc—TCR—κ融合體的各等份。從KJ—1層析柱收集含有純化sc—TCR—κ融合體的級分後，使樣品通過H57 mAb柱。第5和6道說明正確大小的蛋白分子的富集。將樣品在12％SDS—PAGE上按變性和非還原條件電泳，然後用考馬斯亮蘭染色。
另外還進行了三結構域sc—TCR—κ融合體和四結構域sc—TCR—κ融合體瞬時表達的研究。COS細胞分別用質粒pKC60—M(pSUN27)、三結構域sc—TCR或pKC75—M、四結構域sc—TCR進行瞬時轉染。48小時後，取1ml培養上清與0．5μgmAb F23．1(抗Vb8．2)一起溫育過夜。第二天用山羊抗小鼠抗體包被的磁珠(Dynal)使sc—TCR—κ融合體與F23．1mAb形成的免疫複合體沉澱。充分洗滌後，將磁珠懸浮於1x SDS裂解液10μl中並煮沸。在12％SDS—PAGE上按變性和非還原條件電泳並轉移蛋白後，用生物素標記的H57mAb和鏈黴抗生物素蛋白—HRP偶聯物探測尼龍膜上的sc—TCR—κ融合分子。結果如圖15所示。第1道為陰性對照F23．1，與模擬轉染的COS細胞的上清一起溫育；第2道為pSUN27(三結構域sc—TCR，由Vα—VβCβ—κ融合體組成)；第4和5道為pKC75—M的兩種不同分離物(四結構域sc—TCR，另包含Cα片段)。顯然，四結構域sc—TCR—κ融合體的表達即使不比三結構域sc—TCR的好，也是同水平的，而且不同於pSUN27 sc—TCR—κ融合體的表達，pKC75—M融合體的均二聚體和單體以大致相等比例存在。
圖16顯示瞬時表達的sc—TCR(DO11．10)—κ融合變體的ELISA。sc—TCR融合體的分析用夾心ELISA進行，其中利用KJ—1抗克隆型mAB進行捕獲，用生物素標記的H57mAB及鏈黴抗生物素蛋白HRP檢測結合的sc—TCR—κ融合體。
圖17顯示檢測哺乳動物細胞中sc—TCR(p—149)—κ融合蛋白表達的夾心ELISA。各孔用特異於Vα2．3的mAb包被，結合的sc—TCR融合體用抗Vβ11的mAb或mAb H57檢測。
圖18顯示sc—TCR p149和sc—TCR p149—κ融合蛋白在COS細胞中的瞬時表達。所設計的sc—TCR為含有或不含有κ恆定區的Vα—Cα8．2—Vβ／Cβ。表達的蛋白用夾心ELISA檢測，其中細胞用α—Vα2．1mAb包被，受體通過與α—Vβ11．0生物素標記的mAb和鏈黴抗生物素蛋白—HRP偶聯物結合而檢測。
實施例6—可溶性p—149 sc—TCR融合蛋白在大腸桿菌中的構建和表達T細胞克隆p149識別受HLA—A2．1限制化的Hu野生型p53的一段肽(STPPPGTRV)。參見Theobald，M．等(1995)PNAS(USA)92，11993—11997。T細胞受體基因已如上述克隆為三結構域單鏈形式，以產生可溶性TCR和功能性受體分子。
簡短說，自T細胞克隆分離mRNA，用Marathon cDNA擴增試劑盒(Clontech)製備cDNA。以此cDNA為模板用引物KC171(SEQ ID NO．134)和KC173(SEQ ID NO．136)進行聚合酶鏈式反應(PCR)，以產生5』SfiⅠ—3』SpeⅠ Vβ鏈片段，再用引物KC171(SEQ ID NO．134)和KC174(SEQ ID NO．137)進行PCR產生其中含有Cβ鏈的7個胺基酸的相似Vβ片段。相同的cDNA再作為PCR模板，以引物KC172(SEQ ID NO．135)和KC176(SEQ ID N0．138)產生5』XhoⅠ—3』XmaⅠ VβCβ鏈片段。Cβ鏈在緊鄰其全長鏈中第127位半胱氨酸殘基之前被截短。
將α和β鏈片段克隆至pGEM—T Easy載體系統進行DNA測序。將正確片段限制性消化，克隆至表達載體pKC60或pKC67，以產生Vα—(G4S)4—VβCβsc—TCR分子。
pKC60和pKC67載體用相應限制酶消化以切出上述編碼單鏈分子的基因片段，並連接p—149α和β鏈片段。新載體命名為pNAG1和pNAG2。pNAG1和pNAG2的DNA插入物如圖9B示。
含VβCβ基因的DNA區段用引物KC199(SEQ ID NO．139)和KC176(SEQ ID NO．138)PCR擴增為5』SfiⅠ—3』XmaⅠ片段。經測序並克隆至表達載體作為只含β鏈的陰性對照。
K91大腸桿菌細胞用sc—ICR構建體pNAG1轉化。轉化細胞在高磷酸鹽培養基上培養過夜以防止蛋白誘導，然後洗滌細胞，重新懸浮於缺乏磷酸鹽的培養基中以使sc—TCR蛋白表達。簡短說，在搖瓶中培養過夜後，細胞在缺乏磷酸鹽的培養基中多次洗滌。sc—TCR融合蛋白的表達通過將洗過的細胞重新懸浮於缺乏磷酸鹽的培養基中而啟動。誘導約4小時後，收穫細胞。通常4小時的誘導時間可得到合適水平的可溶性sc—TCR融合蛋白，蛋白印跡可檢測。受控於phoA啟動子對照的sc—TCR融合蛋白可通過將細胞培養在3和10升發酵罐或其它大批量製備容器如生物反應器中，而獲得較高產量(如約10—400mg之間)。
我們發現，sc—TCR融合蛋白在慢誘導條件下的表達促進了融合蛋白的可溶性表達。
實施例7—可溶性p—149 sc—TCR融合蛋白在哺乳動物細胞中的構建和表達用大腸桿菌DNA構建體pNAG1和pNAG2作模板，以引物KC203(SEQ IDNO．140)和KC204(SEQ ID NO．141)進行PCR產生5』AgeⅠ—3』ClaⅠ sc—TCR—κ鏈融合片段。可用引物KC203(SEQ ID NO．140)和KC205(SEQ IDNO．142)經PCR擴增相同的模板DNA而產生5』AgeⅠ—3』ClaⅠ sc—TCR，以表達不含κ鏈的蛋白。哺乳動物細胞用此DNA轉染，經ELISA方法篩選sc—TCR蛋白的表達。
實施例8—sc—TCR融合蛋白株的生產比較合乎需要的是選擇特定的大腸桿菌菌株以使sc—TCR融合蛋白的可溶性表達達到最高水平。例如，可分析好幾株已知的大腸桿菌菌株表達sc—TCR融合蛋白的能力(如XL1—B、MM294、TB1、UT5600和K91Kan)。簡短說，宿主細胞株可用如pKC60、pKC73、pKC74或pKC75轉化，在適於所編碼的sc—TCR融合蛋白表達的條件下培養。然後在磷酸鹽培養基中於30℃培養轉化株。sc—TCR融合蛋白的誘導通過在缺乏磷酸鹽的培養基中培養而進行。sc—TCR表達水平可經多種常規方法測定，包括用特異性識別sc—TCR融合蛋白的抗體進行探測的蛋白印跡。
簡短說，蛋白印跡操作如下在12％SDS—PAGE凝膠上加50D／ml轉化細胞懸浮液5μl，按標準的蛋白印跡技術轉移至印跡膜上。用如抗EE標記的抗體(得到加利福尼亞聖地牙哥的聖地牙哥大學Gernot Walter’s實驗室許可)探測印跡膜可檢測sc—TCR。或者，可用其它抗EE抗體和EE標記(如Pharmacia的類似產品)。抗體結合後，加入山羊抗小鼠HRP標記的偶聯物(Jackson實驗室)。
未決的美國專利申請第08／813，781號中發現，大腸桿菌K91KAN菌株十分適於表達含sc—TCR分子的融合蛋白，尤其是pKC60載體。K91KAN菌株可產生大量的本發明之sc—TCR融合蛋白。
實施例9—sc—TCR融合蛋白的純化在此公開的sc—TCR融合蛋白必要時可從轉化細胞中按常規方法經免疫層析純化。包含噬菌體衣殼蛋白的sc—TCR融合蛋白的純化方案已在未決的美國專利申請第09／813，781號中公開。
簡言之，其中一個適宜純化方案如下。層析柱可按每ml蛋白A包被的sepharose磁珠與約5mg倉鼠抗小鼠αβTCR抗體H57—597(ATCC錄入號HB—218)偶聯。將發酵罐中生產的細胞糊50g溶於100ml溶解液(O．05M Tris，pH8．0，150mM NaCl和5mM EDTA)得到大腸桿菌裂解物。重新懸浮的細胞兩次通過French Press進行裂解。不溶物經10，000g離心20分鐘除去。留下上清，以0．2ml／min的流速上樣於抗體柱。隨後用20倍柱體積的PBS洗層析柱，結合的sc—TCR融合蛋白用0．1M甘氨酸pH3．0洗脫，按1ml級分收集於含有0．05ml 2M Tris，pH8．0的管中。將含有sc—TCR的級分集中，對4升PBS透析過夜。第二天將純化的蛋白用centricon過濾器(分子量截留值100)濃縮5—10倍。
sc—TCR融合蛋白製備物可用好幾種方法評估其純度，如SDS—PAGE凝膠電泳再考馬斯亮蘭染色。蛋白完整性可用上述實施例5的方法測定，或用抗體H57—597測定。或者，對於可操作連接有EE標記的DNA載體，可用EE標記抗體作探針。EE抗體識別一個9胺基酸的線性表位。抗—Glu—Glu(EE)EEEEYMPME(SEQ ID NO 98)。
實施例10—sc—TCR融合蛋白的鑑定公開於未決的美國專利申請第08／813，781號的以下試驗可用於鑑定本發明的sc—TCR融合蛋白。
A．分子量如上述實施例5就D011．10 sc—TCR融合蛋白所指出，其它sc—TCR融合蛋白的分子量可經標準SDS—PAGE凝膠電泳再染色如銀染色或考馬斯亮蘭染色而測定。美國專利申請第08／813，781號提供了對sc—TCR分子用SDS—PAGE電泳測定分子量的實施例。預計大多數sc—TCR蛋白的分子量在40—60Kd之間，優選在約45—58Kd之間。
B．抗體競爭一套抗αβTCR mAb可用於鑑定本文公開的sc—TCR融合蛋白，尤其是含小鼠κ鏈的蛋白。例如，倉鼠mAb H57—597可識別C—β區的一個表位。通過競爭試驗分析結合單鏈可變區鏈上空間位置接近之表位的選定抗體之間的競爭效應是有可能的。例如，MR5—2和H57—597抗體可用於對包含合適Vα，Vβ區的sc—TCR融合蛋白上的表位作圖。如未決的美國專利申請第08／813，781號所公開，已發現MR5—2和H57—597抗體識別的表位在空間位置上十分接近。可用其它抗體進一步鑑定可溶性融合蛋白中的sc—TCR部分，包括那些特異性識別標記物如9胺基酸EE序列的抗體。
C．構象摺疊有多種抗獨特型mAb可用於檢驗本文之sc—TCR融合蛋白中Vα，β區是否正確摺疊。例如，如未決的美國專利申請第08／813，781號公開，pKC60 DNA載體編碼的融合蛋白確能正確摺疊，證據是它可結合抗Vβ8．2抗體(MR5—2和F23．1)以及抗獨特型mab KJ1(KapplerMarrack博士所贈)。簡言之，將sc—TCR融合蛋白與抗Vβ8．2抗體一起於4℃溫育過夜，第二天與山羊抗小鼠抗體包被的磁珠(Dynal)結合。室溫(RT)再溫育該材料1小時。按常規過程使免疫複合體沉澱。然後用0．5ml PBS+0．5M NaCl充分洗滌磁珠以除去非特異結合的蛋白。經4次洗滌後，將磁珠重新懸浮於含或不含β—巰基乙醇的SDS裂解液50μ1中，煮沸3分鐘。取出磁珠，將溶液上樣於12％SDS—PAGE凝膠上，在120伏電壓下電泳1小時。電泳樣品，用HRP標記的抗TCR抗體(得自Pharmingen的H57)或抗EE標記抗體探測印跡膜進行蛋白印跡。
上述實施例5公開了可用於檢驗DO11．10sc—TCR融合蛋白是否正確摺疊的特殊抗獨特型抗體。
D．表面等離子體激元共振(BioCore)表面等離子體激元共振可用於鑑定本發明之sc—TCR融合蛋白。例如，如未決的美國專利申請第08／813，781號所公開，pKC51編碼的sc—TCR融合蛋白可以用表面等離子體激元共振鑑定。融合蛋白用標準的夾心試驗檢測，首先將sc—TCR分子捕獲在包被有MR5—2或H57抗體的生物傳感器晶片上(按廠商Pharmacia建議)。通常，若用其中一種抗體捕獲sc—TCR融合蛋白，另一種抗體則用於形成三明治複合體。數據表明，這兩種抗體識別可變區鏈的不同區域並競爭結合sc—TCR。
超抗原(即SAg)無需MHC形式的呈遞便能結合某些V—β鏈。TCR和SAg之間的相互作用發生在V—β鏈的第4高變區(HV4)。由於SAg與HV4區的相互作用依賴於構象，故可應用表面等離子體激元共振測定sc—TCR融合蛋白是否能結合包被在晶片上的SAg。已知SAg能與TCR V—β8．2結合。已報導的用表面等離子體激元共振的最高親和力為5×10—5摩爾，由此使相互作用與TCR—MHC／肽的相互作用相當。
對包含可結合超抗原之單鏈可變區的sc—TCR融合蛋白的構建也包括在本發明的範圍內。其中，如未決的美國專利申請第08／813，781號所公開，被稱為SEC3的鏈球菌SAg(毒素技術，Tampa F1．)可結合包含V—β8．2區的sc—TCR分子。如已公開，超抗原經標準的胺偶聯化學法偶聯到晶片上。純化的融合蛋白以2μl／min的流速通過晶片，濃度範圍約2μM—16μM。作為對照，融合蛋白對空白晶片的非特異結合與對SEC3包被晶片的特異性結合的測定實驗平行進行。有關結合的數據通過比較sc—TCR與這兩種晶片結合的差別進行總結。數據表明，sc—TCR分子與晶片上的SEC3 SAg之間存在特異性相互作用。這些數據說明sc—TCR分子包含一個正確構象的V—β8．2區。
未決的美國專利申請第08／813，781號公布，pKC60載體產生的融合蛋白根據Biocore的測定可與SEC3超抗原結合。相關的Biocore實驗可對本發明之能結合超抗原的sc—TCR融合蛋白進行以測定是否正確摺疊。
實施例11—融合蛋白在OVA特異性T細胞雜交瘤結合試驗中的活性檢驗包含sc—MHCⅠ類或Ⅱ類分子的MHC複合體功能的試驗已由上述已公開的PCT申請PCT／US95／09816、PCT／US97／01617以及上述未決的美國專利申請流水號08／382，454公開。更具體地說，公開的PCT申請PCT／US97／01617公開了T細胞雜交瘤細胞試驗、用於這類試驗的細胞(如DO11．10)、帶有共價連接或非共價結合的呈遞肽(如OVA或HSV gD12肽)的sc—MHCⅠ類和Ⅱ類分子。
已公開的試驗均特別適於測定本文sc—TCR融合蛋白的功能。一般而言，這些試驗都是基於細胞的競爭抑制試驗，可用於測定sc—TCR融合蛋白的功能及生物活性。例如，上述實施例1和2中產生的可溶性融合蛋白可用於阻斷DO11．10細胞中超抗原或抗原參與MHC分子中。根據上述方法，相互作用通過測量IL—2的產量而檢測。
A)細胞雜交瘤細胞試驗已公開的PCT申請PCT／US95／09816、PCT／US97／01617以及未決的美國專利申請流水號08／382，454公開了一種T細胞雜交瘤試驗。這類試驗可方便用於檢驗本發明之sc—TCR融合蛋白的功能。
簡言之，DO11．10T細胞雜交瘤系可表達特異於小雞卵白蛋白之17胺基酸肽片段(第323—339位胺基酸)的細胞表面T細胞受體。OVA肽由表達小鼠Ⅱ類MHC分子I—Ad的APC呈遞給DO11．10細胞。當肽被適當APC呈遞時，DO11．10細胞通過產生IL—2進行應答，而IL—2的產生可用來衡量T細胞的活化。一項T細胞雜交瘤細胞試驗的實例如下述。
將sc—IAd／OVA複合體與sc—TCR融合蛋白一起稀釋在DPBS(無Mg2+和Ca2+離子)中，並用來包被96孔板。優選地，sc—IAd／OVA肽包括共價連接的呈遞肽。室溫溫育過夜後，各孔用無Mg2+和Ca2+離子的DPBS洗兩次。將約1×105DO11．10細胞在包被或未包被0．5μg MHC／肽分子的孔中37℃溫育4或7小時。在相關實驗中，sc—TCR融合蛋白可與DO11．10細胞一起加入。
為證實DO11．10細胞系衍生的sc—TCR融合蛋白(參見上述實施例1和2)的特異性，可應用第二種T細胞雜交瘤(gD)，該雜交瘤也是IAd限制性的，但能識別HSV肽。gD T細胞雜交瘤已公開於PCT申請PCT／US97／01617中。利用該試驗可證實sc—TCR融合蛋白能抑制DO11．10雜交瘤細胞產生IL—2，而對gD 12T細胞雜交瘤的IL—2生產抑制效應很小(如果有的話)。在含完全培養基(RPMI 1640，添加了10％FBS、青黴素／鏈黴素和L—穀氨醯胺)的96孔平底板上進行培養。溫育4或7小時後，用IL—2夾心ELISA法分析培養上清中是否有IL—2。
適於檢測IL—2的方案已公開在已公開的PCT申請PCT／US95／09816、PCT／US97／01617以及未決的美國專利申請流水號08／382，454和08／596，387中。適宜的IL—2夾心ELISA實驗程序基本如PharMingen所述進行。簡短說，用50μl的2μg／ml大鼠抗小鼠IL—2抗體包被各孔。4℃溫育過夜後抗體通過被動擴散而結合到塑料上。用PBS／0．5％吐溫20洗板兩次，然後每孔加入100μl細胞培養上清，室溫溫育4小時。再用PBS／吐溫洗板六次，然後加入第二抗體即生物素化的大鼠抗小鼠IL—2抗體。將該抗體室溫溫育1小時，然後用PBS／吐溫洗板六次。最後，每孔加入100μl的25μg／ml鏈黴抗生物素蛋白—過氧化物酶，室溫溫育30分鐘。用PBS／吐溫洗板8次後，加入100μl ABTS底物，在OD405nm讀取信號。通過對IL—2標準曲線繪圖而定量確定產生的IL—2的濃度。
用於活化DO11．10和gD12細胞的I—Ad／肽分子的最佳劑量為可提供略次於最強應答的劑量。因此，實驗可在包被了0．5μg I—Ad／肽的孔中溫育4或7小時而完成。
通常可檢驗本發明之可溶性sc—TCR融合蛋白阻止DO11．10細胞產生IL—2的量於10—9—10—4M濃度範圍的能力。可用約10∶1至1∶1摩爾比的可溶性sc—TCR和包被於板上的可溶性I—Ad／肽分子進行實驗。濃度可根據需要調節。最佳情況下，與可溶性sc—TCR融合蛋白預先溫育後DO11．10的IL—2產量比gD12的IL—2產量減少，說明可溶性sc—TCR融合蛋白能以TCR特異性方式抑制免疫應答。
由於TCR與MHC／肽的結合親和力較低，故在抑制試驗中用sc—TCR融合蛋白並非總能觀察到IL—2產生減少。但通過如下述產生多價sc—TCR融合蛋白可提高相互作用的親和力。通過提高sc—TCR融合蛋白的親和力(並阻止它們解離)，幾乎沒有TCR能有機會結合MHC／肽複合體。
實施例12—多價融合蛋白的製備有好幾種已知方法可用於製備多價分子。多價sc—TCR融合蛋白可通過將本發明之sc—TCR融合蛋白按標準方法生物素化，再在加入鏈黴抗生物素蛋白後交聯分子而製備。生物素—鏈黴抗生物素蛋白的偶聯可產生多價sc—TCR融合蛋白，通常為四聚體形式。
這樣的多價sc—TCR融合蛋白也可通過將融合蛋白根據已知方法(參見如Newman，S．L．等，免疫學雜誌(1995)154，753)共價連接於膠乳珠(Polysciences，Inc．Warrington，PA)上而製備。例如，sc—TCR融合蛋白可直接通過氨基或二硫基與膠乳珠偶聯。用鏈黴抗生物素蛋白或可特異性結合sc—TCR的抗體包被膠乳珠都可使sc—TCR的變性減至最小。例如，如果sc—TCR如上述包括EE標記，便可用EE標記抗體包被膠乳珠。
實施例13—sc—TCR融合蛋白體外對抗原刺激的T細胞增殖的影響可檢驗本發明之sc—TCR融合蛋白抑制抗原刺激的T細胞增殖的能力。
例如，在上述已公開的PCT申請PCT／US95／09816、PCT／US97／01617以及未決的美國專利申請流水號08／382，454的一個實施方法中，T細胞首先從哺乳動物如小鼠中分離。例如，用於完全弗氏佐劑中的50μg OVA323—339—KLH皮下接種於BALB／C小鼠(MHCⅡ類I—Ad)的尾根部可得到OVA致敏的T細胞(參見HarlowLane，文獻同上)。例如，可間隔7天進行兩次免疫接種，第二次注射的一周後，可處死小鼠，取出腹股溝淋巴結和體側淋巴結，製成單細胞懸液。然後將單細胞懸液在尼龍纖維和Sephadex G—10柱上溫育以耗盡抗原呈遞細胞。可將純化的T細胞群再單與Click’s培養基溫育，或與溶於Click’s培養基中的sc—TCR融合蛋白一起溫育。
BALB／c小鼠的活化B細胞可作為APC用於常規B細胞增殖試驗中。例如，B細胞可製備如下加50μg／ml LPS(即脂多糖)將脾細胞培養48—72小時，此時可通過在Ficoll／Hypaque(Pharmacia)上經密度梯度離心分離活化的細胞。用OVA 323—339肽對活化B細胞脈衝3小時，充分洗滌，用多聚甲醛固定以抑制B細胞增殖，再加入純化T細胞本身中或T細胞加上sc—TCR融合蛋白混合物中。參見細胞免疫學可選方法，(1980)B．B．MishellS．M．Hiigi W．H．Freeman and Co．San Francisco。
可加入上述實施例1—2所製備的sc—TCR融合蛋白以抑制T細胞對APC的結合。
可在96孔圓底微滴板上進行標準B細胞增殖試驗，試驗在37℃、5％CO2中進行3—5天。可用WST—1(Boehringer Manngeim)試劑對板上的孔脈衝4小時，然後終止培養。再記錄培養物的光密度。sc—TCR融合蛋白存在時肽反應性T細胞增殖的程度可指示小鼠經免疫接種後發生的TH細胞應答(即克隆擴充)。
實施例14—sc—TCR融合蛋白體內對抗原刺激的T細胞增殖的影響還可按上述已公開的PCT申請PCT／US95／09816以及未決的美國專利申請流水號08／382，454和08／596，387中公開的方法檢驗本發明之sc—TCR融合蛋白體內對T細胞克隆擴充的抑制。
例如，三個檢驗組可如下設置可對15隻BALB／c小鼠腹膜內(IP)注射完全弗氏佐劑中的約10—100μg OVA 323—339—KLH偶聯物，以誘導對OVA 323—339肽的免疫應答。免疫前1天以及OVA—KLH免疫的2天後，5隻小鼠IP注射由D011．10細胞產生的sc—TCR融合蛋白(實施例1和2)約10—100μg的PBS溶液。sc—TCR融合蛋白將與I—Ad／OVA MHCⅡ類分子結合，減少或消除TCR分子參與抗原特異性T細胞。剩下10隻小鼠可作為對照。例如其中5隻可接受PBS，另5隻接受sc—TCR融合蛋白。免疫的10天後處死小鼠。取出淋巴結，製成單細胞懸液。使該懸液在尼龍纖維和Sephdex G—10柱上溫育以耗盡抗原呈遞細胞。
所得純化T細胞群可與被OVA 323—339肽脈衝的APC一起溫育。可用BALB／c小鼠的活化B細胞作為增殖試驗中的APC。B細胞的製備如下將小鼠脾細胞與50μg／ml LPS混合培養48—72小時，此時可在Lymphoprep上經密度梯度離心分離活化的細胞。然後用OVA 323—339肽對活化B細胞進行脈衝3小時，充分洗滌，用多聚甲醛固定以抑制B細胞增殖，再加至純化的T細胞中。
可在96孔圓底微滴板上進行T細胞增殖試驗，試驗條件為37℃、5％CO2，3—5天。可用WST—1試劑對板上的孔脈衝4小時，然後終止培養並讀取不同吸光度。該試驗中肽反應性T細胞增殖的程度可指示小鼠免疫後發生的TH細胞應答(即克隆擴充)。預計sc—TCR融合蛋白與OVA—KLH或與HSV—KLH一起注射，將能限制克隆擴充量及後續OVA反應性T細胞系的體外增殖，而不影響HSV反應性T細胞系的擴充。
實施例15—小鼠自身免疫病的抑制試驗性過敏性腦脊髓炎(EAE)是一種自身免疫病，一般被認為是多發性硬化症的動物模型。兩種蛋白的致腦炎區髓鞘脂鹼性蛋白(MBP第91—103位胺基酸)和蛋白脂質蛋白(PLP第139—151位胺基酸)已得到鑑定。參見Martin，R．等(1992)免疫學年鑑10153。
在SJL小鼠中，經致腦炎肽免疫或MBP反應性T細胞過繼轉移後可誘發EAE。為測定可溶性抗MBP 91—103或抗PLP 139—151 T細胞受體的治療能否預防T細胞活化後的EAE進程，可對SJL小鼠體內注射MBP 91—103和PLP 139—151反應性T細胞母細胞。適於檢測這類小鼠中T細胞擴充的試驗已公開於上述已公開的PCT申請PCT／US95／09816、PCT／US97／01617以及未決的美國專利申請流水號08／382，454中。
正如上述已公開的PCT申請PCT／US95／09816、PCT／US97／01617以及未決的美國專利申請流水號08／382，454所述，在SJL小鼠背部免疫接種於完全弗氏佐劑中的約400μg MBP91—103可誘導EAE。10—14天後，如上述收穫定域引流(regional draining)淋巴結細胞，在24孔板上按每孔6×106細胞的量加入RPMI 1640培養基／10％胎牛血清／1％青黴素／鏈黴素／50μg／ml MBP 1．5 ml進行培養。經4天的體外刺激後，通過Ficoll／Hypaque密度梯度離心(Pharmacia)收穫MBP 91—103反應性T細胞母細胞，用PBS洗兩次，然後每隻小鼠注射1．3 ×1O7細胞。
接受了致腦炎性MBP 91—103反應性T細胞的小鼠可再在當天、第3和7天靜脈注射含有特異於MBP 91—103之Vαβ鏈的sc—TCR融合蛋白100μg、含有特異於PLP 139—151之Vαβ鏈的sc—TCR融合蛋白100μg(陰性對照)、或生理鹽水(空白對照)(總劑量為300μg)。可進行臨床和組織學評估以證實對MBP 91—103+IA有反應性的sc—TCR分子抑制小鼠EAE的進程。
如上述已公開的PCT申請PCT／US95／09816、PCT／US97／01617號以及未決的美國專利申請流水號08／382，454所述，為了用PLP肽139—151誘導SJL小鼠的EAE，可對小鼠免疫接種溶於PBS並按1∶1的比例與包含4mg／ml結核分枝桿菌H37Ra的完全弗氏佐劑混合的PLP肽139—151。小鼠可隨後接種152μg肽佐劑複合體。當天及48小時後，所有動物接受400ng百日咳毒素。然後如上述進行EAE的過繼轉移。
根據上述方法(參見實施例1)，可自正常及患有EAE病的SJC小鼠獲得TCR DNA。此TCR DNA可用於構建sc—TCR，用於與適當DNA載體連接形成本發明之包含小鼠κ鏈或其合適片段的sc—TCR融合蛋白。然後可根據上述實施例表達並在必要時純化PLP或MBP反應性sc—TCR融合蛋白。還可再檢驗sc—TCR融合蛋白預防EAE發展的能力。
本文就本發明的優選實施方案進行了描述。但本領域內技術人員清楚，理解了本文公開內容後，可在本發明精神和範圍內進行各種修改和改進。
序列表(1)一般資料(ⅰ)申請人Sunol Molecular Corporation(ⅱ)發明題目可溶性單鏈T細胞受體蛋白(ⅲ)序列數146(ⅳ)通訊地址(A)地址Dike，Bronstein，Roberts Cushman，LLp(B)街名130 Water Street(C)城市Boston(D)州名(E)國家美國(F)郵編02109(ⅴ)計算機可讀形式(A)介質類型軟盤(B)計算機IBM可兼容機(C)作業系統DOS(D)軟體FastSEQ的Windows 2．0版(ⅵ)當前申請信息(A)申請號(B)申請日(C)分類(ⅶ)在先申請資料(A)申請號08／943，086(B)申請日1997年10月2日(ⅷ)代理人／代理機構信息(A)姓名Corless, Peter F(B)登記號33，860(C)參考／文檔號47594—PCT(ⅸ)電信信息(A)電話617—523—3400(B)電傳617—523—6440(C)電報(2)SEQ ID NO1的資料(ⅰ)序列特徵(A)長度28個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO1CGGCCATGGC CCAGCTGCAG ACTAGTGC 28(2)SEQ ID NO2的資料(ⅰ)序列特徵(A)長度35個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO2GGCCGCACTA GTCTGCAGCT GGGCCATGGC CGGCT35(2)SEQ ID NO3的資料(ⅰ)序列特徵(A)長度45個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO3CTCGCGGCCC AGCCGGCCAT GGCCGAGGCT GCAGTCACCC AAAGC 45(2)SEQ ID NO4的資料(ⅰ)序列特徵(A)長度32個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO4CTTCCTCACT AGTACAGTCT GCTCGGCCCC AG32(2)SEQ ID NO5的資料(ⅰ)序列特徵(A)長度30個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO5GATGGCCTCG AGGAGCAGGT GGAGCAGCTT 30(2)SEQ ID NO6的資料(ⅰ)序列特徵(A)長度33個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO6GACTAGCCCG GGACAGGGAA CGTCTGAACT GGG 33(2)SEQ ID NO7的資料(ⅰ)序列特徵(A)長度45個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈
(D)拓撲構型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO7CTCGCGGCCC AGCCGGCCAT GGCCGAGCAG GTGGAGCAGC TTCCT 45(2)SEQ ID NO8的資料(ⅰ)序列特徵(A)長度33個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO8CTCGCGCTCG AGGAGGCTGC AGTCACCCAAAGC 33(2)SEQ ID NO9的資料(ⅰ)序列特徵(A)長度33個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO9CTCGCGCCCG GGACAGTCTG CTCGGCCCCA GGC 33(2)SEQ ID NO10的資料(ⅰ)序列特徵(A)長度33個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO10CTCGCGACTA GTACAGGGAA CGTCTGAACT GGG33(2)SEQ ID NO11的資料(ⅰ)序列特徵
(A)長度30個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO11CTCGCGCCCG GGGTCTGCTC GGCCCCAGGC30(2)SEQ ID NO12的資料(ⅰ)序列特徵(A)長度30個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO12CTCGCGACTA GTGGGAACGT CTGAACTGGG30(2)SEQ ID NO13的資料(ⅰ)序列特徵(A)長度30個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO13CTCGCGACTA GTGTCTGCTC GGCCCCAGGC 30(2)SEQ ID NO14的資料(ⅰ)序列特徵(A)長度30個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO14
CTCGCGCCCG GGGGGAACGT CTGAACTGGG 30(2)SEQ ID NO15的資料(ⅰ)序列特徵(A)長度34個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO15CTCGCGCTCG AGCGAGGCTG CAGTCACCCA AAGC 34(2)SEQ ID NO16的資料(ⅰ)序列特徵(A)長度37個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO16GGGGGGCCCG GGGCTGAGGG TGACGATCCC GCAAAAG 37(2)SEQ ID NO17的資料(ⅰ)序列特徵(A)長度67個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO17CTAGTCTGGT GGCGGTGGCA GCGGCGGTGG TGGTTCCGGT GGCGGCGGTT CTGGCGGTGG 60CGGTTCC 67(2)SEQ ID NO18的資料(ⅰ)序列特徵(A)長度67個鹼基對
(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO18TCGAGGAACC GCCACCGCCA GAACCGCCGC CACCGGAACC ACCACCGCCG CTGCCACCGC60CACCAGA 67(2)SEQ ID NO19的資料(ⅰ)序列特徵(A)長度37個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO19GTGCTCACTA GTGTTTGGCT CTACAGTGAG TTTGGTG 37(2)SEQ ID NO20的資料(ⅰ)序列特徵(A)長度33個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO20GATGGCTCGA GTGAGCAGGT GGAGCAGCTT CCT 33(2)SEQ ID NO21的資料(ⅰ)序列特徵(A)長度33個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO21
CTAGTCCCCG GGTACAACTG TGAGTCTGGT TCC 33(2)SEQ ID NO22的資料(ⅰ)序列特徵(A)長度33個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO22CTCGAGACTA GTTACAACTG TGAGTCTGGT TCC 33(2)SEQ ID NO23的資料(ⅰ)序列特徵(A)長度33個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO23CGGCCGAGGA AGAAGAGTAC ATCCCGATGG ATC 33(2)SEQ ID NO24的資料(ⅰ)序列特徵(A)長度40個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO24GGGCCATCCA TCGGGATGTA CTCTTCTTCC TCGGCCGGCT 40(2)SEQ ID NO25的資料(ⅰ)序列特徵(A)長度36個鹼基對(B)類型核酸
(C)鏈型單鏈(D)拓撲構型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO25CCGGGGAGGA AGAAGAGTAC ATCCCGATGG ATTGAG 36(2)SEQ ID NO26的資料(ⅰ)序列特徵(A)長度36個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO26AATTCTCAAT CCATCGGGAT GTACTCTTCT TCCTCC 36(2)SEQ ID NO27的資料(ⅰ)序列特徵(A)長度15個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO27GCCCGGGACT AGTGC 15(2)SEQ ID NO28的資料(ⅰ)序列特徵(A)長度23個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO28GGCCGCACTA GTCCCGGGCT GCA 23(2)SEQ ID NO29的資料(ⅰ)序列特徵(A)長度75個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO29CTAGTCCCCG GGTCATCAAG CGGCGCCTTC CATCGGCATG TACTCTTCTT CCTCTACAAC60TGTGAGTCTG GTTCC 75(2)SEQ ID NO30的資料(ⅰ)序列特徵(A)長度72個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO30CAGTCCCCG GGTCATCAAG CGGCGCCTTC CATCGGCATG TACTCTTCTT CCTCGTCTGC 60TCGGCCCCAG GC 72(2)SEQ ID NO31的資料(ⅰ)序列特徵(A)長度33個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO31CTAGTCCCCG GGTACAACTG TGAGTCTGGT TCC 33(2)SEQ ID NO32的資料(ⅰ)序列特徵(A)長度45個鹼基對(B)類型核酸
(C)鏈型單鏈(D)拓撲構型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO32CCGGGGAGGA AGAAGAGTAC ATGCCGATGG AAGGCGCCGC TTAGC 45(2)SEQ ID NO33的資料(ⅰ)序列特徵(A)長度45個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO33CCTCCTTCTT CTCATGTACG GCTACCTTCC GCGGCGAATC GGGCC 45(2)SEQ ID NO34的資料(ⅰ)序列特徵(A)長度33個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO34GATCAGCCCG GGGAGGCTGC AGTCACCCAA AGC 33(2)SEQ ID NO35的資料(ⅰ)序列特徵(A)長度33個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO35CTAGTCCCCG GGACAGTCTG CTCGGCCCCA CCG 33(2)SEQ ID NO36的資料(ⅰ)序列特徵(A)長度42個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO36CCGGGGAGGA AGAAGAGTAC ATGCCGATGG AAGGCGCCGC TC 42(2)SEQ ID NO37的資料(ⅰ)序列特徵(A)長度42個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO37CCTCCTTCTT CTCATGTACG GCTACCTTCC GCGGCGAGGG CC42(2)SEQ ID NO38的資料(ⅰ)序列特徵(A)長度32個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO38CGCCGCTCAC CATCACCATC ATCACTGATG AC 32(2)SEQ ID NO39的資料(ⅰ)序列特徵(A)長度34個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO39GGCGAGTGGT AGTGGTAGTA GTGACTACTG GGCC 34(2)SEQ ID NO40的資料(ⅰ)序列特徵(A)長度33個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO40GATCAGGGCG CCGCTACTGT TGAAAGTTGT TTA33(2)SEQ ID NO41的資料(ⅰ)序列特徵(A)長度33個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO41CTGATCGGAT CCTCATTAAA GCCAGAATGG AAA33(2)SEQ ID NO42的資料(ⅰ)序列特徵(A)長度45個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO42CCGGGCTAAG CGGCGCCTTC CATCGGCATG TACTCTTCTT CCTCC 45(2)SEQ ID NO43的資料(ⅹ)序列特徵(A)長度42個鹼基對
(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO43CCGGGAGCGG CGCCTTCCAT CGGCATGTAC TCTTCTTCCT CC 42(2)SEQ ID NO44的資料(ⅰ)序列特徵(A)長度35個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO44CCGGGTCATC AGTGATGATG GTGAGCG G35(2)SEQ ID NO45的資料(ⅰ)序列特徵(A)長度15個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO45GCTCGAGCTT ACTCC 15(2)SEQ ID NO46的資料(ⅰ)序列特徵(A)長度14個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO46CGCTCATTAG GCGG 14(2)SEQ ID NO47的資料(ⅰ)序列特徵(A)長度15個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO47GTGTACTTCT GTGCC 15(2)SEQ ID NO48的資料(ⅰ)序列特徵(A)長度15個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO48CTGTGAGTCT GGTTC 15(2)SEQ ID NO49的資料(ⅰ)序列特徵(A)長度15個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO49GCAGGTTCTG GGTTC 15(2)SEQ ID NO50的資料(ⅰ)序列特徵(A)長度17個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈
(D)拓撲構型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO50CATTTACTAA CGTCTGG17(2)SEQ ID NO51的資料(ⅰ)序列特徵(A)長度15個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO51CGCCTGGTAC TGAGC 15(2)SEQ ID NO52的資料(ⅰ)序列特徵(A)長度15個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO52CCTCAACCTC CTGTC 15(2)SEQ ID NO53的資料(ⅰ)序列特徵(A)長度16個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO53CTTATTCCGT GGTGTC 16(2)SEQ ID NO54的資料(ⅰ)序列特徵
(A)長度15個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO54CCACCCTCAG AACCG 15(2)SEQ ID NO55的資料(ⅰ)序列特徵(A)長度16個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO55GAATTTACCG TTCCAG 16(2)SEQ ID NO56的資料(ⅰ)序列特徵(A)長度16個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO56CTTTAGCGTC AGACTG 16(2)SEQ ID NO57的資料(ⅰ)序列特徵(A)長度16個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO57
GAAACGCAAA GACACC 16(2)SEQ ID NO58的資料(ⅹ)序列特徵(A)長度39個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO58GGGGGGCCCG GGCTGCTGAG GGTGACGATC CCGCAAAAG 39(2)SEQ ID NO59的資料(ⅰ)序列特徵(A)長度39個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO59GGGGGGGAAT TCTATTAGCT TGCTTTCGAG GTGAATTTC 39(2)SEQ ID NO60的資料(ⅰ)序列特徵(A)長度41個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO60GAGCACGGCC CAGCCGGCCA TGGCCGAGGC TGCAGTCACC C 41(2)SEQ ID NO61的資料(ⅰ)序列特徵(A)長度69個鹼基對(B)類型核酸
(C)鏈型單鏈(D)拓撲構型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO61GAGCACGAGA CTAGTAGCAC GAACAACACG GTCGTCGATC GGTTCCGGCG GGTTTGGCTC60TACAGTGAG69(2)SEQ ID NO62的資料(ⅰ)序列特徵(A)長度86個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構型線性(ⅹⅰⅰ)序列描述SEQ ID NO62GATCCCTCCT GGACACGCAG GATGGAAGGA AGCTGCTCCA CCTGCTCAGC ACGAACAACA60CGGTCGTCGA TCGGTTCCGG CGGGGC 86(2)SEQ ID NO63的資料(ⅰ)序列特徵(A)長度86個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO63CATGGCCCCG CCGGAACCGA TCGACGACCG TGTTGTTCGT GCTGAGCAGG TGGAGCAGCT60TCCTCCCATC CTGCGTGTCC AGGAGG 86(2)SEQ ID NO64的資料(ⅰ)序列特徵(A)長度39個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO64GAGGTGGAAT TCTATTAAGA CTCCTTATTA CGCAGTATG 39(2)SEQ ID NO65的資料(ⅰ)序列特徵(A)長度60個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO65GAGGAGGTGG TGACTAGTAG CAGGTTCTGG TGGGTTCTGG ATGTTTGGCT CTACAGTGAG 60(2)SEQ ID NO66的資料(ⅰ)序列特徵(A)長度57個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO66GAGGAGGTGG TGACTAGAAG CAGGTTCTGG GTTCTGGATG TTTGGCTCTA CAGTGAG 57(2)SEQ ID NO67的資料(ⅰ)序列特徵(A)長度51個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO67GAGGTGGAAT TCTATTAGTG ATGATGGTGA TGGTGAGACT CCTTATTACG C51(2)SEQ ID NO68的資料(ⅰ)序列特徵(A)長度32個鹼基對
(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO68GAGGTGCCCG GGACTGTTGA AAGTTGTTTA GC 32(2)SEQ ID NO69的資料(ⅰ)序列特徵(A)長度49個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO69GAGGTGGAAT TCTATTAGTG ATGATGGTGA TGGTGGCTTG CTTTCGAGG49(2)SEQ ID NO70的資料(ⅰ)序列特徵(A)長度31個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO70GAGGTGGAAT TCTATTAGCT TGCTTTCGAG G 31(2)SEQ ID NO71的資料(ⅰ)序列特徵(A)長度31個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO71GAGGTGCCCG GGGCTGAGGG TGACGATCCC G 31(2)SEQ ID NO72的資料(ⅰ)序列特徵(A)長度30個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO72AATTCTCATC AGTGATGATG GTGATGGTGC30(2)SEQ ID NO73的資料(ⅰ)序列特徵(A)長度30個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO73CCGGGCACCA TCACCATCAT CACTGATGAG30(2)SEQ ID NO74的資料(ⅰ)序列特徵(A)長度56個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO74GTGGAGCCCG GGTTCCATCG GCATGTACTC TTCTTCCTCT ACAACTGTGA GTCTGG 56(2)SEQ ID NO75的資料(ⅰ)序列特徵(A)長度64個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈
(D)拓撲構型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO75GAGGTGGAAT TCTCACCCGG GTTCCATCGG CATGTACTCT TCTTCCTCGT CTGCTCGGCC60CCAG 64(2)SEQ ID NO76的資料(ⅰ)序列特徵(A)長度61個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO76GAGGTGCTGC AGGTTCCATC GGCATGTACT CTTCTTCCTC GTCTAGACGG CCCCAGGCCT60C61(2)SEQ ID NO77的資料(ⅰ)序列特徵(A)長度34個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構型；線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO77GTGGAGCTGC AGGGTCTAGA CGGCCCCAGG CCTC34(2)SEQ ID NO78的資料(ⅰ)序列特徵(A)長度59個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO78GTGGAGCTGC AGGTGATCCA CCCCCTCCAG ATCCACCCCC TCCGTCTGCT CGGCCCCAG 59(2)SEQ ID NO79的資料(ⅰ)序列特徵(A)長度32個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO79GTGGAGAAGC TTTGCCGAGC AGGTGGAGCA GC 32(2)SEQ ID NO80的資料(ⅰ)序列特徵(A)長度34個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO80GGGGGGGAGG TGCTGGAGCG AGGCAGCAGT CACC34(2)SEQ ID NO81的資料(ⅰ)序列特徵(A)長度35個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO81GAGCCCACTA GTTTGGCTCT ACAGTGAGTT TGGTG 35(2)SEQ ID NO82的資料(ⅰ)序列特徵(A)長度65個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈
(D)拓撲構型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO82CTAGACCAGC AAATCTGCAC CCACAGAATC CCTAGGACAG CTCCCAGGTT CCTCTGCATG 60GTGGA 65(2)SEQ ID NO83的資料(ⅰ)序列特徵(A)長度65個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO83AGCTTCCACC ATGCAGAGGA ACCTGGGAGC TGTCCTAGGG ATTCTGTGGG TGCAGATTTG 60CTGGT 65(2)SEQ ID NO84的資料(ⅰ)序列特徵(A)長度35個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO84GATCGGTCTA GAGGTGAGCA GGTGGAGCAG CTTCC 35(2)SEQ ID NO85的資料(ⅰ)序列特徵(A)長度19個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO85GCCTGGAGAC TCAGCCATG 19(2)SEQ ID NO86的資料(ⅰ)序列特徵(A)長度21個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO86GAAGTACATG GCTGAGTCTC C21(2)SEQ ID NO87的資料(ⅰ)序列特徵(A)長度23個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO87GATGAACGTT CCAGATTCCA TGG 23(2)SEQ ID NO88的資料(ⅰ)序列特徵(A)長度22個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO88CCCAAATCAA TGTGCCGAAA AC 22(2)SEQ ID NO89的資料(ⅰ)序列特徵(A)長度53個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈
(D)拓撲構型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO89CTAGAACACA GGAGACTGGA GAGCACGAAG AAGAGCCTGG AGCCCATGGT GGA 53(2)SEQ ID NO90的資料(ⅰ)序列特徵(A)長度20個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO90GCTCTCCTTG TAGGCCTGAG20(2)SEQ ID NO91的資料(ⅰ)序列特徵(A)長度20個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO91GTACTTCTGT GCCAGCGGTG20(2)SEQ ID NO92的資料(ⅰ)序列特徵(A)長度22個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO92GAGCAATTAT AGCTACTGCC TG 22(2)SEQ ID NO93的資料(ⅰ)序列特徵
(A)長度20個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO93GGTCTGGAGG CCTTGTATCC 20(2)SEQ ID NO94的資料(ⅰ)序列特徵(A)長度53個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO94AGCTTCCACC ATGGGCTCCA GGCTCTTCTT CGTGCTCTCC AGTCTCCTGT GTT 53(2)SEQ ID NO95的資料(ⅰ)序列特徵(A)長度65個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO95TCGAGGAACC GCCACCGCCA GAACCGCCGC CACCGGAACC ACCACCGCCG CTGCCACCGC 60CACCA 65(2)SEQ ID NO96的資料(ⅰ)序列特徵(A)長度65個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO96CTAGTGGTGG CGGTGGCAGC GGCGGTGGTG GTTCCGGTGG CGGCGGTTCT GGCGGTGGCG 60GTTCC 65(2)SEQ ID NO97的資料(ⅰ)序列特徵(A)長度8個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO97(2)SEQ ID NO98的資料(ⅰ)序列特徵(A)長度9個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO98Glu Glu Glu Glu Tyr Met Pro Met Glu15(2)SEQ ID NO99的資料(ⅰ)序列特徵(A)長度63個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO99ATGAAATACC TGCTGCCGAC CGCAGCTGCT GGTCTGCTGC TGCTGGCGGC CCAGCCGATG 60GCC 63(2)SEQ ID NO100的資料(ⅰ)序列特徵(A)長度20個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO100Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Leu Leu Leu Leu Ala Ala1 5 10 15Gln Pro Ala Met20(2)SEQ ID NO101的資料(ⅰ)序列特徵(A)長度30個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO101GCCGGCCATG GCCRGTGCTG TCRTCTCTC 30(2)SEQ ID NO102的資料(ⅰ)序列特徵(A)長度29個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO102GCCGGCCATG GCCGAMRCCM ARGTSACCC 29(2)SEQ ID NO103的資料(ⅰ)序列特徵(A)長度29個鹼基對(B)類型核酸
(C)鏈型單鏈(D)拓撲構型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO103GCCGGCCATG GCCGATGTGA AAGTAACCC 29(2)SEQ ID NO104的資料(ⅰ)序列特徵(A)長度29個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO104GCCGGCCATG GCCGAMRCWG MCRTYTMCC 29(2)SEQ ID NO105的資料(ⅰ)序列特徵(A)長度29個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO105GCCGGCCATG GCCARKGCTG GDGTCACTC 29(2)SEQ ID NO106的資料(ⅰ)序列特徵(A)長度29個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO106GCCGGCCATG GCCAATGCCG GCGTCATGC 29(2)SEQ ID NO107的資料(ⅰ)序列特徵(A)長度29個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO107GCCGGCCATG GCCGRTRCTG GAGTCTCCC 29(2)SEQ ID NO108的資料(ⅰ)序列特徵(A)長度29個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO108GCCGGCCATG GCCGATGCTR GARTCACCC 29(2)SEQ ID NO109的資料(ⅰ)序列特徵(A)長度29個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO109GCCGGCCATG GCCGATTCTG GAGTCACAC 29(2)SEQ ID NO110的資料(ⅰ)序列特徵(A)長度29個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO110GCCGGCCATG GCCGAYGCTG GWGTTATCC 29(2)SEQ ID NO111的資料(ⅰ)序列特徵(A)長度29個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO111GCCGGCCATG GCCGATGCTG RYRTTAYCC 29(2)SEQ ID NO112的資料(ⅰ)序列特徵(A)長度31個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO112GCCGGCCATG GCCGAAGCTG GAGTTACTCA G 31(2)SEQ ID NO113的資料(ⅰ)序列特徵(A)長度36個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO113GCCGGCCATG GCCGATGCTA CTATTCATCA ATGGCC 36(2)SEQ ID NO114的資料(ⅰ)序列特徵(A)長度31個鹼基對
(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO114GCTGCCACCG CCACCCACCT TGTTCAGGTC C31(2)SEQ ID NO115的資料(ⅰ)序列特徵(A)長度30個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO115GCTGCCACCG CCACCCACGT TTTCAGGTCC 30(2)SEQ ID NO116的資料(ⅰ)序列特徵(A)長度34個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO116GGAGGCGGCG GTTCTGCTAA GGAGACCACMC AGCC34(2)SEQ ID NO117的資料(ⅰ)序列特徵(A)長度34個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO117GGAGGCGGCG GTTCTCAGAA GRTAACTCAA RCSC 34(2)SEQ ID NO118的資料(ⅰ)序列特徵(A)長度31個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO118GGAGGCGGCG GTTCTCAGTC KGTGASCCAG C 31(2)SEQ ID NO119的資料(ⅰ)序列特徵(A)長度33個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO119GGAGGCGGCG GTTCTCAGAG AGTGACTCA GCC 33(2)SEQ ID NO120的資料(ⅰ)序列特徵(A)長度35個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO120GGAGGCGGCG GTTCTCWGMA SGTGRAACAA RGTCC 35(2)SEQ ID NO121的資料(ⅰ)序列特徵(A)長度35個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈
(D)拓撲構型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO121GGAGGCGGCG GTTCTCAGCA AGTTAAGCAA AATTC35(2)SEQ ID NO122的資料(ⅰ)序列特徵(A)長度34個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO122GGAGGCGGCG GTTCTGAGAR TGTGGRGCWG CATC 34(2)SEQ ID NO123的資料(ⅰ)序列特徵(A)長度35個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO123GGAGGCGGCG GTTCTAAKGA RGTGGMGCAG RRTYC35(2)SEQ ID NO124的資料(ⅰ)序列特徵(A)長度32個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO124GGAGGCGGCG GTTCTCAGCT GCTGGAGCAG AG 32(2)SEQ ID NO125的資料(ⅰ)序列特徵
(A)長度35個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO125GGAGGCGGCG GTTCTCAAMA GRKAGAASAG RATYC35(2)SEQ ID NO126的資料(ⅰ)序列特徵(A)長度33個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO126GGAGGCGGCG GTTCTGGACA AARCMTTGAR CAG 33(2)SEQ ID NO127的資料(ⅰ)序列特徵(A)長度33個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO127GGAGGCGGCG GTTCTAAGGA CCAAGTGTTT CAG 33(2)SEQ ID NO128的資料(ⅰ)序列特徵(A)長度29個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO128
TTCATAGACT AGTAGGGTCA GGGTTCTGG 29(2)SEQ ID NO129的資料(ⅰ)序列特徵(A)長度45個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO129GGTGGCGGTG GCAGCGGCGG TGGTGGTTCC GGAGGCGGCG GTTCT45(2)SEQ ID NO130的資料(ⅰ)序列特徵(A)長度47個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO130CCACCGCCAC CGTCGCCCGC CACCACCAAG GCCATCCGCC GCCAAGA 47(2)SEQ ID NO131的資料(ⅰ)序列特徵(A)長度O個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO131gAggAggTggTgACTAgTgCTgAgggTgCTgTCCTgAg(2)SEQ ID NO132的資料(ⅰ)序列特徵(A)長度34個鹼基對(B)類型核酸
(C)鏈型單鏈(D)拓撲構型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO132GAGGAGGTGA CTAGTGCTGG TGAAGCTTGT CTGG 34(2)SEQ ID NO133的資料(ⅰ)序列特徵(A)長度39個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO133GAGGAGGTGG TGACTAGTAC TGGGAACGTC TGAACTGGG 39(2)SEQ ID NO134的資料(ⅰ)序列特徵(A)長度41個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO134GAGGTGGAGG CCCAGCCGGC CATGGCCCAG GTGAGACAAA G 41(2)SEQ ID NO135的資料(ⅰ)序列特徵(A)長度39個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO135GAGGTGGAGC TCGAGCAATG CTGCTGGTGT CATCCAAAC 39(2)SEQ ID NO136的資料(ⅰ)序列特徵(A)長度33個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO136GAGGTGGAGA CTAGTGTCAA GGTTGACCTG AAG 33(2)SEQ ID NO137的資料(ⅰ)序列特徵(A)長度33個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO137GAGGTGGAGA CTAGTAGCAG GTTCTGGGTT CTG 33(2)SEQ ID NO138的資料(ⅰ)序列特徵(A)長度33個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO138GAGGTGGAGC CCGGGGTCTG CTCGGCCCCA GGC 33(2)SEQ ID NO139的資料(ⅰ)序列特徵(A)長度32個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO139GGCCCAGCCG CCAATGCTGG TGTCATCCAAAC AC32(2)SEQ ID NO140的資料(ⅰ)序列特徵(A)長度32個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO140GAGGTGACCG GTCAGCAGGT GAGACAAAGT CC 32(2)SEQ ID NO141的資料(ⅰ)序列特徵(A)長度45個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO141GTGGAGATCG ATAAAGTGTA CTTACGTTTG TCTGCTCGGC CCCAG45(2)SEQ ID NO142的資料(ⅰ)序列特徵(A)長度53個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO142GTGGAGATCG ATAAGTGTAC TTACGTTTTC ATTAACAGTC TGCTCGGCCC CAG 53(2)SEQ ID NO143的資料(ⅰ)序列特徵(A)長度32個鹼基對
(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO143GAGGTGACCG GTGAGCAGGT GGAGCAGCTT CC 32(2)SEQ ID NO144的資料(ⅰ)序列特徵(A)長度43個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO144GTGGAGTTCG AAAAGTGTAC TTACGTTTGT CTGCTCGGCC CCA 43(2)SEQ ID NO145的資料(ⅰ)序列特徵(A)長度49個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO145GTGGAGTTCG AAAAGTGTAC TTACGTTTTC ATTAGTCTGC TCGGCCCCA 49(2)SEQ ID NO146的資料(ⅰ)序列特徵(A)長度9個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲構型線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO146Ser Thr Pro Pro Pro Gly Thr Arg Val1 權利要求
1．包含與單鏈T細胞受體共價連接的免疫球蛋白輕鏈恆定區或其片段的可溶性融合蛋白，其中單鏈T細胞受體包含通過肽連接序列共價連接的V—α鏈和V—β鏈。
2．權利要求1的可溶性融合蛋白，其中V—α鏈C端通過肽連接序列與V—β鏈N端共價連接。
3．權利要求1的可溶性融合蛋白，其中V—β鏈C端通過肽連接序列與V—α鏈N端共價連接。
4．權利要求2的可溶性融合蛋白，其中還包含共價連接於V—β鏈C端與免疫球蛋白輕鏈恆定區或片段的N端之間的C—β鏈或片段。
5．權利要求2的可溶性融合蛋白，其中還包含共價連接於V—α鏈C端與肽連接序列N端之間的C—α鏈或片段。
6．權利要求4的可溶性融合蛋白，其中還包含共價連接於V—α鏈C端與肽連接序列N端之間的C—α鏈或片段。
7．權利要求6的可溶性融合蛋白，其中C—α鏈片段長約5—90個胺基酸。
8．權利要求6的可溶性融合蛋白，其中C—β鏈片段長約50—126個胺基酸。
9．權利要求6的可溶性融合蛋白，其中肽連接序列長約2—25個胺基酸。
10．權利要求1的可溶性融合蛋白，其中免疫球蛋白輕鏈恆定區為Cκ鏈或Cκ鏈片段。
11．權利要求10的可溶性融合蛋白，其中Cκ鏈片段長約90—110個胺基酸。
12．含有依次共價連接的以下部分的可溶性融合蛋白1)V—α鏈，2)肽連接序列，3)V—β鏈，4)C—β鏈片段，以及5)Cκ鏈、Cλ鏈或它們的片段之一。
13．權利要求12的可溶性融合蛋白，其中還包含共價連接於V—α鏈和肽連接序列之間的C—α鏈或片段。
14．權利要求12的可溶性融合蛋白，其中還包含共價連接於該可溶性融合蛋白上的至少一個蛋白標記。
15．權利要求14的可溶性融合蛋白，其中還包含共價連接於C—β鏈片段和Cκ鏈、Cλ鏈或它們的片段之間的蛋白標記。
16．通過使權利要求15的可溶性融合蛋白與能切割該蛋白標記的試劑接觸而產生的單鏈T細胞受體。
17．權利要求1的可溶性融合蛋白，其中V—α鏈和V—β鏈與細胞毒性T細胞上的T細胞受體V鏈有至少90％相同。
18．權利要求16的單鏈T細胞受體，其中該單鏈T細胞受體的V區已人源化。
19．權利要求18的單鏈T細胞受體，其中該單鏈T細胞受體的C區已人源化。
20．含有依次共價連接的以下部分的單鏈T細胞受體1)V—α鏈，2)C—α鏈或其片段，3)肽連接序列，4)V—β鏈，和5)C—β鏈或其片段。
21．權利要求12的可溶性融合蛋白，其中還包括共價連接的效應物分子。
22．權利要求21的可溶性融合蛋白，其中該效應物分子為細胞毒素或適於診斷或成像研究的可檢測性標記的分子。
23．包含共價連接之兩序列的DNA區段，第一序列編碼單鏈T細胞受體，該單鏈T細胞受體包含由肽連接序列共價連接的V—α鏈和V—β鏈，第二序列編碼Cκ鏈、Cλ鏈或它們的片段，其中該DNA區段還包含啟動子、轉錄起始信號及與第一序列可操作連接的前導序列。
24．權利要求23的DNA區段，其中由第一序列編碼的單鏈T細胞受體包含V—α鏈C端由肽連接序列共價連接於V—β鏈N端。
25．權利要求23的DNA區段，其中由第一序列編碼的單鏈T細胞受體包含V—β鏈C端由肽連接序列共價連接於V—α鏈N端。
26．權利要求23的DNA區段，其中由第一序列編碼的單鏈T細胞受體還包含共價連接於V—β鏈C端和第二序列所編碼的Cκ鏈、Cλ鏈或其片段的N端之間的C—β鏈片段。
27．權利要求23的DNA區段，其中由第一序列編碼的單鏈T細胞受體還包含共價連接於V—α鏈C端和肽連接序列N端之間的C—α鏈片段。
28．包含可溶性融合蛋白編碼序列的DNA區段，該蛋白序列中包含依次共價連接的以下部分1)V—α鏈，2)肽連接序列，3)V—β鏈，4)C—β鏈片段，以及5)Cκ鏈、Cλ鏈或它們的片段之一。
29．權利要求28的DNA區段，其中還包含編碼位於V—α鏈和肽連接序列之間的C—α鏈片段的序列。
30．權利要求28的DNA區段，其中還包含編碼前導序列的序列、轉錄起始信號及啟動子。
31．權利要求30的DNA區段，其中還包含編碼一個或多個蛋白標記的序列。
32．權利要求30的DNA區段，其中啟動子為phoA，前導序列為大腸桿菌的pelB，其中該DNA區段還包含來自基因10序列的核糖體結合位點。
33．權利要求30的DNA區段，其中啟動子為與巨細胞病毒增強子元件可操作連接的巨細胞病毒啟動子，前導序列為小鼠κ鏈前導序列。
34．包含權利要求20或28的DNA區段的DNA載體。
35．對包含共價連接於單鏈T細胞受體上的免疫球蛋白輕鏈恆定區或其片段的可溶性融合蛋白進行分離的方法，該方法包括將包含該融合蛋白編碼序列的DNA載體導入宿主細胞，在可使該融合蛋白表達的條件下於培養基中培養該宿主細胞，及從宿主細胞或培養基中純化該融合蛋白以分離該可溶性融合蛋白。
36．權利要求35的方法，其中該方法還包括使宿主細胞或培養後基質的提取物與能特異性結合該融合蛋白的抗體接觸。
37．分離可溶性單鏈T細胞受體的方法，該方法包括將包含可溶性單鏈T細胞受體融合蛋白編碼序列的DNA載體導入宿主細胞，所述融合蛋白包含與免疫球蛋白輕鏈恆定區或片段共價連接的單鏈T細胞受體，在可使該可溶性單鏈T細胞受體融合蛋白表達的條件下於培養基中培養該宿主細胞，和從宿主細胞或培養基中純化該單鏈T細胞受體融合蛋白；及將融合的免疫球蛋白輕鏈恆定區或其片段與單鏈T細胞受體分開，以分離該可溶性單鏈T細胞受體。
38．分離可溶性單鏈T細胞受體的方法，該方法包括將包含單鏈T細胞受體編碼序列的DNA載體導入哺乳動物細胞，在可使該單鏈T細胞受體表達的條件下於培養基中培養該哺乳動物細胞，從哺乳動物細胞或培養基中純化該單鏈T細胞受體以分離單鏈T細胞受體。
39．誘導哺乳動物體內免疫應答的方法，包括將融合有免疫球蛋白輕鏈恆定區或其片段的單鏈T細胞受體以有效量施用於該哺乳動物，其中該免疫應答能使該哺乳動物對致病性T細胞表面上的T細胞受體表位產生免疫。
40．抑制哺乳動物內T—細胞活化的方法，包括將融合有免疫球蛋白輕鏈恆定區或其片段的單鏈T細胞受體以有效量施用於該哺乳動物。
41．可特異性結合T細胞受體之抗體的製備方法，該方法包括將融合有免疫球蛋白輕鏈恆定區或其片段的單鏈T細胞受體以有效量施用於哺乳動物。
42．由權利要求41的方法製備的抗體。
43．對包含能特異性結合單鏈T細胞受體之配體的細胞進行殺傷的方法，該方法包括提供包含有依次共價連接的以下部分的可溶性單鏈T細胞受體融合蛋白1)V—α鏈，2)肽連接序列，3)V—β鏈，4)Cκ鏈、Cλ鏈或其片段之一，和5)效應物分子，使該可溶性單鏈T細胞受體融合蛋白與具有能特異性結合該單鏈T細胞受體融合蛋白之配體的細胞進行接觸；及由該單鏈T細胞受體融合蛋白殺死該細胞。
44．權利要求43的方法，其中該細胞為腫瘤細胞或病毒感染的細胞。
全文摘要
本發明描述了完全可溶並有功能的單鏈T細胞受體蛋白。一方面,本發明涉及含有共價連接於單鏈T細胞受體上的免疫球蛋白輕鏈恆定區或其片段的可溶性融合蛋白,其中該單鏈T細胞受體包含由肽連接序列共價連接的V－α鏈和V－β鏈。該單鏈T細胞受體蛋白具有多種用途,包括可用於篩選能表達目的MHC－肽複合體的細胞。
文檔編號C07K14/435GK1279690SQ98811223
公開日2001年1月10日 申請日期1998年9月28日 優先權日1997年10月2日
發明者J·A·魏旦茨, K·F·卡德, H·C·王 申請人:蘇諾爾分子公司