梅毒螺旋體fla-A基因FQ-PCR檢測試劑盒的製作方法

2023-04-25 04:35:41 1

專利名稱：梅毒螺旋體fla-A基因FQ-PCR檢測試劑盒的製作方法
技術領域：
本實用新型涉及一種試劑盒，尤其是涉及一種梅毒螺旋體fla-A基因FQ-PCR檢測試劑盒。
背景技術：
梅毒(Syphilis)是一種由梅毒螺旋體(Treponema pallidum, TP)引起的性傳播疾病，其病原體是梅毒螺旋體，屬螺旋體科。梅 毒螺旋體主要通過性接觸、輸血、創口或者胎盤等途徑傳播。梅毒螺旋體從感染區附近的淋巴結進入血液播散全身，使機體幾乎所有的組織及器官受累，臨床表現為全身性的，可分為不同臨床階段，包括一期、二期、三期和潛伏期。世界衛生組織(WHO)曾樂觀地預言([I] WHO. Global prevalence and incidenceof selected curable sexually transmitted infections:Overview and estimates[J].Geneva:WHO, WHO/HIV/AIDS, 2001:1-30.)由於有高靈敏度檢測方法和高效的治療方案，梅毒是一種能夠通過公共衛生措施得到成功控制的性傳播性疾病」。遺憾的是，由於至今仍然缺乏高靈敏的檢測方法和高效的治療方案，梅毒依然是嚴重危害人類健康的全世界範圍的公共衛生問題。中國疾病控制中心的官方數據顯示2010年我國梅毒(Syphilis)的發病數為375309例，比2009年同期增長24. 50%。報告發病數僅次於病毒性肝炎和肺結核居第三位，居於性傳播疾病首位(中國疾控中心http://www. chinacdc. net. cn)。近年來，有關梅毒與愛滋病之間存在著互相促進的研究結果([2] Buchacz, K.，Klausner, J.D.,Kerndt, P. R. , et al. McElroy, P.D. and Schwendemann, J. HIV incidence among mendiagnosed with early syphilis in Atlanta, San Francisco, and Los Angeles, 2004to 2005 [J] · Jaids-J Acq Tmm Def,2008, 47 (2):234-240. [3]Ghanem, K. G. , Erbelding, E.J. , Wiener, Z. S. , et al. Serological response to syphilis treatment in HIV-positiveand HIV-negative patients attending sexually transmitted diseases clinics[J].Sex Transm Infect, 2007，83 (2) :97-101.)，使得梅毒的控制越發困難而且重要。無疑，人們對梅毒的防控過於樂觀，對梅毒的認識遠遠不夠。儘管青黴素成功應用於治療各期梅毒已經有50年歷史，但治療失敗可見於任何一種被推薦的治療方案。林麗蓉等([4]林麗蓉，楊波，潘錫濤，等.潛在的血源傳播患者梅毒血清學檢測方法的選擇[J].中華醫院感染學雜誌，2010，. 20(10) :1491-1494)在對健康體檢者、門診患者和潛在血源傳播患者梅毒血清學調查中均發現，這些人群存在一定比例的梅毒感染率，推測本地區人群梅毒的檢出率應該在2. 59%以上。顯然，梅毒感染者已經較廣泛地存在於普通人群中。梅毒正以過去500年任何國家和地區都未曾有過的速度在中國傳播，由於存在隱性感染以及無法統計的私人診所患者患病率，目前看到的梅毒發病率或許只是梅毒現狀的冰山一角([5]Lin, L. R. , Fu, Z. G. , Dan, B. , Jing, et al. Developmentof a colloidal gold-immunochromatography assay to detect immunoglobulin Gantibodies to Treponema pallidum with TPNl7 and TPN47[J]. Diagn Micr InfecDis, 2010，68(3) : 193-200. [6]Tucker JD, C. X. , Peeling RW. Syphilis and socialupheaval in china[J]. N Engl J Med, 2010, 362(18):1658-1661. [7]Chen, Z. Q. , Zhang, G.C. , Gong, X. D. , Lin, C. , Gao, X. , Liang, G. J. , Chen, X. S. , and Cohen, M. S. Syphilis inchina:Results of a national surveillance programme[J]. Lancet, 2007, 369:132-138.[8]Li-Rong Lin,Man-Li Tong,Zuo-Gen Fu,et al. Evaluation of a colloidalgoId-immunochromatography assay in the detection of Treponema Pallidm specificIgM antibody in syphilis serofast reaction patients:a serologic marker for therelapse and infection of syphilis[J]. Diagnostic Microbiology and InfectiousDisease. 2011, 70:10-16)。實驗室檢查是診斷梅毒必不可少的方法，也是判斷療效和復發的重要依據，包括暗視野顯微鏡檢查和血清學試驗。梅毒螺旋體感染早期，梅毒抗體還未產生或含量較低時，暗視野顯微鏡查找螺旋體成為最早的實驗室診 斷方法，但敏感度較低，且易受肛門周圍非致病螺旋體的影響而產生假陽性。梅毒螺旋體尚不能進行體外培養，梅毒診斷與流行病學調查主要依賴於血清學試驗，包括特異性抗體和反應素檢測兩大類型。反應素檢測對早期梅毒檢測靈敏度不高，而且生物假陽性率較高，是主要用於療效觀察的一項血清學指標([9]林麗蓉，但冰，付左根，等.潛在血源傳播患者梅毒血清學TRUST/TPPA與IgM抗體聯合檢測.中國皮膚性病學雜誌.2010，152(05):446-448)。梅毒特異性抗體檢測的敏感性和特異性均較反應素高。但是，梅毒特異性抗體檢測仍然存在著靈敏度不足的缺陷，尤其是早期梅毒患者抗體滴度較低。如果能建立一種方法能靈敏、特異和快速檢測到梅毒患者各類組織、體液中存在梅毒螺旋體，能證明梅毒螺旋體存在，那麼這些棘手問題將迎刃而解。兔睪丸是梅毒螺旋體易感器官，少量梅毒螺旋體即可導致兔睪丸炎，因此，兔感染試驗被視為梅毒螺旋體檢測的最靈敏的方法。然而，兔感染試驗操作繁瑣，觀察時間要求3個月，甚至更長時間才能得到結果，臨床可操作性差。PCR擴增技術以梅毒螺旋體特異性的基因片段做為擴增模板，通過指數擴增實現了病原體的快速檢測，具有高效、靈敏和特異等優勢。從理論上分析，通過優化、改良PCR擴增技術，其檢測的靈敏度和特異性可以媲美兔感染試驗，而檢測時間僅僅需要2個小時([10]HAY PE, CLARKE JR,TAYL0R-R0BINS0N D, et al. Detection of treponemal DNA in the csf of patientswith syphilis and hiv infection using the polymerase chain reaction [J].Genitourin Med, 1990，66 (6) : 428-32)，有望成為解決這些棘手問題的最佳方法。.儘管國內外有些企業研發出梅毒PCR檢測試劑，但尚未有進入臨床應用的有註冊文號PCR檢測試劑，而僅僅停留在科研應用。更嚴重的是，目前的PCR檢測試劑在研發過程中由於未經嚴格的比對試驗，無一例外的存在靈敏度和特異性嚴重不足，其準確性不高，是目前梅毒PCR技術在臨床中應用的瓶頸。flaA 鞭毛基因(flagellar filament outer layer protein gene)編碼鞭毛鞘蛋白，該基因擁有聞保守基因序列，僅在螺旋體中存在，有研究將此基因作為祀基因，檢測標本中梅毒螺旋體 DNA([11] Isaacs R D, Radolf J. Expression in escherichia coli ofthe 37_kilodalton endoflagellar sheath protein of treponema pallidum by useof the polymerase chain reaction and a t7 expression system[J]. Infection andimmunity, 1990, 58 (7) : 2025-2034.)。flaA鞭毛基因在梅毒早期快速診斷、療效判斷、療程選擇、神經梅毒確診、胎傳梅毒診斷，以及獻血員、孕產婦、婚前體檢、手術患者和輸血前篩查等領域發揮重大作用，有著目前常用的血清學檢測不可比擬的優勢，將逐漸替代這些方法或作為這些方法的驗證試驗，具有廣闊的應用前景和重要的社會、經濟價值。
發明內容本實用新型的目的是提供一種梅毒螺旋體fla-A基因FQ-PCR檢測試劑盒。本實用新型設有DNA提取試劑瓶、耐熱DNA聚合酶瓶、PCR反應液瓶、標準品瓶、質控品瓶和包裝盒；所述DNA提取試劑瓶、耐熱DNA聚合酶瓶、PCR反應液瓶、標準品瓶和質控品瓶設在包裝盒內；所述DNA提取試劑瓶設有蛋白酶K瓶、裂解液瓶、無水乙醇瓶、抑制物去除液瓶、第I清洗緩衝液瓶、洗脫液瓶、第2清洗緩衝液瓶和含收集管的離心柱；所述標準品瓶設有6個含fla-A基因的標準品質粒瓶；所述質控品瓶設有陰性質控品瓶和陽性質控品瓶。 所述耐熱DNA聚合酶瓶可採用Tag酶瓶。所述陰性質控品為不含梅毒螺旋體DNA的樣品，陽性質控品為含梅毒螺旋體DNA的樣品。所述6個含fla-A基因的標準品質粒的濃度可分別為I. O X 102copies/mL、I. OX IO3Cop ies/mL、I. OX 104copies/mL、I. 0X105copies/mL、l. 0 X 106copi es/mL 和1.0X 107copies/mL,共 6 個濃度。所述PCR反應液的成份含有PCR緩衝液、MgCl2、dNTPs和fla_A基因引物、探針組成的混合物。所述耐熱DNA聚合酶(Tag酶)具有V - DNA聚合酶活性、5 ^ — 3' DNA外切核酸酶活性和可耐受高溫的聚合酶；所述耐熱DNA聚合酶(Tag酶)最好是半衰期>45min的高溫聚合酶。以下給出本實用新型的製備方法I)靶基因篩選，具體方法如下從基因庫(GENBANK)中篩選梅毒螺旋體fla-A基因，fla_A基因探針和引物的設計米用 PCR 引物探針設計軟體 primer premier 5.0、Oligo 6· O、TM Utility vl. 3、ClustalX等設計軟體輔助完成，然後通過Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)進行同源性比對以保證其特異性，合成的引物和探針用TE(10mM Tri-HCl, pH5. 0,0. ImM TA)溶解，使用ND-1000UV-VIS波長紫外/可見光掃描分光光度計進行濃度測定後，保存；2) fla-A基因標準品質粒的構建，具體方法如下以矽膠膜-離心柱法提取梅毒螺旋體Nichols株DNA作為模板，採用步驟I)中的fla-A基因的引物，進行PCR擴增，具體過程如下將擴增產物經過回收及純化後，在微量離心管中配製DNA溶液，後加入5 μ L等量的Solution I，16°C反應30min，與pMD18_T載體連接將連接產物轉化至DH5a中，冰中放置30min，42°C加熱45s後，再在冰中放置lmin，力口入LB培養基，37°C震蕩培養60min後，在含有X_Gal、IPTG、Amp的LB瓊脂平板培養基上培養，形成單菌落，挑選白色菌落，進行增殖培養，提取質粒並對其進行PCR，Xab I和Sal I雙酶切及測序鑑定後，將構建好的質粒進行單酶切線性化處理，再用紫外分光光度計定量並_20°C保存作為FQ-PCR的標準品；3) fla-A基因檢測試劑標準曲線製作，其具體方法如下[0019]包含fla-A基因的陽性克隆大腸桿菌在含Amp LB肉湯增菌，提取質粒，取10 μ L質粒用雙蒸水稀釋100倍,260nm, 280nm比色，純度=A26(I/A28(I,濃度=A260X 50 X 2 X 100 X IO-6X 6. 02 X IO23/(2806 X 324. 5 X 2) copies/mL,根據質粒濃度，進行梯度稀釋，以每個濃度標準品作模板進行螢光定量反應，確定線性範圍；4)製備PCR反應液，其具體方法如下採用PCR緩衝液、MgCl2、dNTPs、fla-A基因引物、探針的混合物共同組成PCR反應液；5)製備耐熱DNA聚合酶，其具體方法如下大腸桿菌用異丙基硫代_β-D半乳糖苷(IPTG)進行 誘導表達，誘導後的菌懸液IOOml 經 5000r/min, 4°C離心 5min,以 IOml 緩衝液 I 重懸菌液，4°C，5000r/min,離心 5min,細菌沉澱再懸於5ml緩衝液I中，加入溶菌酶(Lys)使濃度達5mg/ml，37°C水浴20min ;力口入5ml緩衝液II，75°C水浴45min,4°C, 15000r/min離心IOmin ;上清加入硫酸銨使達30%,4°C,1500r/min離心lOmin，沉澱溶於Iml緩衝液III中，並對緩衝液III在4°C條件下透析，每6h換液I次共4次，離心除去不溶物後，-20°C凍存；6)建立樣品處理方法，其具體方法如下使用梅毒螺旋體fla-A基因FQ-PCR檢測試劑檢測梅毒螺旋體的樣本，採用矽膠膜-離心柱法提取模板DNA ；7)製備質控品，其具體方法如下製備陰性質控品選擇經過臨床確認為陰性的臨床標本；製備陽性質控品選擇經過臨床確認為陽性的臨床標本經稀釋獲得陽性質控品；8)製備梅毒螺旋體fla-A基因FQ-PCR檢測試劑盒，將DNA提取試劑、耐熱DNA聚合酶、PCR反應液、標準品和質控品共同組成梅毒螺旋體fla-A基因FQ-PCR檢測試劑盒。在步驟I)中，所述fla-A基因探針和引物的序列如表I所示；表I
靶基因序列名稱引物/探針序列_
I遊]I 物 IP 列 5'-CGTGG A AGGATTTCCGAAAGGAGCGTTTGA-3' fla-A 卜遊 1JI 物.)P列 5'-CCCTGCAGTACCCATCCGACCCTC-3'
_炎光探針印列 5'-FAM-AAGACAAAGGGTATGCCAC-BHQ 卜 3'所述ND-1000UV-VIS波長紫外/可見光掃描分光光度計可採用Nanedrop，美國產品，所述濃度測定的終濃度可為50μΜ。在步驟2)中，所述紫外分光光度計可採用752型紫外分光光度計。在步驟3)中，所述梯度稀釋可選 I. OX 102copies/mL、I. OX 103copies/mL、1.0X 104copies/mL> 1.0X 105copies/mL> 1.0X 106copies/mL> 1.0X 107copies/mL 6 個濃度作標準品。在步驟4)中，所述PCR緩衝液為pH=5. (TlO. O之間的穩定緩衝時，最適ρΗ=7· 0 9· O ;引物的濃度為25ρπι01/μ L，螢光探針的濃度為20pmol/yL, dNTPs的濃度為2mmol/L ;續離子的濃度為15 20mmol/L。[0037]在步驟5)中，所述緩衝液 I 可為 50mmol/L tris-HCl, 50mmoI /T, Glucose, lmmol/LEDTA, pH8. 0 ;所述緩衝液 II可為 5mmol/L Tris-HCl, 50mmol/L KCl, lmmol/L EDTA, ImmoI/LPMSF, 0. 5%Tween 20,0. 5%NP 40 ;所述緩衝液III可為 50ml mol/L Tris-HCl, lOmmol/LKCl,lmmol/LDTT,0. 5%PMSF，50%甘油。在步驟6)中，所述樣本可包括組織、全血、分泌物等臨床標本；所述分泌物可包括皮膚、生殖器潰瘍、糜爛部分等的分泌物。在步驟8)中，耐熱DNA聚合酶的用量可為8 10U/反應。flaA鞭毛基因(flagellar filament outer layer protein gene)編碼鞭毛鞘蛋白，該基因擁有聞保守基因序列，僅在螺旋體中存在，有研究將此基因作為祀基因，檢測標本中梅毒螺旋體DNA。flaA鞭毛基因在梅毒早期快速診斷、 療效判斷、療程選擇、神經梅毒確診、胎傳梅毒診斷，以及獻血員、孕產婦、婚前體檢、手術患者和輸血前篩查等領域發揮重大作用，有著目前常用的血清學檢測不可比擬的優勢，將逐漸替代這些方法或作為這些方法的驗證試驗，具有廣闊的應用前景和重要的社會、經濟價值。

圖I為本實用新型實施例的組裝示意圖。在圖I中，I 6分別為6個含fla-A基因的標準品質粒瓶(標準品的6個濃度分別為I. OX 102copies/mL、l. OX 103copies/mL、1.0X 104copies/mL、1.0X 105copies/mL、1.0X 106copies/mL 和 1.0X 107copies/mL) ；7 為PCR反應液瓶；8為含收集管的離心柱；9為陰性質控品瓶；10為陽性質控品瓶；11為Tag酶瓶；12為蛋白酶K瓶；13為裂解液瓶；14為無水乙醇瓶；15為抑制物去除液瓶；16為第I清洗緩衝液瓶；17為洗脫液瓶；18為第2清洗緩衝液；19為外包裝盒。圖2為標準品檢測結果。在圖2中。橫坐標代表標準品濃度copies/mL，縱坐標代表閾值循環數;標記·:標準品 Slope -3. 533205，intercept :45. 18945，R2 :0. 999687。圖3為採用本實用新型建立的梅毒螺旋體fla-A基因FQ-PCR檢測方法進行標本檢測的擴增曲線。在圖3中，橫坐標為循環數，縱坐標為較正後的螢光強度；其中I 3為梅毒螺旋體陽性擴增曲線，4 5為梅毒螺旋體陰性擴增曲線，6為閾值線。
具體實施方式
以下實施例將結合附圖對本實用新型作進一步的說明。參見圖I，本實用新型實施例設有6個含fla-A基因的標準品質粒瓶(標準品的 6 個濃度分別為 I. O X 102copies/mL、I. O X 103copies/mL、I. O X 104copies/mL、1.0X 105copies/mL、1.0X 106copies/mL 和 1.0X 107copies/mL) I 6、PCR 反應液瓶 7、含收集管的離心柱8、陰性質控品瓶9、陽性質控品瓶10、Tag酶瓶11、蛋白酶K瓶12、裂解液瓶13、無水乙醇瓶14、抑制物去除液瓶15、第I清洗緩衝液瓶16、洗脫液瓶17、第2清洗緩衝液18和外包裝盒19。所述6個含fla-A基因的標準品質粒瓶I 6、PCR反應液瓶7、含收集管的離心柱8、陰性質控品瓶9、陽性質控品瓶10、Tag酶瓶11、蛋白酶K瓶12、裂解液瓶13、無水乙醇瓶14、抑制物去除液瓶15、第I清洗緩衝液瓶16、洗脫液瓶17和第2清洗緩衝液18均布在外包裝盒19內。其中PCR反應液的成份含有PCR緩衝液、MgCl2, dNTPs、fla-A基因的引物探針混合物。其中所述耐熱DNA聚合酶(Tag酶)具有:V - DNA聚合酶活性，5' - DNA外切核酸酶活性和可耐受高溫度的聚合酶。所述的耐熱聚合酶最好是95半衰期>45min的
高溫聚合酶。質控品包含陰性質控品和陽性質控品，陰性質控品為不含梅毒螺旋體DNA的樣品，陽性質控品為含梅毒螺旋體DNA的樣品。以下給出本實用新型的製備方法I)靶基因篩選從GENBANK中篩選梅毒螺旋體高特異性、高靈敏度的fla-A基因。fla_A基因的引物、突光探針的設計米用 primer premier 5. 0、01igo 6. 0 、TM Utility vl. 3、Clustal X等設計軟體輔助完成，然後通過BLAST進行同源性比對以保證其特異性。合成的引物和探針用TE (IOmMTri-HCl，pH5. 0,0. ImM TA)溶解，使用ND-1000UV-VIS波長紫外/可見光掃描分光光度計(Nanedrop，美國)進行濃度測定，並將終濃度調成50 μ M，_20°C保存。2) fla-A基因標準品質粒的構建以矽膠膜-離心柱法提取梅毒螺旋體Nichols株DNA作為模板，採用步驟I)中的fla-A基因的引物，進行PCR擴增。過程如下將擴增產物經過回收及純化後，在微量離心管中配製DNA溶液，後加入5 μ L等量的Solution I，16°C反應30min，與pMD18_T載體連接將連接產物轉化至DH5 α中，冰中放置30min，42°C加熱45s後，再在冰中放置Imin，加入LB培養基，37°C震蕩培養60min後，在含有X_Gal、IPTG、Amp的LB瓊脂平板培養基上培養，形成單菌落，挑選白色菌落，進行增殖培養，提取質粒並對其進行PCR擴增，XabI和Sal I雙酶切及測序鑑定後，將構建好的質粒進行單酶切線性化處理，再用752型紫外分光光度計定量並_20°C保存作為FQ-PCR的標準品。3) fla-A基因檢測試劑標準曲線製作包含fla-A基因的陽性克隆大腸桿菌在含Amp LB肉湯增菌，提取質粒，取10 μ L質粒用雙蒸水稀釋100倍,260nm, 280nm比色，純度=A26(I/A28(I,濃度=A260 X 50 X 2 X 100 X IO-6 X 6. 02 X IO23/(2806 X 324. 5 X 2) copies/mL,根據質粒濃度，進行一定比例梯度稀釋，選 I. O X 102copies/mL、1.0X 103copies/mL、1.0X 104copies/mL、1.0X 105copies/mL、1.0X 106copies/mL、1.0X 107copies/mL 6 個濃度作標準品，分別以每個濃度標準品作模板進行螢光定量反應，確定線性範圍。4) PCR反應液製備PCR緩衝液、MgCl2, dNTPs、fla-A基因引物探針混合物共同組成PCR反應液。5)耐熱DNA聚合酶的製備大腸桿菌用異丙基硫代_β-D半乳糖苷(IPTG)進行誘導表達，誘導後的菌懸液菌懸液 IOOml 經 5000r/min, 4°C 離心 5min,以 IOml 緩衝液 I (50mmol/Ltris-HCl, SOmmoI /LGlucose, lmmol/L EDTA, ρΗ8· 0)重懸菌液，4°C，5000r/min,離心 5min,細菌沉澱再懸於5ml緩衝液I中，加入溶菌酶(Lys)使濃度達5mg/ml，37°C水浴20min ;加入5ml緩衝液II (5mmol/L Tris2HCl,50mmol/L KCl,lmmol/L EDTA,lmmol/L PMSF,0. 5%Tween20,0. 5%NP40)，75°C水浴 45min,4°C,15000r/min 離心 IOmin ;上清加入硫酸銨使達 30%,4°C, 1500r/min 離心 lOmin。沉澱溶於 Iml 緩衝液III (50ml mol/L Tris-HCl, lOmmol/L KCl, lmmol/LDTT, O. 5%PMSF，50%甘油)中，並對緩衝液III在4°C條件下透析，每6h換液I次共4次，離心除去不溶物後，-20°C凍存。6)樣品處理方法的建立使用梅毒螺旋體fla-A基因FQ-PCR檢測試劑檢測梅毒螺旋體的樣本主要包括組織、全血、分泌物(皮膚、生殖器潰瘍、糜爛部分的分泌物)等臨床標本。採用矽膠膜-離心柱法提取模板DNA。7)質控品製備陰性質控品製備選擇經過臨床確認為陰性的臨床標本。陽性質控品製備選擇經過臨床確認為陽性的臨床標本經稀釋獲得陽性質控品8)製備梅毒螺旋體fla-A基因FQ-PCR檢測試劑盒 DNA提取試劑、耐熱DNA聚合酶(Tag酶)、PCR反應液、標準品和質控品共同組成梅毒螺旋體fla-A基因FQ-PCR檢測試劑盒。以下給出採用梅毒螺旋體fla-A基因FQ-PCR檢測試劑盒檢測患者的臨床標本I.標本處理I. I分泌物(皮膚、生殖器潰瘍、糜爛部分的分泌物)加入ImL滅菌生理鹽水，充分震蕩搖勻，擠幹棉拭子；吸取全部液體轉至I. 5mL離心管中，12，OOOrpm離心5min ;去上清，沉澱加滅菌生理鹽水ImL混勻，12，OOOrpm離心5min ;去上清,沉澱備用。I. 2硬下疳及皮損部位組織標本用適量滅菌生理鹽水清洗送檢組織沾帶的血液；取約50mg組織，加ImL滅菌生理鹽水用勻漿器研磨成組織勻漿，轉移至I. 5mL離心管中，12, OOOrpm離心5min ;去上清,沉澱加滅菌生理鹽水ImL混勻，12, OOOrpm離心5min ;去上清，沉澱備用。I. 3全血肝素抗凝靜脈血5mL，加等量的生理鹽水懸浮細胞。將細胞懸液小心加在與血液等量的淋巴細胞分離液上，室溫中，水平離心500g 20min。吸去最上層的血漿，收集血漿層和淋巴細胞分離液交界面的單個核細胞，儘量全部吸出PBMC。加I 2倍量Hanks液(洗滌液)，混勻後離心200 Xg lOmin，低速離心有利於去除細胞懸液中留存的血小板，去上清液。用同樣洗滌液洗滌細胞2次，每次離心500Xg lOmin，洗去殘留的淋巴細胞分離液，沉澱備用。2.質控品處理取出陰性質控品，8，OOOrpm離心數秒，100 μ L質控品加入等量DNA濃縮液充分混勻；去上清，沉澱加滅菌生理鹽水ImL混勻，12，OOOrpm離心5min ;去上清,沉
澱備用。3. DNA提取(娃膠膜_離心柱法)用200 μ L的生理鹽水懸浮沉澱，加入50 μ L的蛋白酶K，再加入200 μ L的裂解液，蓋緊管蓋，漩渦振蕩15s以充分混勻，37°C溫育20min ；加入200 μ L無水乙醇，漩渦振蕩15s以充分混勻；將混合液全部吸至離心柱，室溫下12，OOOrpm離心lmin，將離心柱裝至新的收集管；將500 μ L的清洗緩衝液I加入離心柱，室溫下12，OOOrpm離心lmin，將離心柱裝至新的收集管；將500 μ L的清洗緩衝液II加入離心柱，室溫下12，OOOrpm離心lmin，將離心柱裝至新的收集管；將離心柱_收集管於室溫下最大轉速離心3min ;將離心柱取出，放置於新的I. 5mL離心管。打開離心柱蓋子,60°C放置2min (使用乾式恆溫器，不能使用水浴鍋)；在離心柱的膜的正上方小心加入60°C預熱的洗脫液50 μ L,蓋緊管蓋,室溫靜置Imin後，12，OOOrpm離心lmin。離心管內即為核酸溶液,建議立即使用，如需保存，置於_20°C。4.標準品處理8，OOOrpm離心數秒，備用。5. PCR擴增在PCR反應管中加入2μ L處理後的樣品(包括樣本、質控品、標準品)40μ L的PCR反應液和3μ L的Taq酶，8，OOOrpm離心數秒，放入PCR儀器樣品槽進行擴增；95°C IOmin; 95 °C 15s, 55 °C 2min，72°C 30s (共 10 個循環)；95°C 15s, 50 °C 20s,72°C 20s (共40個循環)。6.根據標準品檢測的標準曲線(見圖2)，計算得到各待測標本中的梅毒DNA的量(copies/mL)。所述的螢光定量PCR反應可使用的儀器包括ABI實對PCR系統(例如7000,7300，7500，7900 等)；BioRad 實時 PCR 檢測系統、Roche 的 iCycler 等。以下給出梅毒螺旋體fla-A基因FQ-PCR檢測試劑盒的性能檢定I)精密度試驗對同一樣本每天進行I批次檢測，每批重複檢測2次，共進行20天。收集20天的有效數據，進行重複性評價。2)分析靈敏度以 2000 copies/mL、1000 copies/mL、500 copies/mL、250copies/mL 4個濃度樣品每天重複8次檢測，連續做3次，95%檢出陽性的最低濃度值為分析靈敏度。3)特異性臨床常見泌尿生殖道感染患者分泌物標本150例，其中淋病50例、支原體感染50例、尖銳溼疣50例，分別進行DNA提取，螢光定量PCR檢測，同時做梅毒患者和正常人生殖道拭子為陽性和陰性對照，評價方法的特異性。4)線性範圍根據標準曲線的線性，維持相關係數在O. 97以上，判斷方法的線性範圍。5)試劑穩定性用兩個濃度水平臨床樣本，每個濃度水平樣本重複測定至少6次，計算平均值。新配製及穩定期末工作液應在同次運行中測定，將儀器帶來的不精密度減到最小。測定新配製的試劑工作液和穩定期末試劑工作液兩組平均值之間的一致性。以下給出具體實施例。實施例II)靶基因篩選參考文獻，從GENBANK中篩選梅毒螺旋體高特異性、高靈敏度的f I a_A基因。fla-A基因引物、突光探針的設計採用primer premier 5. 0、01igo 6. 0、TM Utility vl. 3、Clustal X等設計軟體輔助完成，然後通過BLAST進行同源性比對以保證其特異性。合成的引物和探針用 TEdOmM Tri-HCl, pH5. 0,0. ImM TA)溶解，使用 ND-1000UV-VIS 波長紫外 /可見光掃描分光光度計(Nanedrop，美國)進行濃度測定，並將終濃度調成50 μ M，-20°C保存。2) fla-A基因標準品質粒的構建以矽膠膜-離心柱法提取梅毒螺旋體Nichols株DNA作為模板，採用步驟I)中的fla-A基因的引物，進行PCR擴增。過程如下將擴增產物經過回收及純化後，在微量離心管中配製DNA溶液，後加入5 μ L等量的Solution I，16°C反應30min，與pMD18_T載體連接將連接產物轉化至DH5 α中，冰中放置30min，42°C加熱45s後，再在冰中放置Imin，加入LB培養基，37°C震蕩培養60min後，在含有X_Gal、IPTG、Amp的LB瓊脂平板培養基上培養，形成單菌落，挑選白色菌落，進行增殖培養，提取質粒並對其進行PCR、Xab I和SalI雙酶切及測序鑑定後，將構建好的質粒進行單酶切線性化處理，再用752型紫外分光光度計定量並_20°C保存作為FQ-PCR的標準品。3) fla-A基因檢測試劑標準曲線製作包含fla-A基因的陽性克隆大腸桿菌在含Amp LB肉湯增菌，提取質粒，取10 μ L質粒用雙蒸水稀釋100倍,260nm, 280nm比色，純度=A26(I/A28(I,濃度=A260 X 50 X 2 X 100 X IO-6 X 6. 02 X IO23/(2806 X 324. 5 X 2) copies/mL,根據質粒濃度，進行一定比例梯度稀釋，選 I. O X 102copies/mL、1.0X 103copies/mL、1.0X 104copies/mL、1.0X 105copies/mL、1.0X 106copies/mL、1.0X 107copies/mL 6 個濃度作標準品，分別以每個濃度標準品作模板進行螢光定量反應，確定線性範圍。4) PCR反應液製備 PCR緩衝液、MgCl2, dNTPs、fla-A基因引物探針混合物共同組成PCR反應液。5)耐熱DNA聚合酶的製備大腸桿菌用異丙基硫代_β-D半乳糖苷(IPTG)進行誘導表達，誘導後的菌懸液菌懸液 IOOml 經 5000r/min, 4°C 離心 5min,以 IOml 緩衝液 I (50mmol/Ltris-HCl, SOmmoI /LGlucose, lmmol/L EDTA, ρΗ8· O)重懸菌液，4°C，5000r/min,離心 5min,細菌沉澱再懸於5ml緩衝液I中，加入溶菌酶(Lys)使濃度達5mg/ml，37°C水浴20min ;加入5ml緩衝液
II(5mmol/L Tris-HCl,50mmol/L KCl,lmmol/L EDTA,lmmol/L PMSF,0. 5%Tween20,0. 5%NP40)，75°C水浴 45min,4°C,15000r/min 離心 IOmin ;上清加入硫酸銨使達 30%,4°C, 1500r/min 離心 IOrnin0 沉澱溶於 Iml 緩衝液III (50ml mol/LTris-HCl, 10mmol/L KCl, lmmol/LDTT, 0. 5%PMSF，50%甘油)中，並對緩衝液III在4°C條件下透析，每6h換液I次共4次，離心除去不溶物後，_20°C凍存。6)樣品處理方法的建立使用梅毒螺旋體fla-A基因FQ-PCR檢測試劑檢測梅毒螺旋體的樣本主要包括組織、全血、分泌物(皮膚、生殖器潰瘍、糜爛部分的分泌物)等臨床標本。採用矽膠膜-離心柱法提取模板DNA。7)質控品製備陰性質控品製備選擇經過臨床確認為陰性的臨床標本。陽性質控品製備選擇經過臨床確認為陽性的臨床標本經稀釋獲得陽性質控品8)製備梅毒螺旋體fla-A基因FQ-PCR檢測試劑盒DNA提取試劑、耐熱DNA聚合酶(Tag酶)、PCR反應液、標準品和質控品共同組成梅毒螺旋體fla-A基因FQ-PCR檢測試劑盒。9)標本處理生殖泌尿道分泌物棉拭子加入ImL滅菌生理鹽水，充分震蕩搖勻，擠幹棉拭子；吸取全部液體轉至1.5mL離心管中，12，000印111離心51^11 ;去上清，沉澱加滅菌生理鹽水ImL混勻，12, OOOrpm離心5min ;去上清,沉澱備用。10)質控品處理取出陰性質控品，8，OOOrpm離心數秒，100 μ L質控品加入等量DNA濃縮液充分混勻；去上清，沉澱加滅菌生理鹽水ImL混勻，12，OOOrpm離心5min ;去上
清，沉澱備用。[0108]11) DNA提取(矽膠膜-離心柱法):用200 μ L的生理鹽水懸浮沉澱，加入50 μ L的蛋白酶K，再加入200 μ L的裂解液，蓋緊管蓋，漩渦振蕩15s以充分混勻，37°C溫育20min ；加入200 μ L無水乙醇，漩渦振蕩15s以充分混勻；將混合液全部吸至離心柱，室溫下12，OOOrpm離心lmin，將離心柱裝至新的收集管；將500 μ L的清洗緩衝液I加入離心柱，室溫下12，OOOrpm離心lmin，將離心柱裝至新的收集管；將500 μ L的清洗緩衝液II加入離心柱，室溫下12，OOOrpm離心lmin，將離心柱裝至新的收集管；將離心柱_收集管於室溫下最大轉速離心3min ;將離心柱取出，放置於新的I. 5mL離心管。打開離心柱蓋子,60°C放置2min (使用乾式恆溫器，不能使用水浴鍋)；在離心柱的膜的正上方小心加入60°C預熱的洗脫液50 μ L,蓋緊管蓋,室溫靜置Imin後，12，OOOrpm離心lmin。離心管內即為核酸溶液,建議立即使用，如需保存，置於_20°C。12)標準品處理8，OOOrpm離心數秒，備用。13) PCR擴增在PCR反應管中加入2 μ L處理後的樣品(包括樣本、質控品、標準品)40 μ L的PCR反應液和3 μ L的Taq酶，8，OOOrpm離心數秒， 放入PCR儀器樣品槽進行擴增；95°C IOmin; 95 °C 15s, 55 °C 2min，72°C 30s (共 10 個循環)；95°C 15s, 50 °C 20s,72°C 20s (共40個循環)。14)根據標準品檢測的標準曲線，計算得到各待測標本中的梅毒DNA的量(copies/mL)實施例2與實施例I相似，其區別在於待檢標本為硬下疳及皮損部位組織標本，標本用適量滅菌生理鹽水清洗送檢組織沾帶的血液；取約50mg組織，加ImL滅菌生理鹽水用勻漿器研磨成組織勻眾，轉移至I. 5mL離心管中，12，OOOrpm離心5min ;去上清,沉澱加滅菌生理鹽水ImL混勻，12，OOOrpm離心5min ;去上清，沉澱的DNA提取和PCR擴增同實施例I。實施例3與實施例I相似，其區別在於待檢標本為全血，肝素抗凝靜脈血5mL，加等量的生理鹽水懸浮細胞。將細胞懸液小心加在與血液等量的淋巴細胞分離液上，室溫中，水平離心500g20min。吸去最上層的血漿，收集血漿層和淋巴細胞分離液交界面的單個核細胞，儘量全部吸出PBMC。加I 2倍量Hanks液(洗滌液)，混勻後離心200 Xg lOmin，低速離心有利於去除細胞懸液中留存的血小板,去上清液。用同樣洗滌液洗滌細胞2次，每次離心500Xgl0min，洗去殘留的淋巴細胞分離液，沉澱的DNA提取和PCR擴增同實施例I。實施例4性能驗證試驗按實施例I的方案製備梅毒螺旋體fla-A基因FQ-PCR檢測試劑盒，然後進行性能驗證。I)精密度試驗對同一樣本每天進行I批次檢測,每批重複檢測2次，共進行20天。收集20天的有效數據，進行重複性評價。2)分析靈敏度以 2000copies/mL、1000copies/mL、500copies/mL、250copies/mL4個濃度樣品每天重複8次檢測，連續做三次，95%檢出陽性的最低濃度值為分析靈敏度。3)特異性臨床常見泌尿生殖道感染患者分泌物標本150例，其中淋病50例、支原體感染50例、尖銳溼疣50例，分別進行DNA提取，螢光定量PCR檢測，同時做梅毒患者和正常人生殖道拭子為陽性和陰性對照，評價方法的特異性。[0121]4)線性範圍根據標準曲線的線性，維持相關係數在O. 97以上，判斷方法的線性範圍。5)試劑穩定性用兩個濃度水平臨床樣本，每個濃度水平樣本重複測定至少6次，計算平均值。新配製及穩定期末工作液應在同次運行中測定，將儀器帶來的不精密度減到最小。測定新配製的試劑工作液和穩定期末試劑工作液兩組平 均值之間的一致性。
權利要求1.梅毒螺旋體f Ia-A基因FQ-PCR檢測試劑盒，其特徵在於所述梅毒螺旋體f Ia-A基因FQ-P CR檢測試劑盒設有DNA提取試劑瓶、耐熱DNA聚合酶瓶、PCR反應液瓶、標準品瓶、質控品瓶和包裝盒；所述DNA提取試劑瓶、耐熱DNA聚合酶瓶、PCR反應液瓶、標準品瓶和質控品瓶設在包裝盒內；所述DNA提取試劑瓶設有蛋白酶K瓶、裂解液瓶、無水乙醇瓶、抑制物去除液瓶、第I清洗緩衝液瓶、洗脫液瓶、第2清洗緩衝液瓶和含收集管的離心柱；所述標準品瓶設有6個含fla-A基因的標準品質粒瓶；所述質控品瓶設有陰性質控品瓶和陽性質控品瓶。
專利摘要梅毒螺旋體fla-A基因FQ-PCR檢測試劑盒，涉及一種試劑盒。設有DNA提取試劑瓶、耐熱DNA聚合酶瓶、PCR反應液瓶、標準品瓶、質控品瓶和包裝盒；所述DNA提取試劑瓶設有蛋白酶K瓶、裂解液瓶、無水乙醇瓶、抑制物去除液瓶、第1清洗緩衝液瓶、洗脫液瓶、第2清洗緩衝液瓶和含收集管的離心柱；標準品瓶設有6個含fla-A基因的標準品質粒瓶；質控品瓶設有陰性質控品瓶和陽性質控品瓶。先篩選靶基因，再構建fla-A基因標準品質粒，製作fla-A基因檢測試劑標準曲線後，再製備PCR反應液、耐熱DNA聚合酶，建立樣品處理方法後製備質控品，最後完成梅毒螺旋體fla-A基因FQ-PCR檢測試劑盒。
文檔編號C12Q1/04GK202576439SQ2012202039
公開日2012年12月5日 申請日期2012年5月8日 優先權日2012年5月8日
發明者林麗蓉, 童曼莉, 劉莉莉, 張長弓, 徐竟波, 楊天賜 申請人:廈門大學附屬中山醫院